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Méthode de référence pour mesurer la toxicité des sédiments contaminés chez les embryons et les larves des échinides (oursins globuleux ou oursins plats)

Unité de l’élaboration et de l’application des méthodes
Direction générale des sciences et de la technologie
Environnement Canada
Ottawa (Ontario)

Méthode de référence
1/RM/58
Juillet 2014

Version PDF - 858 Ko

Commentaires

Prière d’adresser vos commentaires sur la teneur du présent rapport à :

Richard Scroggins
Chef, Section de l’évaluation biologique et normalisation Direction générale des sciences et de la technologie
Environnement Canada
335, chemin River
Ottawa (Ontario)  K1A 0H3

Lisa Taylor
Gestionnaire, Unité de l’élaboration et de l’application des méthodes
Direction générale des sciences et de la technologie
Environnement Canada
335, chemin River
Ottawa (Ontario)  K1A 0H3

Avis de révision

Le présent document a été révisé par le personnel de la Direction générale de l’avancement des technologies environnementales d’Environnement Canada. La mention d’appellations commerciales ou de produits offerts sur le marché ne constitue ni une recommandation ni une approbation quant à l’emploi de ces produits de la part d’Environnement Canada. D’autres produits de valeur comparable peuvent être utilisés.

Résumé

Le présent document décrit une méthode de référence pour mesurer la toxicité des sédiments contaminés chez les embryons et les larves des échinides. Cette méthode est uniquement destinée aux sédiments marins dont la salinité minimale est de 15 ‰. Des instructions explicites sont fournies pour effectuer des essais à l’aide d’au moins une des trois espèces d’échinides suivantes : Strongylocentrotus purpuratus (oursin violet du Pacifique), Lytechinus pictus (oursin blanc) et Dendraster excentricus (clypéastre excentrique).

Dans les essais, des œufs fraîchement fécondés (embryons) sont exposés à des échantillons de sédiments entiers. Chaque essai comprend un sédiment témoin, un ou plusieurs sédiments d’essai à l’étude et un sédiment de référence prélevé sur le terrain. L’essai débute dans les 2 à 4 heures suivant la fécondation, et un taux moyen de fécondation de ≥ 90 % doit être obtenu pour que l’essai soit initié. Si ce taux de fécondation est atteint, ~ 200 œufs (dont ≥ 90 % sont des œufs nouvellement fécondés) sont transférés dans toutes les enceintes d’essai. La durée de l’essai dépend de l’espèce. La fin présumée d’un essai pour chaque espèce est de 48 h pour le L. pictus, de 72 h pour le D. excentricus et de 96 h pour le S. purpuratus. L’essai peut être prolongé de 24 ± 1 h, selon le pourcentage de larves normales déterminé pour les témoins « en milieu exclusivement aqueux » qui font partie de l’essai à cette fin. Si, à la fin présumée de l’essai, le taux moyen de larves normales dans les flacons de surveillance est inférieur à 70 %, l’essai doit être prolongé de 24 h afin de s’assurer que le critère de validité de l’essai [c.-à-d. %de larves normales (Pn) ≥ 60 %] est satisfait lorsque les organismes sont évalués et notés.

En utilisant l’approche de « numération totale », à la fin de l’essai, tous les embryons et les larves recueillis dans chaque répétition doivent être comptés et notés (dans le flacon au moyen d’un microscope inversé ou en utilisant une cellule de Sedgwick-Rafter). Pour chaque répétition d’essai, i) les larves normales (au stade prisme ou pluteus) et ii) les larves anormales (c.-à-d. celles qui présentent des anomalies de développement) sont comptées et documentées. Une fois que tous les organismes recueillis ont été comptés et notés, le pourcentage de larves normales est calculé pour chaque traitement.

Des conditions et des méthodes précises sont stipulées, y compris des instructions pour acclimater et maintenir des échinides adultes en laboratoire pendant de longues périodes ou en vue de leur utilisation immédiate (adultes dont le frai est provoqué dans les trois jours suivant leur arrivée au laboratoire), et pour recueillir le sperme et les œufs nécessaires à l’essai. Les méthodes et les conditions nécessaires sont également décrites pour le transport, l’entreposage et la manipulation des échantillons de sédiment en vue de l’essai; les analyses physicochimiques nécessaires des sédiments et de l’eau; les méthodes et les conditions à respecter dans la préparation et l’exécution de l’essai; les critères relatifs à un rendement acceptable et à des résultats d’essai valides; les mesures et les observations à faire; les analyses de données requises; les instructions pour interpréter les résultats d’essai; et les exigences minimales à l’égard des rapports à produire. Des instructions sur l’utilisation d’essais toxicologiques de référence sont également fournies.

Avant-propos

Le présent document fait partie d’une collection de méthodes de référence pour mesurer et évaluer l’effet ou les effets toxiques de l’exposition d’une seule espèce d’organismes aquatiques ou terrestres à des échantillons de matières ou de substances d’essai, dans des conditions de laboratoire contrôlées et définies.

Par méthode de référence, on entend une méthode biologique particulière d’essai de la toxicité, c’est-à-dire une méthode écrite comportant un ensemble explicite de directives et de conditions expérimentales décrites avec précision. Contrairement à d’autres méthodes d’essai biologique polyvalentes (génériques) publiées par Environnement Canada, la méthode de référence est souvent limitée, dans son emploi, aux essais exigés par certains règlements (p. ex. le Règlement sur l’immersion en mer, sous le régime de la Loi canadienne sur la protection de l’environnement (1999) [LCPE (1999)]; gouvernement du Canada, 2001).

Les méthodes de référence sont celles qui ont été élaborées et publiées par Environnement Canada et qui sont préférées dans les cas suivants :

Dans l’annexe A, on trouve une liste des méthodes de référence préparées pour publication par l’Unité de l’élaboration et de l’application des méthodes d’Environnement Canada, à Ottawa, de méthodes génériques (aux applications plus larges) d’essai biologique et de guides à l’appui.

Les termes définis dans la section « Terminologie » se détachent en italiques, dans le corps du document, quand ils sont employés conformément à leur définition. Les italiques feront aussi ressortir d’autres termes.

Table des matières

Liste des tableaux

Liste des figures

Liste des abréviations et des formules chimiques

% : pourcentage ou pour cent
x g : « fois la gravité » (exprimant la force centrifuge relative)
≤ : moins de ou égal à
≥ : plus de ou égal à
°C : degré(s) Celsius
/ : par; peut aussi signifier « ou » (p. ex. eau témoin/de dilution)
~ : environ
< : moins de
> : plus de
± : plus ou moins
µg : microgramme
µL : microlitre
µm : micromètre
‰ : parties par millier
ADN : Acide désoxyribonucléique
CIp : concentration inhibitrice correspondant à un pourcentage d’effet (précisé)
cm : centimètre
Cu : cuivre
CV : coefficient de variation
ET: écart type
g : gramme
g/kg : gramme par kilogramme
h : heure
KCl : chlorure de potassium
L : litre
m : mètre
M : molarité (concentration)
MC (MC) : marque de commerce
mg : milligramme
min : minute
mL : millilitre
mm : millimètre
mS : millisiemens
N : normal
OD : oxygène dissous (concentration)
s : seconde
SHS : saumure hypersaline
SI : système international d’unités
sp. : espèce
tr/min : tours par minute
V : volt
μmhos : micromhos

Terminologie

Nota : Les définitions suivantes s’inscrivent dans le contexte de la présente méthode d’essai. D’autres définitions se rapportant à la méthode générique détaillée pour les essais chez les échinides (EC, 2011) s’appliquent également.Note de bas de page 1

Verbes auxiliaires

L’auxiliaire doit (doivent) et il faut expriment l’obligation absolue.
L’auxiliaire devrait (devraient) et le conditionnel d’obligation (il faudrait, etc.) expriment une recommandation ou la nécessité de respecter dans la mesure du possible la condition ou la méthode.
L’auxiliaire peut (peuvent) exprime l’autorisation ou la capacité d’accomplir une action.
L’auxiliaire pourrait (pourraient) indique la possibilité ou l’éventualité.

Termes techniques

Acclimatation – Adaptation physiologique à une valeur précise d’un ou de plusieurs facteurs environnementaux, comme la température ou la salinité. Ce terme s’applique généralement à des conditions contrôlées en laboratoire.

Conductivité – Expression numérique de la capacité d’une solution aqueuse de conduire un courant électrique. Cette capacité dépend des concentrations des ions en solution, de leur valence et de leur mobilité ainsi que de la température de la solution. La conductivité des eaux douces est mesurée à 25 °C et exprimée normalement en millisiemens par mètre (mS/m) ou en micromhos par centimètre μmhos/cm) (1 mS/m = 10 μmhos/cm). La conductivité est une méthode normalisée de mesure de la salinité, le résultat étant normalement exprimé en grammes par kilogramme (g/kg) ou en parties par millier (‰).

Conformité – Respect des exigences ou des règlements gouvernementaux en matière de permis.

Embryon – Animal (organisme) se trouvant aux premiers stades de la croissance et de la différenciation (développement), après la fécondation d’un œuf. Dans la présente méthode de référence, ce terme est utilisé pour désigner les étapes séparant la fécondation de l’œuf et la larve au stade prisme ou pluteus; voir les figures 2 et 3.

Gamètes – Œufs non fécondés ou spermatozoïdes obtenus d’échinides adultes.

Larve – Organisme récemment éclos dont les caractéristiques physiques diffèrent de celles observées chez l’adulte de la même espèce. Dans la présente méthode de référence, les larves désignent les stades prisme et pluteus du développement des échinides (voir les figures 2 et 3).

Lot – Groupe d’échinides adultes reçus en une seule fois d’un fournisseur, qui permettent de recueillir tous les gamètes destinés à être utilisés dans un essai toxicologique discret (y compris tout essai toxicologique de référence connexe). Ce terme peut aussi désigner les gamètes d’un seul mâle et d’une seule femelle ou d’un groupe de mâles et de femelles, recueillis aux mêmes fins.

pH – Logarithme négatif de l’activité des ions hydrogène exprimée en équivalents-grammes par litre. La valeur du pH indique le degré ou l’intensité des réactions tant acides qu’alcalines sur une échelle de 0 à 14, le nombre 7 représentant la neutralité, les nombres inférieurs à 7, des réactions de plus en plus acides, et les nombres supérieurs à 7, des réactions de plus en plus alcalines.

Photopériode – Durée de l’éclairement (et de l’obscurité) sur 24 h.

Pourcentage (%) – Concentration exprimée en parties par centaine. Dans le cas des substances d’essai, dix pour cent (10 %) représente 10 unités d’une substance diluée dans un sédiment ou dans l’eau pour constituer en tout 100 parties. Selon la substance d’essai, les concentrations peuvent être préparées en fonction d’un rapport de masse à masse, de masse à volume ou de volume à volume et elles sont exprimées sous forme de pourcentage de la substance dans la solution ou le mélange de sédiment final.

Salinité – Quantité totale (exprimée en grammes) de matière solide dissoute dans 1 kg d’eau. Elle est déterminée une fois que tous les carbonates ont été convertis en oxydes, que le bromure et l’iodure ont été remplacés entièrement par du chlorure et que toute la matière organique a été oxydée. On peut également mesurer la salinité directement à l’aide d’un salinimètre, d’un conductimètre ou d’autres moyens (APHA et al., 1989, 2005). La salinité est habituellement exprimée en grammes par kilogramme (g/kg) ou en parties par millier (‰).

Termes relatifs aux matières ou substances d’essai

Déblais de dragage – Sédiment et/ou déchet formé de particules, déposé au fond de l’eau (p. ex. provenant du fond de l’eau d’un port ou d’un chenal), qui a été dragué ou dont on envisage le dragage et l’immersion ultérieure en mer.

Eau de dilution – Eau de mer ou eau saline servant à diluer une substance ou une matière d’essai à différentes concentrations aux fins des divers traitements associés aux essais de toxicité.

Eau de mer reconstituée – Eau douce (désionisée ou distillée sous verre) à laquelle on a ajouté des sels de mer secs du commerce, des sels de qualité réactif ou de la saumure hypersaline, en une quantité suffisante pour obtenir une salinité (et un pH) d’eau de mer convenant au maintien des organismes et aux essais (eau témoin/de dilution).

Eau de porosité (ou eau interstitielle) – Eau occupant l’espace entre les particules d’un sédiment. La quantité d’eau de porosité s’exprime sous forme de pourcentage en poids du sédiment humide.

Eau sus-jacente – Eau recouvrant le sédiment dans une enceinte d’essai, un vivier ou une enceinte d’acclimatation.

Eau témoin/de dilution – Eau de mer servant à la préparation d’une série de concentrations d’une substance d’essai, ou eau de mer utilisée comme eau sus-jacentedans un essai de toxicité des sédiments ou comme eau témoin dans un essai « en milieu exclusivement aqueux » (p. ex. dans un essai de toxique de référence). L’eau témoin ou de dilution est souvent identique à l’eau (sus-jacente) de culture et d’essai.

Essai de toxicité en milieu exclusivement aqueux – Essai dont on exclut tout sédiment ou toute autre matière solide (en employant, par exemple, la solution aqueuse d’un toxique de référence). Synonyme : essai de toxicité en phase liquide. Dans la présente méthode de référence, les flacons « en milieu exclusivement aqueux » servent à déterminer le taux de fécondation dans l’eau de mer utilisée comme eau sus-jacente pour les répétitions et les traitements. Les données permettent également de confirmer que le taux de fécondation, au début de l’essai pour chaque traitement, était de ≥ 90 % et que l’essai a répondu au critère de validité. L’essai toxicologique de référence est également mené comme un essai « en milieu exclusivement aqueux ».

Essai toxicologique de référence – Essai effectué à l’aide d’un toxique de référence parallèlement à un essai toxicologique de sédiment afin de mesurer la sensibilité des organismes et la précision ainsi que la fiabilité des résultats obtenus par le laboratoire au moment de l’évaluation de la matière d’essai. Toute déviation par rapport à une plage normale préétablie indique que la sensibilité des organismes d’essai ainsi que le rendement et la précision de l’essai sont suspects. Dans le cas de la présente méthode de référence, un essai toxicologique de référence est effectué en l’absence de sédiment (c.-à-d. comme un essai en milieu exclusivement aqueux).

Saumure hypersaline – Solution de sels de mer et d’eau dont la concentration est plus élevée que celle de l’eau de mer. On peut préparer une saumure hypersaline en congelant partiellement de l’eau de mer filtrée de grande qualité et en récupérant le liquide non gelé, en la congelant pour ensuite la dégeler partiellement, ou encore par évaporation en la chauffant lentement. On peut également la préparer en ajoutant des sels de mer du commerce ou des sels de qualité réactif à de l’eau douce ou à de l’eau distillée. La concentration de la saumure utilisée dans le présent essai devrait être de 90 ± 1 g/kg.

Sédiment contaminé – Sédiment renfermant des concentrations de substances chimiques qui posent une menace connue ou potentielle pour l’environnement ou la santé humaine.

Sédiment de référence – Échantillon d’un sédiment présumé non contaminé, prélevé sur le terrain et choisi pour ses propriétés (p. ex. granulométrie, compacité, teneur en matière organique totale) représentatives des conditions sédimentaires étroitement appariées à celles de l’échantillon ou des échantillons du sédiment d’essai, sauf pour ce qui est de la teneur en contaminants chimiques. Il provient souvent d’un site où l’influence d’une ou de plusieurs sources de contamination anthropique est inexistante ou minimale, mais dans les environs du ou des sites où les échantillons du sédiment d’essai sont recueillis. Un ou plusieurs échantillons du sédiment de référence devraient être inclus dans chaque série d’essais visant à évaluer la toxicité d’un ou de plusieurs sédiments d’essai. Dans certains cas, le sédiment de référence peut s’avérer toxique en raison de substances chimiques présentes naturellement dans l’environnement, comme le sulfure d’hydrogène ou l’ammoniac, ou en raison de la présence inattendue de contaminants d’origine anthropique atteignant des concentrations ayant des effets nocifs. Il conviendrait d’éviter d’utiliser un tel sédiment (toxique) comme sédiment de référence dans les futurs essais toxicologiques, à moins qu’il n’en soit tenu compte dans le plan d’expérience et que le ou les responsables de l’essai souhaitent comparer les résultats obtenus avec cette matière et ceux obtenus avec un ou des échantillons du sédiment d’essai.

Sédiment d’essai – Échantillon de sédiment entier, prélevé sur le terrain, dans un site marin, estuarien ou en eau douce que l’on croit contaminé (ou pouvant être contaminé) par au moins un produit chimique et destiné à être employé dans la présente méthode de référence. Dans certains cas, la notion s’applique à tout échantillon solide (notamment le sédiment de référence, le sédiment artificiel ou les déblais de dragage) utilisé dans l’essai. Voir également « sédiment contaminé , « sédiment de référence », « sédiment artificiel » et « sédiment témoin ».

Sédiment non contaminé – Sédiment qui ne contient pas de concentration de substance(s) pouvant causer des désordres observables chez les organismes d’essai, abréger leur survie ou ralentir leur développement durant l’essai.

Sédiment témoin – Sédiment non contaminé (propre), c’est-à-dire ne renfermant aucun contaminant susceptible d’influer sur la survie ou le développement des organismes d’essai. Il pourrait s’agir d’un sédiment naturel prélevé dans un site non contaminé ou d’un sédiment préparé (reconstitué). Il ne doit être additionné d’aucune matière ou substance d’essai et doit permettre un taux de développement acceptable des échinides, conformément aux conditions expérimentales et aux modes opératoires. Le sédiment témoin est utilisé pour confirmer que l’essai a répondu au critère de validité et il sert de base pour interpréter les données issues d’un essai de toxicité à l’aide du ou des sédiments d’essai.

Site – Étendue délimitée de sédiment utilisée ou envisagée pour servir de zone d’étude, habituellement parce qu’elle est contaminée ou susceptible d’être contaminée par l’activité humaine.

Station d’échantillonnage – Endroit précis, dans un site ou une unité d’échantillonnage (selon le plan d’étude) située sur le terrain, où on prélève les échantillons de sédiments destinés aux essais toxicologiques et aux analyses physicochimiques connexes. Voir également la définition du terme « site ».

Substance chimique – Tout élément, composé, préparation ou mélange d’un produit chimique qui pourrait se retrouver associé à des sédiments ou à de l’eau ou y être mélangé ou ajouté.

Témoin – Dans une enquête ou une étude, traitement reproduisant toutes les conditions et tous les facteurs qui pourraient influer sur les résultats, sauf la condition particulière étudiée. Dans un essai toxicologique, le témoin doit reproduire toutes les conditions du ou des traitements d’exposition, mais il ne doit pas renfermer de matière ou de substance d’essai contaminée. Le traitement sert à vérifier l’absence de toxicité mesurable attribuable aux conditions de base de l’essai (p. ex. la qualité de l’eau de dilution, la santé des organismes d’essai ou les effets dus à la manipulation de ces derniers).

Toxique de référence – Étalon chimique permettant d’établir la fiabilité des données sur la toxicité d’une matière ou d’une substance d’essai. Dans la plupart des cas, on procède à un essai toxicologique au moyen d’un toxique de référence afin de mesurer la sensibilité des organismes au moment de l’évaluation de la matière ou de la substance d’essai ainsi que la précision des résultats obtenus par le laboratoire à l’égard de cette substance.

Termes relatifs aux statistiques et à la toxicologie

Aigu – Qui se manifeste à l’intérieur d’une période d’exposition relativement courte par rapport à la durée de la vie de l’organisme d’essai. Il s’agirait d’un intervalle de quelques jours dans le cas des échinides, qui vivent généralement plusieurs années; par exemple, les oursins globuleux vivent de quatre à huit ans. Un effet toxique aigu serait provoqué et observable au cours de cette période.

Batterie d’essais toxicologiques – Combinaison de plusieurs essais toxicologiques, normalement sur différentes espèces d’organismes (une ou plusieurs espèces d’échinides, Vibrio fischeri, une ou plusieurs espèces d’amphipodes marins ou estuariens et un ver polychète).

Carte de contrôle – Graphique servant à suivre l’évolution des effets mesurés d’un toxique de référence. La date de l’essai se trouve sur l’axe horizontal; sur l’axe logarithmique vertical, on porte la concentration à laquelle l’effet est observé.

CIp ou concentration inhibitrice correspondant à un pourcentage d’effet (précisé) – Estimation ponctuelle de la concentration d’une substance ou d’une matière d’essai qui provoque un pourcentage donné d’atteinte à une fonction biologique quantitative, comme le développement des larves, le taux de croissance ou le nombre de jeunes par portée, par rapport au témoin. Par exemple, une CI50 pourrait être la concentration estimative à laquelle le développement des larves sera inférieur de 50 % à celui du témoin. Ce terme devrait être employé pour tout essai toxicologique visant à mesurer un effet quantitatif ou une modification du taux de croissance, de la fréquence respiratoire ou du taux de reproduction, par exemple. Dans la présente méthode de référence, le paramètre de mesure est le nombre de « larves normales » exprimé sous forme de pourcentage de toutes les observations. Les observations sont binomiales et exprimées en pourcentage. Toutefois, le nombre d’observations est élevé (~ 200) et le changement que provoquerait dans le pourcentage d’effet un spécimen qui réagit serait suffisamment faible pour que les données puissent être traitées comme si elles présentaient une distribution continue. Environnement Canada (EC, 2005) recommande donc d’estimer la CIp, un paramètre quantitatif, pour les résultats d’un essai sur le toxique de référence générés aux fins de la présente méthode de référence.

Coefficient de variation (CV) – Écart type (ET) d’un ensemble de données divisé par la moyenne de l’ensemble de données, exprimé sous forme de pourcentage. Il est calculé selon la formule suivante : CV (%) = 100 × (ET ÷ moyenne).

Échantillons répétés – Échantillons de sédiment prélevé dans la même station d’échantillonnage, afin d’estimer l’erreur d’échantillonnage ou d’améliorer la précision de l’estimation. Un échantillon unique prélevé dans une station est considéré comme une répétition. Les échantillons supplémentaires sont considérés comme des échantillons répétés lorsqu’ils sont soumis à un traitement identique, mais en étant gardés dans des récipients séparés (c’est-à-dire qu’ils ne forment pas d’échantillons composites).

Essai sans renouvellement des solutions – Essai toxicologique au cours duquel les solutions d’essai ne sont pas renouvelées pendant la durée de l’essai.

Essai toxicologique ou essai de toxicité – Détermination de l’effet d’une substance ou d’une matière sur un groupe choisi d’organismes, de tissus ou de cellules ou encore sur une autre matière vivante, dans des conditions définies. Un essai toxicologique en milieu aquatique permet habituellement de mesurer : a) la proportion des organismes atteints (mesure quantique) ou b) l’intensité de l’effet observé (quantitatif ou gradué), après exposition à une substance ou à une matière d’essai précise (p. ex. un échantillon de sédiment).

Limite de la zone de confiance – Limite, calculée logarithmiquement, située à plus ou moins deux écarts types (± 2 ET), de part et d’autre de la moyenne géométrique historique des paramètres de mesure d’essais toxicologiques effectués avec un toxique de référence.

Moyenne géométrique – Moyenne de mesures répétées, calculée logarithmiquement. Elle a pour avantage d’atténuer l’influence qu’exercent les valeurs extrêmes sur la moyenne, comme lorsqu’une moyenne arithmétique est établie. On peut calculer la moyenne géométrique comme étant la racine énième du produit de « n » valeurs et, aussi, comme l’antilogarithme de la moyenne des logarithmes des « n » valeurs.

Normalité (ou distribution normale) – Désigne une série de données d’observation qui, une fois reportées sur un graphique, décrivent une courbe symétrique en forme de cloche. Cette série met en lien la fréquence d’occurrence et la valeur du phénomène mesuré. Dans une distribution normale, la plupart des données d’observation se regroupent près de la valeur moyenne et deviennent progressivement moins nombreuses à mesure qu’on se rapproche des extrêmes de la gamme de valeurs. La forme est déterminée par les moyennes et les écarts types, avec 68,3 %, 95,4 % et 99,7 % des observations figurant entre plus ou moins un, deux et trois écarts types de la moyenne, respectivement.

Paramètre (ultime) de mesure – 1. Variable (temps, réaction des organismes, etc.) indiquant la fin de l’essai. 2. Mesure(s) ou valeur(s) dérivée(s) caractérisant les résultats de l’essai (p. ex. le pourcentage moyen de larves normales).

Répétition (traitement de, flacon ou récipient d’essai) – Enceinte expérimentale individuelle renfermant un nombre prescrit d’organismes exposés à une concentration de la matière ou de la substance d’essai, ou encore à un ou des traitements témoins ou traitements de référence. Comme il s’agit d’une unité expérimentale indépendante, tout transfert d’organismes, de substance ou de matière d’essai d’une enceinte à une autre invaliderait l’analyse statistique fondée sur la répétition. Le terme est également utilisé pour désigner le prélèvement de plus d’un échantillon de matière d’essai au même moment dans un endroit et à une profondeur donnés (p. ex. répétitions de terrain), ou des sous-échantillons d’une matière d’essai particulière prélevés pour plusieurs essais toxicologiques (en double ou plus) en utilisant des méthodes et des conditions identiques (p. ex. répétitions de laboratoire).

Toxicité – Capacité propre d’une substance ou d’une matière de provoquer des effets nocifs chez des organismes vivants. Ces effets pourraient être létaux ou sublétaux.

Toxicité aiguë – Manifestation d’un effet nocif (létal ou sublétal) provoqué chez l’organisme d’essai, après une courte exposition au sédiment d’essai (pour les besoins de la présente méthode, en quelques jours).

Toxique – Synonyme de substance ou de matière toxique.

Traitement – En règle générale, intervention ou procédure dont l’effet doit être mesuré. Plus précisément, dans un essai toxicologique, un traitement est une condition ou une procédure que le responsable de l’essai applique aux organismes d’essai afin de mesurer l’effet ou les effets d’une substance ou d’une matière sur ces organismes. Le traitement peut consister en une concentration donnée d’une matière ou d’une substance potentiellement toxique. Il peut aussi s’agir d’une matière d’essai en particulier (p. ex. un échantillon de sédiment, de produit chimique, d’effluent, d’élutriat, de lixiviat, d’eau réceptrice ou d’eau témoin). Les échantillons ou les sous-échantillons de sédiment d’essai représentant un traitement particulier sont habituellement répétés dans un essai toxicologique. Voir également la définition du terme « répétition ».

