Impuretés de nitrosamines : méthodes d’analyses

Les méthodes d'analyses suivantes ont été élaborées par Santé Canada et peuvent servir d'option analytique potentielle pour les organismes de réglementation et l'industrie afin de détecter les impuretés de nitrosamines dans certaines substances et certains produits pharmaceutiques. Ces méthodes doivent être validées par l'utilisateur si les données résultantes sont utilisées pour étayer une évaluation de la qualité de l'IPA ou du produit pharmaceutique requise, ou si les résultats sont utilisés dans une présentation réglementaire. Les méthodes sont susceptibles d'être modifiées à mesure que de nouveaux renseignements sont disponibles.

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Méthode d'analyse pour les sartans ou antagonistes des récepteurs de l'angiotensine II (ARA)

Détection de la N-Nitrosodiméthylamine (NDMA) et de la N-Nitrosodiéthylamine (NDEA) par GC-MS/MS (injection directe) dans les produits finis et les substances médicamenteuses de la classe des sartans

1. Principe et portée

La présente méthode a été dévelopée afin de détecter et quantifier les impuretés nitrosamine N-nitrosodiméthylamine (NDMA) et N-nitrosodiéthylamine (NDEA) dans les produits finis de valsartan, irbésartan et losartan. Cette méthode est effectuée par un chromatographe en phase gazeuse couplé à un spectromètre de masse en tandem (GC-MS/MS) à injection directe.

La méthode peut également être utilisée pour détecter et quantifier la NDMA et la NDEA dans les produits finis de candersartan et olmésartan et les substances médicamenteuses de sartans (par ex. valsartan, ibésartan, losartan, candesartan et olmésartan). Par contre, s'il y a des interférences d'observer, une validation supplémentaire serait requise.

2. Réactifs et étalons de référence

3. Instruments et équipements

4. Préparation des solutions

Solutions étalons

Solutions étalons de référence (telles qu'achetées)
  • Solution étalon de NDMA dans du méthanol (5000 ppm)
  • Solution étalon de NDEA dans du méthanol (100 ppm)
Solution étalon interne (telle qu'achetée)
  • Solution étalon de NDMA-d6 dans du méthanol (1000 ppm)

Solutions étalons diluées

Solution étalon de NDMA (200 ppm) :

Transférer 800 μL de solution étalon de référence de NDMA (5000 ppm) dans un ballon volumétrique de 20 mL, diluer jusqu'à la jauge avec du méthanol.

Solution étalon diluée (NDMA : 40 ppm, NDEA : 20 ppm) :

Transférer 800 μL de solution étalon de NDMA (200 ppm) et 800 μL de solution étalon de NDEA (100 ppm) dans un ballon volumétrique de 4 mL, diluer jusqu'à la jauge avec du méthanol.

Solution-étalon interne-1 (20 ppm) :

Transférer 500 μL de solution étalon de NDMA-d6 (1000 ppm) dans un ballon volumétrique de 25 mL, diluer jusqu'à la jauge avec du méthanol.

Solution-étalon interne-2 (0,2 ppm) :

Transférer 5 μL de solution étalon de NDMA-d6 (20 ppm) dans un ballon volumétrique de 500 mL, diluer jusqu'à la jauge avec du méthanol.

Solutions d'étalonnage

STD-12 :

Transférer 500 μL de solution étalon diluée (NDMA : 40 ppm, NDEA : 20 ppm) et 50 μL de solution étalon interne-1 (20 ppm) dans un ballon volumétrique de 5 mL, diluer au volume avec du méthanol. Bien mélanger.

STD-7 :

Transférer 1000 μL de STD-12 dans un ballon volumétrique de 20 mL, diluer au volume avec la solution étalon interne-2 (0,2 ppm). Bien mélanger. Cette solution servira à effectuer l'évaluation de la performance du système et la vérification de la dérive du système.

STD-11 :

Dilution 1:1 de STD-12 avec la solution étalon interne-2

STD-10 :

Dilution 1:1 de STD-11 avec la solution étalon interne-2

STD-9 :

Dilution 1:1 de STD-10 avec la solution étalon interne-2

STD-8 :

Dilution 3:2 de STD-9 avec la solution étalon interne-2

STD-6 :

Dilution 1:1 de STD-7 avec la solution étalon interne-2

STD-5 :

Dilution 1:1 de STD-6 avec la solution étalon interne-2

STD-4 :

Dilution 2:3 de STD-5 avec la solution étalon interne-2

STD-3 :

Dilution 1:1 de STD-4 avec la solution étalon interne-2

STD-2 :

Dilution 1:1 de STD-3 avec la solution étalon interne-2

STD-1 :

Dilution 2:3 de STD-2 avec la solution étalon interne-2

Concentration des solutions d'étalonnage:
Description Concentration de NDMA (µg/mL) Concentration de NDEA (µg/mL) Concentration de NDMA-d6 (µg/mL)
STD-1 0,002 0,001 0,2
STD-2 0,005 0,0025 0,2
STD-3 0,01 0,005 0,2
STD-4 0,02 0,01 0,2
STD-5 0,05 0,025 0,2
STD-6 0,1 0,05 0,2
STD-7 0,2 0,1 0,2
STD-8 0,3 0,15 0,2
STD-9 0,5 0,25 0,2
STD-10 1 0,5 0,2
STD-11 2 1 0,2
STD-12 4 2 0,2

Pour la NDMA, les solutions STD-1 à STD-6 sont utilisées pour la plage de travail allant de 0,002 à 0,1 µg/mL; les solutions STD-6 à STD-12 sont utilisées pour la plage de travail allant de 0,1 à 4,0 µg/mL.

