Évaluation préalable de trichoderma reesei

Titre officiel: Évaluation préalable de trichoderma reesei souche ATCC 74252

Environnement et Changement climatique Canada

Santé Canada

Février 2018

Sommaire

En vertu de l’article 74 de la Loi canadienne sur la protection de l’environnement, 1999 (LCPE), la ministre de l’Environnement et la ministre de la Santé ont réalisé une évaluation préalable de la souche ATCC^{Note de bas de page 1}  74252 de Trichoderma reesei.

La souche ATCC 74252 de Trichoderma reesei (T. reesei) est un champignon qui partage des caractéristiques avec d’autres espèces du genre Trichoderma et d’autres souches de la même espèce. T. reesei est un champignon sporulant qui prolifère dans le sol et sur la matière végétale en décomposition. Comme il s’agit de l’un des principaux décomposeurs des végétaux, T. reesei peut donc dégrader un éventail de substrats végétaux. En raison de ses propriétés, l’espèce T. reesei peut être utilisée dans la fermentation de matières premières végétales et dans la production d’enzymes et de substances biochimiques utilisées pour produire des aliments, des aliments pour animaux, et des produits de santé. L’espèce T. reesei est généralement considérée comme un organisme sûr servant à la production, car elle est utilisée depuis longtemps sans danger pour fabriquer des carbohydrases, comme la cellulase.

Les espèces de Trichoderma, notamment T. reesei, peuvent produire des métabolites appelés peptaïbols. Certaines souches de T. reesei peuvent produire la paracelsine ainsi que d’autres peptaïbols. La paracelsine a été jugée nocive pour les invertébrés aquatiques, les cellules de mammifères et les souris dans les conditions expérimentales dans lesquelles les barrières naturelles ont été contournées. La paracelsine aurait aussi une activité antibiotique et antifongique. On croit que la souche ATCC 74252 de T. reesei ne produit pas de paracelsine et d’autres peptaïbols dans les conditions industrielles normalisées de fermentation en immersion actuellement employées pour cette souche, mais la production de ces substances pourrait survenir dans d’autres conditions de croissance.

L’espèce T. reesei n’est pas présente dans la nature au Canada. En dépit de sa présence répandue dans les sols des pays tropicaux, rien n’indique que l’espèce cause des effets nocifs chez les végétaux aquatiques ou terrestres ou chez les animaux sous les tropiques. En outre, les espèces de Trichoderma, dont T. reesei, inhibent divers agents phytopathogènes.

Aucune publication scientifique ne fait état de T. reesei comme agent anthropopathogène. Il est peu probable que la souche ATCC 74252 de T. reesei infecte les humains en bonne santé ou affaiblis, et, dans la faible éventualité d’une infection, cette souche est sensible aux principaux médicaments antifongiques utilisés en milieu clinique pour ce type d’infection. L’exposition répétée à des préparations commerciales d’enzymes produites par T. reesei et d’autres espèces de Trichoderma cause rarement des réactions allergiques chez les humains.

La présente évaluation porte sur les propriétés susmentionnées de la souche ATCC 74252 de T. reesei pour ce qui est des effets pour l’environnement et la santé humaine liés à l’utilisation de produits de consommation ou commerciaux et dans les procédés industriels assujettis aux exigences de la LCPE, y compris les rejets dans l’environnement attribuables au flux de déchets et de l’exposition accidentelle des humains dans le milieu environnemental. Pour mettre à jour les données sur les utilisations courantes de ce microorganisme, le gouvernement a mis sur pied un inventaire obligatoire permettant de recueillir des renseignements au terme de l’avis 71 de la LCPE, publié dans la Partie I de la Gazette du Canada le 3 octobre 2009 (avis de l’article 71). Les renseignements communiqués à la suite de la publication de l’avis indiquent que 10 000 à 100 000 kg de la souche ATCC 74252 de T. reesei , en masse de cellules sèches, ont été produits au Canada en 2008 à des fins industrielles.

D’après les renseignements disponibles, il est conclu que la souche ATCC 74252 de T. reesei ne satisfait pas aux critères énoncés aux alinéas 64a) ou 64b) de la LCPE, car elle ne pénètre pas dans l’environnement en une quantité ou concentration ou dans des conditions de nature à avoir, immédiatement ou à long terme, un effet nocif sur l'environnement ou sur la diversité biologique, ou à mettre en danger l’environnement essentiel pour la vie. Il est aussi conclu que la souche ATCC 74252 de T. reesei ne satisfait pas aux critères énoncés à l’alinéa 64c) de la LCPE car elle ne pénètre pas dans l’environnement en une quantité ou concentration ou dans des conditions de nature à constituer un danger au Canada pour la vie ou la santé humaines.

Il est conclu que la souche ATCC 74252 de T. reesei ne satisfait à aucun des critères énoncés à l’article 64 de la LCPE.

1. Introduction

En vertu de l’alinéa 74b) de la Loi canadienne sur la protection de l’environnement (1999) (LCPE), le ministre d’Environnement et Changement climatique Canada et le ministre de la Santé sont tenus de procéder à l’évaluation préalable des organismes vivants inscrits sur la Liste intérieure des substances (LIS) conformément à l’article 105 de la Loi, afin de déterminer s’ils constituent ou pourraient constituer un risque pour l’environnement ou la santé humaine (selon les critères établis dans l’article 64 de la LCPE)^{Note de bas de page 2} . La souche ATCC 74252 de Trichoderma reesei (T. reesei) a été ajoutée à la LI conformément au paragraphe 25(1) de la LCPE (1988) et à la LIS en vertu du paragraphe 105(1) de la LCPE (1999) parce qu’elle a été fabriquée ou importée au Canada entre le 1^er janvier 1984 et le 31 décembre 1986.

La présente évaluation préalable tient compte des renseignements sur les risques tirés du domaine public et des données de recherche non publiées des chercheurs d’Environnement et Changement climatique Canada^{Note de bas de page 3} , ainsi que des commentaires des pairs examinateurs scientifiques. Les données sur l’exposition proviennent du domaine public et des renseignements découlant de l’avis obligatoire relatif à l’article 71 de la LCPE publié le 3 octobre 2009 dans la Partie I de la Gazette du Canada. De plus amples précisions sur la méthode d’évaluation des risques utilisée sont accessibles dans le document intitulé « Cadre d’évaluation scientifique des risques liés aux micro‑organismes réglementés en vertu de la Loi canadienne sur la protection de l’environnement (1999) » (Environnement Canada et Santé Canada, 2011).

Dans le présent rapport, les données qui sont propres à la souche T. reesei ATCC 74252 inscrite sur la LI sont désignées comme telles. Lorsque les données sur la souche n’étaient pas disponibles, des données de substitution provenant de publications ont été utilisées. Dans la mesure du possible, on a effectué les recherches documentaires sur l’organisme à l’aide des synonymes, des noms communs, des noms périmés ainsi que Hypocrea jecorina. Le cas échéant, les organismes substitutifs ont été identifiés au niveau taxonomique fourni par la source. Les recherches documentaires ont été effectuées à l’aide de bases de données de publications scientifiques (SCOPUS, CAB Abstracts, Google Scholar et NCBI Pubmed), de recherches sur le Web et de termes‑clés de recherche afin de cerner les risques pour la santé humaine et l’environnement et les caractéristiques de l’exposition. Les données relevées jusqu’en mars 2016 ont été prises en compte dans la présente évaluation préalable.

2. Décisions d’autorités compétentes sur le plan national et international

2.1 Plan national

L’Agence de la santé publique du Canada (ASPC) a classé l’espèce T. reesei dans le groupe de risque 1 (risque faible pour l’individu et pour la collectivité), soit les organismes qui ne causent pas de maladie chez les humains et les animaux terrestres (communication personnelle, ASPC, 2014). T. reesei n’est considéré ni comme un agent pathogène des animaux aquatiques ni comme un agent phytoravageur réglementé au Canada par l’Agence canadienne d’inspection des aliments (ACIA) (communication personnelle, ACIA, 2014).

La liste des enzymes alimentaires autorisées de Santé Canada énonce les organismes sources autorisés (y compris T. longibrachiatum A83 [antérieurement désigné T. reesei A83] et T. longibrachiatum QM9414 [antérieurement désigné T. reesei QM9414]) desquels sont tirés des enzymes qui peuvent servir d’additifs alimentaires. Conformément à la partie B de l’article B.01.045 du Règlement sur les aliments et drogues, les additifs alimentaires doivent satisfaire les spécifications énoncées dans ce règlement, et lorsque des spécifications ne sont pas prévues dans la partie B, l’additif doit respecter les spécifications précisées dans l’édition la plus récente du Codex des produits chimiques alimentaires (CPCA). Dans le cas des enzymes alimentaires, les spécifications du CPCA propres aux préparations enzymatiques s’appliquent.

T. reesei figure dans la base de données d'ingrédients de produits de santé naturels ayant un rôle médicinal et classé comme produit de santé naturelle (PSN) relevant de l'annexe 1, article 1 (champignon) du Règlement sur les produits de santé naturels. T. reesei est également répertorié comme source de l'enzyme cellulase dans la monographie Cellulase de Santé Canada, ainsi que des enzymes bêta-glucanase, hémicellulose, pectinase et xylanases dans la monographie de Santé Canada sur les enzymes digestives (NHPID, 2016).

