Méthode d’essai biologique : essais pour déterminer la réaction d’évitement ou la reproduction des vers de terre (Eisenia andrei ou Dendrodrilus rubidus) exposés à des contaminants dans le sol

Unité de l’élaboration et de l’application des méthodes
Direction générale de la science et de la technologie
Environnement et Changement climatique Canada
Ottawa (Ontario)

DGST 1/RM/43
Deuxième édition
Août 2022

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Richard Scroggins, chef
Section de l’évaluation biologique et normalisation
Direction générale de la science et de la technologie
Environnement et Changement climatique Canada
335, chemin River
Ottawa (Ontario)
K1A 0H3

Leana Van der Vliet, gestionnaire
Unité de l’élaboration et de l’application des méthodes
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Direction générale de la science et de la technologie
Environnement et Changement climatique Canada
335, chemin River
Ottawa (Ontario)
K1A 0H3

Les demandes de renseignements généraux concernant la présente méthode peuvent être adressées à : methods@ec.gc.ca

Avis de révision

Le présent document a été révisé par le personnel de la Direction générale des sciences et de la technologie d’Environnement et Changement climatique Canada, et sa publication a été autorisée. La mention d’appellations commerciales ou de produits offerts sur le marché ne constitue ni une recommandation ni une approbation de leur emploi par Environnement et Changement climatique Canada. On peut se procurer d’autres produits de valeur analogue.

Résumé

Les méthodes révisées désormais recommandées par Environnement et Changement climatique Canada pour la réalisation de méthodes d’essais biologiques servant à mesurer la toxicité des sols à l’aide de vers de terre (Eisenia andrei et Dendrodrilus rubidus) sont décrites dans le présent rapport. Cette version révisée du document SPE 1/RM/43 comprend de nombreuses mises à jour, notamment : des instructions pour le prélèvement, la manipulation et l’essai de toxicité des sols; le retrait de deux espèces d’expérience (Eisenia fetida et Lumbricus terrestris) et l’ajout d’une autre espèce d’expérience (Dendrodrilus rubidus) utilisée particulièrement pour les essais de toxicité des sols des écozones de la région boréale ou de la taïga; des plans d’expérience révisés; ainsi que des conseils actualisés pour l’élevage et les essais, les essais avec un toxique de référence et l’analyse statistique des données. En outre, en raison d’une faible demande et du manque de sensibilité par rapport à l’essai de reproduction, l’essai de létalité aiguë d’une durée de 14 jours a été supprimé comme option d’essai dans le présent document. Ce rapport révisé remplace la première édition du présent document publiée sous le nom de rapport SPE 1/RM/43 en juin 2004 et révisée en juin 2007. Le présent document expose, conseils à l’appui, les modes opératoires détaillés et les conditions à suivre pour la préparation et la réalisation de chacune des deux méthodes servant à mesurer la toxicité des sols à l’aide de vers de terre (Eisenia andrei ou Dendrodrilus rubidus) :

1. un essai de 56 j servant à déterminer les effets sur la reproduction des vers de terre adultes exposés à un ou plusieurs échantillons ou concentrations de sol contaminé ou potentiellement contaminé;
2. un essai de 48 h servant à déterminer la réaction d’évitement du sol contaminé par les vers de terre adultes.

Appliquée dans des conditions statiques (sans renouvellement du milieu), chaque méthode d’essai emploie un ou plusieurs échantillons de sol effectivement ou potentiellement contaminé ou encore une concentration unique ou des concentrations multiples de substance(s) ou de produit(s) chimique(s) ajoutés à un sol servant de témoin négatif (ou à un autre sol). On ne nourrit les vers (Magic® Worm Food ou céréales mixtes biologiques) que pendant l’essai de reproduction.