Pour la NDEA, les solutions STD-1 à STD-5 sont utilisées pour la plage de travail allant de 0,001 à 0,025 µg/mL; les solutions STD-5 à STD-11 sont utilisées pour la plage de travail allant de 0,025 à 1,0 µg/mL.

Les plages de travail de la NDMA et de la NDEA peuvent être ajustées au besoin.

Préparation des échantillons

Pour les produits finis :

Peser au minimum 20 comprimés et calculer le poids moyen d'un comprimé. Moudre au minimum 20 comprimés en une poudre fine à l'aide du mortier et du pilon.

Préparer trois réplicats par échantillon. Peser précisément l'équivalent de 250 mg d'ingrédient pharmaceutique actifde la poudre d'échantillon homogénéisée dans un tube en verre fileté à fond rond.

À l'aide d'une pipette automatique, ajouter 5 mL de solution étalon interne-2 de NDMA-d6 à chaque tube d'échantillon. Bien refermer les tubes, soumettre à l'ultrason pendant 5 minutes, puis déposer le support de tubes dans l'agitateur vortex à tubes multiples et agiter à 2000 rpm pendant 5 minutes. Centrifuger les tubes pendant au moins 5 minutes à 1500 rpm. Délicatement, retirer les tubes de la centrifugeuse. À l'aide d'une pipette Pasteur, transférer un aliquot de chaque tube dans un vial GC en verre de 2 mL.

Remarque : La précision de la méthode a été évaluée par des études de récupération. Les valsartan, irbésartan et losartan dans les produits finis ont été ensemencés avec une solution d'étalon de référence de la façon suivante :

Pour les échantillons contenant de la NDMA à un taux supérieur à 0,3 ppm ou de la NDEA à un taux supérieur à 0,08 ppm :

Ensemencer la solution d'échantillon avec la solution étalon qui correspond le mieux à celle de l'échantillon et calculer la récupération.

Pour les échantillons contenant de la NDMA à un taux inférieur à 0,3 ppm ou de la NDEA à un taux inférieur à 0,08 ppm :

Ensemencer la solution de l'échantillon avec la solution STD-3 (1:1) afin d'obtenir une solution contenant 0,05 ppm de la NDMA et 0,025 ppm de la NDEA. Vérifier le ratio signal/bruit et calculer la limite de détection (LOD) et la limite de quantification (LOQ).

Pour les substances médicamenteuses :

Préparer trois échantillons de chaque substance. Peser précisément 250 mg de la poudre homogénéisée de l'échantillon dans un tube fileté à fond rond en verre.

Continuer la préparation selon les instructions pour les produits finis ci-dessus. Il est recommandé d'ensemencer l'échantillon pour déterminer la précision de la méthode.

5. Paramètres de fonctionnement des instruments :

Paramètres suggérés pour le GC :

Paramètres de l'injecteur :

Mode d'injection :
Injecteur « pulsed splitless »
Température d'injecteur :
240 °C
Débit :
1,8 mL/min
Débit de vidange de la membrane (septum) :
3 mL/min
Débit de vidange :
50 mL/min après 0,75 minute
Volume d'injection :
2,0 µL
Programmation du four :
Température initiale : 60 °C
Attente : 2 min
Tableau 1. programme du four
No de rail
(ramp #)
Débit (°C/min)
(Rate)
Température finale (°C) Durée d'attente (minutes)
1 5 130 0
2 40 240 5

Durée totale : 24 min

Paramètres suggérés pour le détecteur MS

Ligne de transfert de la MS (température auxiliaire) :
250 °C
Source d'ions :
EI
Température de la source :
250 °C
Délai du solvant :
6 min
Temps d'arrêt :
15 min
Gaz d'injection (quench gas):
Hélium à 2,25 mL/min
Gaz de collision :
Azote à 1,5 mL/min
Tableau 2. Paramètres du MS-MS
Analyte Temps de rétention (minutes) Segment Fenêtre du temps de rétention (minutes) Ion précurseur (m/z) Ion produit (m/z) CE
(V)
Résolution Temporisation (ms) (dwell)
NDMA-d6 (étalon interne) 7,8 1 7,5-8,1 80 50 5 Étendue / étendue 100
NDMA 7,8 1 7,5-8,1 74 42 15 Étendue / étendue 100
74 44 4 100
NDEA 12,7 2 12,4-13,0 102 44 12 Étendue / étendue 150
102 85 2 150

6. Performance du système

Le coefficient de détermination (R2) de chaque courbe d'étalonnage est d'au moins 0,995.

Le ratio signal/bruit de la solution STD-1 (NDMA = 0,002 µg/mL; NDEA = 0,001 µg/mL) devrait être au moins 10.

7. Calculs

Établir les courbes d'étalonnage pour la NDMA et la NDEA en utilisant le ratio de facteur de réponse (surface du pic de NDMA ou NDEA divisée par la surface du pic de l'étalon interne) par rapport à la concentration étalon (µg/mL). À l'aide des pentes et ordonnées à l'origine des courbes d'étalonnage, déterminer la teneur en NDMA et en NDEA de chaque échantillon en fonction de l'équation suivante.