2.2 Plan international

Aux États‑Unis, l’Environmental Protection Agency (EPA) a mis en place un règlement sur les nouvelles utilisations importantes pris en vertu de la Toxic Substances Control Act (TSCA) visant notamment une souche génétiquement modifiée de T. reesei de laquelle sont issus des enzymes utilisées pour la production d’éthanol. Comme il est indiqué dans l’avis relatif à une activité commerciale d’origine microbienne J‑10‑0002, l’utilisation de la souche à cette fin ne devrait pas présenter de risques déraisonnables pour la santé humaine et l’environnement. Les conditions d’utilisation précisées dans l’avis sont celles d’un procédé industriel typique normalisé de fermentation standard en immersion, utilisé pour produire des enzymes conformément aux pratiques industrielles normalisées de confinement et d’inactivation. Ainsi, une nouvelle utilisation importante de ce règlement a été définie par l’EPA des États-Unis, soit toute utilisation d’un micro‑organisme autre que les utilisations en fermentation qui respecte toutes les conditions suivantes : fermentation en immersion en l’absence d’une matière végétale solide ou d’un substrat insoluble, et fermentation d’une matière végétale solide ou d’un substrat insoluble dans un bouillon de fermentation dont la fermentation n’est amorcée qu’après l’inactivation du micro‑organisme telle que décrite. Ces conditions sont imposées, car il a été démontré que les souches de T. reesei produisent la paracelsine, un peptaïbol qui est un métabolite toxique, lorsque ces souches sont utilisées pour produire des enzymes dans le cadre d’une fermentation de substrats végétaux solides ou de substrats insolubles (U.S. EPA, 2012a).

De même, l’EPA des États-Unis a déterminé que T. reesei QM 6a (la souche parent de T. reesei ATCC 74252) et ses dérivés répondent aux critères prescrits pour les micro‑organismes récepteurs exemptés de l’obligation d’une déclaration complète et des procédures de reddition de comptes en vertu de la TSCA pour ce qui est des nouveaux micro‑organismes fabriqués mis sur le marché. Cette décision se justifie par le fait que (la souche QM 6a) [traduction] « ne présentera pas de risques déraisonnables de préjudices pour la santé ou l’environnement ». Les conditions de cette exemption relèvent des conditions industrielles normalisées de fermentation en immersion : aucune matière végétale solide ni substrat insoluble dans le bouillon de fermentation, et le matériel génétique ajouté doit être [traduction] « bien caractérisé, de taille limitée, faiblement mobilisable et exempt de certaines séquences » (U.S. EPA, 2012b).

3. Évaluation des risques

3.1 Caractérisation de Trichoderma reesei

3.1.1 Identification taxonomique et historique de la souche

Nom scientifique : Trichoderma reesei

Désignation taxonomique :

Règne : Champignon

Embranchement : Ascomycètes

Classe : Sordariomycètes

Ordre : Hypocreales

Famille : Hypocreaceae

Genre : Trichoderma

Espèce : reesei

Souche inscrite à la LI : ATCC 74252 (équivalente à ATCC 74444)

3.1.1.1 Synonymes, noms communs et noms périmés

T. longibrachiatum Rifai a été proposé comme synonyme de T. reesei par Simmons (synthèse dans Kuhls et al. 1997; Bissett, 1984). T. reesei M2C38 est l’autre nom de l’ATCC 74252 (Environnement Canada, 2013).

La souche parent de T. reesei ATCC 74252, T. reesei QM 6a (ATCC 13631) a été déposée comme étant Trichoderma viride (ATCC 2014). Hypocrea jecorina est le téléomorphe de T. reesei (synthèse dans Kubicek et al., 2003).

3.1.1.2 Historique de la souche

La souche ATCC 74252 de T. reesei est une souche brevetée, est issue de T. reesei RUT‑C30 (ATCC 56765). Y compris la souche ATCC 74252 de T. reesei et T. reesei RUT‑C30, presque toutes les souches de T. reesei produisant de la cellulase dans le cadre d’un procédé industriel proviennent de la souche type T. reesei QM 6a (ATCC 13631) (Environnement Canada, 2013; Nevalainen et al., 1994). La souche ATCC 74252 a été déposée à l’origine comme un organisme exclusif auprès de l’American Type Culture Collection sous la désignation T. longibrachiatum Rifai, à la suite de son identification, par John Bissett, ministre de l’Agriculture, Ottawa, Ontario en 1994. En septembre 1997, la souche ATCC 74252 a été renommée T. reesei, car des données moléculaires substantielles indiquaient que T. longibrachiatum et T. reesei étaient des espèces distinctes. La souche ATCC 74252 a alors été déposée de nouveau auprès de l’American Type Culture Collection sous la désignation ATCC 74444 comme étant T. reesei, accompagnée d’un énoncé indiquant que les deux souches étaient les mêmes (EFSA, 2012). Aux fins du présent rapport d’évaluation préalable, la souche ATCC 74252 de Trichoderma reesei sera dorénavant désignée par le nom suivant, lequel comprend le numéro de la souche qui a été déposée auprès de l’ATCC à l’origine : la souche ATCC 74252 de T. reesei.

T. reesei QM 6a, la souche parent de la souche ATCC 74252 de T. reesei, a été à l’origine isolée à partir d’une toile de coton trouvée sur l’île de Bougainville, dans les îles Salomon, au cours de la Deuxième Guerre mondiale (ATCC, 2014; Kuhls et al., 1996; Reese, 1976).

3.1.2 Caractéristiques phénotypiques et moléculaires

3.1.2.1 Morphologie

Les renseignements fournis par le proposant indiquent que la souche ATCC 74252 de T. reesei forme des colonies très minces d’une couleur vert pâle après quatre jours de croissance sur une gélose nutritive. la souche ATCC 74252 de T. reesei présente la même morphologie, prolifération et sporulation sur gélose dextrosée à la pomme de terre (GDP) que T. reesei RUT‑C30, ainsi que des hyphes à la structure identique.

Il existe un degré élevé de similarité morphologique entre T. reesei et les espèces de Trichoderma apparentées. T. reesei a été décrite la première fois comme étant une espèce distincte du clade des longibrachiatum de Trichoderma par examen morphologique (Simmons, 1977, cité dans Bissett, 1984). On peut différencier T. reesei de T. longibrachiatum et T. pseudokoningii par ses grandes conidies et sa croissance plus lente sur gélose nutritive spéciale (Samuels et al., 1994).

T. reesei fait maintenant partie du même clade phylogénétique que T. parareesei et T. gracile (Druzhinina et al., 2012, cité dans Samuels et al., 2012). La courbe de croissance de T. reesei, de T. parareesei et de T. gracile est le même entre 25 et 35 ^oC et à 35 ^oC sur gélose dextrosée à la pomme de terre. Toutefois, T. reesei produit moins de conidies sur ce type de gélose et sur gélose nutritive synthétique (GNS) (Samuels et al., 2012).

3.1.2.2 Utilisation du substrat

Il est possible de distinguer les espèces de Trichoderma selon leur utilisation du substrat. Le profil d’utilisation des nutriments de 96 sources de carbone peut servir à identifier les espèces de Trichoderma (Bochner et al., 2001; Kubicek et al., 2003). Par exemple, la gentiobiose et la salacine sont des sources de carbone utilisées par deux souches de H. jecorina (AF486007 et TUB F‑1034), mais pas par les autres espèces de Trichoderma examinées (Kubicek et al., 2003). Par ailleurs, la croissance en présence de saccharose peut permettre de différencier les espèces de Trichoderma (Kubicek et al., 2003). À l’origine, d’après le comportement de la souche QM 6a, M. Simmons croyait que l’incapacité à utiliser le saccharose ou le nitrate était un facteur permettant de distinguer T. reesei (Simmons, 1977, cité dans Lieckfeldt et al., 2000). Cependant, à mesure que des souches de T. reesei capables de croître en présence de saccharose et de nitrate comme seules sources de carbone et d’azote ont été découvertes, on a constaté que cette incapacité à utiliser le saccharose et le nitrate est une caractéristique propre à la souche QM 6a (Lieckfeldt et al., 2000). L’utilisation de certains substrats par la souche QM 6a de T. reesei et T. longibrachiatum est présentée au tableau 1‑1.

(-) : Absence d’une croissance ou d’une utilisation détectable, (+) : Présence d’une croissance ou d’une utilisation détectable, ND : Non déterminé

T. reesei RUT‑C30 croît moins bien en présence d’oligosaccharides et de polysaccharides formant des réseaux comme la dextrine, l’amidon et le maltose. Les renseignements fournis par le proposant indiquent que la souche ATCC 74252 de T. reesei se comporte comme T. reesei QM 6a pour ce qui est de son incapacité à utiliser le saccharose, le nitrate et le nitrite, comme substrats de croissance.

3.1.2.3 Techniques moléculaires

T. reesei et T. longibrachiatum peuvent être différenciées à l’aide d’un éventail de techniques moléculaires : typage génétique (Meyer et al., 1992), hybridation de l’ADN du gène cbh2 (Morawetz et al., 1992), comparaison de régions codantes et de régions flanquantes du gène de l’endoglucanase l (Gonzalez et al., 1992, cité dans Nevalainen et al., 1994) et analyse de la séquence des espaceurs internes  transcrits 1 (ITS1) et 2 (ITS2) de l’ARN ribosomique (Kuhls et al., 1996, cité dans Kuhls et al., 1997). Les études moléculaires faisant appel à ces techniques et les profils morphométriques et des isoenzymes publiés par Samuels et al. (1994) ont permis de conclure que T. reesei et T. longibrachiatum doivent être considérées comme étant des espèces distinctes (Kuhls et al., 1996, cité dans Kuhls et al., 1997).