L’essai de reproduction de 56 j utilise des vers E. andrei ou D. rubidus élevés en laboratoire. Cet essai se déroule en plaçant quatre vers adultes dans chacun des bocaux en verre de la série (500 ml ml pour E. andrei et 250 ml pour D. rubidus), en présence d’une masse humide mesurée, équivalant à un volume d’environ 350 ml (pour E. andrei) ou 200 ml (pour D. rubidus) de sol d’essai ou non contaminé (sol témoin négatif ou de référence). On compte au moins cinq répétitions par concentration si les essais portent sur des concentrations multiples et utilisent la régression aux fins d’analyse des données. Pour un essai à concentration unique qui utilisera le test d’hypothèse aux fins d’analyse des données, le nombre minimal de répétitions dépend de l’espèce de ver de terre utilisée et de l’ampleur cible avec effet. Après 28 j, on détermine le taux de survie des groupes de répétition constitués de vers adultes dans chaque variante expérimentale, puis on poursuit l’essai pendant encore 28 j, en ne gardant que la progéniture de ces vers. À la fin des 56 j, on détermine le nombre de jeunes vers produits pour chaque groupe de répétition et variante expérimentale, et on compare les moyennes relatives à chaque variante expérimentale.

Effectué en tant qu’essai sublétal, l’essai rapide sur le comportement d’évitement dure 48 h, dans des enceintes circulaires d’acier inoxydable ou de plexiglas, chacune possédant une cheminée centrale circulaire, dépourvue de substrat et percée d’orifices donnant chacun sur l’un des six compartiments communicants, en forme de pointe de tarte. Trois compartiments renferment des aliquotes du même échantillon (ou de la même concentration) de matière. Ils sont séparés l’un de l’autre par autant de compartiments renfermant des aliquotes de sol non contaminé (c’est-à-dire, de témoin négatif ou de sol de référence). Au début de l’essai, on dépose dix congénères (E. andrei ou D. rubidus cultivés en laboratoire) dans la cheminée centrale. On détermine le nombre de vers répartis dans les différents compartiments à la fin de la période d’essai de 48 h durant laquelle les vers de chaque enceinte expérimentale sont capables de se répartir dans un sol non contaminé ou dans le sol d’essai. On emploie au moins 5 enceintes par sol d’essai ou par concentration si on utilise une seule concentration et au moins 2 enceintes par sol d’essai ou par concentration si les concentrations sont multiples; toutefois, un nombre inférieur d’enceintes peut être utilisé si l’essai de réaction d’évitement est utilisé uniquement aux fins d’essais préliminaires.

Pour la préparation et l’exécution des essais, on expose des conditions et des modes opératoires généraux ou universels. S’y ajoutent des conditions ou des modes opératoires propres à la destination de chacun des essais. Ces deux méthodes permettent de mesurer et d’évaluer la toxicité : d’échantillons de solides biologiques, de boues ou de sols prélevés sur le terrain ou de matières particulaires semblables; de sols naturels ou artificiels enrichis, au laboratoire, du ou des produits chimiques ou substances d’essai. Elles sont augmentées d’instructions et d’exigences pour les installations expérimentales, le prélèvement, la manipulation et l’entreposage des échantillons, l’élevage et l’acclimatation des vers, la préparation de mélanges de sols ou de sols enrichis et la mise en branle des essais, leurs conditions particulières, les observations et les mesures à faire, les effets mesurés (ou paramètres de mesure), les méthodes de calcul, et l’emploi d’un toxique de référence. Des instructions précises sont également fournies concernant le prélèvement, la manipulation et la préparation des sols de la forêt boréale et de la taïga ainsi que l’analyse de ces sols.

Avant-propos

Voici une série de méthodes recommandées pour évaluer et mesurer l’effet ou les effets toxiques subis par un organisme terrestre ou aquatique après exposition à des échantillons de substances ou de matières effectivement ou potentiellement toxiques, dans les conditions contrôlées et définies du laboratoire. Ces méthodes ont été évaluées par Environnement et Changement climatique Canada (anciennement Environnement Canada) et elles sont recommandées :

• pour les laboratoires d’écotoxicologie d’Environnement et Changement climatique Canada;
• pour les essais impartis par Environnement et Changement climatique Canada ou demandés à l’industrie ou à des organismes tiers;
• dans les cas où l’on ne possède pas d’instructions plus précises, comme celles que prévoient les règlements;
• en tant que fondement d’instructions très explicites, comme celles qui pourraient être exigées dans un protocole réglementaire ou dans une méthode normalisée de référence.