Pour les produits finis :

Les résultats, en ppm relatif à la quantité déclarée de la substance médicamenteuse sartan dans le produit, sont calculés comme suit :

Équation 1

équation 1

Où,

y =
rapport de la surface du pic de NDMA ou de NDEA à la surface du pic de NDMA-d6
b =
ordonnée à l'origine de la courbe linéaire
m =
pente de la courbe linéaire
Wtspl =
poids de l'échantillon (g)
AVGwt =
poids moyen d'un comprimé (g)
LC =
quantité déclarée sur l'étiquette (g) de l'échantillon
V =
5 mL (volume)
Description textuel

Parties par million est égale à y moins b sur m, qui représente la différence entre le rapport de la surface du pic d'impureté à la surface du pic de l'étalon interne moins l'ordonnée à l'origine de la courbe linéaire sur la pente de la courbe linéaire. Cette valeur est multipliée par le poids moyen d'un comprimé, ensuite multipliée par le volume, divisée par le poids de l'échantillon et ensuite divisée par la quantité déclarée sur l'étiquette de l'échantillon.

Pour les substances médicamenteuses :

Les résultats, en ppm relatif à la substance médicamenteuse testée, sont calculés comme suit :

Équation 2

Équation 1

Où,

y =
rapport de la surface du pic de NDMA ou de NDEA à la surface du pic de NDMA-d6
b =
ordonnée à l'origine de la courbe linéaire
m =
pente de la courbe linéaire
Wtspl =
poids de l'échantillon (g)
V =
5 mL (volume)
Description textuel

Parties par million est égale à y moins b sur m, qui représente la différence entre le rapport de la surface du pic d'impureté à la surface du pic de l'étalon interne moins l'ordonnée à l'origine de la courbe linéaire sur la pente de la courbe linéaire. Cette valeur est multipliée par le volume et ensuite divisée par le poids de l'échantillon.

8. Résultats de la LOD et de la LOQ

Les limites de détection (LOD) et les limites de quantification (LOQ) peuvent être calculées en utilisant le ratio signal/bruit de la solution d'échantillon ensemencé (ensemencé avec la solution STD-3 à 1 :1).

LOD et LOQ théoriques :

Si aucun résultat de solution ensemencée n'est disponible, les LOD et LOQ théoriques peuvent être calculées en utilisant le signal/bruit de la STD-1 (NDMA : 0,002 µg/mL; NDEA 0,001 µg/mL).

À des fins de référence, les résultats des LOD et LOQ théoriques de Santé Canada sont les suivants :

Tableau 3. Signal/bruit de la NDMA et de la NDEA de la solution STD-1
Concentration substance médicamenteuse µg/mL NDMA NDEA
µg/mL Signal/bruit LOD (calc.) ppm LOQ (calc.) ppm µg/mL Signal/bruit LOD (calc.) ppm LOQ (calc.) ppm
50 0,002 74 0,002 0,0054 0,001 55 0,002 0,0073

9. Chromatogrammes des échantillons

Figure 1 : Chromatogrammes d'un échantillon dans lequel a été détecté de la NDMA et de la NDEA

Figure 1

Description textuel

La figure montre des chromatogrammes d'un échantillon montrant des pics typiques de la NDMA et de la NDEA. Les chromatogrammes sont organisés en quatre rangées.

  • La première rangée montre un chromatogramme du courant total ionique de 6,0 à 15,0 minutes. Il y a un large pic à 8,5 minutes (étiqueté « matrice ») et des pics plus petits à 7,7 minutes (NDMA, NDMA-d6) et à 12,6 minutes (NDEA).
  • La deuxième rangée montre des chromatogrammes de surveillance de réactions multiples (m/z 80,0 → 50,0) avec un seul pic pour l'étalon interne de la NDMA-d6 à 7,735 minutes.
  • La troisième rangée montre deux chromatogrammes de surveillance de réactions multiples (m/z 74,0 → 44,0 and m/z 74,0 → 42,0), chacun avec un seul pic pour la NDMA à 7,787 minutes.
  • La quatrième rangée montre deux chromatogrammes de surveillance de réactions multiples (m/z 102,0 → 85,0 and m/z 102,0 → 44,0) avec un seul pic pour la NDEA à 12,561 minutes.

Figure 2 : Chromatogramme de la solution STD-1

Figure 2

Description textuel

La figure montre des chromatogrammes de la solution étalon STD-1. Les chromatogrammes sont organisés en quatre rangées.

  • La première rangée montre des chromatogrammes du courant total ionique de 6,0 à 15,0 minutes. Il y a un large pic à 7,7 minutes (NDMA, NDMA-d6) et un petit pic à 8,5 minutes (étiqueté « matrice »).
  • La deuxième rangée montre deux chromatogrammes de surveillance de réactions multiples (m/z 80.0 → 50.0) avec un seul pic pour la solution d'étalon interne NDMA-d6 à 7,715 minutes.
  • La troisième rangée montre deux chromatogrammes de surveillance de réactions multiples (m/z 74.0 → 44.0 and m/z 74.0 → 42.0) avec un seul pic pour la NDMA à 7,767 minutes.
  • La quatrième rangée montre deux chromatogrammes de surveillance de réactions multiples (m/z 102.0 → 85.0 and m/z 102.0 → 44.0) avec un seul pic pour la NDEA à 12,515.

Méthode d'analyses pour les produits contenant de la ranitidine

Détermination de la N-Nitrosodiméthylamine (NDMA) dans les médicaments contenant de la ranitidine par UPLC-MS/MS.