Remerciements

Le présent document a été préparé par Lesley Novak (AquaTox Testing & Consulting Inc., Guelph [Ont.]). En tant que responsable scientifique du projet, Lisa Taylor (gestionnaire, Unité de l’élaboration et de l’application des méthodes, Section de l’évaluation biologique et normalisation, Environnement Canada) lui a imprimé une orientation stratégique, en formulant des observations détaillées et en accordant son aide technique tout au long de sa réalisation. Lisa Taylor, Rick Scroggins et Leana Van der Vliet (Environnement Canada, Ottawa [Ont.]) ont grandement contribué à différentes sections du document. D.J. McLeay (McLeay Environmental Ltd., Victoria [C.-B.]) est remercié pour sa contribution, notamment à la compilation et à la synthèse des travaux de recherche en matière d’élaboration de méthodes qui a servi de fondement à la préparation de la présente méthode.

La présente méthode a été élaborée à partir des travaux de recherche effectués par le Laboratoire des essais environnementaux de l’Atlantique (LEEA) et le Laboratoire des essais environnementaux du Pacifique et du Yukon (LEEPY), Environnement Canada. Les efforts remarquables de Paula Jackman (LEEA), de Ken Doe (chercheur à la retraite d’Environnement Canada, LEEA) et de Craig Buday (LEEPY) sont vivement appréciés. Lesley Novak (AquaTox Testing & Consulting Inc.) a coordonné les études interlaboratoires visant à valider la méthode d’essai décrite dans le présent document. Ces études ont été effectuées avec la participation des laboratoires suivants : le LEEA et le LEEPY d’Environnement Canada, AquaTox Testing & Consulting Inc., EA Engineering, Science, and Technology Inc., Maxxam Analytics, le laboratoire de la région 9 de l’U.S. Environmental Protection Agency (USEPA), Nautilus Environmental et Southern California Coastal Water Research Project.

Nous sommes très reconnaissants des nombreuses observations utiles que nous a fournies chacun des membres suivants du groupe consultatif scientifique : Paula Jackman (Environnement Canada), Craig Buday (Environnement Canada), Ken Doe (chercheur à la retraite d’Environnement Canada), Suzanne Agius (Environnement Canada), Emilia Jonczyk (AquaTox Testing & Consulting Inc.), Wayne McCulloch et Michael Chanov (EA Engineering, Science, and Technology Inc.), Janet Pickard et Leslie-Anne Stavroff (Maxxam Analytics Inc.), Amy Wagner (USEPA Region 9 Laboratory), James Elphick et Josh Baker (Nautilus Environmental), Stephen L. Clark (Pacific EcoRisk), Steven M. Bay et Darrin Greenstein (Southern California Coastal Water Research Project), et Peter Wells (Université Dalhousie).

Ce projet a été cofinancé par Programmes marins et la Section de l’évaluation biologique et normalisation d’Environnement Canada.

Section 1 – Introduction

La présente méthode de référence précise les modes opératoires et les conditions qui s’appliquent à la préparation et à la réalisation d’un essai comportant un contact sédiment-embryons/larves d’échinides pour mesurer la toxicité des échantillons de sédiments marins ou estuariens contaminés ou potentiellement contaminés. Cette méthode d’essai est uniquement destinée aux sédiments marins dont la salinité minimale est de 15 ‰. Pour cet essai, il faut utiliser au moins une des trois espèces d’échinides suivantes : Strongylocentrotus purpuratus (oursin violet du Pacifique), Lytechinus pictus (oursin blanc) et Dendraster excentricus (clypéastre excentrique). Représentant une des méthodes d’essai biologique à employer dans le cadre d’évaluations des sédiments compatibles avec le règlement fédéral concernant l’immersion en mer, sous le régime de la Loi canadienne sur la protection de l’environnement (1999) [(LCPE (1999)]; gouvernement du Canada, 2001), cette méthode peut également servir à mesurer la toxicité d’échantillons de sédiment dont on envisage l’élimination dans un milieu estuarien ou marin pour lequel sont prescrits des évaluations réglementaires ou des modes opératoires rigoureux. Environnement Canada a publié deux autres méthodes de référence, destinées aux échantillons de sédiment (1998; 2002). Il existe aussi d’autres méthodes fédérales (Environnement Canada) d’essai biologique pour mesurer la toxicité sublétale, au moyen de gamètes obtenus d’échinides, ainsi que la toxicité de sédiments (voir l’annexe A).

La présente méthode de référence s’appuie sur des travaux de recherche relatifs à l’élaboration de méthode qu’ont menés le Laboratoire des essais environnementaux de l’Atlantique (LEEA) et le Laboratoire des essais environnementaux du Pacifique et du Yukon (LEEPY), Environnement Canada (McLeay, 2010). Beaucoup de conditions et d’éléments des modes opératoires précisés dans la présente méthode correspondent aux indications et aux approches pour réaliser des essais toxicologiques comportant un contact sédiment-échinides qui sont décrites dans d’autres méthodes ou modes opératoires normalisés de laboratoire, notamment : United States Environmental Protection Agency et Puget Sound Water Quality Authority (USEPA et PSWQA, 1995); Chapman, 1995; Southern California Coastal Water Research Project (SCCWRP, 2004); American Public Health Association (APHA et al., 2005); American Society for Testing and Materials (ASTM, 2007). En particulier, le concept de la présente méthode de référence est semblable à celui de l’essai sur les embryons/larves d’échinides élaboré par l’USEPA et la PSWQA (1995) et décrit à l’annexe A1 de l’ASTM (2007) pour ce qui est de l’essai toxicologique des échantillons de sédiments recueillis sur le terrain. L’annexe E présente un examen des similitudes et des différences associées aux différents modes opératoires et conditions précisés dans ces documents. Nous reconnaissons l’apport de ces méthodes et procédures normalisées d’applications laboratoires à tous les éléments de la présente méthode de référence, lesquels y trouvent leur justification. Toutefois, les modes opératoires et les conditions énoncés dans la présente méthode de référence doivent être considérés comme définitifs dans la planification et la réalisation d’une évaluation toxicologique de sédiments au moyen d’un essai comportant un contact sédiment-embryons/larves d’échinides à des fins réglementaires au Canada.

Avant de finaliser la présente méthode de référence, trois études interlaboratoires ont été effectuées pour évaluer la précision obtenue entre les laboratoires et valider la méthode d’essai. Les échantillons évalués comprenaient un toxique de référence (cuivre) ainsi que des sédiments de référence recueillis sur le terrain et des sédiments contaminés. La première série d’essais consistait en une évaluation d’un toxique de référence au moyen de l’oursin violet du Pacifique, Strongylocentrotus purpuratus, et elle était conçue pour permettre aux laboratoires de se familiariser et d’acquérir de l’expérience avec la méthode. La deuxième série d’essais consistait en une évaluation de sédiments contaminés, de sédiments de référence et de sédiments témoins, ainsi que d’un toxique de référence au moyen du S. purpuratus. Dans la troisième série d’essais, les échantillons de sédiment utilisés dans les séries précédentes ont été testés à nouveau avec l’oursin blanc, Lytechinus pictus. Un toxique de référence a également été utilisé dans la troisième série d’essais. Les résultats des trois séries d’essais de toxique de référence ont produit des coefficients de variation (CV) variant de 23,9 % à 32,4 %, des valeurs se situant dans une plage de variabilité acceptable pour des essais interlaboratoires. Environnement Canada (EC, 2005) suggère que des CV de 20 % à 30 % seraient une plage de variabilité raisonnablement prévue dans le cadre d’essais répétés pour un toxique de référence. Dans l’évaluation avec des échantillons de sédiment, la présente méthode de référence a également présenté une bonne concordance et une sensibilité comparable avec les résultats des essais sur la bactérie luminescente et les amphipodes, lesquels sont utilisés pour juger de la toxicité des sédiments en vue d’une immersion en mer. Les trois méthodes d’essai ont démontré qu’un échantillon de sédiment contaminé aurait été jugé toxique.

Section 2 – Organismes d’essai

2.1 Espèces

Avec la présente méthode de référence, il faut utiliser au moins une des trois espèces d’échinides suivantesNote de bas de page 2 :

Strongylocentrotus purpuratus (oursin violet du Pacifique),

Lytechinus pictus (oursin blanc),

Dendraster excentricus (clypéastre excentrique).

Dans un essai donné, les animaux représentant une seule espèce doivent être utilisés, et tous les organismes d’essai doivent provenir de gamètes recueillis au sein de la même population d’adultes de cette espèce ayant atteint la maturité sexuelle. Un aperçu des conditions relatives au frai, au maintien et l’acclimatation des échinides adultes (à utiliser comme source de gamètes dans le cadre de la présente méthode de référence) est présenté dans le tableau 1. Toutefois, les sections 1.2 et 2 d’Environnement Canada (EC, 2011) devraient être consultées pour obtenir plus de détails concernant les renseignements fournis dans le tableau 1, ainsi que les renseignements généraux sur la répartition géographique de ces organismes d’essai, leur disponibilité pour les essais et leur utilisation passée dans des essais toxicologiques en laboratoire.

2.2 Étapes du cycle biologique et provenance des organismes

Les gamètes (c.-à-d. les œufs non fécondés et le sperme) qui serviront à fournir les embryons nouvellement fécondés pour entreprendre l’essai doivent provenir d’adultes matures et gravides. Le sperme et les œufs recueillis en dehors de la principale période de maturation peuvent produire de faibles taux de fécondation et des résultats peu concluants qui ne satisfont pas aux critères de validité ou qui n’atteignent pas les taux moyens minimaux de fécondation. La détermination du degré de maturité demande une certaine expérience de la part du responsable de l’essai, mais on peut l’évaluer en provoquant le frai d’un échantillon d’échinides (voir 4.5.1) et en examinant les gamètes ainsi obtenus. Les spermatozoïdes matures sont minuscules et deviennent rapidement très actifs dans l’eau de mer, tandis que les œufs matures deviennent sphériques. On reconnaît les œufs immatures à la présence d’une tache claire dans leur cytoplasme.

Les adultes utilisés comme sources de gamètes dans la présente méthode de référence peuvent être obtenus auprès de fournisseurs commerciaux ou être recueillis sur le terrain par le personnel du laboratoire. On trouvera dans la section 2.2 d’Environnement Canada (EC, 2011) des directives détaillées sur la disponibilité des organismes (périodes de frai), le prélèvement et les températures de maintien en laboratoire des échinides à employer dans la présente méthode de référence. À l’exception de l’oursin blanc (L. pictus), les espèces pour les essais peuvent être prélevées sur une ou plusieurs côtes canadiennes. On peut se procurer le Lytechinus pictus et le S. purpuratus auprès d’un fournisseur de matériel biologique, qui se chargera de les expédier au laboratoire. Ces espèces sont disponibles toute l’année pour assurer une reproduction fiable. En général, le Strongylocentrotus purpuratus est disponible de janvier à mai (période optimale, de janvier à mars pour les organismes recueillis sur le terrain; de la fin octobre à avril pour ceux qui sont recueillis sur la côte californienne). Le Dendraster excentricus est généralement disponible de mai à octobre.

Les échinides adultes doivent être identifiés positivement jusqu’à l’espèce. Un taxonomiste qualifié doit procéder à la confirmation et à la documentation de l’espèce à laquelle appartiennent les organismes d’essai reçus d’un fournisseur, au moins une fois pour tout envoi d’échinides effectué par ce fournisseur, en utilisant les caractéristiques taxonomiques distinctives qui sont décrites dans les clés taxonomiques ou l’identification taxonomique fondée sur l’ADN (c.-à-d. les codes à barres). Lorsque les organismes sont achetés auprès d’un fournisseur commercial, ce dernier devrait fournir une attestation de l’identification de l’espèce, de même que la référence taxonomique ou le nom du ou des taxonomistes consultés. Après avoir obtenu du fournisseur l’identification taxonomique de chaque espèce, le laboratoire d’essai peut procéder à la confirmation de l’espèce à laquelle appartiennent les organismes d’essai inclus dans le même envoi. Toute l’information nécessaire à l’identification adéquate des échinides adultes expédiés à un laboratoire d’essai doit accompagner chaque envoi.

Les documents relatifs à chaque lot d’organismes d’essai doivent inclure, à tout le moins, le nombre et la provenance des organismes de chaque envoi, le nom du fournisseur, la date d’expédition, la date d’arrivée au laboratoire d’essai, l’état des organismes à l’arrivée (c.-à-d. la mortalité, la température, l’oxygène dissous et le pH si les organismes ont été expédiés dans de l’eau) et l’identification des espèces.

L’expédition de spécimens très matures ou gravides (particulièrement dans des conditions stressantes comme des changements extrêmes de température) peut provoquer le frai ou la mortalité pendant le transport ou à l’arrivée au laboratoire. Par mesure préventive, on peut parfois acclimater les animaux le plus possible aux conditions du laboratoire avant leur expéditionNote de bas de page 3.

Le transfert d’animaux d’un milieu marin à un autre soulève d’importants problèmes liés à l’introduction d’espèces non indigènes, de maladies et de parasites. Tout projet d’achat, d’expédition ou de transfert d’échinides est d’abord soumis à l’approbation des autorités fédérales, provinciales ou régionales. Les laboratoires d’essai peuvent être tenus de créer et d’utiliser une aire de quarantaine dans leurs installations pour y isoler les organismes importés et pour y stériliser et éliminer, conformément aux règlements provinciaux ou fédéraux, l’équipement et les liquides entrant en contact avec les organismes d’essai ou les gamètesNote de bas de page 4.

Tableau 1 Résumé des conditions relatives à la provenance, au frai, au maintien et à l’acclimatation des échinides adultes (EC, 2011)
S. purpuratus
Description S. purpuratus
Provenance des adultes Fournisseurs de matériel biologique ou collecte sur le terrain; les échinides adultes doivent être identifiés positivement jusqu’à l’espèce; toute l’information nécessaire à l’identification adéquate des échinides adultes expédiés à un laboratoire d’essai doit accompagner chaque envoi (doit inclure, à tout le moins, le nombre et la provenance des organismes de chaque envoi, le nom du fournisseur, la date d’expédition, la date d’arrivée au laboratoire d’essai, l’état des organismes à l’arrivée et l’identification des espèces).
Période du frai Janvier à mai (en général); janvier à mars (période optimale) pour les organismes féraux; fin octobre à avril (côte californienne)—possibilité de prolonger la période du frai en laboratoire en maintenant une température constante (entre 12 °C et 15 °C) dans l’obscurité. Mars à novembre Mai à octobre (février à décembre—possibilité de prolonger la période du frai en laboratoire en maintenant les organismes à une température appropriée)
Température de maintien en laboratoire (°C) 10 ± 2
Acclimatation pour les organismes maintenus en laboratoire > 3 jours Acclimatation graduelle pendant au moins 3 à 4 jours à la température et à la salinité de l’essai, et dans l’eau qui sera utilisée pour les témoins et les dilutions.
Acclimatation pour les organismes dont le frai sera provoqué dans les 3 jours suivant leur arrivée en laboratoire Période de maintien minimale de 3 h pour observer l’état de santé général des adultes et effectuer une transition entre les conditions d’expédition (température et eau) et les conditions d’essai.
Réservoirs de maintien/conditions Maintien dans des réservoirs, des aquariums, des bassins ou des plateaux contenant ≥ 20 cm d’eau; le fond des réservoirs devrait être recouvert de 2 à 3 cm de sable, de sédiment ou de gravier.
Eau Eau de mer naturelle ou reconstituée non contaminée; système à recirculation d’eau ou sans renouvellement (p. ex. toutes les 24 h); salinité moyenne de 28 à 34 g/kg, toujours dans une plage de 25 à 36 g/kg; changement du taux de salinité doit être de < 5 g/kg par jour pour les adultes maintenus pendant > 3 jours; en général, débit fournissant 5 à 10 L par jour et par animal et renouvelant l’eau du réservoir en 6 à 12 h; en pratique, les échanges d’eau plus limités ou moins fréquents donnent également de bons résultats dans les systèmes sans renouvellement.
Oxygène dissous (OD) et pH de l’eau des réservoirs de maintien DO : entre 80 % et 100 % de saturation; pH : doit être entre 7,5 et 8,5.
Surveillance de la qualité de l’eau La température, la salinité, l’oxygène dissous, le pH et le débit de chaque réservoir devraient être mesurés, de préférence, chaque jour.
Éclairage On considère que les conditions d’éclairage n’ont pas une importance critique; éclairage normal du laboratoire (100-500 lux) et photopériode de 16 h de clarté et de 8 h d’obscurité.
Alimentation (pour les organismes dont le frai sera provoqué dans les 3 jours suivant leur arrivée) Alimentation non nécessaire.
Alimentation (pour les organismes maintenus en laboratoire pendant une période prolongée ( > 3 jours) Oursins globuleux : varech, autres macroalgues, ou laitue romaine, épinards et carottes; à volonté.
Nettoyage Enlèvement des algues décomposées, des matières fécales et des débris, chaque jour ou au besoin, à moins que ces éléments ne servent de nourriture.
Critères de santé des organismes Surveillance de la mortalité quotidiennement; pour les adultes maintenus pendant > 3 jours, la mortalité devrait être de ≤ 2 % par jour en moyenne pendant les 7 jours précédant la collecte des gamètes, et la mortalité cumulative pendant cette même période doit être de ≤ 20 %; pour les adultes maintenus pendant ≤ 3 jours, la mortalité cumulative doit être de ≤ 20 %; enlèvement des animaux malades ou moribonds – on devrait éliminer les groupes d’animaux malades.
Tableau 1 Résumé des conditions relatives à la provenance, au frai, au maintien et à l’acclimatation des échinides adultes (EC, 2011)
L. pictus
Description L. pictus
Provenance des adultes Fournisseurs de matériel biologique ou collecte sur le terrain; les échinides adultes doivent être identifiés positivement jusqu’à l’espèce; toute l’information nécessaire à l’identification adéquate des échinides adultes expédiés à un laboratoire d’essai doit accompagner chaque envoi (doit inclure, à tout le moins, le nombre et la provenance des organismes de chaque envoi, le nom du fournisseur, la date d’expédition, la date d’arrivée au laboratoire d’essai, l’état des organismes à l’arrivée et l’identification des espèces).
Période du frai Janvier à mai (en général); janvier à mars (période optimale) pour les organismes féraux; fin octobre à avril (côte californienne)—possibilité de prolonger la période du frai en laboratoire en maintenant une température constante (entre 12 °C et 15 °C) dans l’obscurité. Mars à novembre Mai à octobre (février à décembre—possibilité de prolonger la période du frai en laboratoire en maintenant les organismes à une température appropriée)
Température de maintien en laboratoire (°C) 13 ± 2
Acclimatation pour les organismes maintenus en laboratoire > 3 jours Acclimatation graduelle pendant au moins 3 à 4 jours à la température et à la salinité de l’essai, et dans l’eau qui sera utilisée pour les témoins et les dilutions.
Acclimatation pour les organismes dont le frai sera provoqué dans les 3 jours suivant leur arrivée en laboratoire Période de maintien minimale de 3 h pour observer l’état de santé général des adultes et effectuer une transition entre les conditions d’expédition (température et eau) et les conditions d’essai.
Réservoirs de maintien/conditions Maintien dans des réservoirs, des aquariums, des bassins ou des plateaux contenant ≥ 20 cm d’eau; le fond des réservoirs devrait être recouvert de 2 à 3 cm de sable, de sédiment ou de gravier.
Eau Eau de mer naturelle ou reconstituée non contaminée; système à recirculation d’eau ou sans renouvellement (p. ex. toutes les 24 h); salinité moyenne de 28 à 34 g/kg, toujours dans une plage de 25 à 36 g/kg; changement du taux de salinité doit être de < 5 g/kg par jour pour les adultes maintenus pendant > 3 jours; en général, débit fournissant 5 à 10 L par jour et par animal et renouvelant l’eau du réservoir en 6 à 12 h; en pratique, les échanges d’eau plus limités ou moins fréquents donnent également de bons résultats dans les systèmes sans renouvellement.
Oxygène dissous (OD) et pH de l’eau des réservoirs de maintien DO : entre 80 % et 100 % de saturation; pH : doit être entre 7,5 et 8,5.
Surveillance de la qualité de l’eau La température, la salinité, l’oxygène dissous, le pH et le débit de chaque réservoir devraient être mesurés, de préférence, chaque jour.
Éclairage On considère que les conditions d’éclairage n’ont pas une importance critique; éclairage normal du laboratoire (100-500 lux) et photopériode de 16 h de clarté et de 8 h d’obscurité.
Alimentation (pour les organismes dont le frai sera provoqué dans les 3 jours suivant leur arrivée) Alimentation non nécessaire.
Alimentation (pour les organismes maintenus en laboratoire pendant une période prolongée ( > 3 jours) Oursins globuleux : varech, autres macroalgues, ou laitue romaine, épinards et carottes; à volonté.
Nettoyage Enlèvement des algues décomposées, des matières fécales et des débris, chaque jour ou au besoin, à moins que ces éléments ne servent de nourriture.
Critères de santé des organismes Surveillance de la mortalité quotidiennement; pour les adultes maintenus pendant > 3 jours, la mortalité devrait être de ≤ 2 % par jour en moyenne pendant les 7 jours précédant la collecte des gamètes, et la mortalité cumulative pendant cette même période doit être de ≤ 20 %; pour les adultes maintenus pendant ≤ 3 jours, la mortalité cumulative doit être de ≤ 20 %; enlèvement des animaux malades ou moribonds – on devrait éliminer les groupes d’animaux malades.
Tableau 1 Résumé des conditions relatives à la provenance, au frai, au maintien et à l’acclimatation des échinides adultes (EC, 2011)
D. excentricus
Description D. excentricus
Provenance des adultes Fournisseurs de matériel biologique ou collecte sur le terrain; les échinides adultes doivent être identifiés positivement jusqu’à l’espèce; toute l’information nécessaire à l’identification adéquate des échinides adultes expédiés à un laboratoire d’essai doit accompagner chaque envoi (doit inclure, à tout le moins, le nombre et la provenance des organismes de chaque envoi, le nom du fournisseur, la date d’expédition, la date d’arrivée au laboratoire d’essai, l’état des organismes à l’arrivée et l’identification des espèces).
Période du frai Janvier à mai (en général); janvier à mars (période optimale) pour les organismes féraux; fin octobre à avril (côte californienne)—possibilité de prolonger la période du frai en laboratoire en maintenant une température constante (entre 12 °C et 15 °C) dans l’obscurité. Mars à novembre Mai à octobre (février à décembre—possibilité de prolonger la période du frai en laboratoire en maintenant les organismes à une température appropriée)
Température de maintien en laboratoire (°C) 13 ± 2
Acclimatation pour les organismes maintenus en laboratoire > 3 jours Acclimatation graduelle pendant au moins 3 à 4 jours à la température et à la salinité de l’essai, et dans l’eau qui sera utilisée pour les témoins et les dilutions.
Acclimatation pour les organismes dont le frai sera provoqué dans les 3 jours suivant leur arrivée en laboratoire Période de maintien minimale de 3 h pour observer l’état de santé général des adultes et effectuer une transition entre les conditions d’expédition (température et eau) et les conditions d’essai.
Réservoirs de maintien/conditions On utilise souvent des plateaux contenant 10 cm d’eau; le fond devrait être recouvert de 2 à 3 cm de sable, de sédiment ou de gravier riche en détritus, notamment des cellules algales décantées.
Eau Eau de mer naturelle ou reconstituée non contaminée; système à recirculation d’eau ou sans renouvellement (p. ex. toutes les 24 h); salinité moyenne de 28 à 34 g/kg, toujours dans une plage de 25 à 36 g/kg; changement du taux de salinité doit être de < 5 g/kg par jour pour les adultes maintenus pendant > 3 jours; en général, débit fournissant 5 à 10 L par jour et par animal et renouvelant l’eau du réservoir en 6 à 12 h; en pratique, les échanges d’eau plus limités ou moins fréquents donnent également de bons résultats dans les systèmes sans renouvellement.
Oxygène dissous (OD) et pH de l’eau des réservoirs de maintien DO : entre 80 % et 100 % de saturation; pH : doit être entre 7,5 et 8,5.
Surveillance de la qualité de l’eau La température, la salinité, l’oxygène dissous, le pH et le débit de chaque réservoir devraient être mesurés, de préférence, chaque jour.
Éclairage On considère que les conditions d’éclairage n’ont pas une importance critique; éclairage normal du laboratoire (100-500 lux) et photopériode de 16 h de clarté et de 8 h d’obscurité.
Alimentation (pour les organismes dont le frai sera provoqué dans les 3 jours suivant leur arrivée) Alimentation non nécessaire.
Alimentation (pour les organismes maintenus en laboratoire pendant une période prolongée ( > 3 jours) Fournir un sédiment contenant des déchets et des algues; utiliser un éclairage propice à la croissance des algues; et, au besoin, ajouter des algues de culture ou de la pâte d’algue; un débit constant d’eau non filtrée peut également fournir une nourriture adéquate.
Nettoyage Enlèvement des algues décomposées, des matières fécales et des débris, chaque jour ou au besoin, à moins que ces éléments ne servent de nourriture.
Critères de santé des organismes Surveillance de la mortalité quotidiennement; pour les adultes maintenus pendant > 3 jours, la mortalité devrait être de ≤ 2 % par jour en moyenne pendant les 7 jours précédant la collecte des gamètes, et la mortalité cumulative pendant cette même période doit être de ≤ 20 %; pour les adultes maintenus pendant ≤ 3 jours, la mortalité cumulative doit être de ≤ 20 %; enlèvement des animaux malades ou moribonds – on devrait éliminer les groupes d’animaux malades.

2.3 Maintien et acclimatation des adultes dans le laboratoire

On doit suivre les indications de la section 2.3 dans Environnement Canada (EC, 2011) pour maintenir et acclimater les adultes dont seront issus les gamètes pour fournir le sperme et les œufs fraîchement fécondés qui seront utilisés dans le cadre de la présente méthode de référence.