Les différents types d’essais choisis pour faire partie de cette collection ont été retenus parce qu’ils répondaient de façon acceptable aux besoins des programmes de protection et de gestion de l’environnement exécutés par Environnement et Changement climatique Canada. Les rapports qui leur sont consacrés visent à guider et à faciliter l’emploi de modes opératoires cohérents, adaptés et exhaustifs pour l’obtention de données sur la toxicité d’échantillons de substances ou de matières particulières, présentes dans le milieu ou destinées à y aboutir, à l’égard des formes de vie aquatique ou terrestre. Selon la méthode d’essai biologique choisie et la partie de l’environnement à laquelle on s’intéresse, ces substances ou matières pourraient englober des échantillons de substance ou de produit chimique, de sol, de sédiment ou de matière particulaire semblable, d’effluent, d’élutriat, de percolat ou d’eau réceptrice. Dans l’annexe A sont énumérés les méthodes d’essai biologique et les guides à l’appui qu’Environnement et Changement climatique Canada a publiés jusqu’à maintenant.

Les notions définies sous la rubrique « Terminologie » figurent une première fois en italiques dans le corps du texte.

Liste des abréviations, des symboles et des formules chimiques

Al

aluminium

ANOVA

analyse de variance

AQ/CQ

assurance et contrôle de la qualité

B

bore

C

carbone

°C

degré Celsius

Ca

calcium

Ca(OH)₂

hydroxyde de calcium

CaCl₂

chlorure de calcium

CaCO₃

carbonate de calcium

CCME

Conseil canadien des ministres de l’environnement

CE50

concentration efficace médiane

CEC

capacité d’échange cationique

CEp

concentration efficace correspondant à un pourcentage d’effet (précisé, p. ex., CE25)

CIp

concentration inhibitrice correspondant à un pourcentage d’effet (précisé, p. ex., CI25)

Cl

chlore

CL50

concentration létale médiane

CLHP

chromatographie liquide à haute performance

CLp

concentration létale correspondant à un pourcentage d’effet (précisé, p. ex., CL25)

cm

centimètre(s)

CMEO

concentration minimale avec effet observé

COT

carbone organique total

CRE

capacité de rétention en eau

CSEO

concentration sans effet observé

Cu

cuivre

CV

coefficient de variation

DEL

diode électroluminescente

ET

écart-type

Fe

fer

g

gramme(s)

h

heure(s)

H

hydrogène

H₂O

eau

H₃BO₃

acide borique

HAP

hydrocarbures aromatiques polycycliques

HCl

acide chlorhydrique

ICP

plasma à couplage inductif

j

jour

K

potassium

KCl

chlorure de potassium

kg

kilogramme(s)

L

litre(s)

M

concentration molaire

m

mètre(s)

M.M.

masse moléculaire

^MC

marque de commerce

^MD

marque déposée

Mg

magnésium

mg

milligramme(s)

ml

millilitre(s)

mm

millimètre(s)

Mn

manganèse

MO

matière organique

Mo

molybdène

mS

millisiemens

MWF

Magic® Worm Food

N

azote

n

taille de l’échantillon

Na

sodium

NH₄

ammonium

NHO₃

acide nitrique

nm

nanomètre(s)

NO₂

nitrite

NO₃

nitrate

O

oxygène

OQD

objectifs de qualité des données

P

phosphore

p

poids

p

probabilité

s

seconde

S

soufre

SEA

spectrophotométrie d’émission atomique

sp.

espèce

spp.

espèces

t

temps

v/p

volume sur poids

v/v

volume sur volume

Zn

zinc

α

alpha, indique une erreur de type I

ß

beta, indique une erreur de type II

μg

microgramme(s)

μm

micromètre(s)

μmho

micromho(s)

μmol

micromole(s)

> 

plus grand que

< 

plus petit que

≥

supérieur ou égal à

≤

inférieur ou égal à

%

pour cent

=

égale(nt)

+

plus

−

moins

±

plus ou moins

×

multiplié par

÷

divisé par

/

par; ou « ou » (p. ex., maintien/acclimatation)

≈

approximativement égal à

~

environ

Terminologie

Nota : Toutes les définitions ci-après s’inscrivent dans le contexte du présent rapport. Elles pourraient ne pas être adaptées à d’autres contextes.

Verbes auxiliaires

L’auxiliaire doit (doivent) exprime l’obligation absolue.

L’auxiliaire devrait (devraient) et le conditionnel d’obligation il faudrait expriment une recommandation ou la nécessité de respecter dans la mesure du possible la condition ou la marche à suivre.