1. Principe et portée

La présente méthode a été conçue afin de détecter et de quantifier la N-nitrosodiméthylamine (NDMA) présente dans les médicaments contenant de la ranitidine à l'aide de la chromatographie liquide haute performance couplée à la spectrométrie de masse en tandem (UPLC MS/MS).

2. Réactifs et étalons de références

3. Instruments et équipements

4. Préparation des solutions

Entreposage

Les solutions d'étalonnage et d'échantillons sont conservées au réfrigérateur.

Préparation des phases mobiles

Préparation du diluant

Préparation des solutions étalons

Solutions étalons mère (telles qu'achetées)
Solution étalon de NDMA dans du méthanol (200 ppm).

Solutions étalons pour l'étalonnage

STD-1 :

Transférer 50 μL de la solution étalon mère de NDMA (200 ppm) dans un ballon volumétrique de 50 mL, diluer au volume avec le diluant. Bien mélanger. Cette solution servira à effectuer l'évaluation de la performance du système ansi que la dérive du système.

STD-2 :
Dilution 1 pour 1 de la solution STD-1 avec le diluant. Bien mélanger.
STD-3 :
Dilution 1 pour 1 de la solution STD-2 avec le diluant. Bien mélanger.
STD-4 :
Dilution 1 pour 1 de la solution STD-3 avec le diluant. Bien mélanger.
STD-5 :
Dilution 2 pour 3 de la solution STD-4 avec le diluant. Bien mélanger.
STD-6 :
Dilution 1 pour 1 de la solution STD-5 avec le diluant. Bien mélanger.
STD-7 :
Dilution 1 pour 1 de la solution STD-6 avec le diluant. Bien mélanger.
STD-8 :
Dilution 2 pour 3 de la solution STD-7 avec le diluant. Bien mélanger.
STD-9 :
Dilution 3 pour 1 de la solution STD-8 avec le diluant. Bien mélanger (LOD).
Tableau 1. Concentration des solutions d'étalonnage 
Solutions-étalon d'étalonnage Concentration en NDMA (ng/mL)
STD-1 200
STD-2 100
STD-3 50
STD-4 25
STD-5 10
STD-6 5
STD-7 2,5
STD-8 1
STD-9 0,75

Le R2 de la courbe d'étalonnage devrait être inférieur à (NLT) 0,99.

Préparation des échantillons

Méthode suggérée pour la préparation des échantillons :

La concentration des échantillons (poids et/ou volume) peut être modifiée au besoin.

Récupération suggérée pour les échantillons enrichis :

Échantillons enrichis : enrichir les solutions des échantillons avec la solution étalon, en triplicatas, puis vérifier la récupération.

5. Paramètres instrumentales

Paramètres suggérés pour l'UPLC :

Débit :
0,4 mL/min
Volume d'injection :
10,0 µL
Durée :
12,5 min
Tableau de gradient
Temps (minutes) % de la phase mobile A % de la phase mobile B
0 95 5
5 95 5
7 0 100
10 0 100
10,1 95 5
12,5 95 5

Paramètres suggérés pour le détecteur MS :

Température de la sonde APCI :
450 °C
Température de la source :
150 °C
Corona :
4,0 kV
Type :
MRM
Mode ionique :
Positif
Étendue (Da) :
0,3
Temps de début :
3,3 min
Temps de fin :
5,0 min

Programmation :

Programmation 1 :
0,00 min : déchet
Programmation 2 :
3,30 min : LC
Programmation 3 :
5,00 min : déchet

Remarque : Le débit peut être ajusté selon le système pour dévier la ranitidine au déchet.

Tableau 2. Paramètres pour la « Multiple Reaction Monitoring » :
Nom Ion mère (m/z) Ion fille (m/z) Temporisation (s) Cône (V) Cellule de collision (eV)
NDMA 75,1 42,9 0,3 22 10
NDMA 75,1 58,1 0,3 22 10

Remarque : La transition 75,1 → 58,1 est utilisée pour la quantification; un bruit de fond plus élevé est normalement observé pour la transition 75,1 → 42,9. Il est possible d'effectuer la quantification à l'aide d'une autre paire d'ions (ion mère et d'un ion fille).

6. Calcul

Les résultats, en ppm par rapport à la quantité déclarée d'une substance dans un produit, sont calculés de la façon suivante :

NDMA (ppm) = [(y-b)/m] x AVGwt x V ÷ Wtspl ÷ LC

Où :

y =
surface du pic de NDMA
b =
ordonée à l'origine de la courbe d'étalonnage
m =
pente de la courbe d'étalonnage
Wtspl =
poids de l'échantillon (mg)
AVGwt =
poids moyen d'un comprimé (mg)
LC =
quantité déclarée sur l'étiquette de l'échantillon (mg)
V =
5 mL (volume)
Description textuel

NDMA en parties par million est égale à y moins b sur m, qui représente la différence entre la surface du pic d'impureté moins l'ordonnée à l'origine de la courbe d'étalonnage sur la pente de la courbe d'étalonnage. Cette valeur est multipliée par le poids moyen d'un comprimé, ensuite multipliée par le volume, divisée par le poids de l'échantillon et ensuite divisée par la quantité déclarée sur l'étiquette de l'échantillon.