2.3.1 Généralités

Des laboratoires ont réussi à maintenir en état de reproduction des spécimens des trois espèces employées dans la présente méthode de référence pendant de longues périodes (de trois mois à un an). Il a toutefois été signalé que ce maintien était plus facile dans le cas de l’oursin blanc. Les spécimens de l’oursin blanc peuvent être séparés par sexe et placés dans des aquariums distincts aux fins du prélèvement du nombre de mâles et de femelles dont on a besoin pour les essais. Toutefois, la détermination du sexe d’après les caractéristiques extérieures pourrait ne pas être toujours précise. Les mâles et les femelles peuvent être stimulés pour libérer des gamètes et ainsi être identifiés comme mâles par leur sperme blanc ou comme femelles, s’il y a présence d’œufs roses et jaunes dans le fluide. La plupart des laboratoires signalent que l’acclimatation et le maintien ont entraîné très peu de mortalité chez le L. pictus et qu’il est par ailleurs facile d’acclimater et de maintenir cette espèce dans des aquariums fermés à dispositif de recyclage et à température contrôlée (EC, 2011). Les rapports concernant l’oursin violet du Pacifique et le clypéastre excentrique varient quant à la facilité avec laquelle les spécimens peuvent être maintenus pendant de longues périodes. De nombreux laboratoires du Canada ont opté pour l’achat de spécimens de ces deux espèces d’essai auprès d’un fournisseur commercial lorsqu’ils doivent procéder à des essais, et ils provoquent le frai la journée même de l’arrivée des adultes au laboratoire ou quelques jours après (c.-à-d. sans véritable acclimatation). En raison des problèmes signalés associés au maintien de l’oursin violet du Pacifique et du clypéastre excentrique pendant une longue période, la deuxième édition du rapport SPE 1/RM/27 prévoyait la possibilité de « maintenir des adultes pour utilisation immédiate » et de recueillir les gamètes à l’intérieur d’une courte période (≤ 3 jours) après l’arrivée des adultes au laboratoire, une option qui peut également être employée dans le cas présent. Un aperçu des conditions de maintien et d’acclimatation des adultes est présenté dans les sections suivantes. Toutefois, la section 2.3.1 d’Environnement Canada (EC, 2011) doit être consultée pour obtenir d’autres renseignements et directives afin de « maintenir des adultes pour utilisation immédiate » et de maintenir des spécimens pendant une longue période ( > 3 jours).

Lorsqu’il faut provoquer le frai et soumettre les gamètes à l’essai dans les 3 jours suivant l’arrivée des adultes au laboratoire, on devrait au préalable obtenir du fournisseur la confirmation que les adultes sont matures et que les œufs sont viables. La température à laquelle les organismes d’essai sont expédiés devrait correspondre le plus possible à celle des conditions de l’essai, étant donné que le temps d’acclimatation en laboratoire sera très bref. Même s’ils sont « maintenus pour utilisation immédiate », les adultes devraient être acclimatés aux conditions de laboratoire le plus graduellement possible. Il est recommandé d’exposer graduellement les échinides adultes à l’eau témoin/de dilution du laboratoire dans tous les cas, mais plus particulièrement lorsqu’il y a un écart marqué quant à la qualité (c.-à-d. la température, la salinité et le pH) des conditions d’acclimatation antérieures. Dans le cas des adultes dont on provoque le frai le jour de leur arrivée au laboratoire, il faut prévoir une période de maintien de ≥ 3 h, période pendant laquelle on pourra observer leur état de santé en général et effectuer une transition entre les conditions d’expédition (température et eau) et les conditions d’essai. La marche à suivre pour faire passer les adultes de l’eau d’expédition à l’eau témoin/de dilution avant la provocation du frai est fournie dans la section 2.3.1 d’Environnement Canada (EC, 2011). Les adultes expédiés à l’état « sec » (c.-à-d. dans des essuie-tout humides ou des algues) n’ont pas besoin d’être placés dans l’eau témoin/de dilution avant la provocation du frai; il faut cependant prévoir une période d’observation de 3 h avant la provocation du frai. Pendant cette période, on devrait ajuster le plus graduellement possible leur température (c.-à-d. celle de l’air) par rapport à celle de l’essai, au besoin. La transition entre les conditions d’expédition et les conditions d’essai devrait commencer le plus tôt possible après l’arrivée au laboratoire des échinides adultes à maturité sexuelle.

Dans le cas des échinides adultes qui seront maintenus en laboratoire pendant des périodes prolongées ( > 3 jours), il est souhaitable de procéder graduellement à l’acclimatation à la température et à la salinité de l’essai, dans l’eau qui sera utilisée pour les témoins et les dilutions, avant de procéder à la collecte des gamètes. L’acclimatation devrait commencer le plus tôt possible après l’arrivée des adultes au laboratoire. La nécessité de recourir à des méthodes convenant au « maintien pour utilisation immédiate » ou à l’acclimatation graduelle dans des conditions propices au maintien à long terme est fonction des exigences de l’essai concernant l’obtention de gamètes viables, conformes aux besoins et au critère de validité de l’essai.

Il faut manipuler les échinides avec soin et éviter de leur imposer des chocs ou de changer les conditions de maintien. Les variations de température ou de pression hydrostatique, en particulier, peuvent déclencher le frai. De plus, le frai de certains spécimens étant susceptible de provoquer celui d’autres organismes, on devrait isoler immédiatement les échinides reproducteurs. Pour éviter un frai massif, les adultes devraient être séparés en petits groupes de mâles et de femelles (p. ex. ≤ 20 organismes par réservoir). Les réservoirs de maintien devraient porter une étiquette indiquant la date du frai.

Les recommandations concernant les conditions de maintien des échinides adultes en laboratoire pendant des périodes prolongées ( > 3 jours) sont décrites dans les sections 2.3.2 à 2.3.8 et dans la section 2 d’Environnement Canada (EC, 2011). Les directives permettent une certaine souplesse, tout en normalisant les conditions qui, si elles ne sont pas contrôlées, pourraient nuire à la santé des animaux ou à la viabilité de leurs gamètes.

2.3.2 Réservoirs de maintien

Les groupes d’échinides mâles et femelles sont gardés dans des réservoirs, des aquariums ou des bassins. La profondeur de l’eau des réservoirs contenant les oursins globuleux devrait être de ≥ 20 cm. Dans le cas des oursins plats, on utilise souvent des plateaux (p. ex. de 1 m × 2 m) contenant 10 cm d’eau. Le fond des réservoirs utilisés pour contenir les échinides devrait être recouvert de 2 à 3 cm de sable, de sédiment ou de gravier (et dans le cas des oursins plats, cette matière devrait être riche en détritus, notamment des cellules algales décantées).

2.3.3 Éclairage

Les conditions d’éclairage (y compris la photopériode et l’intensité) au cours du maintien des échinides adultes semblent peu importantes. L’éclairage normal de laboratoire (faible intensité [de 100 à 500 lux], avec photopériode de 16 h de clarté et de 8 h d’obscurité) est généralement considéré comme acceptable. Quant aux oursins plats, un appareil fluorescent suspendu, fournissant un éclairage équivalant à celui d’un bureau bien éclairé, stimule la croissance des algues qui se trouvent dans le sédiment. De cette façon, les oursins plats peuvent devenir autosuffisants sur le plan alimentaire.

2.3.4 Eau

Les directives concernant le type d’eau (c.-à-d. eau de mer naturelle ou reconstituée), les taux de renouvellement appropriés et la qualité de l’eau qui sont présentées dans la section 2.3.4 d’Environnement Canada (EC, 2011) et résumées dans le tableau 1 devraient être suivies.

Pour maintenir les échinides adultes, on peut utiliser de l’eau de mer naturelle non contaminée ou de l’eau de mer « reconstituée » (artificielle) dont la salinité est ajustée conformément aux méthodes recommandées par Environnement Canada (EC, 2001). Il faudrait s’assurer au préalable que les sels de mer du commerce ou le mélange approprié de sels de qualité réactif utilisés pour préparer l’eau de mer reconstituée assureront un bon taux de survie et le maintien en santé des échinides. L’approvisionnement en eau devrait être surveillé et évalué aussi souvent que possible pour en documenter la qualité. Il faudrait aussi mesurer, de préférence quotidiennement, la température, la salinité, l’oxygène dissous, le pH et le débit de chaque réservoir.

On devrait renouveler continuellement (c.-à-d. système à recirculation d’eau) ou périodiquement (c.-à-d. système sans renouvellement) pour prévenir l’accumulation de déchets métaboliques. Des lignes directrices générales pour assurer le maintien optimal d’une eau de grande qualité, y compris les taux de débit/renouvellement et les densités de charge, sont fournies dans EC (2011).

La salinité moyenne de l’eau utilisée pour le maintien des organismes devrait être de 28-34 g/kg, de préférence 30-32 g/kg. Les valeurs extrêmes de la salinité ne doivent pas être de < 25 g/kg ou de > 36 g/kg dans les réservoirs de maintien des échinides. Pour les organismes devant être maintenus au laboratoire pendant une longue période, le taux d’ajustement de la salinité devrait être de ≤ 3 g/kg par jour et ne doit pas dépasser ≤ 5 g/kg par jour. Pour les adultes « maintenus pour utilisation immédiate » (p. ex. dans les 3 jours suivant leur arrivée au laboratoire), les ajustements de la salinité devraient être effectués le plus graduellement possible. Toutefois, on peut procéder à un ajustement quotidien de > 5 g/kg si le critère de validité de l’essai peut être satisfait et si la sensibilité des gamètes n’est pas touchée lors de l’essai sur le toxique de référence. Voir EC (2011) pour obtenir d’autres renseignements.

Si de l’eau de mer reconstituée (artificielle) doit être utilisée pour maintenir des organismes, il faut la maintenir à la salinité souhaitée par l’ajout de saumure hypersaline (SHS) et/ou de sels de mer secs du commerce ou de sels de qualité réactif, à un volume approprié d’eau douce. La salinité de la SHS devrait être de 90 ± 2 g/kg. Toute eau de mer reconstituée préparée par ajout direct de sels secs doit être aérée vigoureusement pendant ≥ 24 h avant l’emploi; toutefois, un vieillissement plus long (≥ 3 jours) avec aération est conseillé. EC (2011) donne la marche à suivre pour la préparation, le vieillissement et l’entreposage de la SHS. Pour préparer de l’eau de mer reconstituée, on peut se servir d’eau désionisée, d’eau distillée, d’eau de surface ou d’eau souterraine non contaminée ou d’eau potable municipale déchlorée.

2.3.5 Température

Au cours de la période de maintien précédant l’acclimatation aux conditions d’essai, les adultes devraient être maintenus à l’intérieur de la plage de températures indiquée précédemment comme étant convenable pour les espèces d’après les plages de températures propres aux espèces qui sont recommandées dans EC (2011). Voir également le tableau 1. Il est conseillé d’acclimater graduellement les animaux à la température d’essai avant de provoquer leur frai, même si la collecte des gamètes doit avoir lieu le jour même ou le lendemain de l’arrivée des adultes gravides au laboratoire. Lorsque les adultes arrivent au laboratoire, la température à laquelle ils sont adaptés devrait être modifiée au besoin, à un rythme ne dépassant pas 3 °C/jour (EC, 2011).

2.3.6 Oxygène dissous et pH

La teneur en oxygène dissous de l’eau des réservoirs de maintien devrait être maintenue entre 80 % et 100 % de saturation. Au besoin, on peut assurer une légère aération de l’eau au moyen d’air comprimé filtré et exempt d’huile. On devrait éviter une agitation trop vigoureuse. Conformément à la section 2.3.7 dans EC (2011), le pH de l’eau de maintien des adultes devrait être de 8,0 à 8,2 et ne doit pas être inférieur à 7,5 ni supérieur à 8,5.

2.3.7 Alimentation

Il n’est pas nécessaire de nourrir les échinides adultes dont le frai sera provoqué aux fins des essais dans les 3 jours suivant leur arrivée au laboratoire. Les oursins globuleux maintenus en laboratoire pendant une période prolongée ( > 3 jours) devraient être nourris de varech ou de macroalgues (Laminaria, Nereocystis, Macrocystis, Egregia, Hedophyllum), ou encore de laitue romaine, d’épinards ou de carottes râpées. Il conviendrait d’ajouter de la nourriture assez fréquemment pour assurer une disponibilité continuelle et de retirer les vieux aliments ou ceux qui sont décomposés. Les oursins plats se nourrissent généralement de façon sélective des particules qui gisent au fond de leur réservoir de maintien. C’est pourquoi le sédiment naturel non contaminé qui est déposé au fond de leur réservoir de maintien devrait contenir des déchets et, possiblement des microalgues (diatomées); on peut également ajouter des algues de culture ou de la pâte d’algue, au besoin (voir 2.3.3). Un débit constant d’eau non filtrée peut également fournir une nourriture adéquate aux oursins plats. En général, le laboratoire qui procède au maintien des échinides adultes (en vue de fournir des gamètes ou des embryons qui serviront aux essais de toxicité) détermine les conditions et les taux d’alimentation qui favorisent de faibles taux de mortalité, une fécondité acceptable et une réussite du frai.

2.3.8 Critères de santé des organismes

On doit examiner les adultes dès leur arrivée au laboratoire, et quotidiennement par la suite, afin de surveiller le taux de mortalité et de détecter les signes de maladie. Les organismes moribonds devraient être éliminés immédiatement. Les critères de santé des organismes spécifiques, fondés sur les périodes de maintien en laboratoire pour les échinides adultes, sont les suivants :

Section 3 – Installations, équipement et fournitures

L’essai peut se dérouler dans un laboratoire propre, doté d’un éclairage ambiant standard. La photopériode à laquelle les enceintes d’essai sont exposées le jour -1 ainsi que tout au long de l’essai devrait être de 16 h de clarté et de 8 h d’obscurité.

Le degré de danger posé par les échantillons de sédiment qui doivent servir à l’essai et le risque de contamination des échantillons et de l’appareillage commanderaient l’emploi d’installations particulières. Les installations devraient être bien ventilées, être exemptes d’émanations et être isolées des facteurs physiques de dérangement ou des contaminants atmosphériques qui pourraient nuire aux organismes d’essai. Les installations d’essai devraient également être isolées de l’atelier de préparation des sédiments et être éloignées de la laverie.

L’équipement et les fournitures entrant en contact avec les sédiments, l’eau ou les solutions mères ne doivent pas renfermer de substances qui peuvent être lixiviées ou dissoutes en quantités nuisibles pour les organismes d’essai. On devrait les choisir soigneusement de façon à réduire au minimum la sorption des matières présentes dans l’eau. Le laboratoire doit être doté des instruments nécessaires pour mesurer les variables fondamentales de la qualité de l’eau (température, salinité, oxygène dissous et pH), et doit être prêt à analyser rapidement et précisément d’autres variables, comme la teneur en ammoniac et la granulométrie.

Un mélangeur ou un agitateur vortex mécanique (pour les flacons à scintillation à fond plat) est nécessaire pour s’assurer que le contenu de chaque flacon (contenant le sédiment et l’eau) est mélangé à une vitesse 1 800 tr/min pendant 10 secondes.

Des flacons à scintillation en verre jetables d’une capacité de 20 mL sont utilisés comme enceintes d’essai dans lesquelles les organismes sont notés au moyen d’une cellule de Sedgwick-Rafter. Les résultats des essais interlaboratoires ont également démontré que des flacons cylindriques en verre borosilicaté de 20 mL sans rebord sont acceptables comme récipients d’essai à utiliser dans les cas où les organismes doivent être notés dans un flacon à l’aide d’un microscope inversé (AquaTox, 2013; voir également 4.7.2). Tous les flacons devraient être neufs et n’avoir jamais été lavés. Toutefois, il est recommandé de rincer les flacons (avant l’utilisation) avec de l’eau désionisée ou d’osmose inverse. En procédant à l’essai, tous les flacons doivent être lâchement recouverts d’un film plastique (neuf) propre (provenant, par exemple, d’un sac en plastique transparent) ou d’une feuille de plexiglas transparente.Note de bas de page 5

Section 4 – Procédure pour l’essai de sédiments

4.1 Prélèvement des échantillons

Environnement Canada (EC, 1994) fournit des directives au sujet des plans d’échantillonnage sur le terrain et des techniques appropriées de prélèvement des échantillons, qu’il faudrait suivre si ces échantillons sont destinés aux essais de toxicité au moyen de la présente méthode de référence.

Les modes opératoires et l’équipement servant aux prélèvements (par carottier, benne, drague ou échantillon composite) dépendront des objectifs de l’étude et des exigences réglementaires ainsi que de la nature de la matière à prélever. Les échantillons de déblais de dragage devraient être prélevés à toutes les profondeurs dignes d’intérêt. Les échantillons de sédiment d’essai ou de référence prélevés sur le terrain, y compris ceux prélevés sur les lieux d’immersion en mer ou à proximité, représentent souvent la couche supérieure de deux centimètres d’épaisseur. Les sites de prélèvement des sédiments de référence devraient être recherchés dans les endroits où les propriétés géochimiques du sédiment, y compris sa granulométrie, sont semblables à celles des sites de prélèvement des sédiments d’essai. Idéalement, le sédiment de référence devrait provenir d’un site à la fois à l’abri de la ou des sources de contamination et dans les environs du ou des sites de prélèvement des échantillons du sédiment d’essai. Il est recommandé de prélever le sédiment de référence en plus d’un endroit, afin d’accroître la probabilité d’une bonne correspondance avec les caractéristiques granulométriques et physicochimiques des sédiments d’essai. Les critères de validité de l’essai sont établis d’après un nombre acceptable de larves normales dans les témoins « en milieu exclusivement aqueux » et le sédiment témoin du laboratoire. De plus, une comparaison avec le sédiment de référence prélevé sur le terrain ou, le cas échéant, avec un sédiment témoin du laboratoire (section 6) permet de déterminer si un sédiment « passe » ou non l’essai. Par conséquent, la sélection de sédiments témoins et de sédiments de référence sera essentielle à la réussite de l’essai et à l’interprétation des résultats de l’essai. De plus, avec l’évaluation répétée, un sédiment de référence non toxique prélevé sur le terrain pourrait être utilisé comme un sédiment témoin approprié.

Le nombre de stations à échantillonner à un site d’étude et le nombre d’échantillons répétés par station seront propres à chaque étude. Dans la plupart des cas, il faudra faire un compromis entre les contraintes logistiques et pratiques (p. ex. temps et coûts) et les considérations statistiques. Des directives supplémentaires sur l’échantillonnage pour les applications relatives à l’immersion en mer se trouvent dans Environnement Canada (EC, 1995) et dans Chevrier et Topping (1998).

Lorsque cela est possible et conforme au plan et aux objectifs de l’étude, au moins cinq échantillons répétés (c.-à-d. répétitions de terrain) de sédiment doivent être prélevés à chaque station d’échantillonnage et à chaque profondeur d’intérêt. Lorsque cela est possible et convenable, le prélèvement d’échantillons doit aussi inclure ≥ cinq échantillons (c.-à-d. répétitions de terrain) d’au moins une station de référence (c.-à-d. les sites où on peut trouver un sédiment non contaminé possédant des propriétés physicochimiques similaires à celles des sédiments d’essai) à proximité. L’objectif du prélèvement d’échantillons répétés à chaque station est de permettre des comparaisons statistiques quantitatives à une même station et entre différentes stations (EC, 2005). En conséquence, chacun de ces échantillons de sédiment, qui constituent de « véritables répétitions », doit être vérifié quant à sa toxicité pour les embryons et les larves d’échinides, dans au moins six enceintes d’essai par échantillon (c.-à-d. des répétitions de laboratoire).

À l’égard de certains projets de dragage, il est souvent inutile de prélever des échantillons répétés à une station d’échantillonnage donnée (EC, 1994; 1995). Si l’objectif est d’évaluer de façon efficiente la toxicité des échantillons dans le secteur où sera réalisé le projet, la meilleure solution pourrait être d’échantillonner le plus grand nombre possible de stations (sous réserve des contraintes de coûts), en prélevant un seul échantillon à chaque station. Dans ce cas, l’essai pourrait se limiter à six répétitions en laboratoire (c.-à-d. six sous-échantillons) par échantillon (et aucune répétition des échantillons de chaque station), chacune des répétitions étant préparée au laboratoire.

Pour prélever le sédiment, on devrait utiliser une benne « benthique » (c.-à-d. Smith-MacIntyre, Van Veen, PONAR) ou un carottier, plutôt qu’une drague, afin de perturber le moins possible l’échantillon. On doit veiller, au cours de l’échantillonnage, à réduire au minimum la perte de particules fines. On devrait utiliser partout la même méthode de prélèvement.

Le volume d’échantillons nécessaire pour réaliser un essai comportant un contact sédiment-embryons/larves d’échinides est faible (voir 4.6.2). Environ 100 mL devraient être expressément utilisés pour la réalisation de l’essai. Un volume d’échantillons plus grand (p. ex. 5 à 7 L de sédiment entier) est souvent nécessaire selon les objectifs et le plan de l’étude, la nature des analyses physicochimiques connexes et la batterie d’essais toxicologiques à réaliser. Pour obtenir le volume d’échantillon requis pour la batterie d’essais, il est souvent nécessaire de combiner des sous-échantillons obtenus au moyen du préleveur. On devrait suivre les conseils donnés dans Environnement Canada (EC, 1994) pour obtenir un échantillon composite à partir de sous-échantillons prélevés sur le terrain.

4.2 Étiquetage, transport et entreposage des échantillons

Outre les consignes qui suivent, Environnement Canada (EC, 1994) fournit des orientations plus détaillées et utiles sur l’étiquetage, le transport et l’entreposage des échantillons, document qu’il faudrait bien connaître à cette fin.

Les récipients utilisés pour le transport et l’entreposage des échantillons doivent être neufs ou nettoyés et rincés à fond avec de l’eau propre. Il faudrait consulter Environnement Canada (EC, 1994) pour obtenir des conseils sur le choix des récipients convenables. Chaque récipient devrait être rempli entièrement de l’échantillon, afin d’en exclure l’air. Sans délai, on doit le sceller, puis l’étiqueter ou le coder. L’étiquetage et les enregistrements connexes qui accompagnent cette opération doivent comprendre au moins un code que l’on peut utiliser pour identifier l’échantillon ou le sous-échantillon. Un registre à renvois croisés, qui pourrait ou pourrait ne pas accompagner l’échantillon ou le sous-échantillon, doit être établi par le personnel de terrain identifiant le type d’échantillon (p. ex. prélevé par benne, carottier, échantillon composite), sa source, le lieu précis du prélèvement (p. ex. hydronyme, latitude, longitude, profondeur), le numéro d’échantillon répété et la date du prélèvement. Cet enregistrement devrait aussi comprendre le nom et la signature du ou des préposés au prélèvement, lesquels devraient aussi conserver des registres décrivant :

Dès le prélèvement, il faudrait refroidir les échantillons tièdes ( > 7 °C) entre 1 °C et 7 °C, avec de la glace ordinaire ou des contenants réfrigérants (« cryosacs ») et les maintenir froids (4 ± 3 °C), dans l’obscurité, durant le transport. Au besoin, on devrait utiliser des contenants réfrigérants, de la glace ordinaire, des glacières ou d’autres moyens de réfrigération pour maintenir l’intervalle de températures de l’échantillon dans la fourchette de 1 °C à 7 °C durant le transport. Les échantillons ne doivent pas geler, pas même en partie, au cours du transport ou de l’entreposage, et on ne doit pas les laisser sécher.

À l’arrivée au laboratoire, il faut enregistrer la température de l’échantillon et sa date de réception sur une fiche à l’usage du laboratoire ou un formulaire de chaîne de possession. Les échantillons à conserver pour usage ultérieur doivent être conservés dans des récipients étanches, à l’obscurité, à 4 ± 2 °C. Il est recommandé de soumettre à l’essai dès que possible après le prélèvement, les échantillons de sédiment ou de matières particulaires semblables. L’essai toxicologique du sédiment devrait commencer dans les deux semaines suivant le prélèvement, de préférence dans la semaine qui suit ce dernier; l’essai ne doit pas démarrer plus de six semaines après le prélèvement. Cependant, la décision du moment exact du début de l’essai dépendra du type soupçonné de contaminant. Par exemple, les échantillons soupçonnés de contenir des contaminants moins persistants ou volatils (sulfures) pourraient être soumis à l’essai plus tôt (p. ex. dans la semaine suivant le prélèvement) qu’un échantillon contenant des substances plus stables ou persistantes (p. ex. métaux).

4.3 Manipulation et caractérisation des échantillons

Il ne faut pas soumettre au tamisage hydraulique les échantillons de sédiment de référence et d’essai prélevés sur le terrain. Il faudrait éliminer les particules ≥ 2 mm ainsi que les gros débris ou les gros organismes indigènes. Selon l’échantillon, on peut à cette fin utiliser une pincette ou un gant, qu’on devrait rincer ou remplacer, entre chaque échantillon, pour en prévenir la contamination croisée. Si un échantillon renferme un grand nombre de particules ≥ 2 mm et beaucoup d’organismes indigènes macroscopiques qui ne peuvent pas être éliminés avec la pincette ou la main gantée, on peut soumettre l’échantillon à un tamisage sous pression (à sec, non hydraulique) au travers d’au moins un tamis d’acier inoxydable à ouvertures convenablement calibrées (p. ex. < 2 mm). Cette manipulation devrait s’appliquer à toutes les fractions de l’échantillon utilisées pour les analyses physicochimiques (y compris l’analyse granulométrique), de même qu’aux fractions destinées aux essais toxicologiques. Les modes opératoires utilisés pour la manipulation de chaque échantillon doivent être consignées sur la fiche de laboratoire.

Il faut homogénéiser de nouveau le sédiment et l’eau de porosité qui se seraient séparés au cours de l’expédition et de l’entreposageNote de bas de page 6 . À cette fin, on mélange l’échantillon, soit dans le récipient qui a servi à son transport ou à son entreposage, soit dans un récipient propre servant à cette opération. On devrait normalement employer un outil non toxique (p. ex. une cuillère ou une spatule en acier inoxydable), tant que la texture, la consistance et la couleur ne sont pas homogènes. On peut aussi utiliser une méthode mécanique (EC, 1994; 1998; 2002) pour homogénéiser l’échantillon. Pour chaque échantillon faisant partie d’un essai, il faut que les conditions de mélange, y compris la durée et la température à laquelle l’opération se déroule, soient aussi semblables que possible.

Si on doute de l’efficacité du brassage de l’échantillon, on devrait prélever des sous-échantillons du sédiment après le mélange, puis en analyser séparément l’homogénéité.

Immédiatement après le mélange de l’échantillon, il faut prélever les sous-échantillons de la matière exigée pour cet essai de toxicité et d’autres (p. ex. EC, 1998; 2002) et pour les analyses physicochimiques, les placer dans des enceintes d’essai étiquetées et dans les récipients étiquetés exigés pour l’entreposage des échantillons destinés à des analyses physicochimiques ultérieures. Il faudrait alors transvaser aussi toute fraction subsistant de l’échantillon homogénéisé qui pourrait être nécessaire à des essais toxicologiques supplémentaires employant une bactérie luminescente (EC, 2002), des amphipodes (EC, 1998) ou d’autres organismes dans des récipients étiquetés. On devrait conserver tous les sous-échantillons à entreposer dans des récipients scellés, sans espace d’air, et on doit les ranger à l’obscurité, à 4 ± 2 °C, jusqu’à l’emploi ou l’analyse. Immédiatement avant de l’analyser ou de l’employer dans l’essai toxicologique, il faut mélanger de nouveau à fond chaque sous-échantillon, pour s’assurer de son homogénéité.