L’auxiliaire peut (peuvent) exprime l’autorisation ou la capacité d’accomplir une action.

L’auxiliaire pourrait (pourraient) indique la possibilité ou l’éventualité.

Termes techniques

Acclimatation – Accoutumance physiologique à une valeur particulière d’un ou de plusieurs facteurs du milieu tels que la température. Le terme fait habituellement référence à l’accoutumance aux conditions contrôlées de laboratoire.

Adulte – Se dit d’un ver de terre ayant atteint la maturité sexuelle et qui est doté d’un clitellum bien visible. (V. clitellum, jeune, subadulte.)

Assurance de la qualité – Programme appliqué dans un laboratoire pour que les travaux scientifiques et techniques arrivent à des résultats précis et exacts. Cela comprend la sélection des bons modes opératoires, le prélèvement des échantillons, le choix des limites, l’évaluation des données, le contrôle de la qualité ainsi que les compétences et la formation du personnel.

Biomasse – Masse totale d’un groupe d’animaux ou de végétaux.

Clitellum – Anneau ou selle de tissu glandulaire située sur certains segments du milieu du corps des lombricidés. C’est la caractéristique la plus visible du ver de terre adulte et il n’est proéminent que chez les individus parvenus à la maturité sexuelle, c’est-à-dire les adultes. Les jeunes vers qui n’ont pas atteint la maturité sexuelle se distinguent des adultes par l’absence de clitellum. Le clitellum sécrète le cocon dans lequel les ovules et les spermatozoïdes sont déposés. Pendant l’accouplement, il sécrète également un mucus qui enveloppe les extrémités antérieures des deux vers.

Cocon – Enveloppe de protection des œufs formée par le clitellum d’où sortent les jeunes. (V. clitellum.)

Conductivité électrique – Grandeur physique caractérisant la capacité de conduction du courant électrique par une solution aqueuse. Cette capacité dépend de la concentration des ions dans la solution, de leur valence et de leur mobilité ainsi que de la température de la solution. Dans le cadre de cette méthode, la conductivité électrique se mesure à 25 °C et elle s’exprime en micromhos par centimètre (μmhos/cm) ou en millisiemens par mètre (mS/m); 1 mS/m = 10 μmhos/cm.

Conformité – Respect des exigences officielles énoncées dans les règlements ou sur les permis.

Contrôle de la qualité – Actions précises, englobées dans le programme d’assurance de la qualité : normalisation, étalonnage, obtention de sous-échantillons, échantillons témoins et estimations statistiques des limites relatives aux données.

Couches LFH – Regroupement des horizons pédologiques L, F et H. Ces couches organiques, qui reposent sur un sol minéral, résultent habituellement de l’accumulation de feuilles, de brindilles et de matériaux ligneux. La plupart du temps, on peut identifier les composants de l’horizon L (litière feuillue), qui forme la première couche. La couche suivante, l’horizon F, se distingue de la première du fait que ses composants d’origine sont difficiles à identifier parce qu’ils sont en décomposition. La dernière, l’horizon H, est constituée de matériaux organiques décomposés, impossibles à identifier. Onpourrait y trouver des particules minérales provenant du sol minéral sous-jacent.

Couvert végétal – Pour les besoins de cette méthode, couverture plus ou moins continue produite par le feuillage des plantes.

Croissance – Augmentation de la taille ou du poids, du fait de la prolifération de nouveaux tissus. Dans la présente méthode, il s’agit de l’augmentation du poids sec.

Décontamination – Traitement d’un lieu contaminé pour empêcher, réduire au minimum ou atténuer des effets négatifs pour la santé humaine et l’environnement. L’opération peut comprendre à la fois des actions physiques directes (p. ex. l’élimination, la destruction et le confinement des toxiques) et des moyens administratifs (p. ex. le zonage ou des décrets).

Diode électroluminescente (DEL) – Type de source lumineuse. Il s’agit d’une diode semi-conductrice qui s’allume lorsqu’une tension est appliquée. La DEL diffère des sources lumineuses fluorescentes et incandescentes par le mécanisme utilisé pour générer la lumière.

Dissépiment – Cloison interne, intersegmentaire, vis-à-vis les constrictions, ou sillons, intersegmentaires du tégument d’un ver de terre. Le dissépiment joue aussi le rôle de membrane de soutien des organes internes (Reynolds, 1977).

