ARCHIVÉE - Trousse Elisa Systems pour la détection de la caséine : évaluation de la performance

Avertissement: La publication de cette méthode dans le recueil ne sous‑entend pas qu'elle est approuvée ou entérinée par Santé Canada.

Introduction

La présente étude a pour objet d'obtenir des données sur la performance de la trousse Elisa Systems pour la détection de la caséine, un allergène alimentaire important retrouvé dans le lait de vache. Cette étude fait partie des mesures soutenues visant à évaluer les méthodes de détection des allergènes dans les aliments et à les intégrer dans le Recueil des méthodes. Une poudre de lait entier représentative a été choisie comme matériel de référence désigné, selon la définition établie par le CMA.

L'évaluation de la trousse s'est faite par l'entremise d'expériences de récupération au cours desquelles des matrices d'aliments choisies ont été artificiellement fortifiées (échantillons fortifiés) avec de la poudre de lait entier. Méthode évaluée:

Trousse Elisa Systems pour la détection de la caséine.

Niveau d'évaluation:

Évaluation complète conformément aux lignes directrices établies pour le Recueil des méthodes d'analyse des allergènes.

Matériel de référence désigné

De la poudre de lait écrémé provenant du National Institute of Standards & Technology (NIST) a servi de matériel de référence. Cette poudre de lait entier a été développée conjointement par Agriculture Canada et le NIST sous le numéro de référence 1549.

Laboratoires participants

Laboratoire de recherche sur les allergènes alimentaires de Santé Canada
Édifice Banting
Ottawa (Ontario)

Laboratoire de la Région de l'Ouest, Santé Canada
Burnaby (Colombie‑Britannique)

Laboratoire du Québec, ACIA
Longueuil (Québec)

Laboratoire de la Région de l'Ouest, ACIA
Burnaby (Colombie‑Britannique)

Niveaux de fortification:

Les échantillons de céréale pour bébé ont été fortifiés avec 0, 4 ppm et 10 ppm du matériel de référence NIST 1549. Les autres échantillons ont été fortifiés avec 0, 2 ppm et 5 ppm du matériel de référence NIST 1549. Le raisonnement derrière le choix d'utiliser des niveaux de fortification plus élevés pour les céréales pour bébé sera discuté dans la section des résultats. Ces niveaux sont conformes aux lignes directrices d'évaluation du Recueil, selon lesquelles les niveaux de fortification doivent engendrer une réponse de la trousse équivalant à environ 0, 2 et 5 fois la limite de dosage appliquée au matériel de référence donné.

Conditions de fortification

La fortification a été faite au moyen d'une suspension de la poudre de lait écrémé NIST 1549 dans une solution tampon phosphate saline avec 0.1% Tween-20 (PBS-T). Les échantillons ont été soit laissés tels quels (échantillons non fortifiés) ou ont été fortifiés avec l'un des deux niveaux. Un code d'identification anonyme leur a été enfin assigné.

Matrices d'intérêt:

Trois matrices différentes ont été utilisées pour l'évaluation : céréales pour bébé, biscuits et chocolat noir. Ces produits ont été choisis parce qu'ils sont les plus susceptibles de contenir des traces de protéines de lait dont la présence n'est pas déclarée. Le risque d'une faible contamination croisée est présent lorsque des aliments qui ne contiennent pas de lait ou des composantes de lait comme ingrédient sont fabriqués avec l'équipement servant à fabriquer des produits qui en contiennent.

Matériel et ressources

Nous avons fourni à chaque laboratoire participant les éléments suivants :

• trousses complètes Elisa Systems pour la détection de la caséine avec la notice du fabricant contenant des directives pour se servir de la trousse. Les instructions d'utilisation (version PDF) ont été fournies par le fabricant uniquement en Anglais;
• échantillons codés à l'insu (30 de chaque matrice - 90 échantillons au total).