À l’aide de la technique du polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP) faisant appel à des sondes d’oligonucléotides, on a relevé une homologie d’environ 25 % entre T. reesei de T. longibrachiatum (Meyer et al., 1992). Toutefois, T. reesei et T. longibrachiatum présentent les différences suivantes dans les premiers introns du gène de leur endoglucanase I (egl I) : 123 paires de base (pb) pour T. longibrachiatum contre 70 pb pour T. reesei, et insertion de 50 pb dans la séquence consensus signalant un site d’épissage de T. longibrachiatum (séquence conservée à 80 % chez T. reesei) (Gonzalez et al., 1992). L’analyse des régions ITS1 et ITS2 a révélé une différence de séquence sur 6 pb (2,6 %) entre la région ITS1 de T. reesei et celle de T. longibrachiatum (à l’intérieur de la fourchette de variabilité des séquences interespèces de T. longibrachiatum pour les espèces anamorphes) (Kuhls et al., 1996, cité dans Kuhls et al., 1997).

Des données moléculaires prouvent aussi que T. reesei est la forme anamorphe du champignon H. jecorina (Kubicek et al., 2008; Kuhls et al., 1996). Les séquences des ITS de l’ARN ribosomique de T. reesei et de H. jecorina sont identiques. Par PCR et typage génétique, on a montré que la variation interspécifique entre les deux espèces est équivalente à la variation intraespèces de H. jecorina, ce qui laisse croire qu’il s’agit du même organisme, sous forme anamorphe ou téléomorphe, qui se distingue uniquement par le mode de reproduction et certaines caractéristiques phénotypiques mineures (Kuhls et al., 1996).

TrichOKEY2.0, un outil d’identification par technique moléculaire, est offert en ligne pour permettre d’identifier rapidement les espèces d’Hypocrea et de Trichoderma à l’aide d’une combinaison de plusieurs oligonucléotides des séquences de l’ITS1 et de l’ITS2 de l’ARN ribosomique (International Subcommission on Trichoderma and Hypocrea Taxonomy). Le génome de T. reesei a été séquencé (Martinez et al., 2008, cité dans Samuels et al., 2012).

3.1.2 Propriétés biologiques et écologiques

Le nom T. reesei plutôt que H. jecorina a été accepté pour ce champignon, qui peut être sous forme anamorphe ou téléomorphe (Bissett et al., 2015). C’est pourquoi dans la présente évaluation préliminaire, on a utilisé les données des publications sur la forme tant anamorphe que téléomorphe, au besoin, pour caractériser la souche ATCC 74252 de T. reesei.

3.1.2.1 Cycle de vie

Le cycle de vie de T. reesei est typique de celui des Ascomycètes. T. reesei est la forme anamorphe, soit le stade de reproduction asexué, tandis que H. jecorina est la forme téléomorphe ou stade de reproduction sexué de l’espèce (Kuhls et al., 1996). La reproduction asexuée se caractérise par la production des spores végétatives que sont les conidies (Nevalainen et al., 1994). L’espèce produit des conidies entre 20 et 30 ^oC sur gélose nutritive synthétique et sur gélose dextrosée à la pomme de terre, mais sa reproduction est faible à une température supérieure à 35 ^oC (Samuels et al., 1998). La transcription des gènes de la cellulase et de l’hémicellulase de T. reesei est induite par la formation de conidies, ce qui augmente la vitesse de germination lorsqu’une source de carbone à base de cellulose ou d’hémicellulose est disponible (Metz et al., 2011).

T. reesei est une espèce hétérothallique, ainsi que la souche industrielle T. reesei QM 6a possédant le locus lié à la reproduction MAT1‑2 (Seidl et al., 2009). Au cours d’expériences sur la reproduction menées avec des isolats de T. reesei QM 6a et de H. jecorina possédant le locus MAT1‑1, des fructifications sexuées (stroma) dotées de périthèces enchâssés à la surface se sont formées à l’interface du mycélium de chacun des deux isolats – des spores sexuées (ascospores) ont aussi été observées à l’intérieur des périthèces (Seidl et al., 2009; Samuels et al., 1994).

3.1.2.2 Répartition naturelle

Les espèces de Trichoderma sont des « Ascomycètes à spores vertes se propageant dans le sol » généralement présentes sur la matière végétale en décomposition (Schuster et Schmoll, 2010). Les espèces du genre Trichoderma sont présentes dans le sol sous tous les climats. Les espèces typiques de ce genre sont des décomposeurs de la matière végétale et présentent une croissance rapide typique ainsi que la capacité à utiliser un large éventail de substrats (Hoyos-Carvajal et al., 2009).

Il est rare d’isoler la forme anamorphe sans la forme téléomorphe, H. jecorina (Kubicek et al., 2003). T. reesei semble occuper une niche écologique étroite, compte tenu de son efficacité limitée à produire des conidies, de la capacité à métaboliser une faible diversité de sources de carbone des souches et de sa présence rare dans la nature (Druzhinina et al., 2010). La matière végétale ligneuse était présente dans tous les endroits où Samuels et al. ont prélevé des échantillons de H. jecorina (Samuels et al., 1998).

H. jecorina est généralement considérée comme un organisme pantropical et sa présence se limite à la zone définie par une latitude de 20^o de part et d’autre de l’équateur (Samuels et al., 1998). Des souches de H. jecorina (ou les échantillons) ont été isolées d’échantillons prélevés dans les régions suivantes :

• Amérique centrale et Amérique du Sud équatoriale :
  • Serra Araca (Amazone, Brésil)
  • Île Combu (Belém, Para, Brésil)
  • Sierra de la Neblina (Amazone, Vénézuela)
  • Municipalité de Marino (Sucre, Venezuela)
  • Parc international Amistad (Puntarenas, Costa Rica)
  • diverses régions de la Guinée française
• Océanie :
  • Parc national de l’Est Dumoga‑Bone (Sulawesi du Nord, Indonésie)
  • diverses régions de la province du Nord de Nouvelle‑Calédonie
  • Membakut du Bornéo du Nord britannique (Samuels et al., 1998)

Dans ces zones géographiques, H. jecorina a été abondamment isolé à partir de végétaux, notamment l’écorce et le bois sans écorce d’arbres dicotylédones, mais rarement sur les palmiers, ainsi que de cacaoyers atteints de la maladie du balai de sorcière au Brésil (Lieckfeldt et al., 2000; Samuels et al., 1998).

H. jecorina a aussi été isolé en milieu aquatique à partir des milieux suivants :

• argile de mer des côtes du Lianyungang, Jiangsu, Chine (Sun et al., 2006; méthodes d’identification non révélées),
• sol d’un lac réservoir en Guinée française (Lieckfeldt et al., 2000).

T. reesei ne persiste ni ne croît en Europe (Atanasova et al., 2010, cité dans Kredics et al., 2014). Jusqu’à maintenant,  la région la plus au nord où on a prélevé un échantillon de la forme anamorphe de T. reesei dans était à Chitan, à Taïwan (Kubicek et al., 2003).

3.1.2.3 Conditions de croissance

T. reesei est un organisme aérobie obligatoire (Breakspear et Momany, 2007). L’ATCC (ATCC, 2014) recommande de mettre T. reesei en culture sur une gélose dextrosée à la pomme de terre, une gélose de Sabouraud modifiée (Emmons) ou une gélose ou un bouillon destinés à la culture des levures ou des moisissures. La température de croissance optimale de toutes les espèces de Trichoderma est entre 25 et 30 ^oC (synthèse dans Gams et Bissett, 1998). T. reesei peut proliférer dans une vaste gamme de pH (2,5 à 9) (Adav et al., 2011). Toutes les souches de T. reesei dérivées de la souche QM 6a peuvent croître dans un milieu inorganique enrichi uniquement d’une source de carbone organique. Aucune vitamine, aucun acide aminé ni autre facteur de croissance n’est nécessaire (Sternberg, 1976).

D’après les renseignements fournis par le proposant, la souche ATCC 74252 de T. reesei croît bien sur GDP à pH 5,5, à une température située entre 28 et 30 ^oC et sans lumière. T. reesei produit des spores qui forment un réseau de mycélium, qui, au bout de six à sept jours, produit des spores vertes.

3.1.2.4 Survie, persistance et dispersion dans l’environnement

On a étudié la survie de l’organisme pendant six mois en utilisant un dérivé de la souche QM 6a (QM 6a#4, marquée à l’aide d’un gène de résistance à l’hygromycine‑B recombinant) qui a été incubé dans une chambre de croissance contenant un sol intact, tenant lieu de microcosme confiné dans un laboratoire (Providenti et al., 2004). Différents types de sol (loam sableux à loam argileux) et les effets de la rhizosphère ont été mis à l’essai, et après quatre mois, des carottes de sol ont été prélevées et soumises à une simulation d’hivernage pendant deux semaines à 4 ^oC, suivi de trois semaines à -20 ^oC et de deux semaines à 4 ^oC.