7. Plage, limite de détection (LOD) et limite de quantification (LOQ)

Tableau 3. Plage, LOD et LOQ
  NDMA (ng/mL) NDMA (ppm)Tableau 3 Note de bas de page *
LOQ 1 0,033
LOD 0,75 0,025
Plage 1 – 200 0,03 – 6,7
Tableau 3 Note de bas de page *

ppm par rapport au montant déclaré de la substance médicamenteuse dans le produit

Tableau 3 Retour à la référence de la note de bas de page *

8. Exemples de courbe d'étalonnage et chromatogrammes

Figure 1 : Courbe d'étalonnage (disponible en anglais seulement)

Figure 1

Description texte

La figure montre une courbe d'étalonnage avec la concentration des solutions étalons de référence de NDMA sur l'axe x et le signal (unités arbitraires) sur l'axe y. Il y a un point de donnée pour chacun des neufs concentrations des solutions étalons de référence, reliées par une ligne droite. Le coefficient de corrélation est R2 = 0,999761, et l'équation de la courbe est y = 257,934 x – 15,8397.

Figure 2 : Chromatogrammes de solutions-étalon à 200 ppb : MRM et UV (disponibles en anglais seulement)

Figure 2

Description texte

La figure comprend deux panneaux. Le panneau à la gauche montre deux chromatogrammes MRM (m/z 75,1 → 58,1 et m/z 75,1 → 42,9) de la solution étalon STD-1, chacun avec un seul pic à 4,05 minutes pour la NDMA. Le panneau à la droite montre le chromatogramme UV de la solution étalon STD-1. La section du chromatogramme entre 3,3 et 5,0 minutes (correspondant au moment où le débit est acheminé au détecteur MS) est relativement plate, tandis que le reste du chromatogramme contient plusieurs pics et décalages de la ligne de base.

Figure 3 : Chromatogrammes d'un échantillon : MRM et UV (disponibles en anglais seulement)

Figure 3

Description texte

La figure comprend deux panneaux. Le panneau à la gauche montre deux chromatogrammes MRM (m/z 75,1 → 58,1 et m/z 75,1 → 42,9) d'une solution d'échantillon typique, chacun avec un seul pic à 4,01 minutes pour la NDMA. Le panneau à la droite montre le chromatogramme UV d'une solution d'échantillon typique. La section du chromatogramme entre 3,3 et 5,0 minutes (correspondant au moment où le débit est acheminé au détecteur MS) est relativement plate, tandis que le reste du chromatogramme contient plusieurs pics et décalages de la ligne de base.

Méthodes d'analyse pour les produits contenant de la metformin

Détermination des impuretés de nitrosamines dans les médicaments contenant de la metformine

1. Principe et portée

La présente méthode a été développée afin de détecter et de quantifier les impuretés de nitrosamine suivantes dans les médicaments contenant de la metformine à l'aide de la chromatographie liquide haute performance couplée à un spectromètre de masse en tandem (UPLC-MS/MS) : N-nitrosodiméthylamine (NDMA), N-nitrosodiéthylamine (NDEA), N-nitrosodiisopropylamine (NDIPA), N-éthyl-N-nitroso-isopropylamine (NEIPA), N-nitroso-di-n-butylamine (NDBA) et l'acide N-nitroso-N-méthyl-4-aminobutyrique (NMBA)

2. Réactifs et étalons de références

3. Instruments et équipements

4. Préparation des solutions

4.1 Entreposage

Les solution d'étalonnage et d'échantillons sont conservées au réfrigérateur.

4.2 Préparation des phases mobile

4.3 Préparation du diluant

4.4 Solutions étalons

Solutions étalons de référence (telles qu'achetées)

Méthode suggérée pour la préparation de la solution étalon mère de NMBA (100 ppm)

Peser précisément 2,0 mg de NMBA dans un ballon volumétrique de 20 mL. Dissoudre et diluer au volume avec du méthanol.

Remarque: La concentration de la solution étalon mère de NMBA peut variée. La dilution pour la préparation des solutions étalons intermédiares -1 et -2 peut être calculée et ajustée selon le cas pour s'assurer que la concentration finale soit approximativement de 200 ppb et 5 ppb.

Préparation de la solution étalon intermédiare-1 (200 ppb)

Transférer 100 µL de solution étalon de référence de NDMA (200 ppm), 200 µL des autres solutions étalons de référence de nitrosamine (100 ppm) et 200 µL de la solution étalon mère de NMBA (100 ppm) dans un ballon volumétrique, diluer au volume avec le diluant. Bien mélanger.

Préparation de la solution étalon intermédiare-2 (5 ppb) (STD-4)

Transférer 500 µL de la solution étalon intermédiare-1 (200 ppb) dans un ballon volumétrique de 20 mL, diluer au volume avec le diluant. Bien mélanger.

Solutions d'étalonnage suggérées
Solution
STD
Solution de travail Concentration de la solution de travail (ppb) Volume de la solution de travail (mL) Volume total (mL) Concentration en nitrosamine (ppb)
LOD Solution étalon Intermédiaire-2 5 0,5 5 0,5
LOQ Solution étalon Intermédiaire-2 5 0,75 5 0,75
STD-1 Solution étalon Intermédiaire-2 5 1 5 1
STD-2 Solution étalon Intermédiaire-2 5 2 5 2
STD-3 Solution étalon Intermédiaire-2 5 3 5 3
STD-4 Solution étalon Intermédiaire-2 5 - - 5
STD-5 Solution étalon Intermédiaire-1 200 0,25 5 10
STD-6 Solution étalon Intermédiaire-1 200 0,375 5 15
STD-7 Solution étalon Intermédiaire-1 200 0,5 5 20
STD-8 Solution étalon Intermédiaire-1 200 0,625 5 25
STD-9 Solution étalon Intermédiaire-1 200 1,25 5 50

Le R2 de la courbe d'étalonnage ne devrait pas être inférieur à (NLT) 0,995.