Il faut caractériser chaque échantillon (notamment de sédiment de référence et de sédiment témoin), au moyen de sous-échantillons, au moins relativement aux paramètres suivants (EC, 1998; 2002) : dans le cas d’un sédiment entier, le pourcentage de sédiment grossier (p. ex. particules > 2,0 mm), de sables (p. ex. particules > 0,063 à ≤ 2,0 mm), de limons (p. ex. particules > 0,002 à ≤ 0,063 mm), d’argiles (p. ex. particules ≤ 0,002 mm), d’eau (humidité), la teneur en carbone organique total, la teneur en ammoniac total, la teneur en sulfure et le pH.

On pourrait également englober d’autres analyses : la teneur en carbone inorganique total, en matières volatiles totales, la demande biochimique d’oxygène, la capacité d’échange cationique, les sulfures volatils acides, les métaux, les composés organiques de synthèse, les huiles et les graisses, et les hydrocarbures de pétrole.

Il faut entreprendre le plus tôt possible après le prélèvement des échantillons et de préférence avant le prélèvement des échantillons pour l’essai toxicologique, les analyses de la répartition granulométrique, pour faciliter la sélection du ou des échantillons convenables de sédiment de référence et du sédiment témoin.

4.4 Conditions d’essai

4.4.1 Grandes lignes de l’essai

La présente méthode de référence est un essai comportant un contact sédiment-embryons/larves d’échinides sans renouvellement des solutions pour mesurer la toxicité des échantillons de sédiments marins ou estuariens contaminés ou potentiellement contaminés. Dans des conditions d’essai normalisées, les groupes répétés d’œufs fraîchement fécondés (embryons) sont exposés à chaque traitement pendant la même durée (voir la section 4.6.5). Par la suite, les embryons et les larves sont conservés aux fins d’examen ultérieur et de détermination du nombre de larves normales et anormales dans chaque répétition, suivie d’une détermination du pourcentage de larves normales dans chaque traitement (voir 4.8). Le tableau 2 offre une liste de contrôle des conditions exigées ou recommandées pour cette méthode de référence. Les sections 4.4.2 à 4.4.5 renferment plus de détails.

4.4.2 Eau d’essai

L’eau témoin/de dilution utilisée pour un essai donné doit provenir de la même source. L’eau de mer doit être filtrée (~ 60 µm) avant son utilisation, et elle doit provenir d’une source naturelle non contaminée (dont les caractéristiques de la qualité de l’eau sont connues). L’eau devrait être utilisée dans les trois jours suivant la filtration. Des détails supplémentaires sur l’eau témoin/de dilution se trouvent dans la section 2.3.4 du présent document et la section 3.4 d’Environnement Canada (EC, 2011).

La salinité de l’eau de mer utilisée pour l’essai doit se trouver dans la gamme de 30 ± 2 g/kgNote de bas de page 7 .

Il faut régler la température de l’eau d’essai à celle qui est nécessaire au déroulement de l’essai (c’est-à-dire 15 ± 1 °C si on utilise S. purpuratus et D. excentricus; 20 ± 1 °C si on utilise L. pictus) [voir 4.4.3]. La concentration en oxygène dissous doit être de 90 à 100 % de la valeur de saturation en air, à cette température et à cette salinité. Au besoin, on devrait aérer vigoureusement le volume d’eau nécessaire (à l’air comprimé, exempt d’huile, diffusé au travers d’une ou de plusieurs pierres poreuses pour aquarium) immédiatement avant de l’utiliser, et on devrait en vérifier la teneur en oxygène dissous pour confirmer que l’on a atteint ce taux de 90 à 100 %. Le pH de l’eau témoin/de dilution doit se situer entre 7,5 et 8,5 (normalement, 8,0 ± 0,2).

4.4.3 Température

La température de l’essai dépend de l’espèce. Les valeurs moyennes quotidiennes doivent être maintenues dans les plages suivantes :

De plus, la température instantanée doit se trouver dans les 3 °C de la température moyenne quotidienne en tout temps.

4.4.4 Manipulations et réglages

4.4.5 Calendrier des manipulations

Le tableau 3 fournit un aperçu du calendrier des manipulations pour réaliser la présente méthode de référence, et les détails se trouvent dans les sections 4.5 à 4.7. Conformément à APHA et al. (2005) et ASTM (2007), cet essai d’embryons ou de larves d’échinides devrait commencer dans les deux heures suivant la fécondation et doit commencer dans les quatre heures suivant la fécondation. La durée de l’essai est de 48 à 120 h, selon l’espèce et le taux de développement du témoin « en milieu exclusivement aqueux » (voir 4.6.5).

Tableau 2 Liste de contrôle des conditions recommandées et exigées pour les essais
Type d’essai
  • sans renouvellement; les œufs fraîchement fécondés (embryons) sont exposés à chaque traitement pendant la même durée (48 à 120 h, selon l’espèce et le taux de développement du témoin « en milieu exclusivement aqueux »), puis préservés en utilisant du glutaraldéhyde pour un examen ultérieur et une détermination du nombre de larves normales (stade pluteus ou prisme) et anormales
Eau témoin/de dilution (sus-jacente)
  • eau de mer naturelle non contaminée, filtrée (~ 60 µm); teneur en oxygène dissous : 90 à 100 % de saturation au moment de l’utilisation; salinité doit être de 30 ± 2 g/kg; pH : 7,5 à 8,5, de préférence 8,0 ± 0,2
Organismes
  • Strongylocentrotus purpuratus (oursin violet du Pacifique), Lytechinus pictus (oursin blanc) ou Dendraster excentricus (clypéastre excentrique)
  • la densité cible d’embryons (c.-à-d. œufs fraîchement fécondés) doit être de ~ 200 œufs par aliquote de 200 μL (en volumes d’exposition de 10 mL); le rapport spermatozoïdes:œufs est déterminé pour cibler un taux moyen de fécondation obligatoire ≥ 90 % au début de l’essai
Plan d’expérience
  • un minimum de huit flacons de répétition renfermant le sédiment témoin
  • un minimum de huit flacons de répétition renfermant chacun le sédiment d’essai à l’étude
  • un minimum de 23 flacons « en milieu exclusivement aqueux »
  • selon la disponibilité, un minimum de huit flacons de répétition renfermant un sédiment de référence convenable
Récipients d’essai
  • flacons à scintillation ou flacons cylindriques en verre jetables de 20 mL; les flacons doivent être lâchement recouverts d’un film plastique (neuf) propre; si des matières volatiles sont présentes, les flacons individuels devraient être bien scellés
Volume de sédiment humide par récipient d’essai
  • 0,5 ± 0,05 g
Volume d’eau (sus-jacente) d’essai par récipient d’essai
  • 10 mL d’eau de mer naturelle non contaminée, filtrée (~ 60 µm)
Température moyenne
  • 15 ± 1 °C pour S. purpuratus et D. excentricus
  • 20 ± 1 °C pour L. pictus
  • la température instantanée doit se trouver dans les 3 °C de la température quotidienne moyenne
Oxygène/aération
  • non requis
pH et salinité
  • l’eau sus-jacente ne doit pas être ajustée avant ou pendant l’essai
Éclairage
  • éclairage normal de laboratoire (de 500 à 1 000 lux adjacent à la surface de l’eau est recommandé) et photopériode normale (16 heures d’éclairage et 8 heures d’obscurité)
Durée
  • la durée dépend de l’espèce; l’essai peut être prolongé de 24 h, selon le pourcentage de larves normales déterminé pour les six témoins « en milieu exclusivement aqueux » qui font partie de l’essai à cette fin; la fin présumée de l’essai pour chaque espèce est de 48 h pour L. pictus, de 72 h pour D. excentricus et de 96 h pour S. purpuratus
Observations
  • chaque organisme est évalué comme étant une larve normale (pluteus ou prisme) ou anormale; tout œuf non fécondé ne doit pas être compté ou évalué
Mesures
  • au début et à la fin de l’essai dans toutes les solutions témoin et d’exposition (toxique et sédiments de référence) : la température, la salinité, la teneur en oxygène dissous et le pH doivent être mesurés dans l’eau sus-jacente dans les deux répétitions réservées à cette fin; l’ammoniac total doit être mesuré (et l’ammoniac non ionisé doit être calculé) dans la solution témoin au début et à la fin de l’essai du toxique de référence ainsi que dans toutes les expositions aux sédiments au début et à la fin de l’essai
Paramètres
  • pourcentage d’embryons (c.-à-d. les œufs nouvellement fécondés) se développant en larves normales pendant l’essai (c.-à-d. Pn) et calculé pour chaque traitement selon la formule Pn = 100 (Ln/En), où : Ln = nombre de larves normales à la fin de l’essai et En = nombre d’embryons au début de l’essai dans les témoins « en milieu exclusivement aqueux »
Toxique de référence
  • il est recommandé d’utiliser le cuivre (comme le sulfate de cuivre ou le chlorure de cuivre) comme toxique de référence pour l’essai en milieu exclusivement aqueux; minimum de cinq concentrations d’expositions et de trois répétitions par concentration
Validité de l’essai
  • une moyenne de ≥ 60 % des embryons maintenue dans les enceintes du témoin « en milieu exclusivement aqueux » doit être considérée comme des larves développées normalement à la fin de l’essai
  • une moyenne de ≥ 60 % des embryons maintenue dans les enceintes du sédiment témoin doit être considérée comme des larves développées normalement à la fin de l’essai
Sédiment recueilli sur le terrain
Transport et entreposage
  • si la température de l’échantillon est > 7 °C, l’abaisser à 7 °C (avec de la glace ou des blocs réfrigérants); pendant le transport, garder les échantillons dans l’obscurité et maintenir la température entre 1 °C et 7 °C; les entreposer dans l’obscurité à 4 ± 2 °C; les échantillons ne doivent pas geler, pas même en partie, au cours du transport ou de l’entreposage, et on ne doit pas les laisser sécher; l’essai devrait commencer dans les deux semaines suivant le prélèvement et doit commencer dans les six semaines suivant le prélèvement
Sédiment de référence
  • essai parallèle avec un sédiment propre aux propriétés physicochimiques similaires (sédiment non contaminé), le cas échéant; autrement, utiliser un sédiment témoin
Caractérisation des échantillons
  • il faut caractériser tous les échantillons (c.-à-d. de sédiment de référence et de sédiment témoin), au moyen de sous-échantillons : dans le cas d’un sédiment entier, le pourcentage de sédiment grossier (p. ex. particules > 2,0 mm), de sables (p. ex. particules > 0,063 à ≤ 2,0 mm), de limons (p. ex. particules > 0,002 à ≤ 0,063 mm), d’argiles (p. ex. particules ≤ 0,002 mm), d’eau (humidité), la teneur en carbone organique total, la teneur en ammoniac total, la teneur en sulfure et le pH
Préparation de l’échantillon
  • il ne faut pas soumettre au tamisage hydraulique les échantillons de sédiment d’essai et de référence prélevés sur le terrain; il faudrait retirer les particules ≥ 2 mm ainsi que les gros débris ou les gros organismes indigènes à l’aide d’une pincette ou d’un gant; si un échantillon renferme un grand nombre de particules ≥ 2 mm ou beaucoup d’organismes indigènes macroscopiques, on peut soumettre l’échantillon à un tamisage sous pression (non hydraulique) au travers d’un tamis d’acier inoxydable à ouvertures convenablement calibrées (p. ex. < 2 mm); il faut homogénéiser de nouveau le sédiment et l’eau de porosité qui se seraient séparés au cours de l’expédition et de l’entreposage

4.5 Frai et fécondation

4.5.1 Collecte des gamètes en vue de l’essai

Dans le cadre de cette méthode de référence, il est essentiel d’atteindre un niveau élevé de fécondation afin de garantir un pourcentage suffisamment élevé d’œufs nouvellement fécondés dans chaque enceinte d’essai au début de l’essai. À cet égard, un taux de fécondation moyen ≥ 90 % pour l’essai doit être obtenu pour que l’essai soit entamé (APHA et al., 2005; McLeay, 2007). Une orientation à jour sur le frai des échinides adultes et les procédures de fécondation est fournie dans les sections 4.2.1, 4.2.2 et 4.2.3 d’Environnement Canada (EC, 2011); elle doit être consultée avant d’entreprendre cette méthode de référence. Cependant, la condition préalable pour obtenir un taux de fécondation moyen ≥ 90 % au début de l’essai a exigé une certaine répétition des procédures de la méthode SPE 1/RM/27 dans la présente méthode de référence.

Tableau 3 Aperçu des activités de l’essai et calendrier des manipulationsa
Jour -2 (c.-à-d. deux jours avant le début de l’essai)
  • filtrer (60 µm) et aérer l’eau de mer
Jour -1 (c.-à-d. un jour avant le début de l’essai)
  • des aliquotes de 0,5 g de sédiment homogénéisé (humide) sont ajoutées à chaque enceinte d’essai de 20 mL (minimum de huit répétitions par traitement, y compris le sédiment d’essai, le sédiment témoin et le sédiment de référence, le cas échéant); un volume de 10 mL d’eau de mer non contaminée filtrée (~60 µm) est ajouté à chaque flacon; la salinité doit être de 30 ± 2 g/kg; voir 4.6.2
  • chaque flacon doit être mélangé en l’agitant sur un agitateur vortex mécanique à une vitesse de 1 800 tr/min pendant 10 secondes
  • les flacons sont transférés à la zone d’essai, répartis aléatoirement (voir la figure 1), couverts et laissés en l’état une nuit dans les conditions de température et d’éclairage à utiliser pendant l’essai (voir 4.4 et tableau 1)
  • préparer les solutions du toxique de référence pour l’essai (trois répétitions par concentration) et les transférer à la zone d’essai
Jour 0 (début de l’essai)
  • le frai des échinides adultes est provoqué et les gamètes sont prélevés (4.5.1); le rapport spermatozoïdes:œufs est déterminé et la fécondation est provoquée (4.5.2 et 4.5.3)
  • dans les 15 à 30 minutes suivant la fécondation, déterminer si le taux de fécondation moyen est ≥ 90 % (voir 4.5.4); si ce taux est atteint, les embryons sont transférés dans toutes les enceintes d’essai, y compris celles utilisées pour la surveillance de la qualité de l’eau; les transferts devraient être terminés dans les 2 heures suivant la fécondation et doivent être terminés dans les 4 heures suivant la fécondation
  • compter le nombre d’œufs fécondés et non fécondés dans chacun des six (ou plus) flacons « en milieu exclusivement aqueux » inclus dans l’essai à cette fin (voir 4.6.4)
  • la température, la salinité, la teneur en oxygène dissous, le pH et l’ammoniac doivent être mesurés dans l’eau sus-jacente de l’une des deux répétitions (c.-à-d. « la septième répétition ») réservées à cette fin pour chaque traitement (p. ex. chaque échantillon en cours d’évaluation); [voir 4.6.3]
Fin présumée de l’essai
Jour 2 (48 h) : L. pictus
Jour 3 (72 h) : D. excentricus
Jour 4 (96 h) : S. purpuratus
  • une heure immédiatement avant la fin de ces durées d’essai propre à l’espèce, déterminer le pourcentage de larves normales dans six des témoins « en milieu exclusivement aqueux » restants (« flacons de surveillance »); si le pourcentage de larves normales est inférieur à 70 %, l’essai doit être prolongé de 24 heures afin de garantir que les critères de validité de l’essai (Pn ≥ 60 %) auront été satisfaits lorsque les organismes seront évalués et notés (voir 4.6.5 et 4.7)
  • si le pourcentage de larves normales dans les six flacons de surveillance « en milieu exclusivement aqueux » est ≥ 70 %, l’essai doit prendre fin; récupérer et préserver (avec du glutaraldéhyde) tous les embryons et toutes les larves des répétitions et des traitements de l’essai (répétitions 1 à 6)
  • la température, la salinité, la teneur en oxygène dissous, le pH et l’ammoniac doivent être mesurés dans l’eau sus-jacente de l’une des deux répétitions (c.-à-d. « la huitième répétition ») réservées à cette fin pour chaque traitement (p. ex. chaque échantillon en cours d’évaluation); [voir 4.6.6]

a Un essai toxicologique de référence « en milieu exclusivement aqueux » doit être réalisé en même temps que l’essai définitif, en utilisant des sous-groupes d’œufs tout juste fécondés provenant du même lot que celui ayant servi à effectuer l’essai définitif.

On provoque le frai en injectant aux échinides adultes du chlorure de potassium (KCl)Note de bas de page 8. On injecte aux oursins globuleux 0,5 à 1,0 mL de KCl 0,5 M à travers la membrane du péristome (c.-à-d. entre la lanterne d’Aristote et le test) selon un angle allant vers l’extérieur du test, dans le cœlomeNote de bas de page 9. La dose de KCl peut être divisée et injectée dans plusieurs endroits autour de la lanterne d’Aristote; on peut aussi secouer doucement l’oursin afin de répartir la dose dans son organisme. Dans le cas des oursins plats, on injecte, à un angle, 0,5 mL de la même solution dans la bouche. Une seringue à tuberculine munie d’une aiguille de calibre 25 convient parfaitement.

La technique privilégiée et recommandée pour recueillir le sperme des oursins globuleux est la « collecte à sec ». Une fois le sperme mouillé, sa viabilité diminue grandement. Le sperme devrait donc être recueilli à sec pour qu’il reste viable aux fins de la vérification des gamètes et du prétest, puis de l’essai. Il faut prendre bien soin d’éviter que le sperme « sec » soit contaminé par l’eau ou par la solution de KCl injectée aux organismes pour provoquer le frai. Une des techniques de collecte à sec consiste à placer un mâle adulte, face aborale vers le bas, dans un bécher sec ou une boîte de Petri sèche. On recueille ensuite le sperme au fond du contenant (plutôt qu’à la surface de l’animal). Une autre technique consiste à déposer les mâles sur leur face aborale dans un bécher (c.-à-d. avec le côté du corps opposé à la bouche vers le haut), puis à ajouter de l’eau témoin/de dilution jusqu’à mi-hauteur du test. Le sperme, qui est exsudé par les pores et qui s’accumule sur la surface de l’organisme, est recueilli à l’aide d’une micropipette, transféré dans une petite éprouvette munie d’un bouchon ou d’un couvercle, puis conservé sur de la glace. Ici encore, il faut s’assurer que la surface sur laquelle le sperme sera libéré (c.-à-d. le fond d’une boîte de Petri ou la surface de l’oursin) est sèche pour éviter de mouiller le sperme et, ainsi, de l’activer.

Les clypéastres excentriques pourraient ne pas produire une quantité suffisante de sperme lorsqu’on utilise la technique de collecte à sec. On peut provoquer le frai de ces clypéastres dans un volume minimal d’eau de mer (5 mL)Note de bas de page 10, mais ils devraient être placés au-dessus d’un bécher de façon à être suspendus au-dessus de la colonne d’eau. Il a été constaté que les oursins plats ne fraient pas si leur face aborale est en contact direct avec le fond d’une boîte de Petri rincée à l’eau de mer.

Le sperme recueilli à sec peut être conservé sur de la glaceNote de bas de page 11 pendant quatre heures avant d’être « activé » dans de l’eau de mer; il peut ensuite être utilisé pour un essai dans un délai de deux à quatre heures. Si on recueille le sperme dans des béchers remplis d’eau de mer, on devrait commencer l’essai dans les 30 minutes à 120 minutes après la fin de la collecte. Dans l’intervalle, il faut le conserver dans une quantité minimale d’eau, sur de la glace.

Si on provoque le frai dans de l’eau (la méthode privilégiée pour le clypéastre et les femelles d’autres espèces), on place l’organisme sur sa face aborale dans un petit bécher d’une capacité de 50 à 250 mL ou d’une taille appropriée, entièrement rempli d’eau témoin/de dilution à la température d’essai. Une fois le frai terminé, on extrait le plus d’eau possible des gamètes. On peut aussi placer les femelles sur leur face orale dans un récipient contenant juste assez d’eau témoin/de dilution pour couvrir le test à hauteur de ~ 1 cm. Les œufs sont ensuite recueillis sur la surface du test, puis transférés dans un petit bécher ou un autre récipient approprié. On rince les œufs à trois reprises. On ajoute d’abord 100 mL d’eau témoin/de dilution, on mélange, on laisse reposer 10 minutes, puis on décante. Si on recueille une substance pigmentée en même temps que les œufs, il serait indiqué de rincer ces derniers aussitôt que possible après la collecte, car cette substance peut être toxique pour l’oursin violet du Pacifique et, dans certains cas, pour d’autres espècesNote de bas de page 12. Les œufs peuvent être conservés dans la dernière eau témoin/de dilution, à la température d’essai, pendant au plus 4 heures avant leur utilisation. Il est recommandé d’aérer légèrement les œufs à l’aide d’une pipette Pasteur pendant ce temps.

Si le frai ne se produit pas dans les cinq à dix minutes suivant l’injection, on peut faire une deuxième injection, mais cela peut amener les organismes à libérer des gamètes immatures ou de qualité médiocre. L’adulte devrait libérer le sperme ou les œufs sous la forme d’un filet continu, moins de 30 minutes après la dernière injection. Le sperme libéré dans l’eau prend l’aspect d’un filet dense et blanc, alors que les œufs ont un aspect granulaire et sont généralement de couleur pastel (rosâtre chez les oursins plats). Il arrive parfois que des substances colorées soient exsudées avant ou pendant le frai, mais il ne faudrait pas les confondre avec les gamètes.

La collecte des gamètes devrait prendre fin 15 minutes après le début de leur libération. Il faudrait recueillir suffisamment de gamètes des mêmes organismes pour la vérification des gamètes, le prétest et l’essai définitif.

Les différents prélèvements de gamètes provenant du même organisme sont normalement combinés à l’aide d’une pipette. Pour la manipulation des œufs, beaucoup de responsables d’essai se servent de micropipettes en plastique, d’une capacité de 1 mL, qu’ils amputent de 2 à 3 mm à l’aide d’un scalpel afin d’obtenir un diamètre de 1 mm et de réduire ainsi les risques de dommage aux œufs.

Le sperme recueilli selon cette méthode de référence devrait provenir d’au moins trois échinides mâles adultes de l’espèce choisie, tandis que les œufs devraient provenir d’au moins trois femelles adultes. Étant donné que le sperme ou les œufs d’un organisme donné peuvent être particulièrement sensibles ou, à l’inverse, tolérants, on devrait chercher à obtenir des unités expérimentales homogènes (c.-à-d. éviter des variations en lien avec les parents). La seule façon pratique de procéder consiste à combiner les gamètes mâles ou femelles provenant de parents différents avant de les transférer dans les récipients d’essai; toutefois, la combinaison de gamètes de bonne qualité et de qualité médiocre peut nuire au succès de la fécondation. En conséquence, il faut vérifier les gamètes (voir le paragraphe suivant) de chaque mâle et de chaque femelle afin de s’assurer que seuls les gamètes de bonne qualité serviront à l’essai. Il est possible d’utiliser les gamètes d’un seul adulte de chaque sexe (c.-à-d. un mâle et une femelle) dont les gamètes ont un bon succès de fécondation; toutefois, dans ces conditions, il faut effectuer une vérification des gamètes et un prétest. Il faut vérifier les gamètes pour s’assurer que le sous-échantillon de gamètes des mâles et des femelles adultes choisis comme sources probables de sperme et d’œufs pour l’essai présente un taux de viabilité élevé. Pour ce faire, on choisit au moins trois femelles et trois mâles dont on examinera les gamètes respectifs au microscope. On provoque le frai de chaque organisme et on dépose les gamètes dans des récipients distincts. On conserve séparément le sperme de chaque mâle sur de la glace. On en dilue une petite quantité (p. ex. 0,1 mL) avec de l’eau témoin/de dilution (p. ex. 10 mL) sur une lame pour évaluer au microscope la motilité des spermatozoïdes. On examine également au microscope les œufs de chaque femelle. Les œufs de qualité médiocre sont petits, vacuolisés et de forme irrégulière (c.-à-d. formation de petites cavités dans le cytoplasme liées par une seule membrane).

On transfère ensuite dans plusieurs flacons à scintillation de petites aliquotes (p. ex. 0,1 mL) d’œufs de chaque femelle dont les œufs sont de « bonne qualité »Note de bas de page 13. On féconde des groupes distincts d’œufs provenant de chaque lot de « bonne qualité » avec quelques gouttes de sperme dilué provenant lui aussi de lots de « bonne qualité ». Par exemple, si l’examen porte sur les gamètes de 4 femelles et de 3 mâles, on prépare 3 flacons d’œufs avec 10 mL d’eau de mer par femelle (c.-à-d. un flacon d’œufs pour chaque mâle dont on a provoqué le frai). On verse dans chaque flacon 5 à 7 gouttes de sperme légèrement dilué (soit 20 à 50 μL de sperme concentré ou « sec » dans 10 mL d’eau de mer filtrée) de l’un des 3 mâles (les œufs de chaque flacon sont fécondés avec le sperme d’un mâle différent). Après 10 minutes, on observe au microscope chaque mélange de sperme et d’œufs pour déterminer le pourcentage de fécondation. On évalue la qualité du sperme d’après la motilité, l’activité et l’agglutination des spermatozoïdes et d’après le succès de la fécondation. On évalue la qualité des œufs d’après leur forme, leur couleur et leur taille et d’après le succès de la fécondation.

4.5.2 Préparation de suspensions types de gamètes

On combine le sperme des oursins globuleux ou des oursins plats choisis après vérification des gamètes (voir 4.5.1) afin d’obtenir une suspension concentrée de sperme de qualité. Si le sperme a été recueilli dans des béchers remplis d’eau, on doit le prélever sur le fond des béchers à l’aide d’une pipette. Le sperme devrait être transféré lentement (pour ne pas provoquer de cavitation) à l’aide d’une micropipette (diamètre de ≥ 1 mm) et déposé dans l’eau en vidant la pipette et en la rinçant à plusieurs reprises avec l’eau dans laquelle on dépose le sperme.

La densité spermatique de la suspension initiale est évaluée à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un autre appareil de numération cellulaire d’une capacité de grossissement de 400 foisNote de bas de page 14. Pour ce faire, on dilue 100 à 1 000 fois (selon la concentration du sperme) une petite quantité (0,1 à 1 mL) de la suspension avec de l’acide acétique cristallisable à 10 %, préparé avec de l’eau témoin/de dilution. Il faut ensuite mélanger en retournant dix fois le récipient, puis attendre que les bulles disparaissent, ce qui prend une à deux minutes. On place une goutte du mélange dans la chambre de numération de l’hémocytomètre et on attend 15 minutes afin que les spermatozoïdes se déposent. Il faut compter les spermatozoïdes qui se trouvent dans les 400 petits carrés du milieu. On calcule le nombre de spermatozoïdes présents dans 1 mL de suspension initiale à l’aide de l’équation suivante : (facteur de dilution) × (nombre de spermatozoïdes dans les 400 carrés) × (facteur de conversion de l’hémocytomètre) × (facteur de conversion des millimètres cubes en millilitres) ÷ (nombre de carrés comptés).