Des résultats des études en microcosme de sol ont donné les résultats suivants :

• Les populations de T. reesei dans tous les sols ont diminué au cours des quatre mois, mais la souche QM 6a#4 était toujours présente. L’ADN inactivé au préalable de la souche T. reesei QM 6a#4 n’a pas été détecté par PCR après trois jours d’incubation.
• La souche QM 6a#4 est demeurée viable après l’hivernage.
• Dans le sol de la rhizosphère, on a constaté trois fois plus de champignons de la souche QM 6a#4 après le dégel (probablement en raison de la libération des nutriments provenant des racines mortes), ce qui indique une prolifération de T. reesei.

Ces résultats laissent penser que T. reesei est rarement isolée dans les zones tempérées, mais il est possible que des populations introduites puissent survivre et hiverner au Canada (Providenti et al., 2004). T. reesei a aussi été décelée dans des échantillons d’air prélevés en Europe, endroit où on n’a jamais observé sa croissance, ce qui indique une possible dispersion des spores sur une longue distance. Cependant, il se peut que les spores n’entrent pas en croissance végétative si les conditions sont sous‑optimales (Atanasova et al., 2010, cité dans Kredics et al., 2014).

3.1.2.5 Résistance aux agents antifongiques

La plupart des espèces de Trichoderma sont sensibles aux agents antifongiques suivants : amphotéricine B, fluconazole, itraconazole, kétoconazole et miconazole (Kredics et al., 2003). D’après les publications sur les espèces de Trichoderma pathogènes, le traitement d’infections graves à Trichoderma peut, dans certains cas, nécessiter une combinaison de traitements, par exemple un traitement antifongique en association avec une chirurgie éliminant la source de l’infection et le traitement de toute maladie sous‑jacente qui pourrait avoir prédisposé le patient à l’infection (Furukawa et al., 1998; Gautheret et al., 1995; Munoz et al., 1997; Richter et al., 1999).

Aucune publication ne fait état d’une sensibilité de T. reesei à des agents antifongiques; toutefois, on a signalé une sensibilité de T. longibrachiatum à certains d’entre eux. Comme ces deux espèces sont étroitement apparentées, les données sur la sensibilité de T. longibrachiatum aux agents antifongiques ont été ajoutées à des fins de référence au tableau A-1 de l’annexe A. Le proposant a montré que T. reesei ATCC 74252 est résistante au 5‑flucytosine et à l’itraconazole, mais est sensible à la caspofungine et au voriconazole. Comme la souche ATCC 74252 de T. reesei, T. longibrachiatum est résistante à la 5‑flucytosine et est sensible à la caspofungine et au voriconazole. Le profil de sensibilité de T. longibrachiatum à l’itraconazole est fonction de la souche.

3.1.2.6 Propriétés pathogènes et toxicogènes

On en connaît peu sur la virulence de T. reesei ou des espèces du genre Trichoderma. Certaines espèces comme T. citrinoviride, T. harzianum, T. koningii, T. viride et T. longibrachiatum sont connues pour être des agents étiologiques de quelques infections contractées par des patients ayant un système immunitaire affaibli (Kredics et al., 2003).

T. longibrachiatum, qui est étroitement apparentée à T. reesei, présente les facteurs de virulence potentiels suivants :

• La capacité à croître à des températures pouvant aller jusqu’à 40 oC et dans une vaste gamme de pH (2 à 9), ce qui le rend capable de survivre dans un hôte (Antal et al., 2005). Ce sont des traits également partagés par T. reesei et d’autres espèces du clade des longibrachiatum (Richter et al., 1999)
• La capacité à métaboliser des acides aminés basiques (L‑asparagine, acide aspartique, glutamine, acide glutamique, ornithine) en tant que sources de carbone et d’azote (Antal et al., 2005)
• Une cytotoxicité, comme l’indique des composés produits par des isolats cliniques de T. longibrachiatum UAMH 9515, ATCC 208859 et CM‑382 dosés à l’aide de l’épreuve sur l’immobilisation des spermatozoïdes de porc (Antal et al., 2005)

3.1.2.7 Enzymes produites

Les cellulases produites par les espèces de Trichoderma sont utilisées depuis longtemps dans la production d’aliments (Sukumaran et al., 2005). Bon nombre d’enzymes fabriquées par T. reesei sont « généralement reconnues comme étant sans danger » (GRAS) par la Food and Drug Administration (FDA) des États‑Unis pour être utilisées comme ingrédients dans les aliments (U.S. FDA, 2014a; U.S. FDA, 2014b; U.S. FDA, 2014c; U.S. FDA, 2014d; U.S. FDA, 2014e; U.S. FDA, 2014f; U.S. FDA, 2014g). T. reesei produit trois types d’enzymes qui dégradent ensemble la cellulose pour la transformer en glucose : β‑glucosidases, exo‑β‑1,4 glucanases et endo‑β‑1,4‑glucanases (Bissett, 1979).

T. reesei produit aussi des xylanases, qui dégradent uniquement les xylanes (hémicelluloses ayant des unités xylopyranose liées par des liaisons β‑1,4 et qui sont communes à toutes les plantes annuelles) (Tenkanen et al., 1992). Cependant, son génome ne comporte pas de gènes codant les lignases essentielles pour amorcer la digestion des végétaux (Maheshwari, 2008). Ce déficit peut limiter sa capacité à agir comme phytopathogène. T. reesei produit aussi des enzymes lignocellulolytiques, mais la lignine agit comme une barrière empêchant l’action des enzymes lignocellulolytiques chez les plantes (Dashtban et al., 2009). L’endochitinase fabriquée par T. reesei lyse les hyphes du champignon phytopathogène Ganoderma philipii (Harjono et Widyastuti, 2001).

Les protéases apparentées à la chymoélastase, à la trypsine et à la chymotrypsine sont des facteurs de virulence présumés de T. longibrachiatum (Kredics et al., 2004). Les protéases décelées chez T. reesei sont les suivantes :

• Protéase à sérine apparentée à la trypsine (Dienes et al., 2007)
• Endopeptidase dibasique (Goller et al., 1998)
• Protéases extracellulaires insensibles à la pepstatine et protéases à aspartate sensible au N‑chlorosuccinimide de T. reesei QM 9414 (Haab et al., 1990)
• Protéase à aspartate extracellulaire sensible à la pepstatine de T. reesei D38 (Eneyskaya et al., 1999)

3.1.2.8 Métabolites secondaires et mycotoxines :

T. reesei, à l’instar d’autres espèces de Trichoderma, produit des métabolites appelés peptaïbols, que l’on désigne aussi par le terme peptaïbiotiques (Bruckner et Graf, 1983). Les peptaïbols forment une famille de polypeptides amphipathiques produits par des champignons du sol, qui contiennent l’acide aminé α‑aminoisobutyrique et un acide aminé ayant une extrémité C‑terminale hydroxylée (Chugh et Wallace, 2001). T. reesei QM 6a, la souche parent de la souche ATCC 74252, et une souche dérivée, soit la souche QM 9414, produisent le peptaïbol appelé paracelsine (Solfrizzo et al., 1994). Ces deux souches produisent également d’autres types de peptaïbols (Degenkolb et al., 2012; Neuhof et al., 2007).

Les conditions de croissance dans lesquelles T. reesei produit des peptaïbols ou des peptaïbiotiques ne sont pas bien connues. La formation de conidies et les facteurs favorisant cette formation ont été associés à la production de peptaïbols chez de nombreuses espèces de Trichoderma. Parmi ces facteurs, citons la croissance en présence de lumière, la croissance en présence de matières insolubles, la croissance sur substrat solide, l’absence de nutriments, les lésions d’origine mécanique et la mise en culture sur de longues périodes (Degenkolb et al., 2012; Komon-Zelazowska et al., 2007; Röhrich et al., 2014; Solfrizzo et al., 1994). Les espèces de Trichoderma produisent des peptaïbols lorsqu’elles sont mises en culture à la surface d’un substrat solide (Berg et al., 2003; Landreau et al., 2002; Rebuffat et al., 1991; Wiest et al., 2002). La production de peptaïbols est possible en immersion, mais dans des conditions particulières qui comprennent généralement le recours à un milieu complexe. Le fait de modifier le milieu de fermentation ou les conditions de fermentation (comme le pH, la température, la durée, la quantité d’oxygène et la présence ou l’absence de matières insolubles) pourrait avoir une incidence sur la production de peptaïbiotiques (Brewer et al., 1987).

Les conditions de fermentation en immersion normalisées par l’industrie en absence de matières végétales solides ou d’un substrat insoluble dans le bouillon de fermentation ne sont pas associées à la production de paracelsine (synthèse dans U.S. EPA, 2012b). Dans l'industrie, les fermentations normalisées ont généralement lieu dans un milieu simple en l’absence de lumière, des conditions qui ne sont pas censées induire la production de paracelsine et d’autres peptaïbols. On n’a recensé aucune donnée dans les publications scientifiques sur la stabilité de la paracelsine et d’autres peptaïbols dans l’environnement.