Élevage – Stock d’organismes élevés en laboratoire dans des conditions définies et contrôlées pendant une génération ou plus afin d’obtenir des organismes d’essai en bonne santé. Ce terme désigne également l’activité visant à produire de tels sujets à partir d’une génération ou plus dans des conditions définies et contrôlées.

Épigé – Se dit des espèces de vers vivant dans la litière, principalement actifs dans les détritus et se nourrissant principalement de matière organique fraîche.

Épilobique – Se dit du prostomium dont le prolongement dorsal étroit, limité par des sillons latéraux, s’arrête sur le trajet du premier segment. (V. prostomium et premier segment.)

Évaluation des risques écologiques – Processus comportant l’analyse du risque et l’évaluation des effets négatifs des milieux naturels contaminés (p. ex., air, sol, eau) sur les organismes non humains, en tenant compte de la nature et de l’étendue de ces effets, de même que de la probabilité de manifestation de ceux-ci (ISO, 2005).

Évaluation des risques, v. évaluation des risques écologiques.

Hormèse – Stimulation observée de la performance (reproduction) des organismes d’essai, par rapport aux organismes témoins, aux faibles concentrations utilisées dans un essai de toxicité.

Jeune – Ver non adulte, dépourvu d’un clitellum visible. Font partie des jeunes les nouveau-nés (moins de 48 h après la sortie du cocon) et tous les stades non adultes des vers sortis du cocon jusqu’au stade subadulte. (V. adulte, clitellum, nouveau-né, subadulte.)

Lombricidé – Ver de terre appartenant à la famille Lumbricidae, superfamille Lumbricoidea, ordre Haplotaxida, sous-classe Oligochaeta (oligochètes), classe Clitellata et embranchement Annelida (annélides).

Lux – Unité d’éclairement (symbole : lx) par mètre carré. 1 lux = 0,0929 pied-bougie (pied-chandelle) et 1 pied-bougie = 10,76 lux. Pour transformer les lux en flux quantique [μmol/(m² · s)], il faut connaître la qualité spectrale de la source lumineuse. Les conditions d’éclairage ou l’irradiance sont bien décrites par le flux quantique (débit de fluence photonique) dans la gamme de longueurs d’ondes photosynthétiquement efficaces d’environ 400 à 700 nm. La relation entre flux quantique et lux (bougie-pied) varie énormément en fonction de la source lumineuse, du photomètre utilisé, de la disposition géométrique et des réflexions possibles (v. ASTM, 2014). Les facteurs approximatifs de conversion entre le flux quantique et le lux sont cependant les suivants :

• sous éclairage fluorescent blanc et cru : 1 lux ≈ 0,014 μmol/(m² · s);
• sous éclairage fluorescent à spectre continu (p. ex. Vita-Lite® de Duro-Test®) : 1 lux ≈ 0,016 μmol/(m² · s); et
• sous éclairage à incandescence : 1 lux ≈ 0,019 μmol/(m² · s) [Deitzer, 1994; Sager et McFarlane, 1997].

Mamelon – Région où l’épiderme du lombric est modifié par une papille glandulaire sans délimitation nette, au travers de laquelle s’ouvre le follicule d’une soie génitale (Reynolds, 1977).

Méthode de référence – Protocole particulier d’un essai de toxicité, c’est-à-dire méthode d’essai biologique au moyen d’un ensemble explicite de modes opératoires et de conditions expérimentales sur lesquels les parties concernées se sont officiellement entendues, qui est décrite dans un document écrit qu’on appelle également protocole. Contrairement aux autres méthodes polyvalentes (génériques) d’essai biologique publiées par Environnement et Changement climatique Canada, la méthode de référence est souvent réservée aux essais exigés par un règlement particulier.

Nouveau-né – Ver venant de sortir du cocon et ayant commencé à se nourrir activement et à croître. (V. jeune.)

Papille – Éminence dermique sur le corps d’un ver de terre (Reynolds, 1977).