Méthode

Méthode de fortification

Les niveaux de fortification ont été choisis de façon à obtenir un résultat d'environ 5 ppm et 12.5 ppm (2 et 5 fois la limite de dosage) avec la trousse Elisa Systems pour la détection de la caséine. L'étalon de la trousse Elisa Systems pour la détection de la caséine utilisé pour produire la courbe d'étalonnage est différent de la poudre de lait écrémé NIST 1549. Cependant, le matériel de référence a répondu de façon identique par rapport aux étalons de calibration de la trousse Elisa Systems pour la détection de la caséine c'est pourquoi aucun facteur de corrélation n'a été nécessaire. À titre d'exemple, la trousse Elisa Systems pour la détection de la caséine donne une réponse de 5 ppm lorsque 5 ppm de poudre de lait écrémé NIST 1549 est utilisée pour fortifier un échantillon.

Les échantillons ont été fortifiés avec une solution‑mère de la poudre de lait écrémé NIST 1549 à une concentration de 50 mg/ml. Cette solution a été préparée par une dilution en série. Un aliquot de 1g de la poudre de lait écrémé NIST 1549 a été dissous dans 10 ml de PBS-T (100 mg/ml), puis dilué 100 fois dans du PBS-T (1mg/ml). Enfin, 25 ml de solution à 1 mg/ml a été diluée dans un volume total de 500 ml avec du PBS-T pour obtenir la solution mère à 50 mg/ml.
La fortification des échantillons a procédé comme suit:

Fortification à 10 ppm avec l'ajout de 1.0 ml de solution mère (50 mg/ml)
Fortification à 5 ppm avec l'ajout de 0.5 ml de solution mère (50 mg/ml) + 0.5 ml PBS-T
Fortification à 4 ppm avec l'ajout de 0.4 ml de solution mère (50 mg/ml) + 0.6 ml PBS-T
Fortification à 2 ppm avec l'ajout de 0.2 ml de solution mère (50 mg/ml) + 0.8 ml PBS-T
Tous les échantillons non fortifiés ont reçu 1 ml de PBS-T.

Préparation des échantillons

Les 360 échantillons requis (10 réplicats de chacun des trois niveaux des trois produits pour cinq laboratoires) ont été préparés au Laboratoire de recherche sur les allergènes alimentaires de Santé Canada. Des échantillons de 5 g ont été pesés, puis déposés dans des bouteilles à bouchon vissé de 250 mL (120 échantillons par matrice alimentaire). Les échantillons ont été séparés en groupes de 40, puis chaque groupe a été fortifié à l'un des trois niveaux. Chaque échantillon s'est vu assigner un code numérique, puis les échantillons ont été regroupés pour distribution à chacun des quatre laboratoires participants.

Extraction et analyse des échantillons

Chaque laboratoire a soumis les échantillons à une extraction en suivant la méthode indiquée dans la trousse Elisa Systems pour la détection de la caséine. Par contre, les échantillons de chocolat noir ont été extraits avec la solution d'extraction améliorée recommandée à cet effet par la trousse. Les échantillons de céréales pour bébé ont été extraits avec le double du volume de solution tampon (100 ml au lieu de 50 ml) suite à une recommandation des représentants de Elisa Systems. L'extraction a été effectuée directement dans les bouteilles d'échantillons fournies. Les laboratoires ont ensuite analysé les extraits d'échantillons à l'aide de la trousse Elisa Systems pour la détection de la caséine en suivant la méthode indiquée dans la notice du fabricant.

Résultats

Pendant les études préliminaires de récupération nous avons observé que les récupérations pour les échantillons de céréales pour bébé étaient basses en comparaison avec les autres échantillons. Suite à la recommandation du fabricant Elisa Systems le problème a été résolu en doublant la quantité de solution d'extraction utilisée pour ces échantillons. Par conséquent, la sensibilité globale de la trousse s'est vue divisée par deux. Ainsi, en comparant un échantillon extrait avec100ml de solution d'extraction (au lieu des 50 ml habituels), l'étalon de 1ppm qui est fourni avec la trousse devient un étalon de 2 ppm, l'étalon de 2.5 ppm devient un étalon de 5 ppm et ainsi de suite. En raison de ce changement, les échantillons de céréales pour bébé ont dû être fortifiés avec le double de la concentration des autres échantillons (4ppm et 10ppm au lieu de 2ppm et de 5ppm) afin d'atteindre des valeurs de fortification de 2 et 5 fois la limite de quantification.