Si on utilise un hémocytomètre type (Neubauer), l’équation est la suivante :

nombre de spermatozoïdes/mL = 100 × (spermatozoïdes dénombrés) × 4 000 × 1 000 ÷ 400

Il faut amener la concentration de la suspension initiale de sperme à la concentration désirée pour une suspension type, en utilisant de l’eau témoin/de dilutionNote de bas de page 15. La concentration de cette suspension type est déterminée par le rapport spermatozoïdes:œufs choisi (voir la section 4.5.3)Note de bas de page 16. On peut facilement déterminer les dilutions à utiliser grâce à l’équation type suivante :

C1 × V1 = C2 × V2

« concentration 1 × volume 1 = concentration 2 × volume 2 ».

Par exemple, si la numération révèle que la concentration de la suspension initiale est de 125 millions de spermatozoïdes/mL et qu’on désire utiliser 5 mL d’une suspension type dont la concentration est de 40 millions/mL, on pourrait calculer comme suit le volume nécessaire (V1) de la suspension initiale qui devra être porté à 5 mL :

125 × V1 = 40 × 5, donc V1 = 1,6 mL.

La densité de la suspension d’œufs est ensuite déterminée. Pour cette méthode de référence, une densité cible d’embryons (c.-à-d. œufs nouvellement fécondés) de ~ 200 œufs par aliquote de 200 μL (dans des volumes d’exposition de 10 mL) est nécessaire (équivaut à une densité de 20 œufs par 20 μL ou de 100 000 œufs par 100 mL). Cela représente l’ajout de ~ 200 œufs (≥ 90 % fécondés et < 10 % non fécondés) à chaque flacon de 10 mL. Pour la numération, on ajoute 20 μL (ou un autre volume connu) de la suspension à une cellule de Sedgwick-Rafter et on l’observe sous un grossissement de 20 à 100 fois. Toute autre technique de numération jugée efficace peut être utilisée. Il est possible de réduire la densité d’œufs en y ajoutant de l’eau témoin/de dilution ou, s’il faut augmenter la densité, en laissant les œufs sédimenter avant d’extraire l’eau de la suspension.

4.5.3 Rapport spermatozoïdes:œufs

Chaque laboratoire doit déterminer le rapport optimal spermatozoïdes:œufs de façon à atteindre un taux de fécondation moyen ≥ 90 %.

Les rapports qui suivent, signalés par des laboratoires du Canada et des États-Unis, ont permis d’obtenir un taux de fécondation moyen ≥ 90 % pour les organismes d’essai à utiliser dans le cadre de cette méthode de référence : 20 000:1 pour L. pictus, 500:1 à 20 000:1 pour S. purpuratus, et 2 000:1 pour D. excentricus. Des lignes directrices aussi sommaires ne doivent toutefois pas garantir l’obtention de résultats satisfaisants par tous les laboratoires et pour toutes les périodes du frai.

On devrait établir le rapport spermatozoïdes:œufs approprié immédiatement avant chaque essai, en se servant des gamètes qui seront utilisés dans l’essai. On peut utiliser un ou deux (possiblement plus) rapports spermatozoïdes:œufs dans le prétest. Par conséquent, en se fondant sur les résultats obtenus, on pourrait porter le nombre de gamètes qu’on désire utiliser sur une « courbe du succès de la fécondation » construite à partir des expériences antérieures du laboratoire, ce qui permettrait de choisir un rapport approprié pour l’essai.

Un autre prétest peut être effectué pour déterminer le rapport spermatozoïdes:œufs à utiliser pour obtenir un taux de fécondation ≥ 90 % (Carr et Chapman, 1995). Ainsi, on fait appel à deux répétitions de l’eau témoin/de dilution et à une répétition de chacune des trois concentrations d’un toxique de référence en regard desquelles chaque rapport spermatozoïdes:œufs (c.-à-d. cinq) sera mesuré afin de déterminer celui qui sera « optimal » pour l’essai. Les rapports spermatozoïdes:œufs employés dans le prétest devraient couvrir une plage étendue de concentrations spermatiques (p. ex. différence de concentration spermatique dix fois supérieure). Une fois le pourcentage de fécondation établi pour tous les rapports spermatozoïdes:œufs de chaque traitement, on se base sur le taux de fécondation obtenu dans l’eau témoin/de dilution (taux moyen de fécondation ciblé : ≥ 90 %) pour choisir le rapport spermatozoïdes:œufs qui maximisera la possibilité d’obtenir, avec le toxique de référence, des résultats qui se situeront à l’intérieur des limites de la zone de confiance de la carte de contrôle. Cette façon de procéder permet de choisir le rapport spermatozoïdes:œufs affichant la sensibilité qui convient quant au taux de fécondation moyen de ≥ 90 %.

4.5.4 Préparation des œufs fécondés pour l’essai et la vérification du taux de fécondation

Au jour 0 (immédiatement après la détermination du rapport spermatozoïdes:œufs), dans les 15 à 30 minutes suivant la fécondation du lot d’œufs à utiliser avec la présente méthode de référence, au moins 5 sous-échantillons répétés doivent être examinés afin d’évaluer le taux de fécondation dans l’eau de mer utilisée comme eau sus-jacente pour toutes les répétitions et tous les traitements inclus dans l’essai. Les données de ces 5 répétitions servent à confirmer que le taux de fécondation moyen au début de l’essai, dans les conditions d’essai définies pour chaque traitement, était ≥ 90 %.

Pour chacune des 5 répétitions, au moins 100 œufs de chaque répétition devraient être transférés dans une cellule de Sedgwick-Rafter ou une cellule similaire. Il faudrait ensuite compter, noter et documenter comme étant fécondés ou non 100 œufs (fécondés ou non fécondés) de chaque répétition. La fécondation est déterminée par la présence ou l’absence d’une membrane de fécondation. L’absence de membrane indique que l’œuf n’est pas fécondé.

Si le pourcentage de fécondation moyen est ≥ 90 %, l’essai peut commencer. Cependant, si le taux de fécondation moyen est < 90 %, on peut ajouter plus de spermatozoïdes au mélange spermatozoïdes:œufs, puis réexaminer le taux de fécondation conformément à la section précédente. Un taux de fécondation moyen de < 90 % après le deuxième ajout de spermatozoïdes indique que les gamètes sont de qualité médiocre (APHA et al., 2005), et ils ne doivent pas être utilisés pour fournir des œufs nouvellement fécondés dans le cadre de la présente méthode de référence. Dans ce cas, les responsables de l’essai doivent provoquer le frai d’organismes supplémentaires afin de tenter d’obtenir des gamètes de meilleure qualité et d’atteindre un taux de fécondation moyen connexe de ≥ 90 %.

Voici un aperçu de la méthode utilisée pour déterminer le taux de fécondation avant le début de l’essaiNote de bas de page 17 :

  1. Provoquer le frai des échinides, prélever les gamètes et vérifier la qualité des gamètes.
  2. Mener le prétest afin de déterminer le rapport spermatozoïdes:œufs nécessaire pour atteindre un taux de fécondation moyen ≥ 90 % (conformément à 4.5.3).
    1. Dans cet exemple, le prétest a indiqué qu’un rapport spermatozoïdes:œufs de 2 000:1 avait produit un taux de fécondation moyen ≥ 90 %.
  3. Verser le contenu d’une pipette de 100 µL d’œufs concentrés dans un flacon contenant 10 mL d’eau témoin/de dilution.
  4. Déterminer la densité d’œufs dans un volume de 20 µL de l’étape 3 (la cible est ~ 200 œufs par 200 µL).
    1. 18 œufs par volume de 20 µLont été comptés.
  5. Calculer le volume d’œufs concentrés nécessaire pour atteindre une densité de 200 œufs/200 µL dans un volume de suspension d’œufs de 100 mL.
    1. Selon l’étape 4, augmentation du rapport = 1,11.
    2. Par conséquent, 110 µLd’œufs dans 10 mL ou 1,1 mLd’œufs par 100 mL (X).
  6. Ajouter ~ 98 mL d’eau témoin/de dilution à un bécher de 200 mL.
  7. Ajouter le volume d’œufs calculé (X = 1,1 mL)Note de bas de page 18.
  8. Ajouter le volume de spermatozoïdes calculé.
    1. En suivant la formule indiquée dans 4.5.2 et en supposant que la suspension spermatique initiale était de 200 millions/mL, ajouter 1 mL de la suspension spermatique initiale au bécher de 200 mL pour obtenir un rapport spermatozoïdes:œufs de 2 000:1 dans un volume de 100 mL.
  9. Mélanger à l’aide d’une pipette Pasteur et aérer légèrement.
  10. Permettre une période de fécondation de 15 à 30 minutes.
  11. Transférer 200 µL dans 5 flacons contenant 10 mL d’eau témoin/de dilution.
  12. Ajouter 1 mL de glutaraldéhyde à 0,5 % pour préserver les œufs nouvellement fécondés aux fins d’examenNote de bas de page 19.
  13. Pour chacune des 5 répétitions, compter un minimum de 100 œufs (fécondés et non fécondés) et les noter comme étant fécondés ou non.
  14. Consigner le nombre et le pourcentage d’œufs fécondés dans chacune des 5 répétitions, et calculer la moyenne.
    1. Si le taux de fécondation moyen était ≥ 90 %, une aliquote identique d’œufs (fécondés et non fécondés) du lot est ensuite transférée à chaque flacon d’essai. Les transferts devraient être achevés dans les 2 heures suivant la fécondation et doivent être achevés dans les 4 heures suivant la fécondation (voir 4.6.4).
    2. Si le taux de fécondation moyen est < 90 %, on peut ajouter plus de spermatozoïdes au mélange spermatozoïdes:œufs, puis réévaluer le taux de fécondation (voir 4.5.4).

4.6 Méthodes d’essai

4.6.1 Aperçu du plan d’expérience

Selon le plan d’expérience, les éléments suivants doivent faire partie de chaque essai :

  1. un minimum de huit flacons renfermant le sédiment témoin;
  2. un minimum de huit flacons renfermant chaque sédiment d’essai à l’étude;
  3. un minimum de 23 flacons « en milieu exclusivement aqueux » est exigé pour mener les essais des sédiments conjointement avec un essai toxicologique de référence
    • 14 flacons « dans l’eau seulement » sont nécessaires pour mener un essai toxicologique de référence seul : 6 flacons pour En, 2 flacons pour la surveillance de la qualité de l’eau au début et à la fin de l’essai, 3 flacons pour la surveillance à la fin présumée de l’essai, 3 flacons pour juger la validité de l’essai;
  4. s’ils sont disponibles et font partie du programme d’échantillonnage sur le terrain, au moins huit flacons représentant un sédiment de référence approprié devraient aussi être intégrés au plan d’expérience. Certains plans d’expérience et programmes d’échantillonnage sur le terrain pourraient incorporer plus d’un sédiment de référence; dans ce cas, huit flacons sont nécessaires pour chacun de ces traitements distincts.

Dans chaque cas où huit flacons ou plus représentant un traitement individuel (échantillon de sédiment) sont utilisés, les organismes d’essai (c.-à-d. œufs nouvellement fécondés) sont placés dans tous les flacons, y compris ceux utilisés pour la surveillance de la qualité de l’eau. Six de ces flacons (ou plus) seront utilisés comme répétitions pour évaluer le développement des larves. Les septième et huitième répétitions (ou plus, selon les exigences d’analyse) seront utilisées pour mesurer la composition chimique de l’eau sus-jacente au début et à la fin de l’essai. Pour chacun de ces flacons de répétition, une aliquote mesurée de sédiment et d’eau de mer est ajoutée, suivi d’un mélange normalisé du contenu de chaque flacon (voir 4.6.2) et de leur ajustement pendant la nuit dans les conditions de température et d’éclairage de l’essai.

Il faut préparer et utiliser 23 flacons (ou plus) « en milieu exclusivement aqueux » (auxquels les organismes sont ajoutés) aux fins suivantes :

4.6.2 Préparation des solutions d’essai

Au jour -1 (c.-à-d. le jour précédant le début de l’essai), au moins huit enceintes d’essai de répétition par traitement (c.-à-d. pour chaque sédiment d’essai et le sédiment témoin) sont préparées dans le laboratoire.

Après le mélange (pour homogénéisation) de chaque sédiment d’essai (voir 4.3), une aliquote de 0,5 g de sédiment (humide) est ajoutée à chaque enceinte d’essai de 20 mL (minimum de huit répétitions par traitement). Par la suite, un volume de 10 mL d’eau de mer naturelle non contaminée et filtrée (~ 60 µm) est ajouté à chaque flacon pré-étiqueté (voir 4.4.2). L’eau de mer doit provenir d’une source naturelle dont la salinité se situe à 30 ± 2 g/kg.

Le contenu de chaque flacon doit ensuite être mélangé en agitant les flacons individuels sur un agitateur vortex mécanique (approprié pour les flacons à scintillation ou les flacons cylindriques à fond plat) à une vitesse de 1 800 tr/min pendant 10 secondesNote de bas de page 21. Par la suite, tous les flacons (y compris les 23 flacons « en milieu exclusivement aqueux ») à utiliser dans l’essai doivent être transférés à la zone d’essai, où ils sont répartis aléatoirement, couverts et laissés en l’état une nuit dans les conditions de température et d’éclairage à utiliser pendant l’essai (voir 4.4 et le tableau 2). Pour l’exposition, on place les récipients dans un support pour tubes à essai ou tout autre type de support, lui-même placé dans un bain-marie ou un autre appareil à température contrôlée. Les récipients doivent être disposés de façon aléatoire à l’intérieur de chaque colonne du support; chaque colonne représentant un échantillon/traitement et un témoin (p. ex. les échantillons/traitements sont disposés de façon aléatoire, mais les répétitions sont conservées ensemble). Chaque récipient doit porter une étiquette ou un code correspondant à sa position, ce qui permettra d’identifier les échantillons/traitements et les répétitions. La figure 1 présente un exemple de répartition aléatoire dans un essai.

4.6.3 Qualité de l’eau au jour 0

Au début de l’essai, la température, la salinité, la teneur en oxygène dissous et le pH doivent être mesurés dans l’eau sus-jacente de l’une des deux répétitions (c.-à-d. « la septième répétition »; voir 4.6.1) réservées à cette fin pour chaque traitement. Dans le cas de l’essai de toxique de référence, l’ammoniac total doit être mesuré au début de l’essai dans le témoin « en milieu exclusivement aqueux » correspondant soumis à l’essai conjointement avec le toxique de référence. On doit aussi mesurer l’ammoniac total dans toutes les expositions aux sédiments au début de l’essai, y compris dans le témoin « en milieu exclusivement aqueux » correspondant. Les valeurs relatives à l’ammoniac doivent être exprimées sous forme d’ammoniac total (tel qu’il a été mesuré) et, par calcul, d’ammoniac non ionisé. Le pourcentage d’ammoniac non ionisé dans l’ammoniac total est déterminé par le pH et la température. La formule suivante peut être utilisée pour calculer la concentration d’ammoniac non ionisé :

Ammoniac non ionisé (mg/L) = ammoniac total (mg/L) × [1 / (1 + 10 pKa – pH)]
(Emerson et al., 1975)
où : pH est celui mesuré dans l’eau sus-jacente
pKa (la constante de dissociation acide de NH4+) = 0,09018 + 2729,92/T
T = température en kelvinNote de bas de page 22

L’annexe F présente une comparaison de la sensibilité des espèces à l’ammoniac (selon l’essai mené pendant l’élaboration de la méthode).

4.6.4 Exposition (début de l’essai)

Au jour 0, le frai des échinides adultes qui fourniront les organismes d’essai (c.-à-d. œufs nouvellement fécondés) est provoqué, le rapport spermatozoïdes:œufs approprié est déterminé, et la fécondation est provoquée (voir 4.5).

WO-6 C-2 A-8 G-1 D-4 B-5 E-8 WO-16 F-5 WO-21
WO-3 C-1 A-4 G-6 D-3 B-2 E-3 WO-9 F-5 WO-15
WO-7 C-3 A-6 G-8 D-7 B-7 E-1 WO-11 F-2 WO-17
WO-5 C-4 A-7 G-2 D-2 B-1 E-2 WO-14 F-1 WO-22
WO-1 C-8 A-2 G-7 D-8 B-6 E-7 WO-15 F-7 WO-20
WO-2 C-5 A-5 G-5 D-5 B-3 E-4 WO-13 F-3 WO-19
WO-8 C-3 A-1 G-4 D-1 B-4 E-5 WO-10 F-4 WO-23
WO-4 C-7 A-3 G-3 D-6 B-8 E-7 WO-12 F-6 WO-18

Figure 1 Exemple de répartition aléatoire des échantillons dans un essai. Les traitements sont étiquetés de A à F; « WO » indique les témoins « en milieu exclusivement aqueux ». Les répétitions sont étiquetées de 1 à 8. Les traitements d’échantillon sont disposés de façon aléatoire afin que chaque colonne du support ait un traitement. Les échantillons répétés de chaque traitement sont aussi disposés de façon aléatoire, mais ils sont conservés dans leur colonne appropriée. La totalité du traitement A est soulignée pour illustrer que toutes ses répétitions se trouvent dans la même colonne.

Par la suite, et dans les 15 à 30 minutes suivant la fécondation, le lot d’œufs est vérifié pour déterminer si un taux de fécondation moyen ≥ 90 % a été atteint (voir 4.5.4). Si ce taux de fécondation est atteint, une aliquote d’embryons de 200 μL est transférée dans toutes les enceintes d’essai, y compris celles réservées à la surveillance de la qualité de l’eau. Chaque aliquote de 200 µL représentera l’ajout de ~ 200 œufs, composés de ≥ 90 % d’œufs nouvellement fécondés et d’un faible pourcentage ( < 10 %) d’œufs non fécondés.

Les transferts aux flacons d’essai devraient être achevés dans les deux heures suivant la fécondation et doivent être achevés dans les quatre heures suivant la fécondation. Pendant le transfert des aliquotes individuelles du bassin d’œufs nouvellement fécondés, les œufs de ce bassin doivent être conservés dans une suspension homogène. Pour ce faire, on peut les remuer doucement à la main à l’aide d’une tige en verre immédiatement avant de retirer chaque aliquote. Une ventouse perforée (disque de plastique comprenant de nombreux trous, attaché à une tige de plastique) peut aussi être utilisée pour mélanger doucement et minutieusement le bassin d’œufs lors de chaque transfert (APHA et al., 2005). Par la suite, une pipette (une pipette à répétition de préférence) avec une extrémité de grand diamètre (orifice de ~ 2 mm) est utilisée pour transférer une aliquote de 200 μL dans chaque flacon. Les flacons doivent être recouverts (voir la section 3) une fois tous les transferts terminés.

Six flacons « en milieu exclusivement aqueux » sont ensuite vérifiés pour déterminer le taux de fécondation dans l’eau de mer utilisée comme eau sus-jacente pour toutes les répétitions et tous les traitements inclus dans l’essai, au début de l’essai (0 h). Une aliquote de 1 mL de glutaraldéhyde à 0,5 % est ajoutée directement à chaque flacon d’essai, et les méthodes décrites à la section 4.7.2 sont suivies pour :

i) confirmer que le taux de fécondation moyen au début de l’essai, dans les conditions d’essai définies pour chaque traitement, était ≥ 90 %;

ii) fournir une estimation du nombre d’œufs fécondés (embryons) dans chaque traitement au début de l’essai (En), qui sert à calculer le pourcentage de larves normales pour chaque traitement à la fin de l’essai (voir 4.8).

Le nombre (et le pourcentage) d’œufs fécondés et non fécondés dans chaque répétition doit être consigné, et la moyenne (± ET) pour les six répétitions doit être calculée et consignée. Ce nombre (moyen) représente la valeur « En » utilisée pour calculer les paramètres d’essai de chaque traitement (voir 4.8) et déterminer si le critère de validité de l’essai a été satisfait (voir 4.9).

4.6.5 Durée de l’essai

La durée de l’essai dépend de l’espèce. La durée de l’essai peut être prolongée de 24 ± 1 h, selon le pourcentage de larves normales déterminé pour les 6 témoins « en milieu exclusivement aqueux » qui font partie de l’essai à cette fin (voir 4.6.1). La fin présumée de l’essai pour chaque espèce est :

Dans l’heure précédant immédiatement la fin de ces durées propres à chaque espèce20, 6 des 17 témoins restants « en milieu exclusivement aqueux » devraient être préservés et examinés immédiatement après (voir 4.7.1 et 4.7.2) pour déterminer le pourcentage de larves normales dans chaque flacon.

Si la moyenne de larves normales dans les 6 » flacons de surveillance » en milieu exclusivement aqueux est ≥ 70 %, l’essai doit prendre fin, et on doit recouvrir et préserver tous les embryons et larves de chaque répétition et traitement (avec du glutaraldéhyde) en vue de les noter et de les compter ultérieurement (voir 4.7.1 et 4.7.2)Note de bas de page 23. Un ensemble de flacons « en milieu exclusivement aqueux » (les six derniers témoins « en milieu exclusivement aqueux » jumelés et notés conjointement avec les échantillons de sédiment) doit être transféré à de nouveaux flacons (comme s’il s’agissait d’un échantillon de sédiment) avant la préservation dans du glutaraldéhyde. Trois témoins « en milieu exclusivement aqueux » doivent être jumelés au toxique de référence et préservés sans être transférés à un nouveau flacon (comme ce serait le cas avec les expositions du toxique de référence).

Si, à la fin présumée de l’essai, le taux moyen de larves normales dans les flacons de surveillance est < 70 %, l’essai doit être prolongé de 24 h afin de s’assurer que le critère de validité de l’essai [Pn ≥ 60 %] est respecté lorsque les organismes sont évalués et notés. À ce moment (c.-à-d. 72 h pour L. pictus, 96 h pour D. excentricus et 120 h pour S. purpuratus), l’essai doit prendre fin, et tous les embryons et les larves de chaque répétition et traitement doivent être recouverts et préservés en vue de les noter et de les compter ultérieurement (comme il a été décrit précédemment).

4.6.6 Qualité de l’eau à la fin de l’essai

À la fin de l’essai, la température, la salinité, la teneur en oxygène dissous et le pH doivent être mesurés dans l’eau sus-jacente de l’une des deux répétitions (c.-à-d. « la huitième répétition »; voir 4.6.1) réservées à cette fin pour chaque traitement (ces paramètres sont aussi mesurés au début de l’essai). Dans le cas de l’essai de toxique de référence, l’ammoniac total doit être mesuré à la fin de l’essai dans le témoin « en milieu exclusivement aqueux » correspondant soumis à l’essai conjointement avec le toxique de référence. On doit aussi mesurer l’ammoniac total dans toutes les expositions aux sédiments à la fin de l’essai, y compris dans le témoin « en milieu exclusivement aqueux » correspondant soumis à l’essai conjointement avec le toxique de référence. Les variables de la qualité de l’eau devraient être réexaminées pour déterminer les caractéristiques de l’eau sus-jacente représentant chaque traitement à la fin de l’essai. Pour aider à interpréter les résultats de l’essai, il faudrait dresser un tableau de ces mesures à côté des mesures de la qualité de l’eau initiales (jour 0) correspondantes pour chaque traitement et des données tabulées faisant partie de chaque rapport sur les résultats de l’essai.

4.7 Observations et mesures (mettant fin à l’essai)

4.7.1 Récupération des embryons et des larves

Pour mettre fin à un essai, l’eau sus-jacente du sédiment dans chaque flacon d’essai est transférée dans un nouveau flacon à scintillation ou flacon cylindrique (étiqueté) à l’aide d’une pipette de 10 mLavec une ouverture ≥ 2 mm. L’ouverture minimale de 2 mm peut être réalisée en utilisant une pipette avec une extrémité de grand diamètre ou en coupant une extrémité à la taille requise. Par la suite, 1 mLde glutaraldéhyde à 0,5 % est ajouté pour préserver les embryons et les larves aux fins d’examen ultérieur. L’expérience montre que la transmission du sédiment peut poser problème pendant le comptage et la notation des organismes préservésNote de bas de page 24 . Par conséquent, pendant ce transfert, des précautions doivent être prises pour réduire au minimum la perturbation du sédiment dans le flacon (et la transmission du sédiment au nouveau flacon), tout en s’assurant que tous les organismes d’essai dans l’eau sus-jacente sont transférésNote de bas de page 25. Les témoins « en milieu exclusivement aqueux » qui sont jumelés aux échantillons de sédiment doivent aussi être transférés à de nouveaux flacons (comme s’il s’agissait d’un échantillon de sédiment) avant de les préserver avec du glutaraldéhyde.

Dans le cas de toutes les répétitions et de tous les traitements de l’essai toxicologique de référence (voir la section 5), une aliquote de 1 mL de glutaraldéhyde à 0,5 % est ajoutée directement à chaque flacon d’essai à la fin de l’essai. Les témoins « en milieu exclusivement aqueux » qui sont jumelés au toxique de référence sont aussi préservés sans être transférés à un nouveau flacon.

Par la suite, tous les flacons contenant les organismes d’essai et les agents de conservation sont couverts et conservés à température ambiante jusqu’à ce que leur contenu soit examiné et que le développement des larves soit évalué. Cet examen devrait avoir lieu dès que possible, et il doit être achevé dans les quatre semaines suivant la fin de l’essai.

4.7.2 Numération et notation des embryons et des larves

Chaque technicien de laboratoire responsable de la numération et de la notation des embryons et des larves d’échinides doit être formé et expérimenté dans ce domaine. Les photomicrographies montrant des larves pluteus normales et anormales, et les premiers stades du cycle biologique sont présentés aux figures 2 et 3, et sont utiles à cet égardNote de bas de page 26. On peut trouver d’autres photomicrographies de larves d’échinides en développement dans Lesser et Barry (2003). Pour chacune des espèces d’échinides candidates utilisées dans la présente méthode de référence, une distinction claire entre les œufs fécondés et non fécondés doit être constamment faite. Les responsables d’essai doivent aussi être en mesure de distinguer les larves « normales » (stade pluteus et prisme), des larves anormales (celles qui présentent des anomalies du développement telles que des bras asymétriques ou manquants, ou un développement retardé). Les larves au stade prisme sont généralement de forme triangulaire (pyramidale) sans prolongement en forme de bras. Les larves pluteus normales ont habituellement une forme pyramidale soutenue par une structure de bâtonnets squelettiques, un intestin interne qui est fixé à la paroi corporelle aux deux extrémités et qui comprend trois régions distinctes, et au moins une paire de bras post-oraux. La longueur des bras varie selon l’espèce (APHA et al., 2005). Chaque laboratoire utilisant une espèce différente devrait soigneusement comparer les embryons bien développés des échantillons témoins aux écarts de développement anormal dans un toxique afin de déterminer de façon constante ce qui est normal et anormal pour une espèce donnée.