Les peptaïbols peuvent s’associer aux canaux ioniques dans les membranes plasmiques, avoir une activité antibiotique (Chugh et Wallace, 2001) et contribuer au mycoparasitisme des espèces de Trichoderma (Röhrich et al., 2014). Il a été établi que les peptaïbols de T. longibrachiatum perturbent l’embryogenèse des huîtres à des concentrations nanomolaires (Poirier et al., 2007b). La paracelsine de T. reesei QM 9414 a une activité antibactérienne contre Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Streptococcus lactis et Streptococcus thermophiles (Bruckner et Graf, 1983) et inhibe Phoma destructiva (Grigoriev et al., 2003). Les effets toxiques de la paracelsine sont résumés au tableau 1‑2. Comme l’un des essais de toxicité a été réalisé avec un extrait de culture et non la paracelsine seule, les auteurs ont conclu que la paracelsine pourrait avoir une certaine toxicité, mais les effets des autres constituants de l’extrait ne peuvent pas être exclus.

^a Induction d’une hémolyse à la CL₅₀, ce qui indique une toxicité pour les cellules de mammifères
^b Exposition à la paracelsine A, un analogue de la paracelsine
^c Induction d’une hypothermie accompagnée d’une diminution spontanée de l’activité motrice après une seule administration intrapéritonéale
^d Exposition à un extrait de culture de T. reesei
^e Exposition à un mélange commercial d’homologues de la paracelsine (pureté de 88,4 %)

3.1.3 Effets

3.1.3.1 Environnement

Malgré une utilisation de longue date des souches de T. reesei en production industrielle à grande échelle, aucune infection naturelle ni aucun effet toxique n’ont été signalés chez les végétaux, les vertébrés ou les intervertébrés dans l’environnement. Certains effets nocifs ont été signalés dans un cadre expérimental, comme il est indiqué plus loin.

3.1.3.1.1 Microbiote

Les espèces de Trichoderma sont des mycoparasites efficaces, des antagonistes et des agents servant à la lutte biologique. L’antibiose, la lyse, la compétition, le mycoparasitisme, l’induction de la croissance végétale (Baker, 1988; Chet, 1987; Henis, 1984; Lynch, 1990; Papavizas, 1985) ainsi que la sécrétion de métabolites figurent parmi les mécanismes proposés de lutte biologique et d’inhibition des agents phytopathogènes du sol. Les métabolites sécrétés par les espèces de Trichoderma agissent comme fongicides biologiques et peuvent tuer les champignons pathogènes (Navazio et al., 2007; Spiegel et Chet, 1998; Vinale et al., 2006; Vinale et al., 2009). Plus précisément, les peptaïbols ont une activité antibiotique et contribuent au mycoparasitisme des espèces de Trichoderma (Chugh et Wallace, 2001; Röhrich et al., 2014). La paracelsine a un effet inhibiteur (Grigoriev et al., 2003) et antibactérien (Bruckner et Graf, 1983) contre certaines espèces de micro‑organismes.

Les cellulases produites par T. reesei inhibent fortement les infections causées par le virus de la marbrure bénigne du piment chez les plantes (Oka et al., 2008). T. reesei s’est avérée avoir un effet antagoniste efficace contre les phytopathogènes Rhizoctonia solani (Grosch et al., 2006) et Bipolaris oryzae, qui causent l’helminthosporiose du riz (Harish et al., 2008). T. reesei est capable de parasiter Pythium ultimum, un phytopathogène agressif du sol (do Nascimento Silva et al., 2009; Harish et al., 2008).

3.1.3.1.2 Plantes aquatiques

Dans les publications scientifiques, aucun effet nocif de T. reesei n’a été signalé chez les plantes aquatiques.

3.1.3.1.3 Plantes terrestres

Les espèces de Trichoderma augmentent la résistance systémique des plantes (Shoresh et al., 2010; Yedidia et al., 1999) et peuvent aussi avoir des effets bénéfiques sur la croissance végétale en favorisant la croissance des racines et en protégeant la plante contre les substances chimiques toxiques (Harman, 2000).

Il est peu probable que T. reesei soit un agent pathogène des plantes vivantes, car son génome ne contient pas les gènes nécessaires pour la production de lignases (essentielles pour une première digestion des végétaux) (Maheshwari, 2008).

Des scientifiques d’Environnement Canada ont mené des études de pathogénicité et de toxicité avec le trèfle des prés (Trifolium pratense) exposé à la souche ATCC 74252 de T. reesei dans un sol naturel (prélevé sur le terrain) ou artificiel à la concentration de 1,2 x 10⁶ unités formatrices de colonies (UFC) de T. reesei par gramme de sol. Le trèfle a été cultivé à partir de semences pendant 14 jours. Aucun effet important de T. reesei n’a été observé sur la longueur ou la masse des pousses ou la longueur des racines. Toutefois, les plantes présentaient une masse considérablement plus élevée des racines par rapport aux plantes témoins, ce qui indique un effet bénéfique possible de T. reesei envers les racines de cette plante^{Note de bas de page 4} . On ignore si la paracelsine et d’autres peptaïbols sont produits dans les conditions utilisées au cours de ces expériences.

3.1.3.1.4 Vertébrés aquatiques

Aucun effet nocif de T. reesei chez les vertébrés aquatiques n’a été recensé dans les publications scientifiques.

3.1.3.1.5 Vertébrés terrestres

À la suite de recherches poussées dans les publications scientifiques, on n’a relevé aucun cas d’infection par T. reesei chez les vertébrés terrestres dans les conditions naturelles. Dans les conditions expérimentales, T. reesei peut avoir des effets nocifs chez les animaux ayant un système immunitaire affaibli, notamment les souris, les cochons d’Inde et les lapins. Cependant, le décès de certains animaux d’expérience n’a été observé qu’après l’administration intraveineuse de doses massives de provocation (1,0 x 10⁵ spores viables et 1,0 x 10⁷ spores viables ou tuées) (Hjortkjaer et al., 1986). D’autres données sur les études de pathogénicité chez les animaux réalisées avec T. reesei sont fournies à la section 1.1.3.2 sur la santé humaine.

La paracelsine produite par T. reesei est mortelle pour les souris à la dose de 5 mg/kg administrée par injection intrapéritonéale (ip), et la paracelsine A (un analogue de la paracelsine) est toxique pour ces animaux à la dose de 20 mg/kg administrée par injection ip (Bruckner et al., 1984; Grigoriev et al., 2003) (tableau 1‑2). On a aussi observé que la paracelsine est toxique pour les cellules de mammifères, à la CL₅₀ de 71,08 µg/mL et 34,88 µg/mL pour les érythrocytes humains et les cellules PC12, respectivement (Bruckner et al., 1984; Raya et al., 1993) (tableau 1‑2). Toutefois, l’injection ip n’est pas un mode d’exposition qui s’applique dans l’environnement comparativement à l’ingestion par voie orale, qui est l’exposition la plus probable chez les vertébrés terrestres. Ce mode d’exposition est particulièrement important, car les peptaïbols sont extrêmement résistants au clivage protéolytique et ne peuvent pas traverser la paroi intestinale pour atteindre la circulation sanguine (Degenkolb et al., 2008). Ce mode d’exposition ne peut permettre de prédire les effets de la paracelsine à la suite d’une ingestion par des vertébrés terrestres.

3.1.3.1.6 Invertébrés aquatiques

Les peptaïbols et les espèces de Trichoderma productrices de peptaïbols isolés dans une région où on pratique la conchyliculture en France étaient fortement toxiques pour les larves de moules (Poirier et al., 2007a), dans le premier compte rendu d’un isolement de peptaïbols provenant d’espèces de Trichoderma présentes dans la nature.

La paracelsine produite par T. reesei pourrait être toxique pour la crevette des salines (Artemia salina) et la puce d’eau (Daphnia magna), comme il a été déterminé lors d’essais de toxicité. Chez A. salina, la CL₅₀ de la paracelsine est de 4 µg/mL pour la larve et la CL₅₀ d’un mélange commercial d’homologues de la paracelsine est de 40,84 µg/mL et de 18,56 µg/mL pour une exposition de 24 heures et de 36 heures, respectivement, pour l’adulte (Favilla et al., 2006; Solfrizzo et al., 1994) (tableau 1‑2). Chez D. magna, la CL₅₀ d’un mélange commercial d’homologues de la paracelsine est de 14,79 µg/mL pour une exposition de 24 heures et de 10,76 µg/mL pour une exposition de 36 heures (Favilla et al., 2006) (tableau 1‑2).

3.1.3.1.7 Invertébrés terrestres

Chez les invertébrés terrestres, aucun effet nocif de T. reesei n’a été signalé dans les publications scientifiques.

Des scientifiques d’Environnement Canada ont mené des études de pathogénicité et de toxicité avec le collembole (Folsomia candida) et le lombric (Eisenia andrei) exposés à la souche ATCC 74252 de T. reesei. Les essais sur F. candida ont été réalisés sur une période de 28 jours dans un sol naturel (1,1 x 10⁶ UFC de T. reesei par gramme de sol) et un sol artificiel (1,4 x 10⁶ UFC de T. reesei par gramme de sol). L’ajout de T. reesei ATCC 74252 n’a eu aucun effet considérable sur la survie de Folsomia candida adulte ou sur la reproduction de l’espèce. Les essais sur Eisenia andrei ont été effectués sur une période de 56 jours dans un sol artificiel à la concentration de 1,2 x 10⁶ cellules de T. reesei par gramme de sol. L’ajout de la souche ATCC 74252 de T. reesei n’a eu aucun effet important ni sur la reproduction d’Eisenia andrei ni sur la masse individuelle des juvéniles produits[2]. On ignore si la paracelsine et d’autres peptaïbols ont été produits dans les conditions utilisées au cours de ces expériences.