Les résultats de l'évaluation ont révélé une bonne concordance inter- et intralaboratoires pour les 360 échantillons. Trois échantillons non fortifiés sur 120 ont été signalés comme faux positif. Deux des 120 échantillons fortifiés avec 2 ppm ont donné un résultat faux négatif. Les deux échantillons provenaient d'échantillons de céréales pour bébé. Il importe de noter que même si tous ces échantillons se situaient sous le seuil de 2 ppm, ils donnaient tous des résultats proches de 2 ppm, et les densités optiques correspondantes étaient largement supérieures à celles lues pour les échantillons non fortifiés. Tous les échantillons fortifiés avec 4 ppm ont donné des résultats positifs.

Pour chaque groupe de dix échantillons dans une matrice donnée à l'un des trois niveaux de fortification qui a été analysé par un laboratoire (par exemple, les échantillons de chocolat noir fortifiés avec 2 ppm du laboratoire 2) la moyenne et l'écart‑type ont été calculés. Tous les résultats dépassant deux écarts‑types par rapport à la moyenne étaient considérés comme aberrants et ont été exclus. Sur les 360 échantillons, seulement onze ont été exclus pour cette raison.

L'écart réduit d'un élément indique l'importance et le sens de l'écart de cet élément par rapport à la moyenne de sa distribution, exprimée en unités de l'écart‑type de sa distribution. Un écart réduit de 2,0 indique qu'un résultat se situait à deux écarts‑types au‑dessus de la moyenne, tandis qu'un écart de -2,0 indique qu'il se situait à deux écarts‑types au‑dessous. L'écart réduit a été calculé pour chaque matrice alimentaire objet de l'étude, à chacun des niveaux de fortification et pour chaque laboratoire. Aucun des résultats n'était supérieur à 2,0, et la plupart des résultats étaient inférieurs à 1,0, ce qui révèle une assez bonne concordance entre tous les laboratoires participants.

Un résumé des résultats de chacun des sept laboratoires est présenté ici.

Il faut noter que les quantités ajoutées pour la fortification sont indiquées en ppm de la poudre de lait écrémé NIST, mais que les résultats obtenus au moyen de la trousse sont exprimés en ppm de l'étalon de la trousse Elisa Systems, exprimés en ppm de la poudre de lait écrémé commercial. Les deux valeurs sont cette fois équivalentes. Aucun facteur de corrélation n'a donc été nécessaire. Le choix d'utiliser la poudre de lait écrémé NIST pour cette évaluation a été fait en raison de sa disponibilité et de sa caractérisation bien définie comme matériel de référence. Il faut noter que la poudre de lait écrémé NIST n'a pas été conçue pour le contrôle d'allergènes alimentaires mais qu'il s'est avéré utile pour ce genre d'expérimentations.

Conclusion

La trousse Elisa Systems pour la détection de la caséine a donné des résultats satisfaisants avec les matrices et les niveaux utilisés au cours de l'évaluation. Les échantillons de chocolat noir et de biscuits avaient des récupérations moyennes entre 75-85%. Pour les échantillons de céréales pour bébé la quantité de solution d'extraction a dû être doublée pour permettre une meilleure extraction. Cette modification a engendré des récupérations variant en moyenne entre 112 et 118%.

Les données de l'évaluation, qui reposent sur des échantillons fortifiés à l'aide de la poudre de lait écrémé NIST, pourront être complétées par d'autres données obtenues avec des échantillons naturels fabriqués au moyen d'une quantité de lait ou de caséine connue. Les données d'études ultérieures seront ajoutées à ce rapport lorsqu'elles seront rendues disponibles, afin de fournir davantage de données sur la performance de cette trousse commerciale.