Figure 2 Dessins illustrant les stades du développement clés des larves d’échinides normales se produisant au cours des 48 à 96 premières heures du développement, et des exemples de développement anormal ou interrompu.
Description textuelle - Figure 2

Reproduction avec l’autorisation de l’ASTM (2004). On peut obtenir un exemplaire de la norme intégrale auprès d’ASTM International, à l’adresse www.astm.org. Les exemples de développement normal et anormal d’embryons d’échinides sont tirés de Kinae et al., 1981, de Rulon, 1956 et de Timourian, 1969.

Les exemples de développement normal et anormal d’embryons d’échinides sont tirés de : Kinae, N., Hashizume, T., Makita, T., Tomita, I., Kimura, I., « Kraft Pulp Mill Effluent and Sediment can Retard Development and Lyse Sea Urchin Eggs, » Bulletin of Environmental Contamination Toxicology, 1981, vol. 27, p. 616–623; Rulon, O., « Effects of Cobaltous Chloride on Development in the Sand Dollar, » Physiological Zoology, 1956, vol. 29, p. 51–63; et Timourian, H., « The Effect of Zinc on Sea Urchin Morphogenesis, » Journal of Experimental Zoology, 1969, vol. 169, p. 121–132.

La figure 2 est reproduite, avec l’autorisation, à partir du guide E1563-98(2004)e1 Standard Guide for Conducting Static Acute Toxicity Tests with Echinoid Embryos, droits d’auteur ASTM International, 100 Barr Harbor Drive, West Conshohocken, PA 19428, USA. On peut obtenir un exemplaire de la norme intégrale auprès d’ASTM International, à l’adresse www.astm.org.

Figure 3 Stades du développement normal des embryons d’échinides (Lytechinus). Photo reproduite avec l’autorisation de Mme Judy Cebra-Thomas, Millersville University, Millersville, PA.

Description textuelle - Figure 3

Stades du développement normal des embryons d’échinides (Lytechinus).

À l’aide d’une approche de « compte total », pour chaque répétition, tous les embryons et larves récupérés à la fin de l’essai doivent être comptés et notés. Le nombre compté ne devrait pas dépasser le nombre d’œufs (fécondés et non fécondés) placés dans chaque flacon au début de l’essai (~ 200; voir 4.5.4), mais dans certains cas, ce nombre pourrait être légèrement supérieur ou sensiblement inférieur (p. ex. en raison du mélange ou de la précision de la pipette)Note de bas de page 27.

On peut utiliser deux approches pour compter et noter les larves conservées dans chaque flacon d’essai : la notation dans le flacon à l’aide d’un microscope inversé ou le recours à une cellule de Sedgwick-RafterNote de bas de page 28 .

Un microscope inversé permet d’évaluer tous les organismes dans un seul flacon sans avoir besoin de multiples transferts sur une cellule distincte ou une chambre de numération. Cependant, cette approche nécessiterait également l’utilisation de flacons cylindriques pour les essais (plutôt que des flacons à scintillation).

Si une cellule de Sedgwick-Rafter (ou une autre chambre du même type) est utilisée, le contenu de chaque flacon comportant ces organismes devrait être transféré dans la chambre ou la cellule pour la numération. Étant donné que le volume de la cellule ne fait que 1 à 2 mL, il pourrait être nécessaire de préparer et d’évaluer plus d’une lame afin de compter tous les embryons et larves récupérés dans chaque flacon. Puisque les embryons et les larves coulent normalement après la conservation, une grande partie de l’excédent d’eau dans le flacon peut être généralement décantée ou retirée avec soin afin de réduire le volume d’eau résiduelle qui doit être examiné au microscope. Toutes les précautions doivent être prises au moment d’ôter l’excédent d’eau afin de ne pas perdre par mégarde des embryons ou des larves à compter et à noter.

Avec une cellule de Sedgwick-Rafter, une approche pratique comprend l’utilisation d’une pipette de 10 mL réglée à 8,5 mL pour extraire (et retirer) une grande partie du volume d’eau de mer qui ne contient pas les organismes conservés. Ensuite, le volume de 1,5 mL restant dans le flacon est doucement remué à la main pour remettre en suspension les embryons et les larves. Ce plus petit volume est ensuite récupéré à l’aide d’une pipette de transfert, puis placé dans la chambre de numération. Un volume de 0,5 mL d’eau de mer filtrée est ensuite ajouté dans le flacon qui contenait auparavant les spécimens conservés, et le flacon est doucement remué à la main pour s’assurer que les embryons et larves restants qui auraient pu se coller aux parois du flacon s’en détachent et soient récupérés pour la notation. Même si cela n’est peut-être pas possible pour certains échantillons de sédiment, il faut éviter de secouer vigoureusement le flacon et de mélanger, car cela pourrait endommager les organismes (AquaTox, 2013). Chaque flacon devrait être porté à la lumière lorsqu’il est remué afin de voir si des embryons ou des larves restent collés aux parois du flacon et, si tel est le cas, de les récupérerNote de bas de page 29.

Le contenu de chaque flacon (si l’on utilise un microscope inversé) ou cellule de Sedgwick-Rafter contenant des organismes provenant d’un seul flacon d’essai devrait être examiné au microscope composé à une résolution convenable (p. ex. grossissement de 100x). Pour chaque répétition d’essai, i) les larves normales (au stade prisme ou pluteus) et ii) les larves anormales sont comptées et documentées. Les œufs non fécondés observés ne doivent pas être comptés ni notésNote de bas de page 30.

La durée habituelle pour la notation d’un flacon d’un échantillon « en milieu exclusivement aqueux » (à l’aide d’une cellule de Sedgwick-Rafter) était d’environ 15 minutes, par rapport à plus de 30 minutes pour un flacon d’organismes récupérés dans un échantillon de sédiment.

Le taux de récupération moyen à chaque traitement doit être calculé et déclaré avec les données sommaires connexes pour les paramètres de l’essai, une fois que la numération et la notation sont terminéesNote de bas de page 31. Cette valeur (à savoir le taux de récupération) est calculée en divisant la moyenne du nombre total de stades du cycle biologique récupérés à chaque répétition du traitement, par la moyenne du nombre total de stades du cycle biologique récupérés dans les témoins « en milieu exclusivement aqueux », et en multipliant le résultat par 100.

4.8 Paramètres et calculs

Le paramètre pour cette méthode de référence est basé sur le nombre de larves normales produites dans chaque répétition avant la fin de l’essai et sur le pourcentage de larves normales connexe calculé pour chaque traitement, à l’aide des méthodes et des conditions d’essai définies aux présentes.

Dans la détermination du « pourcentage de larves normales » pour chaque traitement, toutes les larves déformées et retardées, tous les embryons (déformés ou normaux) et tous les œufs fécondés qui ont été comptés et notés (section 4.7) doivent être considérés comme « anormaux » (APHA et al., 2005), le nombre restant (c’est-à-dire le nombre de larves normales que l’on trouve dans chaque répétition) étant utilisé dans la détermination.

Une fois que tous les organismes récupérés ont été comptés et notés (voir section 4.7), le nombre de larves normales (stades prisme et pluteus) dans chaque répétition doit être déterminé et consigné. De plus, la valeur moyenne représentant le « pourcentage de larves normales » doit être calculée et consignée pour toutes les répétitions à partir du même traitement (n = 6).

Selon APHA et al. (2005), le pourcentage de larves normales (Pn) est calculé pour chaque traitement comme suit :

Pn = 100(Ln/En)
Où : Ln = nombre moyen de larves normales dans 6 répétitions en fin d’essai
En = nombre moyen d’embryons dans 6 répétitions en début d’essai dans des témoins « en milieu exclusivement aqueux »

Dans le cas d’un essai avec toxique de référence effectué simultanément avec des échantillons de sédiments, la valeur Ln sera fondée sur 3 répétitions et la valeur En, sur 6 répétitions. Dans le cas d’un essai avec toxique de référence effectué séparément, les valeurs En et Ln seront toutes deux fondées sur 3 répétitions.

Le nombre moyen d’embryons en début d’essai (En) à utiliser dans ce calcul est le nombre moyen d’œufs récemment fécondés déterminé pour les 6 répétitions (ou plus, selon le plan d’expérience) de témoins « en milieu exclusivement aqueux », en début d’essai (voir 4.6.1). La valeur Ln est représentée par le nombre moyen de larves normales déterminé pour chacune des six répétitions (ou plus) dans ce traitement.

4.9 Critère de validité de l’essai

Pour la présente méthode de référence, le critère utilisé pour juger si les résultats d’un essai sont valides ou non est fondé sur la qualité du développement de l’embryon dans les répétitions représentant le témoin « en milieu exclusivement aqueux » et dans les répétitions des sédiments témoins.

Pour que les résultats d’un essai soient considérés comme étant valides, au moins 60 % des embryons en moyenne doivent être jugés comme étant des larves normalement développées à la fin de l’essai dans le : 1) témoin « en milieu exclusivement aqueux » et le 2) sédiment témoin de laboratoire. Le critère de validité doit être respecté dans les témoins « en milieu exclusivement aqueux » jumelés et notés conjointement avec le toxique de référence et les échantillons de sédiment.

La valeur du « pourcentage de larves normales » (Pn) atteint dans les témoins « en milieu exclusivement aqueux » et les témoins de sédiment à la fin de l’essai est calculée à l’aide de la même équation décrite dans la section 4.8, sauf que « Ln » représente le nombre moyen de larves normales trouvé dans les six répétitions (ou plus) des groupes témoins « en milieu exclusivement aqueux » (ou les groupes témoins de sédiments) à la fin de l’essai.

Section 5 – Modes opératoires pour les essais sur un toxique de référence

Il faut utiliser couramment un ou des toxiques de référence pour évaluer, dans des conditions d’essai normalisées, la sensibilité relative des lots de gamètes, et la précision et la fiabilité des données obtenues en laboratoire pour le ou les toxiques de référence choisis, ainsi que les compétences techniques du personnel de laboratoire qui réalise les essais (EC, 1990).

Un essai toxicologique de référence à concentrations multiples « en milieu exclusivement aqueux » doit être réalisé conjointement avec chaque lot d’organismes utilisé pour l’essai ou les essais de toxicité des sédiments effectués chaque jour, selon la présente méthode de référence. Cet essai à concentrations multiples doit être réalisé en même temps que l’essai définitif, en utilisant des sous-groupes d’œufs tout juste fertilisés provenant du même lot que celui ayant servi à effectuer l’essai définitifNote de bas de page 32.

Les critères sur lesquels sont fondées les recommandations relatives aux toxiques de référence sont les suivants :

Pour l’essai, on recommande le cuivre comme toxique de référence (sous forme de sulfate de cuivre ou de chlorure de cuivre). On devrait employer du sulfate de cuivre ou du chlorure de cuivre pour préparer les solutions mères, qui devraient être acides (pH 3-4). Ces solutions peuvent être utilisées immédiatement ou entreposées dans l’obscurité à 4 ± 2 °C pendant plusieurs semaines. La teneur en cuivre devrait être exprimée en µg Cu/L.

L’essai toxicologique de référence doit être effectué comme un essai à concentrations multiples dans le cadre duquel une CI50 est établie en fonction d’un pourcentage de larves normales (v. 4.8). Les résultats doivent être calculés et présentés en µg Cu/LNote de bas de page 33. L’analyse de régression (avec pondération binomiale) est la principale technique utilisée pour déterminer la CI50. Si l’analyse de régression ne convient pas, le programme ICPIN peut être utilisé. Au moins trois répétitions par traitement (concentration) et au moins cinq concentrations (plus le témoin « en milieu exclusivement aqueux ») sont nécessairesNote de bas de page 34. Les recommandations formulées à la section 4.5.2 du document publié par Environnement Canada en 2011 (EC, 2011) et à la section 6 du document publié en 2005 (EC, 2005) qui concernent la détermination d’une CIp au moyen d’analyses de régression (ou d’autres méthodes) devraient être considérées et suivies.

Afin de normaliser le plus possible cet essai toxicologique de référence, et conformément aux autres traitements dans cette méthode de référence, la salinité de l’eau témoin/de dilution utilisée pour l’essai sur le toxique de référence doit avoir une valeur de 30 ± 2 g/kg.

La concentration du toxique de référence dans toutes les solutions mères devrait être analysée chimiquement avec la méthode appropriée (p. ex. APHA et al., 1989, 2005). Au moment de préparer les solutions d’essai, il faudrait prélever des aliquotes du témoin et des concentrations faible, moyenne et élevée pour les analyser immédiatement ou les entreposer à des fins d’analyse ultérieure, dans l’éventualité d’une CIp se situant à l’extérieur des limites de confiance. Le cas échéant, les aliquotes doivent être entreposées dans l’obscurité à 4 ± 2 °C. Les solutions de cuivre devraient subir un traitement de conservation avant d’être entreposées (APHA et al., 1989, 2005). On devrait procéder à l’analyse chimique des aliquotes entreposées à cette fin dès que l’essai toxicologique est terminé. Le calcul de la CIp devrait être fondé sur les concentrations mesurées lorsque celles-ci diffèrent suffisamment (≥ 20 %) des concentrations nominales et lorsque la précision des analyses chimiques est satisfaisante.

Une fois qu’on dispose d’un nombre suffisant de données (cinq points de données) [EC, 1990], une carte de contrôle doit être établie et mise à jour pour chaque toxique de référence utilisé. On porte les CIp successives sur le graphique et on les examine pour déterminer si les résultats se situent dans l’intervalle de ± 2 ET des valeurs obtenues dans les essais précédents.

Pour chaque CIp, on recalcule la moyenne géométrique ainsi que les limites de la zone de confiance supérieure et inférieure (± 2 ET, calculé en fonction des données logarithmiques)Note de bas de page 35 jusqu’à ce que les statistiques se stabilisent (USEPA, 1989, EC, 1990).

Il est nécessaire de tracer une carte de contrôle distincte pour chaque espèce d’échinide qui est utilisée pour l’essai définitif de la toxicité des sédiments réalisé conformément à cette méthode de référence. Les données reportées sur cette carte de contrôle doivent être obtenues à partir du même toxique de référence (c.-à-d. le sulfate de cuivre) et en employant des modes opératoires et des conditions d’essai identiques à ceux décrits pour cette méthode de référence.

Si une CI50 donnée tombe à l’extérieur des limites de la zone de confiance, il convient de mettre en doute la sensibilité des organismes d’essai, et l’exécution et la précision de l’essai. Comme cette situation peut se produire dans 5 % des cas par le simple jeu du hasard, l’obtention d’une seule valeur aberrante de la CIp n’est pas nécessairement un signe de sensibilité anormale du lot de gamètes ou de précision insatisfaisante des données toxicologiques; c’est seulement un avertissement. Si cela se produisait, on devrait procéder à un examen approfondi de toutes les conditions de maintien des organismes et des conditions d’essai.

Le fait que les résultats soient tous à l’intérieur des limites de la zone de confiance n’est pas nécessairement un gage de la cohérence des résultats obtenus par le laboratoire. Des données historiques extrêmement variables pour un toxique de référence donné élargiraient ces limites à un point tel qu’un nouveau résultat d’essai pourrait se trouver à l’intérieur des limites, tout en représentant une variation indésirable dans les résultats de l’essai. On trouvera des indications sur la variation raisonnable des données sur les toxiques de référence (c.-à-d. les limites de la zone de confiance d’une carte de contrôle) à la sous-section 2.8.1 et à l’annexe F d’Environnement Canada (2005).

Une CIp qui tombe à l’extérieur des limites de contrôle (moyenne ± 3 ET) révèle presque à coup sûr que l’essai est inacceptable et qu’il devrait être repris après un examen attentif de tous ses aspects. Si les paramètres se situent entre les limites de contrôle et les limites de la zone de confiance plus de 5 % du temps, cela révélerait une détérioration de la précision. Encore là, l’essai le plus récent devrait être repris après un examen attentif des modes opératoires, des conditions et des calculs.

Section 6 – Analyse et interprétation des données

6.1 Analyse des données

L’objectif de l’analyse des données est de quantifier les effets des contaminants sur les sous-groupes d’organismes d’essai exposés aux divers traitements préoccupants et de déterminer si ces effets sont statistiquement différents de ceux qui se produisent dans des sédiments témoins ou de référence.

Initialement, les paramètres [c.-à-d. le « pourcentage de larves normales » (Pn); v. 4.8] sont calculés pour les échantillons répétés représentant chaque traitement (y compris ceux qui représentent les traitements témoins et les traitements de référence).

Chaque étude consiste en au moins huit flacons contenant un sédiment témoin, huit flacons contenant chacun un sédiment d’essai à l’étude et, s’ils sont disponibles et font partie du programme d’échantillonnage sur le terrain, au moins huit flacons représentant un sédiment de référence appropriéNote de bas de page 36. Un sédiment d’essai pourrait consister en des échantillons répétés de déblais de dragage prélevés à une certaine profondeur ou à une station d’échantillonnage d’intérêt, ou en des échantillons répétés de sédiments collectés sur le terrain à une station en particulier d’un site d’immersion en mer ou à proximité. Un traitement d’essai consistera en six sous-échantillons ou plus (c.-à-d. répétitions de laboratoire) d’un seul échantillon (non répété) de sédiment prélevé à une station d’échantillonnage en particulier ou à une profondeur à un lieu précis. Dans chaque cas, le traitement d’essai est représenté par six répétitions ou plus qui permettent d’évaluer le développement des organismes.

Une analyse de puissance a été effectuée à l’aide des données obtenues durant l’essai interlaboratoires dans le but d’atteindre une puissance d’au moins 80 % permettant de détecter une diminution de 30 % du pourcentage de larves normales (c.-à-d. le seuil critique d’effet; AquaTox, 2013). L’analyse était compatible avec les recommandations formulées par Bosker et al. (2013).

Les comparaisons statistiques entre les données biologiques des répétitions représentant chaque traitement d’essai (c.-à-d. des sédiments potentiellement contaminés prélevés à une seule station d’échantillonnage et profondeur) et les données biologiques des échantillons répétés du sédiment de référence doivent être appliquées dans la mesure du possible et si cela est pertinent. À cette fin, un sédiment de référence ne devrait pas être contaminé (c.-à-d. que les substances analysées devraient être en concentrations inférieures aux lignes directrices sur la qualité des sédiments) et devrait être semblable aux sédiments d’essai en ce qui concerne la granulométrie et les matières organiques totales. En outre, le sédiment de référence devrait susciter une réaction biologique acceptable (c.-à-d. que le pourcentage de larves normales dans un sédiment de référence ne devrait pas être inférieur de plus de 10 % au pourcentage de larves normales dans le sédiment témoin). De telles comparaisons fournissent une base pour l’évaluation de la toxicité en fonction du site. Il faudrait effectuer des comparaisons statistiques entre les données biologiques du ou des sédiments d’essai et les données biologiques du ou des sédiments témoins s’il ne convient pas de comparer les échantillons du sédiment de référence avec des échantillons de sédiment d’autres sites (p. ex. en raison de propriétés physicochimiques atypiques des sédiments d’essai ou d’autres facteurs confusionnels).

La réaction des organismes dans un ou plusieurs sédiments d’essai (p. ex. des sédiments provenant de divers sites) est comparée à la réaction des organismes dans le sédiment témoin et le sédiment de référence. Les données sur les larves d’échinides sont un cas unique pour l’analyse des données de toxicité. Elles satisfont souvent à l’hypothèse de normalité (même si elles sont binomiales de par leur nature) du fait qu’il y a un grand nombre de répétitions (~ 200)Note de bas de page 37. Par conséquent, les recommandations formulées ici privilégient les techniques de données quantitatives ou continues (EC, 2011).

Cette méthode de référence vise à déterminer si la réaction des organismes (pourcentage de larves normales) dans un sédiment d’essai est moins importante que dans un sédiment témoin ou de référence. Il faut effectuer le test-t de Welch comme un test statistique unilatéralNote de bas de page 38 Note de bas de page 39. Le test de Shapiro-Wilk doit aussi être effectué pour déterminer si l’hypothèse de normalité est confirmée. Si (et seulement si) la P < 0,05 dans le test de Shapiro-Wilk, un test U de Mann-Whitney (unilatéral) doit aussi être effectuéNote de bas de page 40 Note de bas de page 41 . Les résultats de tous les tests doivent être présentésNote de bas de page 42.

Il est inutile d’appliquer la correction d’Abbott aux taux de fécondationNote de bas de page 43.

Le pourcentage moyen (± ET) de larves normales, tel qu’il est déterminé à la fin de l’essai, dans chaque sédiment d’essai doit être présenté, y compris celui du ou des sédiments témoins et de référence.

6.2 Interprétation des résultats

L’interprétation des résultats ne relève pas nécessairement de la seule responsabilité du personnel de laboratoire qui effectue l’essai. Ce pourrait être une tâche partagée avec, notamment, un consultant en environnement ou d’autres personnes compétentes chargées d’étudier et d’interpréter les résultats.

Environnement Canada (1999) donne des conseils utiles sur l’interprétation et l’application des résultats des essais de toxicité réalisés sur des échantillons environnementaux et devrait donc être consulté à cet égard. Au départ, le responsable de l’essai devrait examiner les résultats et déterminer s’ils sont valides. À cet égard, il faut satisfaire aux critères de validité de l’essai (v. 4.9).

Les résultats de l’essai toxicologique de référence qui a été entrepris avec le même lot d’organismes que celui ayant servi dans l’essai toxicologique des sédiments (v. 5) doivent être pris en considération à l’étape d’interprétation des résultats de l’étude. Lorsqu’ils sont comparés avec les résultats d’essai précédents obtenus par le laboratoire d’essai avec le même toxique de référence, le même organisme d’essai et la même procédure d’essai (c.-à-d. si l’on compare avec la carte de contrôle du laboratoire pour cet essai toxicologique de référence), ces résultats donnent un aperçu de la sensibilité des organismes d’essai ainsi que de la précision et du rendement des essais en laboratoire au moment où l’essai toxicologique des sédiments a été effectué.

Il importe de passer en revue et de considérer les propriétés physicochimiques de chaque échantillon de la matière d’essai (y compris celles du sédiment témoin et du sédiment de référence) pour interpréter les résultats. Les données d’analyse établies pour le sédiment entier devraient être comparées aux seuils de tolérance connus des espèces d’échinides utilisées dans l’essai. Les valeurs qui s’approchent des seuils de tolérance connus (p. ex. pour l’ammoniac), mais qui ne les dépassent pas pourraient avoir contribué à réduire la tolérance de chaque espèce aux contaminants contenus dans l’échantillon et donc avoir influencé les résultats des essais.

Il faudrait aussi revoir toutes les données physicochimiques obtenues pour l’eau sus-jacente dans le cadre de l’essai toxicologique des sédiments (v. 4.6.3et 4.6.6) et en tenir compte pour l’interprétation des résultats. Si, par exemple, les documents indiquent que la concentration d’oxygène dissous dans l’eau sus-jacente d’une ou de plusieurs enceintes d’essai est inférieure à 40 %de saturation, cette baisse de l’oxygène peut donc avoir contribué aux réponses toxiques observées. Les concentrations d’ammoniac mesurées dans l’eau sus-jacente au début et à la fin de l’essai (v. 4.6.3 et 4.6.6) doivent aussi être converties en valeurs respectives pour l’ammoniac non ionisé (selon les mesures de pH et de température prises en même temps dans l’eau sus-jacente). Lors de l’interprétation des résultats des essais, ces valeurs devraient être prises en considération au même titre que la tolérance à l’ammoniac des espèces connues (annexe F).

En vertu de la Loi canadienne sur la protection de l’environnement (1999) [LCPE 1999], il est nécessaire d’effectuer des essais biologiques à l’étape de demande de permis afin d’évaluer les sédiments que l’on prévoit rejeter en mer. Ces essais biologiques permettent de confirmer la prédiction selon laquelle les activités d’immersion en mer n’auront aucun impact biologique important. Aucun essai précis ne devrait être utilisé pour évaluer les impacts sur l’environnement. Par conséquent, lorsque la série d’essais biologiques est combinée à des analyses chimiques, elle fournit une évaluation plus complète des impacts potentiels sur le milieu marin. Pour cette raison, quatre essais de toxicité employés par Environnement Canada (c.-à-d. qui utilisent des amphipodes, des échinides, des bactéries photoluminescentes et des polychètes) et un essai de bioaccumulation [c.-à-d. la méthode d’essai de l’USEPA (1993) qui utilise des vers marins ou des mollusques bivalves] font partie de la série actuelle d’essais servant à évaluer les rejets en mer au Canada. Cependant, lors des études sur les sédiments hautement contaminés du port de Sydney, un des essais (l’essai sur la fécondation chez les échinides, SPE 1/RM/27; Environnement Canada, 2011) sur l’eau interstitielle des sédiments a donné des résultats inexplicables (Zajdlik et al., 2000; Tay, 2000), probablement en raison de la concentration naturelle d’ammoniac. Il a donc été recommandé au cours de l’atelier sur les décisions concernant la gestion des déblais de dragage (Agius et Porebski, 2008) qu’Environnement Canada normalise un nouvel essai d’échinides qui permettrait d’éliminer les effets confusionnels de l’ammoniac.

Le résultat est l’essai actuel comportant un contact sédiment-embryons/larves d’échinides, qui est destiné à être utilisé dans la série d’essais susmentionnés et qui remplace l’essai sur la fécondation chez les échinides (SPE 1/RM/27; Environnement Canada, 2011). La méthode actuelle peut servir à déterminer si un ou plusieurs sédiments d’essai sont toxiques pour les organismes d’essai. Comme la méthode ne donne aucune directive sur la façon d’effectuer des essais à concentrations multiples ou de dilution des sédiments contaminés, l’essai ne fournit aucun renseignement sur le degré de toxicité, ni l’ampleur ou la cause de la toxicité.

Les organismes de réglementation et les titulaires de permis ont utilisé divers critères pour déterminer si les échantillons du sédiment d’essai passaient ou non le test de toxicité des sédiments (EC, 1998, 2002; WSDOE, 2008). Par exemple, certains responsables d’essai se sont basés sur deux conditions pour déterminer si la réponse était significative sur le plan environnemental : la réponse dans le sédiment d’essai doit être supérieure de plus de 20 % à la réponse dans le sédiment témoin, et la différence entre la réponse moyenne dans le sédiment d’essai et la réponse moyenne dans le sédiment de référence doit être statistiquement significative (WSDOE, 2008).