La solution STD-9 servira à effectuer l'évaluation de la performance du système ainsi que la dérive du système.

4.5 Préparation des échantillons

Méthode suggérée pour la préparation des échantillons :

La concentration des échantillons (poids et/ou volume) peut être modifiée au besoin.

4.6 Préparation suggérée pour les échantillons enrichis :

5. Paramètres instrumentales

5.1 Paramètres suggérés pour l'UPLC:

Débit :
0,4 mL/min
Volume d'injection :
10,0 µL
Durée :
30 min
Tableau de gradient:
Temps (minutes) % de la phase mobile A % de la phase mobile B
0 95 5
5 95 5
22 0 100
27 0 100
28 95 5
30 95 5

5.2 Paramètre suggérés pour le détecteur MS :

Température de la sonde APCI :
400°C
Température de la source :
150°C
Corona :
4,0 kV
Type :
MRM
Mode ionique :
Positive
Span (Da) :
0
Temps de début :
3.5 min
Temps d'arrêt :
21 min

Programmation:

Programmation 1 : 0,00 min
Flow State: déchet
Programmation 2 : 3,5 min
Flow State: LC
Programmation 3 : 21 min
Flow State: déchet

Remarque : Le débit peut être ajusté, si nécessaire, pour permettre au système de détourner la metformine vers les déchets.

5.3 Paramètres pour MRM « Multiple Reaction Monitoring » :

Nom Période de temps
(minutes)
Ion mère (m/z) Ion fille (m/z) Temporisation (s) Cône (V) Cellule de collision (eV)
NDMA 3,5 – 6,0 75,0 43,1 0,1 30 10
75,0 58,0* 0,1 30 8
NMBA 6,0 – 10,0 146,9 44,0 0,1 22 12
146,9 117,0* 0,1 22 4
NDEA 10,0 – 13,0 103,0 47,1 0,1 30 12
103,0 75,0* 0,1 30 10
NEIPA 12,8 – 15,0 117,0 47,0 0,1 26 14
117,0 75,0* 0,1 26 10
NDIPA 14,6 – 17,0 131,0 43,1 0,1 26 10
131,0 89,0* 0,1 26 6
NDBA 17,0 – 21,0 159,0 57,1 0,1 32 12
159,0 103,0* 0,1 32 10
*Ions cible utilisés pour les calculs.

6. Calculs

Les résultats, en ppm par rapport à la quantité déclarée d'une substance dans un produit, sont calculés de la façon suivante :

Impureté de nitrosamine (ppm) = [(y-b)/m] × AVGwt × V ÷ Wtspl ÷ LC

Où:

Impureté de nitrosamine réfère à la NDMA, NDEA, NEIPA, NDIPA NDBA ou la NMBA

y = surface du pic de l'impureté de nitrosamine

b = ordonnée à l'origine de la courbe d'étalonnage

m = pente de la courbe d'étalonnage

Wtspl = poids de l'échantillon (mg)

AVGwt = poids moyen d'un comprimé (mg)

LC = quantité déclarée sur l'étiquette de l'échantillon (mg)

V = 10 mL (volume)

Équation - Description textuel

La concentration d'impureté de nitrosamine en parties par million (ppm) est égale à y moins b divisé par m, ce qui représente la différence entre la surface du pic d'impureté moins l'ordonnée à l'origine de la courbe d'étalonnage, le tout divisé par la pente de la courbe d'étalonnage. Cette valeur est multipliée par le poids moyen d'un comprimé, qui est ensuite multipliée par le volume, divisée par le poids de l'échantillon et pour terminer, divisée par la quantité déclarée sur l'étiquette de l'échantillon.

7. Plage, limite de détection (LOD) et limite of quantification (LOQ)

Nom du composé Concentration (ng/mL) Concentration (ppm*)
LOD LOQ Plage LOD LOQ Plage
NDMA 0,5 0,75 0,75 – 50 0,010 0,015 0,015 – 1,0
NDEA 0,1 0,5 0,5 – 50 0,002 0,010 0,010 – 1,0
NEIPA 0,1 0,5 0,5 – 50 0,002 0,010 0,010 – 1,0
NDIPA 0,1 0,5 0,5 – 50 0,002 0,010 0,010 – 1,0
NDBA 0,1 0,5 0,5 – 50 0,002 0,010 0,010 – 1,0
NMBA 0,25 0,5 0,5 – 50 0,005 0,010 0,010 – 1,0
* ppm (ng/g) par rapport à la quantité déclarée de Metformine dans le produit

8. Example de chromatogrammes

Figure 1. Chromatogramme MRM de l'étalon de NDMA à 5 ppb

Figure 1

Description textuel

La figure montre deux rangées. La rangée du haut montre un chromatogramme MRM (m/z 75,0 → 58,0) de la solution étalon de NDMA à 5 ppb tandis que la rangée du bas montre un chromatogramme MRM (m/z 75,0 → 43,1) de la solution étalon de NDMA à 5 ppb. Chaque chromatogramme montre un seul pic à environ 4.03 minutes.