3.1.3.2 Santé humaine

Des recherches approfondies dans la littérature scientifique ont révélé que T. reesei n’est pas un agent anthropopathogène connu. Malgré son utilisation de longue date, T. reesei n’a jamais été l’objet d’une déclaration de cas (Degenkolb et al., 2015).

Certaines espèces du genre Trichoderma, soit T. citrinoviride, T. pseudokoningii, T. harzianum, T. koningii, T. viride et T. longibrachiatum se sont révélées être des agents étiologiques dans quelques rapports de cas portant sur une infection chez des patients immunodéprimés (Kredics et al., 2003, cité dans Schuster et Schmoll, 2010). Parmi toutes les espèces deTrichoderma, T. longibrachiatum et H. orientalis sont les isolats les plus fréquents en milieu clinique (Schuster et Schmoll, 2010). On a aussi signalé que T. viride cause des problèmes respiratoires chez l’humain en raison de la production de composés organiques volatils (Larsen et al., 1998). Les cas d’infection à T. longibrachiatum déclarés entre 1980 et 2013 sont résumés à l’annexe B. Un sommaire des infections par Trichoderma chez l’humain est présenté à l’annexe C. La plupart des infections à Trichoderma déclarées ont été contractées par des personnes présentant des facteurs de risque sous‑jacents, comme une neutropénie grave prolongée, l’administration d’agents antimicrobiens à large spectre, un traitement aux stéroïdes, une lésion des muqueuses et la transplantation d’organe (Alanio et al., 2008; Furukawa et al., 1998; Katta et al., 2005; Kredics et al., 2003; Kuhls et al., 1999; Richter et al., 1999). On peut traiter avec succès les infections à Trichoderma au moyen d’agents antifongiques classiques (Espinel-Ingroff et al., 2008; Kratzer et al., 2006). Genencor a mené une étude de pathogénicité pour le compte de la FDA aux États‑Unis avec la souche A83 de T. reesei, laquelle a été administrée à des rats. Une dose ip de 2,2 x 10⁷ UFC a été injectée à des rats Sprague Dawley. Aucun décès n’est survenu, et on n’a noté aucun signe d’effets nocifs dans les cages et à la nécropsie (Genencor, 2007). Toutefois, dans les rapports d’expériences de provocation, T. reesei a agi comme un agent pathogène (Hjortkjaer et al., 1986; Nevalainen et al., 1994).

Des études de pathogénicité ont été effectuées par Hjortkjaer et al. (1986) sur des souris, des cobayes et des lapins immunodéprimés recevant de la cortisone, et auxquels on a inoculé par voie intraveineuse (IV) ou intrapéritonéale (IP) 1,0 x 10⁵ ou 1,0 x 10⁷ spores de T. reesei (viables ou inactivées). Les décès chez la souris sont survenus à la dose IV de 1,0 x 10⁷ spores viables ou inactivées. Chez les lapins, on a constaté des décès à la dose de 1,0 x 10⁵ ou 1,0 x 10⁷ spores viables administrées par voie IV. Cependant, deux de ces décès ont été attribués à une maladie spontanée non liée à la provocation. Aucun effet n’a été relevé dans les groupes ayant reçu 10⁵ spores viables par voie IP. À la suite de la provocation avec T. reesei, on a noté des lésions chez les trois espèces étudiées :

• Chez la souris, tous les groupes soumis à la provocation ont développé des lésions dans le foie, les reins et les poumons, et des abcès abdominaux ont été observés chez tous les groupes ayant reçu une administration IP.
• Chez le lapin, on a noté une bronchopneumonie chronique et des lésions rénales chroniques dans les groupes ayant reçu des spores viables par voie IV, et des abcès péritonéaux chez tous les animaux ayant reçu 1,0 x 10⁷ spores viables par voie IP et chez certains animaux ayant reçu 1,0 x 10⁷ spores inactivées par voie IP.
• Chez le cobaye, tous les groupes soumis à la provocation ont développé une pneumonie interstitielle, et quatre animaux ayant reçu par voie IV 1,0 x 10⁵ ou 1,0 x 10⁷ spores viables ont développé des nécroses au foie.

Pour toutes les espèces, on a réussi à isoler T. reesei dans divers organes jusqu’à 40 jours après l’administration de 1,0 x 10⁵ ou 1,0 x 10⁷ spores viables par voie IV ou 1,0 x 10⁷ spores viables par voie IP. Il est à noter que toutes les souris ayant reçu une dose de spores vivants par voie IV présentaient une prolifération fongique dans les cinq organes dans lesquels on a prélevé des échantillons. L’examen microscopique a révélé des hyphes de T. reesei chez un lapin, des spores chez deux souris et des hyphes munies de spores chez une troisième souris, tous ces animaux ayant reçu 1,0 x 10⁷ spores viables par voie IV. Par conséquent, T. reesei peut causer des effets nocifs et une infection chez les animaux immunodéprimés, mais ces effets n’apparaissent que lorsque de grandes quantités d’inoculum sont administrées (Hjortkjaer et al., 1986).

La toxicité et l’immunogénicité des enzymes et des métabolites produits par T. reesei peuvent avoir des conséquences sur la santé humaine. La paracelsine produite par T. reesei est mortelle pour la souris à la dose de 5 mg/kg administrée par injection ip, et la paracelsine A (un analogue de la paracelsine) est toxique pour la souris à la dose de 20 mg/kg administrée aussi par injection ip (Bruckner et al., 1984; Grigoriev et al., 2003) (tableau 1‑2). Dans le cas des cellules de mammifères, on a aussi observé une toxicité de la paracelsine à la CL₅₀ de 71,08 µg/mL et de 34,88 µg/mL pour des érythrocytes humains et les cellules PC12, respectivement (Bruckner et al., 1984; Raya et al., 1993) (tableau 1‑2). Toutefois, l’injection ip n’est pas un mode d’exposition pertinent alors que l’ingestion par voie orale est la voie d’exposition la plus probable chez les vertébrés. Cette donnée est particulièrement importante compte tenu du fait que les peptaïbols sont extrêmement résistants au clivage protéolytique et ne peuvent traverser la paroi intestinale pour atteindre la circulation sanguine (Degenkolb et al., 2008). Cette voie d’exposition ne peut permettre de prédire l’effet de la paracelsine après ingestion chez les vertébrés terrestres.

La DL₅₀ d’une exposition à court terme par voie orale à une préparation de cellulase de T. reesei (Celluclast^MD) est supérieure à la dose de 16, 8 et 5 g/kg de poids corporel chez la souris, le rat et le chien, respectivement, et elle est considérée comme ayant une toxicité faible selon le Système général harmonisé de classification et d’étiquetage des produits chimiques de l’EPA (Santé Canada, 2014; Hjortkjaer et al., 1986). Hjortkjaer et al. (1986) ont examiné le risque d’irritation cutanée associé aux cellulases provenant d’une souche de T. reesei. Une étude sur l’irritation cutanée d’une durée d’une journée a été menée sur dix adultes en bonne santé exposés à diverses concentrations de cellulase. La dose irritante médiane (DI₅₀) s’est avérée être d’environ 0,75 % (p/v), soit la concentration la plus élevée mise à l’essai. À cette dose, cinq volontaires sur dix ont présenté une réaction (Hjortkjaer et al., 1986). La β‑glucanase de T. reesei était uniquement associée à un risque de sensibilisation cutanée, et on n’a relevé aucun signe de toxicité orale ou par inhalation, de mutagénicité ni d’irritation oculaire ou cutanée (Coenen et al., 1995).

À l’instar d’autres enzymes produites par des micro‑organismes utilisés en industrie, les cellulases sont des allergènes potentiels. Parmi les allergies associées à Trichoderma, citons des cas de dermatite, de rhinite et d’asthme résultant d’une exposition professionnelle à une espèce de Trichoderma ou à une préparation commerciale d’enzymes (Halprin et al., 1973; Hytonen et al., 1994; Ransom et Schuster, 1981; Tarvainen et al., 1991), et de détresse respiratoire retardée chez des employés affectés à l’entretien d’une usine de fabrication de pâtes et papier à partir de copeaux de bois (Cohn et al., 1984). En ce qui concerne la plupart des autres cas, les patients avaient eu des réactions allergiques antérieures à des allergènes de l’environnement ou présentaient une sensibilité à d’autres enzymes en raison de leur travail.

Dans le cadre d’un essai de sensibilisation cutanée réalisé chez 25 volontaires adultes sur une période de dix jours, chaque personne a reçu un timbre sur l’avant‑bras contenant 0,3 g de cellulase appliquée sous un pansement occlusif durant 48 heures. Après une période de dix jours, un timbre a été appliqué pendant 48 heures dans le cadre d’une épreuve de provocation. L’observation immédiatement après le retrait du timbre ou 24 heures plus tard n’a révélé aucune sensibilisation cutanée de contact (Hjortkjaer et al., 1986).

3.2 Gravité des risques

Depuis les années 1960, les espèces de Trichoderma ont servi à produire, à des fins commerciales, des carbohydrases utilisés dans l’industrie alimentaire et forestière, et pour fabriquer des aliments pour les animaux et des produits de santé. Compte tenu de cette utilisation sans danger en milieu industriel, de nombreux auteurs de publications scientifiques considèrent actuellement T. reesei comme étant un organisme sûr pouvant être utilisé pour la production (Miettinen-Oinonen et Suominen, 2002; Nevalainen et al., 1994; Sukumaran et al., 2005).