Conformément à d’autres interprétations faites par Environnement Canada (1998), il est utile de se fier aux directives en deux parties suivantes pour déterminer si les échantillons d’un sédiment d’essai passent ou non un essai toxicologique des sédiments lorsque cette méthode de référence est utilisée :

  1. On considère que le sédiment d’essai prélevé à une station d’échantillonnage en particulier et à une profondeur précise n’a pas passé l’essai de toxicité des sédiments si la proportion de larves normales dans les sous-groupes d’organismes d’essai exposés à ce sédiment est inférieure de plus de 20 % à la proportion de larves normales dans le sédiment de référence et si cette différence est significative (P < 0,05)Note de bas de page 44.
  2. En l’absence d’un sédiment de référence acceptable, on considère que le sédiment d’essai n’a pas passé l’essai de toxicité des sédiments si la proportion de larves normales dans les sous-groupes d’organismes d’essai exposés à ce sédiment est inférieure de plus de 30 % à la proportion de larves normales dans le sédiment témoin et si cette différence est significative (P < 0,05).

Dans le cadre du programme de demande de permis d’immersion en mer, le critère satisfaisant ou non satisfaisant peut être le critère qui permet de décider quand les déblais de dragage sont considérés comme acceptables pour l’immersion en mer. Un échec (de cet essai ou combiné à l’échec d’autres essais aigus, sublétaux ou de bioaccumulation) peut amener les demandeurs de permis à envisager l’assainissement des déblais de dragage ou des options de gestion des déblais autres que le rejet en eaux libres.

Section 7 – Rapports à produire

Le rapport d’essai doit mentionner tout écart par rapport aux exigences absolues exposées aux sections 2à 6 de la présente méthode de référence et, le cas échéant, fournir des précisions. Le lecteur doit pouvoir déterminer, à partir de ce document, si les conditions et les modes opératoires préalables et expérimentaux ont rendu les résultats valides et acceptables pour l’usage qu’on entend en faire.

La sous-section 7.1 ci-après énumère les renseignements à inclure dans chaque rapport d’essai. Ces renseignements, de même que ceux à fournir séparément dans un rapport général ou à conserver pendant au moins cinq ans sont précisés à la sous-section 7.2. Des programmes particuliers de surveillance ou des règlements pourraient exiger que soient inclus dans le rapport d’essai certains des renseignements énumérés à la sous-section 7.2 et concernant l’essai (p. ex. des précisions sur la matière d’essai ou les modes opératoires et les conditions propres au prélèvement, à la manipulation, au transport et à l’entreposage des échantillons) ou que ces renseignements soient conservés.

On peut citer les conditions et modes opératoires communs à une série d’essais en cours (p. ex. essais de toxicité systématiques exécutés à des fins de surveillance ou de vérification de la conformité aux règlements) et conformes aux exigences de la présente méthode; on peut aussi joindre un rapport général exposant dans ses grandes lignes la pratique ordinairement suivie en laboratoire.

Les détails relatifs à la conduite et aux résultats de l’essai qui ne sont consignés ni dans le rapport d’essai ni dans un rapport général doivent être conservés par le laboratoire pendant au moins cinq ans, de sorte qu’on puisse fournir l’information pertinente si l’essai doit faire l’objet d’une vérification. L’information à conserver peut comprendre les éléments suivants :

Le personnel de laboratoire effectuant les essais doit signer et dater les feuilles de données originales.

7.1 Exigences minimales pour le rapport d’essai

Voici la liste des renseignements à inclure dans chaque rapport d’essai.

7.1.1 Substance ou matière d’essai

7.1.2 Organismes d’essai

7.1.3 Installations et appareils

7.1.4 Sédiment témoin et eau témoin/de dilution

7.1.5 Méthode d’essai

7.1.6 Conditions expérimentales et modes opératoires

7.1.7 Résultats de l’essai

7.2 Exigences supplémentaires

Voici la liste des éléments qui doivent soit être inclus dans le rapport d’essai ou dans le rapport général, soit être conservés dans des dossiers pendant au moins cinq ans.

7.2.1 Substance ou matière d’essai

7.2.2. Organismes d’essai

7.2.3. Installations et appareils

7.2.4. Sédiment témoin et eau témoin/de dilution

7.2.5 Méthode d’essai

7.2.6 Conditions expérimentales et modes opératoires

7.2.7 Résultats de l’essai

Références

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Annexe A – Méthodes d’essai biologique et documents d’orientation publiés par l’Unité de l’élaboration et de l’application des méthodes d’Environnement Canadaa

A. Méthodes d’essai biologique universelles
Titre de la méthode d’essai ou du document d’orientation Numéro du rapport Date de publication Modifications applicables
Essai de létalité aiguë sur la truite arc-en-ciel SPE 1/RM/9 Juillet 1990 Mai 1996 et mai 2007
Essai de létalité aiguë sur l’épinoche à trois épines (Gasterosteus aculeatus) SPE 1/RM/10 Juillet 1990 Mars 2000
Essai de létalité aiguë sur Daphnia spp. SPE 1/RM/11 Juillet 1990 Mai 1996
Essai de reproduction et de survie du cladocère Ceriodaphnia dubia SPE 1/RM/21
2e édition		 Février 2007 —
Essai de croissance et de survie sur des larves de tête de-boule SPE 1/RM/22
2e édition Février		 2011 —
Essai de toxicité sur la bactérie luminescente Photobacterium phosphoreum SPE 1/RM/24 Novembre 1992 —
Essai d’inhibition de la croissance d’une algue d’eau douce SPE 1/RM/25
2e édition		 Mars 2007 —
Essai de toxicité aiguë de sédiments chez des amphipodes marins ou estuariens SPE 1/RM/26 Décembre 1992 Octobre 1998
Essai sur la fécondation chez les échinides (oursins globuleux et oursins plats) SPE 1/RM/27
2e édition		 Février 2011 —
Essai de toxicité sur des salmonidés aux premiers stades de leur cycle biologique (truite arc-en-ciel, saumon coho ou saumon de l’Atlantique) SPE 1/RM/28
2e édition		 Juillet 1998 —
Essai de survie et de croissance des larves dulcicoles de chironomes (Chironomus tentans ou Chironomus riparius) dans les sédiments SPE 1/RM/32 Décembre 1997 —
Essai de survie et de croissance de l’amphipode dulcicole Hyalella azteca dans les sédiments SPE 1/RM/33
2e édition		 Janvier 2013 —
Essai de mesure de l’inhibition de la croissance de la plante macroscopique dulcicole Lemna minor SPE 1/RM/37
2e édition		 Janvier 2007 —
Essai de survie et de croissance des vers polychètes spionides (Polydora cornuta) dans les sédiments SPE 1/RM/41 Décembre 2001 —
Essais pour déterminer la toxicité de sols contaminés pour les vers de terre (Eisenia andrei, Eisenia fetida ou Lumbricus terrestris) SPE 1/RM/43 Juin 2004 Juin 2007
Essai de mesure de la levée et de la croissance de plantes terrestres exposées à des contaminants dans le sol SPE 1/RM/45 Février 2005 Juin 2007
Essai de mesure de la survie et de la reproduction de collemboles exposés à des contaminants dans le sol SPE 1/RM/47
2e édition		 Février 2013 —
Essai de croissance de plantes terrestres indigènes de la région boréale exposées à un sol contaminé SPE 1/RM/56 Août 2013 —
B. Méthodes de référenceb
Titre de la méthode d’essai ou du document d’orientation Numéro du rapport Date de publication Modifications applicables
Méthode de référence pour la détermination de la létalité aiguë d’effluents chez la truite arc-en-ciel SPE 1/RM/13
2e édition		 Décembre 2000 Mai 2007
Méthode de référence pour la détermination de la létalité aiguë d’effluents chez Daphnia magna SPE 1/RM/14 2eédition Décembre 2000 —
Méthode de référence pour la détermination de la létalité aiguë d’un sédiment pour des amphipodes marins ou estuariens SPE 1/RM/35 Décembre 1998 —
Méthode de référence servant à déterminer la toxicité des sédiments à l’aide d’une bactérie luminescente dans un essai en phase solide SPE 1/RM/42 Avril 2002 —
C. Documents d’orientation
Titre de la méthode d’essai ou du document d’orientation Numéro du rapport Date de publication Modifications applicables
Document d’orientation sur le contrôle de la précision des essais de toxicité au moyen de produits toxiques de référence SPE 1/RM/12 Août 1990 —
Document d’orientation sur le prélèvement et la préparation de sédiments en vue de leur caractérisation physicochimique et d’essais biologiques SPE 1/RM/29 Décembre 1994 —
Document d’orientation sur la mesure de la précision des essais de toxicité sur sédiment de contrôle dopé avec un produit toxique de référence SPE 1/RM/30 Septembre 1995 —
Guide des essais écotoxicologiques employant une seule espèce et de l’interprétation de leurs résultats SPE 1/RM/34 Décembre 1999 —
Guide des essais de pathogénicité et de toxicité de nouvelles substances microbiennes pour les organismes aquatiques et terrestres SPE 1/RM/44 Mars 2004 —
Document d’orientation sur les méthodes statistiques applicables aux essais d’écotoxicité SPE 1/RM/46 Mars 2005 Juin 2007
Procédure de stabilisation du pH pendant un essai de létalité aiguë d’un effluent d’eau usée chez la truite arc-en-ciel SPE 1/RM/50 Mars 2008 —
Renseignements de base et conseils supplémentaires pour l’étude de la létalité aiguë d’un effluent d’eau usée pour la truite arc-en-ciel — Mars 2008 —
Guide d’échantillonnage et de préparation de sol contaminé aux fins d’essais biologiques SPE 1/RM/53 Septembre 2012 —

a Ces documents sont vendus à l’adresse suivante : Services des communications, Environnement Canada, Ottawa (ON) K1A 0H3, Canada. Pour en commander des copies papier, prière d’envoyer un courriel. Il est également possible de les télécharger gratuitement en format PDF à partir de l’adresse suivante : http://www.ec.gc.ca/faunescience-wildlifescience/. Pour obtenir de plus amples renseignements ou pour formuler des commentaires, prière de communiquer avec le chef de la Section de l’évaluation biologique et normalisation, Environnement Canada, Ottawa (ON) K1A 0H3, Canada.

b Dans le présent contexte, on définit une méthode de référence comme étant une méthode d’essai biologique spécifique en vue de la réalisation d’un essai de toxicité, respectant une série de conditions expérimentales et de modes opératoires décrits avec précision dans un document écrit. Contrairement à d’autres méthodes d’essai biologique génériques (polyvalentes ou « universelles ») publiées par Environnement Canada, les méthodes de référence sont souvent réservées aux essais associés à des règlements particuliers.

Annexe B – Membres du Groupe intergouvernemental sur les essais écotoxicologiques (en juillet 2014)

Gouvernement fédéral, Environnement Canada

Suzanne Agius
Section des programmes de protection marine
Gatineau (Qc)

Fabiola Akaishi
Laboratoire des essais environnementaux de l’Atlantique
Moncton (N.-B.)

Adrienne Bartlett
Division de la recherche sur la protection des écosystèmes aquatiques
Burlington (Ont.)

Lorraine Brown
Laboratoire des essais environnementaux du Pacifique et du Yukon
North Vancouver (C.-B.)

Joy Bruno
Laboratoire des essais environnementaux du Pacifique et du Yukon
North Vancouver (C.-B.)

Craig Buday
Laboratoire des essais environnementaux du Pacifique et du Yukon
North Vancouver (C.-B.)

Ken Doe (chercheur émérite)
Laboratoire des essais environnementaux de l’Atlantique
Moncton (N.-B.)

Garth Elliott
Laboratoire des essais environnementaux des Prairies et du Nord
Edmonton (Alb.)

Chris Fraser
Laboratoires Sciences et technologie
Ottawa (Ont.)

François Gagné
Recherche sur les écosystèmes fluviaux
Montréal (Qc)

Patricia Gillis
Division de la recherche sur la protection des écosystèmes aquatiques
Burlington (Ont.)

Manon Harwood
Laboratoire des essais environnementaux du Québec
Montréal (Qc)

Ryan Hennessy
Laboratoires Sciences et technologie
Ottawa (Ont.)

Dale Hughes
Laboratoire des essais environnementaux de l’Atlantique
Moncton (N.-B.)

Paula Jackman
Laboratoire des essais environnementaux de l’Atlantique
Moncton (N.-B.)

Nancy Kruper
Laboratoire des essais environnementaux des Prairies et du Nord
Edmonton (Alb.)

Heather Lemieux
Laboratoires Sciences et technologie
Ottawa (Ont.)

Michelle Linssen-Sauvé
Laboratoire des essais environnementaux du Pacifique et du Yukon
North Vancouver (C.-B.)

Danielle Milani
Direction de la recherche sur l’étude des impacts sur les écosystèmes aquatiques
Burlington (Ont.)

Warren Norwood
Division de la recherche sur la protection des écosystèmes aquatiques
Burlington (Ont.)

Heather Osachoff
Laboratoire des essais environnementaux du Pacifique et du Yukon
North Vancouver (C.-B.)

Joanne Parrott
Division de la recherche sur la protection des écosystèmes aquatiques
Burlington (Ont.)

Linda Porebski
Section des programmes de protection marine
Gatineau (Qc)

Juliska Princz
Laboratoires Sciences et technologie
Ottawa (Ont.)

Ellyn Ritchie
Laboratoires Sciences et technologie
Ottawa (Ont.)

Grant Schroeder
Laboratoire des essais environnementaux du Pacifique et du Yukon
North Vancouver (C.-B.)

Rick Scroggins
Laboratoires Sciences et technologie
Ottawa (Ont.)

Rachel Skirrow
Laboratoire des essais environnementaux du Pacifique et du Yukon
North Vancouver (C.-B.)

Troy Steeves
Laboratoire des essais environnementaux de l’Atlantique
Moncton (N.-B.)

David Taillefer
Section des programmes de protection marine
Gatineau (Qc)

Lisa Taylor (présidente)
Laboratoires Sciences et technologie
Ottawa (Ont.)

Sylvain Trottier
Laboratoire des essais environnementaux du Québec
Montréal (Qc)

Graham van Aggelen
Laboratoire des essais environnementaux du Pacifique et du Yukon
North Vancouver (C.-B.)

Leana Van der Vliet
Laboratoires Sciences et technologie
Ottawa (Ont.)

Brian Walker
Laboratoire des essais environnementaux du Québec
Montréal (Qc)

Peter Wells (chercheur émérite)
Service de la conservation de l’environnement
Dartmouth (N.-É.)

Gouvernement fédéral, Ressources naturelles Canada

Melissa Desforges
Programme Gestion du risque lié aux écosystèmes
Laboratoire des mines et des sciences minérales
Ottawa (Ont.)

Morgan King
Programme Gestion du risque lié aux écosystèmes
Laboratoire des mines et des sciences minérales
Ottawa (Ont.)

Philippa Huntsman-Mapila
Programme Gestion du risque lié aux écosystèmes
Laboratoire des mines et des sciences minérales
Ottawa (Ont.)

Carrie Rickwood
Programme Gestion du risque lié aux écosystèmes
Laboratoire des mines et des sciences minérales Ottawa (Ont.)

Gouvernement provincial

Richard Chong-Kit
Ministère de l’Environnement de l’Ontario
Etobicoke (Ont.)

Olesya Hursky
Saskatchewan Research Council
Saskatoon (Sask.)

Kim Mahon
Etobicoke (Ont.)
Ministère de l’Environnement de l’Ontario

Mary Moody
Saskatchewan Research Council
Saskatoon (Sask.)

David Poirier
Ministère de l’Environnement de l’Ontario
Etobicoke (Ont.)

Trudy Watson-Leung
Ministère de l’Environnement de l’Ontario
Etobicoke (Ont.)

Établissements privés de recherche/autres

Christian Bastien
Centre d’expertise en analyse environnementale du Québec
Ste-Foy (Qc)

Bozena Glowacka
ALS Environmental
Winnipeg (Man.)

 

Annexe C

Administration centrale et bureaux régionaux du Service de la protection de l’environnement d’Environnement Canada
Administration centrale
351, boulevard Saint-Joseph
Place Vincent-Massey
Gatineau (Qc)
K1A 0H3		 Région des Prairies et du Nord
Bureau de l’Alberta :
4999, 98e Avenue
Edmonton (Alb.)
T6B 2X3
Région de l’Atlantique
45, promenade Alderney
Dartmouth (N.-É.)
B2Y 2N6		 Bureau du Manitoba :
123, rue Main, pièce 150
Winnipeg (Man.)
R3C 4W2
Région du Québec
1550, avenue d’Estimauville
Québec (Qc)
G1J 0C3		 Région du Pacifique et du Yukon
Bureau de Vancouver :
401, rue Burrard
Vancouver (C.-B.)
V6C 3S5
Région de l’Ontario
4905, rue Dufferin
Downsview (Ont.)
M3H 5T4		 Bureau du Yukon :
91782, route de l’Alaska
Yukon (T.N.-O)
Y1A 5B7

Annexe D

Membres du groupe scientifique consultatif
Lisa N. Taylor
Environnement Canada
335, chemin River
Ottawa (Ontario)
K1A 0H3		 Rick Scroggins
Environnement Canada
335, chemin River
Ottawa (Ontario)
K1A 0H3
Leana Van der Vliet
Environnement Canada
335, chemin River
Ottawa (Ontario)
K1A 0H3		 Craig Buday
Environnement Canada
2645, autoroute Dollarton
North Vancouver (Colombie-Britannique)
V7H 1B1
Paula Jackman
Environnement Canada
Angle de l’avenue Morton et de l’avenue de l’Université
Moncton (Nouveau-Brunswick)
E1A 3E9		 Emilia Jonczyk et Lesley Novak
AquaTox Testing & Consulting Inc.
11B, chemin Nicholas Beaver
Guelph (Ontario)
N1H 6H9
Wayne McCulloch et Michael Chanov
EA Engineering, Science and Technology Inc.
15 Loveton Circle
Sparks, Maryland 21152, États-Unis		 Janet Pickard et Leslie-Anne Stavroff
Maxxam
4606, Canada Way
Burnaby (Colombie-Britannique)
V5G 1K5
Amy Wagner
USEPA Region 9 Laboratory
1337 S. 46th St., Bldg. 201
Richmond, Californie 94804, États-Unis		 James Elphick et Josh Baker
Nautilus Environmental
8664, Commerce Court
Burnaby (Colombie-Britannique)
V5A 4N7
Stephen L. Clark
Pacific EcoRisk
2250 Cordelia Road
Fairfield, Californie 94534, États-Unis		 Steven M. Bay et Darrin Greenstein
Southern California Coastal Water Research Project
3535 Harbor Blvd. Ste 110
Costa Mesa, Californie 92626-1437, États-Unis
Ken Doe (chercheur à la retraite, Environnement Canada)
74, promenade Pinewood
Mount Uniacke (Nouvelle-Écosse)
B0N 1Z0		 Peter Wells (professeur auxiliaire)
Marine Affairs Program et School for Resource and Environmental Studies
Université Dalhousie
Halifax (Nouvelle-Écosse)
B3H 4R2
Suzanne Agius
Environnement Canada
351, boulevard Saint-Joseph
Gatineau (Québec)
K1A 0H3		  

Annexe E – Différentes méthodes employées dans des essais toxicologiques sur les embryons/larves d’échinides et décrites dans des documents de méthodologie du Canada et des États-Unisa

Les documents sources sont présentés en ordre chronologique, par organisme d’origine plutôt que par auteur.

USEPA et PSWQA. 1995. représente USEPA et PSWQA, Echinoderm Embryo Sediment Bioassay, p. 40-48, In:Recommended Guidelines for Conducting Laboratory Bioassays on Puget Sound Sediments, Environmental Protection Agency des États-Unis (Seattle, Washington) et Puget Sound Water Quality Authority (Olympia, Washington), juillet 1995.

APHA et al. 2005. représente APHA, AWWA et WEF (American Public Health Association, American Water Works Association, Water Environment Federation), Echinoderm Embryo Development Test, 8810 D, p. 8-143 à 8-145, In: Standard Methods for the Examination of Water & Wastewater, 21e éd., Washington (DC).

ASTM. 2007. représente ASTM (American Society for Testing and Materials), Standard Guide for Conducting Static Acute Toxicity Tests with Echinoid Embryos, E1563-98 (réapprouvé en 2004), p. 720-741. In: 2007 Annual Book of ASTM Standards, vol. 11.06. ASTM, West Conshohocken (PA), États-Unis.

SCCWRP. 2008. représente SCCWRP, Standard Operating Procedure T04: Sea Urchin, Strongylocentrotus purpuratus, Embryo Development Test, Southern California Coastal Water Research Project, Costa Mesa (CA), 2004 SOP, révisé le 10 octobre 2008.

EC. 2013. représente la méthode courante d'Environnement Canada.

a D'après des documents disponibles dès juin 2013.

1. Espèces d’essai, et matière ou substance d’essai
Document Espèces d’essai recommandéesa Matière ou substance d’essai
USEPA et PSWQA, 1995 AP, SD, SP, DE sédiment
APHA et al., 2005 AP, SD, SP, DE sédiment, effluent, eau réceptrice, substance chimique
ASTM, 2007 AP, SD, SP, DE sédiment (annexe A1), effluent, lixiviat, eau de surface, matière particulaire, substance chimique
SCCWRP, 2008 SP effluents des eaux marines
EC, 2013 SP, LP, DE sédiment

a AP – Arbacia punctulata (oursin violet de l’Atlantique); SD – Strongylocentrotus droebachiensis (oursin vert; espèce circumpolaire); SP – Strongylocentrotus purpuratus(oursin violet du Pacifique); LP – Lytechinus pictus(oursin blanc; trouvé du sud de la Californie au Panama); DE – Dendraster excentricus (clypéastre excentrique; espèce du Pacifique)

2. Provenance des adultes
Document Provenance des adultes
USEPA et PSWQA, 1995 les adultes sont prélevés de sites non contaminés; s’ils proviennent d’un récolteur commercial, la zone de collecte d’origine doit être identifiée
APHA et al., 2005 collecte du champ pendant la période naturelle du frai; des organismes d’un fournisseur commercial peuvent être utilisés ASTM, 2007 les adultes sont apportés au laboratoire et identifiés jusqu’à l’espèce
SCCWRP, 2008 les adultes sont achetés de fournisseurs commerciaux ou recueillis de zones rocheuses intertidales non contaminées
EC, 2013 les adultes peuvent être obtenus de fournisseurs commerciaux ou recueillis par le personnel de laboratoire; le site marin où les adultes sont recueillis devrait être non contaminé
3. Transport, maintien et acclimatation des adultes
Document Conseils sur le transport, le maintien et l’acclimatation des adultes
USEPA et PSWQA, 1995 transporter dans les 24 heures suivant la collecte ou l’achat; garder au frai pendant le transport; placer dans de l’eau de mer courante dès la réception; eau de mer aérée et à température contrôlée nécessaire; maintenir un débit habituellement > 28 L/h par individu; conserver les oursins plats sur un lit de sable; nourrir d’algues naturelles ou cultivées; nettoyer les réservoirs de stockage plusieurs fois par semaine; retirer les spécimens morts immédiatement
APHA et al., 2005 éviter les variations soudaines ou extrêmes de température et de salinité pendant le transport; maintenir à l’aide d’eau de mer à renouvellement continu ou d’un système de filtration à recirculation; nourrir les oursins à volonté de macroalgues brunes et de substitut de laitue romaine ou de nourriture commerciale pour poissons si du varech frais n’est pas disponible; la température de maintien varie selon l’espèce et devrait être similaire à celle du site de collecte; maintenir à une salinité de 28 à 34 g/kg
ASTM, 2007 acclimater les organismes à l’eau du laboratoire pendant 2 jours ou plus; changer la température à une vitesse de ≤ 2 °C/jour et la salinité à un rythme de ≤ 1 g/kg par jour; observer tous les jours; retirer quotidiennement les organismes morts ou stressés; si les gonades ne sont pas mûres, les adultes devraient être maintenus et nourris jusqu’à ce qu’ils atteignent un état de reproduction approprié
SCCWRP, 2008 il est préférable de transporter les organismes à l’état « sec » (dans des essuie-tout humides ou imbibés d’eau de mer); maintenir à la température de collecte ou de culture; maintenir dans l’obscurité totale, entre 12 °C et 15 °C et à une salinité de 32 ± 2 g/kg; il est préférable de fournir de l’eau de mer courante à raison de ~ 5 L/min; la nourriture privilégiée est Macrocystis; la nourriture et les matières fécales en décomposition devraient être retirées
EC, 2013 suivre les conseils sur le maintien et l’acclimatation dans la deuxième édition du rapport SPE 1/RM/27; tous les adultes utilisés pour fournir des gamètes pour un essai doivent provenir de la même population et de la même source, et ils doivent être obtenus d’adultes à maturité sexuelle; inspecter quotidiennement et retirer les animaux morts ou malades dès leur observation; ajuster la température à une vitesse de ≤ 3 °C/jour dès la réception des organismes au laboratoire; la température de maintien dépend de l’espèce; il est recommandé d’acclimater les adultes à la température d’essai pendant au moins trois jours avant le prélèvement des gamètes; la salinité moyenne de l’eau de maintien devrait être de 28 à 34 g/kg, mais préférablement de 30 à 32 g/kg; ajuster la salinité graduellement (≤ 1 g/kg par jour) dès la réception des organismes adultes à maintenir dans le laboratoire pendant de longues périodes; tout ajustement de la salinité devrait être effectué à un rythme de ≤ 3 g/kg par jour et doit être de ≤ 5 g/kg par jour; l’éclairage normal de laboratoire à faible intensité est acceptable
4. Frai et fécondation
Document Conseils sur le frai et la fécondation
USEPA et PSWQA, 1995 provoquer le frai en injectant du KCl; provoquer la fécondation dans l’heure suivant le frai en utilisant un rapport spermatozoïdes:œufs ≤ 2 000:1; ajuster la densité des œufs fécondés de 20 000 à 30 000 par mL quand > 90 % des œufs présentent la formation d’une membrane en 10 à 15 minutes
APHA et al., 2005 provoquer le frai en injectant du KCl ou, pour les espèces appropriées (principalement A. punctulata), en utilisant la stimulation électrique; prélever le sperme des oursins plats à l’état « sec »; activer le sperme par la dilution dans de l’eau de mer et l’utiliser dans les 30 minutes qui suivent; utiliser un rapport spermatozoïdes:œufs de 200:1 à 1 000:1; évaluer le taux de fécondation après 10 minutes et ajouter plus de sperme si < 90 % est fécondé; il faudrait recommencer en utilisant de nouveaux gamètes si le taux de fécondation est < 90 % à ce moment
ASTM, 2007 provoquer le frai en injectant du KCl ou en utilisant la stimulation électrique; prélever le sperme dans de l’eau ou à sec et les œufs dans de l’eau; ajuster la densité des œufs à 20 à 50 œufs/mL avant d’ajouter les spermatozoïdes; utiliser 105 à 107spermatozoïdes/mLdans la solution finale
SCCWRP, 2008 provoquer le frai en injectant du KCl; prélever seulement les gamètes dans les 15 minutes suivant le début de la libération par un organisme; utiliser un rapport spermatozoïdes:œufs de 500:1; ajuster la densité des œufs fécondés à 2 500 œufs/mL; si la fécondation n’est pas ≥ 90 % après 10 minutes, ajouter des spermatozoïdes et revérifier après 10 minutes; si le taux de fécondation n’est toujours pas ≥ 90 %, recommencer en utilisant différents gamètes
EC, 2013 suivre les conseils pour le frai et la fécondation dans la deuxième édition du rapport SPE 1/RM/27; le taux de fécondation doit être ≥ 90 % pour que l’essai soit entamé; le rapport spermatozoïdes:œufs dépend de l’espèce; une densité cible d’embryons (œufs nouvellement fécondés) de ~ 200 œufs par aliquote de 200 μL(dans des volumes d’exposition de 10 mL) est nécessaire (équivaut à une densité de 20 œufs par 20 μLou de 100 000 œufs par 100 mL); cela représente l’ajout de ~ 200 œufs (≥ 90 % fécondés et < 10 % non fécondés) à chaque volume de 10 mL
5. Enceintes d’essai et contenus initiaux
Document Enceinte d’essai Quantité de sédiment Volume d’eau de mer
USEPA et PSWQA, 1995 contenant ou bécher de 1 La 18 g (poids humide) 900 mL
APHA et al., 2005 verre, diversb non indiqué variablef
ASTM, 2007 contenant ou bécher de 1 Lc 18 g (poids humide) 900 mL
SCCWRP, 2008 flacon en verre de 20 mLd sans objet 9,9 mL
EC, 2013 flacon en verre de 20 mLe 0,5 g (poids humide) 10 mL

a Utiliser un contenant ou un bécher en verre de 1 L standard (diamètre interne de 10 cm); couvrir avec un verre de montre d’un diamètre de 11,4 cm.

b Utiliser des chambres en verre d’une capacité de 10 mL à 1 L; couvrir lâchement ou sceller; des flacons à scintillation jetables sont acceptables.

c Utiliser des béchers en verre de 1 L ou des bocaux de mise en conserve en verre de ~ 950 mL; recouvrir lâchement avec un verre de montre en plastique non toxique (dans le cas d’un bécher) ou d’un couvert avec protection en Teflon (dans le cas d’un bocal de mise en conserve); l’utilisation de plus petites enceintes (et de volumes équivalents de sédiment et d’eau sus-jacente) peut convenir.

d Utiliser des flacons à scintillation de 20 mL en verre munis d’un bouchon en polypropylène.

e Utiliser des flacons à scintillation ou des flacons cylindriques en verre de 20 mL recouverts lâchement d’un film plastique ou d’une feuille de plexiglas transparente; bien sceller (p. ex. avec une pellicule [Saran Wrap]) si le sédiment d’essai renferme une quantité appréciable de matières volatiles.

f Dépend du volume de l’enceinte d’essai; le volume utilisé devrait fournir une densité initiale de ~ 25 embryons/mL.