Figure 2. Chromatogramme MRM de l'étalon de NBMA à 5 ppb

Figure 2

Description textuel

La figure montre deux rangées. La rangée du haut montre un chromatogramme MRM (m/z 146,9 → 117,0) de la solution étalon de NBMA à 5 ppb tandis que la rangée du bas montre un chromatogramme MRM (m/z 146,9 → 44,0) de la solution étalon de NBMA à 5 ppb. Chaque chromatogramme montre un grand pic à environ 8,5 minutes et deux pics plus petits à environ 8,6 et 8,7 minutes. La présence des deux derniers pics est probablement dû à la structure asymétrique du NBMA.

Figure 3. Chromatogramme MRM de l'étalon de NDEA à 5 ppb

Figure 3

Description textuel

La figure montre deux rangées. La rangée du haut montre un chromatogramme MRM (m/z 103,0 → 75,0) de la solution étalon de NDEA à 5 ppb tandis que la rangée du bas montre un chromatogramme MRM (m/z 103,0 → 47,1) de la solution étalon de NDEA à 5 ppb. Chaque chromatogramme montre un seul pic à environ 11.7 minutes.

Figure 4. Chromatogramme MRM de l'étalon de NEIPA à 5 ppb

Figure 4

Description textuel

La figure montre deux rangées. La rangée du haut montre un chromatogramme MRM (m/z 117,0 → 75,0) de la solution étalon de NEIPA à 5 ppb tandis que la rangée du bas montre un chromatogramme MRM (m/z 117,0 → 47,0) de la solution étalon de NEIPA à 5 ppb. Chaque chromatogramme montre un grand pic à environ 13,8 minutes et l'épaulement d'un petit pic à environ 14,0 minutes. La présence de ce dernier est probablement dû à la structure asymétrique de la NEIPA.

Figure 5. Chromatogramme MRM de l'étalon de NDIPA à 5 ppb

Figure 5

Description textuel

La figure montre deux rangées. La rangée du haut montre un chromatogramme MRM (m/z 131,0 → 89,0) de la solution étalon de NDIPA à 5 ppb tandis que la rangée du bas montre un chromatogramme MRM (m/z 131,0 → 43,1) de la solution étalon de NDIPA à 5 ppb. Chaque chromatogramme montre un seul pic à environ 15.6 minutes.

Figure 6. Chromatogramme MRM de l'étalon de NDBA à 5 ppb

Figure 6

Description textuel

La figure montre deux rangées. La rangée du haut montre un chromatogramme MRM (m/z 159,0 → 103,0) de la solution étalon de NDBA à 5 ppb tandis que la rangée du bas montre un chromatogramme MRM (m/z 159,0 → 57,1) de la solution étalon de NDBA à 5 ppb. Chaque chromatogramme montre un seul pic à environ 19.2 minutes.

Détermination des impuretés de N-nitrosodiméthylamine dans les produits de metformine par GC-MS/MS

1. Principe et portée

La méthode ci-dessous a été mise au point pour déceler et quantifier les impuretés de N-nitrosodiméthylamine (NDMA) dans les produits de metformine par GC-MS/MS.

2. Réactifs et normes de référence

3. Instruments et équipements

4. Préparation des solutions

4.1 Entreposage

Les solutions d'étalonnage et d'échantillons sont conservées au réfrigérateur.

4.2 Solutions étalons

Solutions étalons de référence (telles qu'achetées)
Préparation de la solution-étalon de NDMA-1 (1 ppm)

Transférer 125 µL de la solution-étalon mère de NDMA (200 ppm) dans un ballon volumétrique de 25 mL, diluer au volume avec le dichlorométhane. Bien mélanger.

Préparation de la solution-étalon interne-1 (2 ppm)

Transférer 100 µL de la solution-étalon mère de NDMA-d6 (1 000 ppm) dans un ballon volumétrique de 50 mL, diluer au volume avec du dichlorométhane. Bien mélanger.

Préparation de la solution-étalon interne-2 (10 ppb)

Transférer 2,5 mL de la solution-étalon interne-1 (2 ppm) dans un ballon volumétrique de 500 mL, diluer au volume avec du dichlorométhane. Bien mélanger.

Étalonnage proposé des solutions-étalons
Solution-étalon Volume de solution-étalon
enrichie (uL)
Volume de l'étalon
interne-1 (uL)
Diluant Ballon volumétrique
(mL)
Concentration
de NDMA dans solution
STD (ppb)
Concentration étalon
interne (ppb)
Étalon-1 500 (Solution-étalon de référence-1 NDMA) 50 Dichlorométhane 10 50 10
Étalon-2 250 (Solution-étalon de référence-1 NDMA) 50 Dichlorométhane 10 25 10
Étalon-3 100 (Solution-étalon de référence-1 NDMA) 50 Dichlorométhane 10 10 10
Étalon-4 50 (Solution-étalon de référence-1 NDMA) 50 Dichlorométhane 10 5 10
Étalon-5 25 (Solution-étalon de référence-1 NDMA) 50 Dichlorométhane 10 2.5 10
Étalon-6 50 (Solution-étalon de référence-1 NDMA) 250 Dichlorométhane 50 1 10
Étalon-7(LOQ) 5 000(étalon-6) 0 Étalon interne-2 10 0.5 10
LOD 1 000(étalon-6) 0 Étalon interne-2 10 0.1 10

4.3 Préparation des échantillons

Méthode pour la préparation des échantillons :