3.2.1 Environnement

Les risques associés à la souche ATCC 74252 de T. reesei pour l’environnement ont été établis comme étant faibles ou moyens sur la base des motifs suivants :

1. T. reesei agit comme un fongicide biologique inhibant les agents phytopathogènes d’origine fongique par divers mécanismes, dont l’antibiose, la lyse, la compétition ou l’antagonisme, le mycoparasitisme, la sécrétion de métabolites, et chez les végétaux, une augmentation de la résistance systémique et la stimulation de la croissance. La paracelsine produite par T. reesei QM 9414 a une activité antibactérienne et antifongique.
2. Selon certaines sources, T. reesei ne serait pas un agent pathogène des végétaux aquatiques et terrestres, et il se peut qu’il ne possède pas les enzymes nécessaires à la pathogénicité. Cet organisme peut toutefois avoir des effets bénéfiques sur la croissance végétale et la résistance systémique à l’infection et à des produits chimiques toxiques. Les épreuves de pathogénicité et de toxicité menées avec la souche ATCC 74252 de T. reesei n’ont pas montré d’effets délétères envers Trifolium pratense et ont révélé un effet bénéfique potentiel de la souche sur les racines de Trifolium pratense.
3. Les publications scientifiques ne font pas état d’effets nocifs chez les vertébrés aquatiques.
4. Des recherches approfondies dans les publications scientifiques n’ont révélé aucun cas d’effets nocifs ou d’infections à T. reesei chez les vertébrés terrestres dans des conditions naturelles. Dans les conditions expérimentales, T. reesei peut causer des effets nocifs chez des animaux immunodéprimés, dont la souris, le cobaye et le lapin, mais, les décès n’ont été observés qu’après l’administration ip d’une dose massive dans le cadre d’une épreuve de provocation (1,0 x 10⁵ spores viables et 1,0 x 10⁷ spores viables ou inactivées). La paracelsine produite par T. reesei est toxique pour les cellules de mammifères et les souris.
5. On n’a jamais observé d’effets nocifs de T. reesei chez les invertébrés aquatiques. Cependant, la paracelsine produite par T. reesei est toxique pour A. salina, sous forme de larve ou adulte, et pour D. magna, sous forme adulte. Les peptaïbols, comme la paracelsine, sont aussi très toxiques pour les larves de moules. On ignore si la souche ATCC 74252 de T. reesei produit des peptaïbols comme la paracelsine, mais il est raisonnable de présumer qu’elle le peut, car il s’agit d’une caractéristique de la souche QM 6a, de laquelle elle est dérivée.
6. En dépit de sa présence naturelle dans les sols des pays tropicaux, des recherches approfondies dans les publications scientifiques n’ont révélé aucun cas d’effets nocifs ou d’infections à T. reesei chez des invertébrés terrestres. Les épreuves de pathogénicité et de toxicité réalisées avec la souche ATCC 74252 de T. reesei n’ont montré aucun effet nocif envers F. candida et E. andrei, adulte ou juvénile.

3.2.2 Santé humaine

Les risques associés à la souche ATCC 74252 de T. reesei pour l’humain sont considérés faibles, compte tenu des motifs suivants :

1. Il n’existe aucun cas d’infection attribuable à T. reesei chez l’humain dans les publications scientifiques.
2. Les espèces étroitement apparentées comme T. longibrachiatum ont causé des infections, mais seulement chez des personnes gravement immunodéprimées.
3. Dans les conditions expérimentales, T. reesei peut causer des effets nocifs chez des animaux immunodéprimés, dont la souris, le cobaye et le lapin. Cependant, les décès n’ont été observés qu’après l’administration iv de doses massives dans le cadre d’une épreuve de provocation (1,0 x 10⁵ spores viables et 1,0 x 10⁷ spores viables ou inactivées).
4. Dans l’éventualité peu probable d’une infection à la souche ATCC 74252 de T. reesei, cet organisme est sensible aux traitements antifongiques dont l’efficacité contre d’autres espèces de Trichoderma a été éprouvée.
5. On n’a pas observé d’effets nocifs de T. reesei chez l’humain, mais la paracelsine produite par T. reesei est toxique pour les cellules de mammifères et les souris dans les conditions expérimentales où les barrières naturelles ont été contournées. On ignore si la souche ATCC 74252 de T. reesei produit de la paracelsine, mais il est raisonnable de présumer qu’elle le peut, car il s’agit d’un trait de la souche QM 6a, de laquelle elle est dérivée.
6. T. reesei a été utilisée depuis longtemps dans la production d’enzymes sans qu’il y ait des cas d’infection. Toutefois, l’exposition professionnelle répétée à des préparations commerciales d’enzymes (p. ex. cellulases) produites par T. reesei ont entraîné des cas d’allergies liées à Trichoderma comme des dermatites, des rhinites et l’asthme.

Les risques liés aux micro‑organismes utilisés en milieu de travail doivent être catégorisés selon le Système d’information sur les matières dangereuses utilisées au travail (SIMDUT)^{Note de bas de page 5} .

4. Évaluation de l’exposition

4.1 Sources d’exposition

La présente évaluation examine l’exposition à la souche ATCC 74252 de T. reesei résultant de son ajout à des produits de consommation ou commerciaux et de son utilisation dans des procédés industriels au Canada.

Les réponses à un questionnaire facultatif envoyé en 2007 à un sous‑ensemble d’entreprises de biotechnologie ainsi que les renseignements obtenus d’autres programmes fédéraux réglementaires et non réglementaires indiquent que la souche ATCC 74252 de T. reesei a été utilisée à des fins commerciales en 2006. Une masse de 1 000 à 10 000 kg de cellules sèches de la souche ATCC 74252 de T. reesei a été produite en 2006 à des fins industrielles.

Le gouvernement a procédé à une collecte obligatoire de renseignements en application de l’article 71 de la LCPE, dont l’avis a été publié dans la Partie I de la Gazette du Canada le 3 octobre 2009 (Avis en vertu de l’article 71). L’Avis en vertu de l’article 71 s’appliquait à toute personne qui, au cours de l’année civile 2008, avait fabriqué ou importé la souche ATCC 74252 de T. reesei, que ce soit seule, dans un mélange ou dans un produit. En 2008, une masse de 10 000 à 100 000 kg de cellules sèches de la souche ATCC 74252 de T. reesei a été produite à des fins industrielles.

Une recherche dans le domaine public (fiches signalétiques, publications scientifiques et brevets) a permis de relever les applications commerciales, industrielles et de consommation suivantes pour d’autres souches de T. reesei. Ces applications représentent des utilisations potentielles de la souche ATCC 74252 de T. reesei, car cette souche partage probablement des caractéristiques (modes d’action) avec d’autres souches commercialisées de T. reesei :

Utilisation en tant qu’organisme de production dans les contextes suivants :

• enzymes utilisées dans la dégradation de la biomasse cellulosique (Merino et al., 2008; Peciulyte et al., 2014; Schuster et Schmoll, 2010)
• enzymes utilisées pour produire des additifs alimentaires ou des additifs pour la nourriture destinée aux animaux d’élevage (Galante et al., 1998; Nevalainen et al., 1994; Schuster et Schmoll, 2010; Rhode Jr. et al., 1998)
• enzymes comme les α-glucanases utilisées dans le cadre de soins buccaux (Kim et al., 2009)
• enzymes utilisées à l’étape de l’empâtage et de la filtration lors du brassage de boissons alcoolisées (Elvig et Festersen, 2005)
• enzymes utilisées pour attendrir la viande (Robbins et al., 1986)
• enzymes utilisées pour traiter le tissu en coton (Clarkson et al., 1992)
• protéines utilisées dans l’industrie du textile, du détergent et des pâtes et papier (Baeck et al., 2000; Foreman et al., 2010)
• production de glycoprotéines, de protéines antimicrobiennes, de protéines hétérologues (chymosine de veau) et de fragments d’anticorps immunologiquement actifs (Bobrowicz et al., 2007; Harkki et al., 1989; Masri et al., 2013; Nevalainen et al., 2005 Nyyasonen et al., 1993; Uusitalo et al., 1991)
• production de carburants ou d’alcools (Bonaccorsi et al., 2006)
• revêtements protecteurs contre les champignons et fongicides (Batdorf et Brendle, 1998; Schuster et Schmoll, 2010)
• synthèse de nanoparticules d’argent (Mansoori, 2013; Vahabi et Dorcheh, 2014)

T. reesei est reconnue pour être une source des préparations d’aminopeptidase, ainsi que de cellulase, de β‑glucanase, de β‑d‑glucosidase et d’hémicellulose et de pentosanase dans le Codex des produits chimiques alimentaires (FCC 2016).

Par ailleurs, T. reesei peut être utilisée pour biograder les hydrocarbures aromatiques polycycliques et en biorestauration (Cocaign et al., 2013; Zafra et Cortés‑Esponosa, 2015). En outre, la souche T. reesei ATCC 28217 est décrite dans un brevet portant sur un pesticide microbien parmi de nombreuses autres souches de micro‑organismes destinés à être appliqués directement sur le sol, les végétaux ou les semences (Bok et al., 1996).