6. Manipulation avant l’essai et conditions relatives au contenu d’une enceinte d’essai
Document Agitation initiale Conditions d’incubation avant l’essai
USEPA et PSWQA, 1995 agiter vigoureusement pendant 10 secondes laisser reposer pendant 4 heures avant d’ajouter les embryons
APHA et al., 2005 non indiquéa non indiquéa
ASTM, 2007 mélanger ou agiter vigoureusement pendant 10 secondes laisser reposer pendant 4 heures avant d’ajouter les embryons
SCCWRP, 2008 sans objetb sans objetb
EC, 2013 mélanger en agitant les flacons individuels sur un agitateur vortex mécanique à une vitesse de 1 800 tr/minpendant 10 secondes laisser incuber pendant la nuit

a La méthode d’essai est conçue pour diverses matières (y compris les sédiments) ou substances d’essai, et elle n’aborde pas le traitement avant l’essai et les conditions pendant l’essai sur des échantillons de sédiment ou d’autres matières solides.

b L’essai est conçu pour être mené sur des effluents d’eaux marines et non pour mesurer la toxicité des échantillons de sédiment.

7. Traitements associés aux essais et répétitions connexes
Document Sédiment d’essai (contaminé) Sédiment de référence Sédiment témoin Témoins « en milieu exclusivement aqueux »
USEPA et PSWQA, 1995 5 + 1a 5 + 1a, d ouih 5 + 5j
APHA et al., 2005 5 + 1a NIe NI 5 + 5k
ASTM, 2007 5 + 1a 5 + 1a, f 5 + 1a, i 6 + 5l
SCCWRP, 2008 s.o.b s.o. s.o. 5 + 1n
EC, 2013 6 + 2c 6 + 2a, g 6 + 2a, i 6 + 2 + 6 + 9m

a Outre les cinq répétitions pour chaque échantillon de sédiment servant aux données biologiques, une répétition additionnelle de chaque échantillon est utilisée pour surveiller la qualité de l’eau de mer sus-jacente dans les enceintes d’essai.

b Sans objet.

c Les septième et huitième répétitions (ou plus, selon les exigences d’analyse) sont utilisées pour surveiller la composition chimique de l’eau sus-jacente au début et à la fin de l’essai.

d Le plan des études sur le terrain peut comprendre un sédiment de référence provenant d’un endroit que l’on sait exempt de contamination chimique. Cela permet ainsi de comparer les conditions potentiellement toxiques et celles qui ne le sont pas (aucune directive n’est offerte à cet égard).

e Non indiqué.

f Si des sédiments recueillis sur le terrain sont soumis à l’essai, des sédiments de référence devraient aussi l’être en plus des sédiments témoins, ou les sédiments de référence peuvent être considérés comme les sédiments témoins.

g Si possible et si elles font partie du programme d’échantillonnage sur le terrain, au moins huit répétitions représentant au moins un échantillon du sédiment de référence devraient être intégrées au plan d’expérience.

h On mentionne brièvement l’utilisation d’un sédiment témoin, mais aucune directive n’est fournie sur le nombre de répétitions ou sur l’application des données concernant ce sédiment lorsqu’il s’agit d’évaluer la toxicité de l’échantillon.

i Le plan d’expérience exige (obligatoirement) l’utilisation d’un sédiment témoin et de témoins « en milieu exclusivement aqueux ».

j Deux séries de témoins « en milieu exclusivement aqueux » sont préparées, dont une sert de « témoin sacrificiel » pour surveiller le développement des embryons.

k Outre les cinq répétitions de témoins (ou plus) qui sont menées jusqu’à la fin de l’essai, au moins cinq autres témoins sont nécessaires lorsque l’on utilise la « méthode de dénombrement complet » pour estimer le nombre réel d’embryons dans chaque enceinte d’essai au début de l’essai.

l Six témoins « en milieu exclusivement aqueux » sont utilisés pour les données biologiques et les données sur la qualité de l’eau (dans la sixième enceinte d’essai). Cinq autres témoins « en milieu exclusivement aqueux » sont nécessaires pour estimer le nombre d’embryons dans chaque enceinte d’essai au début de l’essai et surveiller le développement.

m Vingt-trois flacons (ou plus) « en milieu exclusivement aqueux » sont utilisés comme suit : six flacons sont utilisés pour fournir une estimation du nombre d’œufs fécondés (embryons) dans chaque traitement au début de l’essai (En), qui est utilisé pour calculer le pourcentage de larves normales pour chaque traitement à la fin de l’essai; deux flacons sont utilisés pour surveiller la qualité de l’eau représentant le témoin « en milieu exclusivement aqueux », au début et à la fin de l’essai; six flacons de surveillance sont utilisés pour déterminer le pourcentage de larves normales dans l’eau de mer utilisée comme eau sus-jacente pour le témoin « en milieu exclusivement aqueux », dans l’heure précédant immédiatement la fin présumée de l’essai; les neuf derniers flacons « en milieu exclusivement aqueux » sont utilisés pour confirmer que l’essai a satisfait au critère de validité. Un ensemble de flacons (les six derniers témoins « en milieu exclusivement aqueux ») est jumelé aux échantillons de sédiment et trois témoins « en milieu exclusivement aqueux » doivent être jumelés au toxique de référence.

n En plus des cinq répétitions de solutions témoins, une sixième devrait être prévue pour les mesures physiques et chimiques.

8. Début de l’essai
Document Âge des organismes au début de l’essai Aliquote d’œufsa transférée Nombre d’œufsa par enceinte d’essai Densité initiale d’œufsa dans l’enceinte d’essai
USEPA et PSWQA, 1995 moins de 2 h après la fécondation 1 mL ~ 25 000 ~ 28 par mL d’eau de mer
APHA et al., 2005 2 à 4 h après la fécondation varieb varieb ~ 25 par mL d’eau de mer
ASTM, 2007 moins de 4 h après la fécondation NIc 20 000 à 40 000 22 à 44 par mL d’eau de mer
SCCWRP, 2008 moins de 1 h après la fécondation 0,1 mL ~ 250 ~ 25 par mL d’eau de mer
EC, 2013 2 à 4 h après la fécondation 200 µL ~ 200 ~ 20 par mL d’eau de mer

a Comprend à la fois les œufs non fécondés et les œufs fécondés.

b Dépend de la taille de l’enceinte d’essai (capacité de 10 mL à 1 L).

c Non indiqué. Le volume d’aliquote doit être inférieur à 1 % du volume total de liquide dans l’enceinte d’essai.

9. Conditions pendant l’essai
Document Rapport sédiment-eau Températurea Salinité Aération Éclairage
USEPA et PSWQA, 1995 0,2 g/10 mL 15 ± 1 °C 28 ± 1 g/kg normalement nong 14 h de lumière, 10 h d’obscurité
APHA et al., 2005 NIb 20 °C pour AP
15 °C pour SP et DE
12 °C pour SD		 28 à 34 g/kg NI ambianth
ASTM, 2007 0,2 g/10 mL 20 °C pour AP
15 °C pour DE
12 ou 14 °C pour SP
12 °C pour SDd		 27 à 36 g/kge normalement nonh NI
SCCWRP, 2008 s.o.c 15 ± 1 °C 34 à 2 g/kg non 12 h de lumière, 12 h d’obscurité
EC, 2013 0,5 g/10 mL 15 ± 1 °C pour SP ou DE
20 ± 1 °C pour LPd		 30 à 2 g/kgf non 16 h de lumière, 8 h d’obscuritéi

a AP—Arbacia punctulata; SP—Strongylocentrotus purpuratus; SD—Strongylocentrotus droebachiensis; LP—Lytechinus pictus; DE—Dendraster excentricus.

b Non indiqué.

c Sans objet; l’essai est conçu pour des substances aqueuses (substances chimiques).

d De plus, la température instantanée doit se trouver dans les 3 °C de la température moyenne quotidienne en tout temps.

e De plus, la salinité ne devrait pas varier de plus de 1 g/kg dans les traitements ou renouvellements pendant l’essai.

f La salinité de l’eau sus-jacente ne doit pas être ajustée au début de l’essai ni à un autre moment.

g Si l’oxygène dissous dans une enceinte d’essai baisse en dessous de 60 % de saturation, aérer légèrement toutes les enceintes d’essai jusqu’à la fin de l’essai. Pour aérer, utiliser une pipette insérée à mi-profondeur dans la colonne d’eau, avec un flux d’air d’environ 100 bulles par minute.

h Les niveaux d’éclairage ambiant du laboratoire et les photopériodes sont adéquats pour toutes les espèces.

i On recommande une intensité de 500 à 1 000 lux à côté de la surface de l’eau sus-jacente dans chaque enceinte d’essai.

10. Durée de l’essai
Document Conseils sur la durée de l’essai
USEPA et PSWQA, 1995 fin de l’essai à 48 h ou lorsque plus de 90 %des embryons dans le témoin constitué d’eau de mer ont atteint le stade pluteus à 4 bras (selon l’occurrence la plus tardive, et dans les 48 à 96 h)
APHA et al., 2005 A. punctulata, 48 h à 20 °C; D. excentricus, 72 h à 15 °C; S. purpuratus, 72 h à 15 °C ou 96 h à 12 °C; S. droebachiensis, 96 h à 12 °C a
ASTM, 2007 la durée de l’essai dépend de l’espèce et de la température, et devrait être de 48 h, de 72 h ou de 96 hb
SCCWRP, 2008 finir l’essai à 72 h
EC, 2013 la fin présumée de l’essai est à 48 h pour L. pictus, 72 h pour D. excentricus et 96 h pour S. purpuratusc

a Ce sont des périodes de temps cibles; quelques heures supplémentaires pourraient être permises pour s’assurer que la plupart (plus de 90 %) des larves témoins ont atteint le stade pluteus normal.

b La durée de l’essai est établie en fonction du temps nécessaire à ≥ 70 % des embryons dans les solutions témoins pour se développer au stade pluteus. Poursuivre l’essai au-delà de la durée habituelle (pour cette espèce et cette température) au besoin, mais consigner cette prolongation en tant qu’écart dans l’essai.

c Pendant l’heure précédant les échéances propres aux espèces, déterminer le pourcentage de larves normales dans 6 témoins « en milieu exclusivement aqueux »; s’il y a plus de 70 % de larves normales, l’essai doit être terminé; si à la fin présumée de l’essai, ce pourcentage est inférieur à 70 %, prolonger l’essai pendant 24 h pour s’assurer que le critère de validité de l’essai est respecté (à savoir, fin de l’essai à 72 h pour L. pictus; à 96 h pour D. excentricus; et à 120 h pour S. purpuratus).

11. Surveillance de la qualité de l’eau de mer sus-jacente pendant l’essai
Document Variables surveillées et fréquence
USEPA et PSWQA, 1995 mesures quotidiennes de la température, du pH, de la salinité et de l’oxygène dissous dans la répétition de chaque traitement à ces fins; mesurer la teneur en ammoniac et en sulfures au début et à la fin de l’essai
APHA et al., 2005 mesurer la qualité de l’eau initiale et finale (variables non précisées) pour chaque traitement
ASTM, 2007 mesures quotidiennes du pH, de la salinité, de l’oxygène dissous et de la température; dans au moins une enceinte d’essai, mesurer la température plusieurs fois par jour ou utiliser un thermomètre à maxima et minima; recommander de mesurer la teneur en ammoniac et en sulfures au début et à la fin de l’essai (il faut mesurer dans le cas où la teneur en matières organiques du sédiment est élevée)
SCCWRP, 2008 mesurer le pH, la salinité et l’oxygène dissous au début et à la fin de l’essai; mesurer la température quotidiennement
EC, 2013 il faut mesurer la température, le pH, la salinité, l’oxygène dissous et la teneur en ammoniac (total et, par calcul, non ionisé) au début et à la fin de l’essai
12. Fin de l’essai
Document Échantillon conservé Agent de conservation Période d’entreposage Numération et notation
USEPA et PSWQA, 1995 3 aliquotesa Formol tamponné à 5 % archiver 2 aliquotesf utiliser des cellules de Sedgewick-Rafter;
pourcentage de survie, de larves normales/anormalesi
APHA et al., 2005 contenu de l’aliquote ou du flaconb Formol tamponné à 5 % NI utiliser des cellules de Sedgewick-Rafter ou compter directement (microscope inversé)j
ASTM, 2007 aliquote(s)c Formol tamponné à 5 % NI utiliser des cellules de Sedgewick-Rafterk
SCCWRP, 2008 contenu du flacond Formol tamponné à 4 % ou glutaraldéhyde à 1 % NIg utiliser des cellules de Sedgewick-Rafter ou compter directement (microscope inversé)l
EC, 2013 transfert par pipettee glutaraldéhyde à 0,5 % 4 semainesh utiliser des cellules de Sedgewick-Rafter ou compter directement (dans le flacon avec un microscope inversé)m

a L’eau et les organismes de chaque enceinte d’essai de 1 L sont remués doucement et avec soin pour mettre les organismes en suspension, le liquide est décanté et 3 aliquotes de 10 mL sont retirées avec une pipette et placées dans des flacons de 10 mL avec bouchon vissé, auxquels est ensuite ajouté un agent de conservation.

b L’agent de conservation est ajouté directement dans l’enceinte d’essai si des flacons ou des tubes à culture sont utilisés. Autrement, mélanger le contenu de l’enceinte, transférer une aliquote de 10 mL dans un flacon et ajouter l’agent de conservation.

c L’agent de conservation est ajouté directement dans chaque flacon d’essai à la fin de l’essai.

d L’eau sus-jacente du sédiment dans chaque flacon d’essai est transférée avec soin dans un nouveau flacon à scintillation ou flacon cylindrique à l’aide d’une pipette de 10 mLavec une ouverture ≥ 2 mm.

ePar la suite, 1 mL de glutaraldéhyde à 0,5 % est ajouté pour préserver les embryons et les larves aux fins d’examen ultérieur.

f Le contenu de l’une des trois aliquotes est compté et noté, tandis que celui des deux autres est archivé. La période d’entreposage n’est pas indiquée.

g Non indiqué.

h Les organismes conservés doivent être comptés et notés dans les 4 semaines suivant la fin de l’essai.

i Les larves normales et anormales sont dénombrées séparément. Le pourcentage de survie est calculé d’après le nombre d’organismes survivants par rapport au nombre initial.

j Compter tous les organismes (méthode de la numération totale) ou procéder à une numération relative d’au moins 100 organismes (embryons et larves); noter les larves normales, les larves anormales, les embryons déformés, les embryons d’apparence normale et les œufs fécondés non clivés.

k Compter tous les embryons et les larves de chaque flacon d’essai conservé; noter les organismes normaux (p. ex. larves pluteus normalement développées) et anormaux (p. ex. larves pluteus nettement déformées ou embryons qui n’ont pas réussi à se développer en larves pluteus).

l Compter les 100 premiers embryons (et larves) à l’aide d’un compteur manuel à plusieurs unités; ne pas compter les œufs non fécondés; noter les larves normales, les larves anormales et les organismes à des stades antérieurs du cycle biologique (p. ex. œufs fécondés et embryons au stade blastula ou gastrula).

m Compter le nombre de larves normales (au stade prisme ou pluteus) et de larves anormales. Les œufs non fécondés observés ne doivent pas être comptés ni notés.

13. Paramètres biologiques
Document Larves normales (%) Survie (%) Survivants anormaux (%) Essai à concentrations multiples
USEPA et PSWQA, 1995 ouia ouie ouif NIg
APHA et al., 2005 ouib non non NI
ASTM, 2007 ouic non non CE50h
SCCWRP, 2008 ouid non non CSEOi
EC, 2013 ouib non non NIg

a Le principal effet biologique à mesurer par l’essai est le pourcentage de larves normales. Ce paramètre est calculé en divisant le nombre de larves normales trouvées dans un traitement à la fin de l’essai par le nombre d’embryons représentant ce traitement au début de l’essai, et en multipliant par 100. Le paramètre représente les effets combinés du ou des contaminants sur la survie et le développement (normal).

b Le paramètre biologique à mesurer par cet essai est le pourcentage de larves normales. En appliquant la « méthode de dénombrement complet », le pourcentage de larves normales est calculé en divisant le nombre de larves normales trouvées dans un traitement à la fin de l’essai par le nombre d’embryons représentant ce traitement au début de l’essai, et en multipliant par 100.

c ASTM (2007) calcule et exprime les résultats de l’essai comme le pourcentage d’embryons dans chaque répétition d’un traitement qui n’a pas produit des larves pluteus normales. Ce calcul est essentiellement le même que celui du pourcentage de larves normales, puisqu’il se fonde sur les effets combinés du ou des contaminants sur la survie et le développement; il utilise les données pour le nombre d’embryons au début de l’essai ainsi que le nombre de larves normales à la fin de l’essai.

d Le paramètre biologique à mesurer par l’essai est le pourcentage de larves normales. Il est déterminé par les comptes de 100 larves, blastulas, gastrulas et œufs fécondés dans chaque répétition; les œufs non fécondés observés ne sont pas comptés.

e Un paramètre biologique secondaire utilisé dans le cadre de l’essai est le pourcentage de survie. Selon l’USEPA et la PSWQA (1995), ce paramètre est calculé en divisant le nombre de larves ayant survécu à l’essai par le nombre de larves témoins, et en multipliant par 100.

f Un autre paramètre biologique secondaire utilisé aux fins de l’essai est le pourcentage de survivants anormaux. Selon l’USEPA et la PSWQA (1995), ce paramètre est calculé en divisant le nombre de larves anormales (survivantes) par le nombre de larves survivantes normales et anormales, et en multipliant par 100.

g Non indiqué (sauf dans le cas d’un essai toxicologique de référence).

h Dans le cas d’un essai à concentrations multiples, la CE50(concentration efficace moyenne) est calculée en utilisant les valeurs moyennes du pourcentage de larves normales déterminé pour chaque concentration.

i Dans le cas d’un essai à concentrations multiples, la CSEO (concentration sans effet observé) est calculée en utilisant les valeurs moyennes du pourcentage de larves normales déterminé pour chaque concentration.

14. Essai toxicologique de référence
Document Substances chimiques Requis? Paramètre biologique Paramètre statistique
USEPA et PSWQA, 1995 chlorure de cadmium dodécyl sulfate de sodium ouib, c % de larves normales CE50f
APHA et al., 2005 NIa NI NI NI
ASTM, 2007 NI nond NI NI
SCCWRP, 2008 chlorure de cuivre ouie % de larves normales CSEOg
EC, 2013 cuivre (sous forme de sulfate de cuivre ou de chlorure de cuivre) ouib, c % de larves normales CI50h

a Non indiqué.

b Doit être réalisé conjointement avec avec l’essai définitif de la toxicité des sédiments.

c L’essai est réalisé sans sédiment. Autrement, les méthodes et les conditions d’essai sont identiques à celles utilisées dans l’essai définitif comportant un contact sédiment-embryons/larves.

d Un essai utilisant un toxique de référence pourrait s’avérer utile pour évaluer la qualité des embryons et des larves; une telle évaluation ne peut être effectuée que simultanément avec l’essai toxicologique définitif.

e Doit être réalisé en même temps que chaque essai sur des effluents.

f Concentration efficace moyenne.

g Concentration sans effet observé.

h Concentration inhibitrice pour un effet (50 %) précisé.

15. Exigences pour des résultats d’essai valides
Document Exigences relatives à un essai
USEPA et PSWQA, 1995 « au moins 70 pour cent des larves [dans 5 répétitions de l’eau de mer témoin] doivent atteindre un stade pluteus normal »; « le critère biologique d’acceptabilité recommandé est que les larves... ne doivent pas présenter un taux combiné de mortalité/anomalie supérieur à 30 pour cent pendant les 48 à 96 heures d’exposition à l’eau de mer de l’essai biologique »
APHA et al., 2005 « la qualité de l’eau de dilution devrait permettre de produire un développement normal d’au moins 70 %(par rapport au nombre initial d’embryons) dans les échantillons témoins » ASTM, 2007 « la qualité de l’eau de dilution devrait permettre de produire un développement normal d’au moins 70 % (par rapport au nombre initial d’embryons) dans les échantillons témoins »; « pour qu’un essai toxicologique avec des embryons d’échinides soit acceptable, une moyenne d’au moins 70 % des embryons maintenus dans les enceintes de témoin de l’eau de dilution doivent être jugés comme étant des larves pluteus normalement développées »
SCCWRP, 2008 « le pourcentage d’embryons anormaux dans le témoin de l’eau de dilution ne peut pas dépasser 20 % pour que l’essai soit considéré comme acceptable » a
EC, 2013 « Pour que les résultats d’un essai soient considérés comme étant valides, au moins 60 % des embryons doivent être jugés comme étant des larves normalement développées à la fin de l’essai dans : 1) le témoin en milieu exclusivement aqueux, et 2) le sédiment témoin de laboratoire. Le critère de validité doit être respecté dans les témoins « en milieu exclusivement aqueux » jumelés et notés conjointement avec le toxique de référence et les échantillons de sédiments. » b

a SCCWRP (2008) indique également que, si dans les dix minutes suivant la fécondation le taux de fécondation n’est pas d’au moins 90 %, un autre volume de sperme doit être ajouté. Le taux de fécondation est ensuite revérifié après dix minutes. Si le taux de fécondation est toujours inférieur à 90 %, l’essai doit être recommencé avec des gamètes différents.

b Au début de l’essai, le taux de fécondation moyen doit être ≥ 90 % pour que l’essai se poursuive.

c SCCWRP (2008) indique également que, si dans les dix minutes suivant la fécondation le taux de fécondation n’est pas d’au moins 90 %, un autre volume de sperme doit être ajouté. Le taux de fécondation est ensuite revérifié après dix minutes. Si le taux de fécondation est toujours inférieur à 90 %, l’essai doit être recommencé avec des gamètes différents.

d Au début de l’essai, le taux de fécondation moyen doit être ≥ 90 % pour que l’essai se poursuive.

Annexe F

Comparaison de la sensibilité des espèces à l’ammoniaca
Espèce Paramètre Résultatb Type
Dendraster excentricus CE50 après 72 h 2,39 mg/L (2,24–2,52) Totalc
CE50 après 72 h 51,8 μg/L (47,5–55,7) Non ionisé (NH3-N)d
CE50 après 72 h 3,59 mg/L (3,33–3,77) Total
CE50 après 72 h 76,1 μg/L (66,6–83,1) Non ionisé (NH3-N)
Strongylocentrotus purpuratus CE50 après 96 h 3,31 mg/L (2,99–3,53) Total
CE50 après 96 h 52,5 μg/L (47,0–56,2) Non ionisé (NH3-N)
Lytechinus pictus CE50 après 48 h 1,91 mg/L (1,53–2,15) Total
CE50 après 48 h 78,6 μg/L (52,1–96,1) Non ionisé (NH3-N)

a D’après les travaux de recherche en matière d’élaboration de méthodes effectués par le Laboratoire des essais environnementaux de l’Atlantique (LEEA) et le Laboratoire des essais environnementaux du Pacifique et du Yukon (LEEPY) d’Environnement Canada.

b L’intervalle de confiance de 95 % est indiqué entre parenthèses.

c Le paramètre a été calculé en utilisant l’ammoniac total mesuré moyen au début et à la fin de l’essai par concentration d’exposition d’essai.

d Le paramètre a été calculé en utilisant l’ammoniac total mesuré au début et à la fin de l’essai, et moyen par concentration d’exposition d’essai.

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