4.4 Récupération pour les échantillons enrichis :

5. Paramètres de fonctionnement des instruments

5.1 Paramètres pour le GC :

Paramètres de l'injecteur :

Mode d'injection :
Injecteur « Pulsed Splitless »
Température de l'injecteur :
240 °C
Débit :
1,3 mL/min.
Débit de vidange de la membrane
(Septum): 10 mL/min.
Débit de vidange :
50 mL/min. après 1 minute
Volume d'injection :
2,0 µL
Programme du four
Température initiale :
60 °C; attente : 2 minutes
No d'échelle température Débit (°C /min.) Température finale (°C)(ºC) Durée d'attente (min.)
1 20 220 2
2 60 240 3

5.2 Paramètres pour le détecteur MS :

Ligne de transfert de la MS (température auxiliaire)
240°C
Source d'ion Source :
EI
Température de la source :
250°C
Délai du solvant :
4 min
Temps d'arrêt :
7 min
Gaz d'injection :
Hélium à 2,5 mL/min.
Gaz de collision :
Azote à 1,5 mL/min.

5.3 Paramètres pour la « surveillance de réactions multiples » (MRM) :

 
Nom Temps de rétention
(min.)
Ion précurseur
(m/z)
Ion produit
(m/z)
Delta gauche
(TR)
Delta droit
(TR)
Résolution
(MS1 et MS2)
CE Tempo-risation
(ms)
NDMA 5,8 74 42 1.0 1.2 Unité/étendue 7 165,8
74 44Note de bas du tableau * 1,0 1,2 Unité/étendue 4 165,8
NDMA-d6 5,8 80,1 50,1 1,0 1,2 Unité/étendue 5 165,8

Notes de bas du tableau

Note *

Ions cibles utilisés pour les calculs..

Retour à la référence du tableau 1

6. Calcul

Les résultats, en ppm par rapport à la quantité déclarée d'une substance dans un produit, sont calculés de la façon suivante :

Où :
Impureté de nitrosamine, NDMA, (ppm) = [(y-b)/m]× 〖AVGwt × V ÷〖Wtspl ÷LC

y =
Rapport de la surface du pic de NDMA à la surface du pic de NDMA-d6
b =
Ordonnée à l'origine de la courbe d'étalonnage
m =
Pente de la courbe d'étalonnage
Wtspl =
Sample Weight (mg)
AVGwt =
Poids de l'échantillon (mg)
LC =
Quantité déclarée sur l'étiquette de l'échantillon (mg)
V =
10 mL (volume)
Équation – Description textuelle

La concentration d'impuretés de nitrosamine en parties par million (ppm) est égale à y moins b divisé par m, ce qui représente la différence entre la surface du pic d'impureté, moins l'ordonnée à l'origine de la courbe d'étalonnage, le tout divisé par la pente de la courbe d'étalonnage. Cette valeur est multipliée par le poids moyen d'un comprimé, ensuite multipliée par le volume, divisée par le poids de l'échantillon et pour terminer, divisée par la quantité déclarée sur l'étiquette de l'échantillon.

7. Plage, limite de détection (LOD) et limite de quantification (LOQ)

Nom du composé Concentration (ng/mL) Concentration (ppmNote Tableaux x *)
LOD LOQ Plage LOD LOQ Plage
NDMA 0,1 0,5 0,5-50 0,002 0,01 0,01-1,00
Note de bas du tableau *

ppm (ug/g) par rapport à la quantité déclarée de metformine dans le produit

Retour à la référence de la note de bas du tableau *

8. Exemple de chromatogrammes

Figure 1. Chromatogramme de la solution STD-4 (solution-étalon de NDMA de 1ppb)

Chromatogram of STD-4 (1ppb NDMA standard)

Description textuelle

pics typiques de la NDMA et de la NDMA-d6. Les chromatogrammes sont organisés en trois rangées.

  • La première rangée montre un chromatogramme de courant total ionique de 5,6 à 6,25 minutes. Il y a un pic prononcé à 5,853 minutes (NDMA-d6) et un autre pic prononcé à 5,872 minutes (NDMA).
  • La deuxième rangée montre un chromatogramme de surveillance de réactions multiples (m/z 74,0 → 44,0) avec un pic à 5,872 minutes pour la NDMA.
  • • La troisième rangée illustre un chromatogramme de surveillance de réactions multiples (m/z 80,1 → 50,1) avec un seul pic à 5,853 minutes pour l'étalon interne NDMA-d6.

Figure 2. Chromatogramme des échantillons

Sample Chromatogram

Description textuelle

La figure 2 illustre les chromatogrammes d'un échantillon montrant les pics typiques de la NDMA et de la NDMA-d6. Les chromatogrammes sont organisés en trois rangées :

  • La première rangée illustre le chromatogramme ionique total de 5,7 à 6,4 minutes. Il y a un pic prononcé à 5,861 minutes (NDMA-d6), un pic léger à 5,889 minutes (NDMA) et un pic lié à la matrice à 6,32 minutes.
  • La deuxième rangée illustre des chromatogrammes de surveillance de réactions multiples (m/z 74,0 → 44,0) avec un pic à 5,889 minutes pour la NDMA et un pic prononcé lié à la matrice à 6,3 minutes.
  • La troisième rangée illustre un chromatogramme de surveillance de réactions multiples (m/z 80,1 → 50,1) avec un pic unique à 5,861 minutes pour l'étalon interne NDMA-d6.
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