La souche ATCC 74252 de T. reesei figure sur la LIS et peut être utilisée au Canada sans notification préalable, mais il s’agit d’une souche brevetée à laquelle seule l’entreprise déclarante a accès. Par conséquent, le recours à la souche ATCC 74252 de T. reesei pour toute utilisation potentielle établie au Canada se limite aux souches accessibles au public.

4.2 Caractérisation de l’exposition

Comme la souche ATCC 74252 de T. reesei est une souche brevetée uniquement accessible par l’entremise du déclarant, on y a beaucoup moins souvent recours pour les usages potentiels définis à la section 2.1 Sources d’exposition que les souches accessibles au public. Toutefois, comme le déclarant pourrait vendre la souche ou l’utiliser d’une autre façon, des scénarios d’exposition possibles dans le futur ont aussi été envisagés. La souche ATCC 74252 de T. reesei est le plus souvent utilisée comme organisme de production à l’échelle industrielle. On prévoit que le rejet des installations de production sera limité, notamment en raison de la mise en œuvre de bonnes pratiques de fabrication, au cours desquelles des mesures doivent être prises pour réduire au minimum le rejet des micro‑organismes utilisés en production.

4.2.1 Environnement

L’exposition environnementale globale à la souche ATCC 74252 de T. reesei est faible, compte tenu des renseignements fournis en réponse à l’avis en vertu de l’article 71, dans lesquels les utilisations déclarées se limitaient à des processus industriels où des mesures de confinement sont appliquées. Les procédés industriels qui utilisent actuellement la souche ATCC 74252 de T. reesei ne devraient pas rejeter de la paracelsine dans l’environnement.

Si les usages potentiels cernés à la section 2.1 étaient mis en œuvre au Canada, la souche ATCC 74252 de T. reesei pourraient être utilisée dans le cadre de la biorestauration, de la biodégradation ou comme souche constitutive d’un pesticide. Dans ce cas, le micro‑organisme vivant pourrait alors être rejeté dans l’environnement au cours de son application sur le sol, les végétaux et les semences, et ainsi exposer les végétaux terrestres et les invertébrés, et dans une moindre mesure, les vertébrés terrestres qui se nourrissent sur le lieu de l’application, et les espèces aquatiques par l’entremise du ruissellement provenant des plantes et des sols traités. Le degré d’exposition environnementale à la souche ATCC 74252 de T. reesei dépendra de la quantité rejetée ainsi que de la survie du champignon, de sa persistance et de sa dispersion dans l’environnement récepteur. Les pesticides contenant la souche ATCC 74252 de T. reesei destinés à être utilisés au Canada seraient assujettis à une évaluation des risques pour la santé humaine et l’environnement et à une homologation en vertu de la Loi sur les produits antiparasitaires.

Bien que les espèces de Trichoderma soient des champignons communs du sol présents partout dans le monde, T. reesei est connue pour être un organisme pantropical présent dans un habitat étroit, délimité par une latitude de 20^o de part et d’autre de l’équateur. La souche ATCC 74252 de T. reesei croît de façon optimale à une température située entre 28 ^oC et 30 ^oC. Des études sur des microcosmes de sol ont montré que T. reesei peut survivre au froid (4 ^oC à – 20 ^oC) pendant sept semaines si des nutriments sont ajoutés à son milieu, ce qui indique qu’il pourrait hiverner dans les régions du Canada où les hivers sont doux. Néanmoins, comme la dispersion de spores à partir d’échantillons d’air signalée en Europe n’a pas abouti à l’établissement de T. reesei en Europe, il est probable que les populations introduites ne peuvent pas persister à long terme. En outre, la persistance d’un nombre de micro‑organismes introduits supérieur à la population naturelle est peu probable, compte tenu de la compétition naturelle qui aurait lieu entre T. reesei et les micro‑organismes de l’environnement (Dobbs et Hinson, 1953).

4.2.2 Chez l’humain

L’exposition globale estimée des humains à la souche ATCC 74252 de T. reesei est faible compte tenu des renseignements fournis en réponse à l’avis en vertu de l’article 71, dans lesquels les utilisations déclarées se limitaient à des processus industriels disposant de mesures de confinement.

Si les utilisations potentielles indentifiées dans la section 2.1 devaient être réalisées au Canada, la souche ATCC 74252 de T. reesei pourrait être utilisée en biorestauration, dans des procédés de biorestauration, de biodégradation ou comme souche constitutive d’un pesticide. Dans ce cas, elle pourrait être rejetée dans l’environnement à la suite de son application sur le sol, les végétaux et les semences. Le degré d’exposition des humains à la souche ATCC 74252 de T. reesei dépendrait de la quantité libérée et de la proximité des non‑utilisateurs sur le lieu d’application. Il ne devrait pas y avoir d’exposition associée à l’utilisation de produits de santé naturels contenant des enzymes produites par T. reesei. Les préparations d’enzymes devraient respecter les spécifications du produit fini.

5. Caractérisation des risques

Dans la présente évaluation, le risque est caractérisé selon un paradigme qui veut qu’un risque et l’exposition à ce risque soient tous deux nécessaires pour qu’il y ait un risque. La conclusion de l’évaluation des risques se fonde sur le risque et sur ce que l’on connaît de l’exposition attribuable aux utilisations actuelles.

On estime que le risque associé à la souche ATCC 74252 de T. reesei est faible ou moyen pour l’environnement, en raison de la production possible de paracelsine et d’autres peptaïbols dans certaines conditions de croissance, et que ce risque devrait être faible pour la santé humaine. À l’heure actuelle, il ne devrait pas y avoir de risques pour l’environnement et la santé humaine associés à une exposition à la souche ATCC 74252 de T. reesei ou à la paracelsine, car on utilise actuellement la souche ATCC 74252 de T. reesei dans des installations où on a prévu des mesures de confinement et où les conditions de croissance, selon les données les plus récentes, ne devraient pas entraîner la production de paracelsine et d’autres peptaïbols. Le risque associé aux utilisations actuelles devrait donc être faible à la fois pour l’environnement et la santé humaine.

L’évaluation des risques associés aux utilisations actuelles est suivie d’un examen de l’estimation des risques associés à des expositions futures prévues (découlant de nouvelles utilisations ou de conditions de croissance modifiées). La souche ATCC 74252 de T. reesei est une souche brevetée, dont le risque d’une utilisation accrue par rapport aux souches accessibles au public est limité. Toutefois, il est toujours possible que le déclarant décide d’utiliser ou de vendre la souche ATCC 74252 de T. reesei à de nouvelles fins.

Le risque associé à la souche ATCC 74252 de T. reesei est lié à sa capacité présumée de produire de la paracelsine ou d’autres peptaïbols, qui sont possiblement toxiques pour les invertébrés aquatiques et les mammifères. La paracelsine et d’autres peptaïbols ne sont pas réputés être produits dans des conditions de croissance actuelles, qui respectent les paramètres suivants : fermentation en immersion en l’absence de lumière et de matière végétale solide ou d’un substrat insoluble, et fermentation d’une matière végétale solide ou d’un substrat insoluble dans un bouillon dont la fermentation n’est amorcée qu’après l’inactivation de T. reesei. La paracelsine et d’autres peptaïbols pourraient, toutefois, être produits dans d’autres conditions de croissance. Ces autres conditions de croissance pourraient être la fermentation en immersion liquide en présence de matière insoluble, ainsi que la fermentation à l’état solide. Le rejet de grandes quantités de paracelsine ou d’autres peptaïbols dans l’environnement pourrait poser un risque aux invertébrés aquatiques.

Si la souche ATCC 74252 de T. reesei devenait une souche constitutive d’un pesticide, il y aurait risque d’un rejet à grande échelle dans l’environnement. Au Canada, les agents antiparasitaires microbiens et les préparations commerciales pesticides contenant la souche ATCC 74252 de T. reesei seraient sujettes à une évaluation avant leur homologation en vertu de la LPA. Les risques pour l’environnement et la santé humaine associés aux usages de la souche ATCC 74252 de T. reesei seraient alors évalués exhaustivement, et toute mesure d’atténuation des risques nécessaire devrait être appliquée par l’Agence de réglementation de la lutte antiparasitaire.

6. Conclusion

À la lumière des renseignements présentés dans cette évaluation préalable, on peut conclure que la souche ATCC 74252 de Trichoderma reesei ne pénètre pas dans l’environnement en une quantité ou une concentration ou dans des conditions de nature à :

• avoir, immédiatement ou à long terme un effet nocif sur l’environnement ou sur la diversité biologique
• mettre ou pouvoir mettre en danger l’environnement essentiel pour la vie humaine
• constituer ou pouvoir constituer un danger au Canada pour la vie ou la santé humaine

Nous estimons donc que la souche ATCC 74252 de Trichoderma reesei ne satisfait à aucun des critères énoncés à l’article 64 de la LCPE.

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ANNEXES

Annexe A : Résistance aux agents antifongiques et sensibilité de T. longibrachiatum

Annexe B : Rapports de cas d’infection attribuable à une souche de T. longibrachiatum

^a Identifié de nouveau comme étant T. longibrachiatum dans Kuhls et al., 1999 par analyse de l’ADN et comparaison de la séquence des espaceurs internes transcrits.

Annexe C : Rapports de cas d’infection attribuable à une espèce de Trichoderma