Péristomium – Premier segment du corps d’un ver de terre, dépourvu de soies, dans lequel s’ouvre la bouche. (V. soie.)

pH – Logarithme négatif de l’activité des ions hydrogène mesurée par leur concentration en moles par litre. Le pH exprime le degré ou l’intensité des réactions acide et alcaline sur une échelle de 0 à 14, où le pH 7 représente la neutralité. Les pH inférieurs à 7 correspondent, en ordre décroissant, à des réactions acides de plus en plus fortes, tandis que les pH supérieurs à 7 indiquent, en ordre croissant, des réactions basiques ou alcalines de plus en plus fortes.

Photopériode – Durée quotidienne de la période d’éclairement.

Pollution – Addition d’une substance, d’une matière ou d’une forme d’énergie telle que la chaleur à un milieu, en une quantité y causant une modification décelable, qui est nocive pour l’utilisation de ce milieu par un organisme ou l’espèce humaine. Il existe des définitions officielles (nationales et internationales) de la pollution, auxquelles il faudrait faire honneur dans les contextes appropriés.

Potentiel d’oxydoréduction – Mesure (exprimée en volts) d’affinité d’une substance pour les électrons par rapport à l’hydrogène.

Prétraitement – Traitement d’un échantillon ou d’une fraction d’échantillon de sol avant d’y exposer les organismes d’essai.

Progéniture – Vers engendrés directement par un ver adulte.

Prostomium – Lobe antérieur en saillie devant le péristomium, au-dessus de la bouche. (V. péristomium.)

Protocole – Document exposant avec précision le mode opératoire d’un essai, auquel adhèrent officiellement les parties concernées. ∥ Ces marches à suivre.

Reproduction sexuée – Reproduction qui se fait par fertilisation de l’ovule par un spermatozoïde.

Risque – Probabilité de survenance d’un effet fâcheux

Soie – Production, ressemblant à un bâtonnet ou à un poil, de cellules situées au fond d’une invagination épidermique tubulaire appelé follicule sétigère. Les soies sont de divers types (p. ex. génitales, péniales ou non spécialisées; v. Reynolds, 1977, pour plus de précisions).

Spermathèque – Vésicule située dans les dissépiments du ver de terre, qui reçoit le sperme du partenaire. Ce sperme s’y conserve jusqu’à la ponte dans le cocon (Reynolds, 1977). [V. dissépiment.]

Subadulte – Se dit d’un jeune ver, « adolescent » qui n’a pas atteint la maturité sexuelle et est dépourvu de clitellum bien visible. (V. adulte, clitellum, jeune.)

Surveillance – Vérification régulière (p. ex. journalière, hebdomadaire, mensuelle, trimestrielle) de la qualité ou de la collecte et de la divulgation des données. Dans le présent rapport, c’est la vérification et la mesure périodiques (régulières), soit de certaines variables biologiques ou de certaines variables de la qualité des sols, ou encore, c’est le prélèvement et l’essai de toxicité d’échantillons de sol.

Tubercule de la puberté – Bourrelet glandulaire qui, chez le ver de terre, se manifeste près des marges ventrolatérales du clitellum. Il n’est pas toujours présent et il peut être continu ou discontinu ainsi que de tailles et de formes variées (Reynolds, 1977).

Vésicule séminale – Organe sacciforme recueillant les produits mâles (spermatogonies) jusqu’au moment de l’accouplement.

Terminologie des substances ou des matières

Capacité d’échange cationique (CEC) – Quantité totale de cations échangeables que le sol peut adsorber. Parfois appelée capacité totale d’échange, pouvoir d’échange de cations et capacité d’adsorption de cations. Elle s’exprime en milliéquivalents par 100 g de sol (ou de tout autre solide adsorbant, comme l’argile) (AAC, 1998).

Capacité de rétention en eau (CRE) – Quantité maximale d’eau que le sol peut retenir, après saturation complète. On la mesure par gravimétrie et on l’exprime généralement sous forme de pourcentage d’eau (en poids; eau-sol sec) que retient un échantillon de sol ayant été saturé d’eau.

Carbone organique total (COT) – Teneur en carbone organique du sol, à l’exclusion du carbone des résidus végétaux et animaux non décomposés, déterminée au moyen d’une analyse par combustion sèche (ISO, 1995). (V. matière organique.)

Carotte – Échantillon de sol prélevé au moyen d’un carottier.

Concentration – Rapport de la masse de la substance ou de la matière d’essai à la masse du sol, en milligrammes par kilogramme de sol sec (mg/kg). On peut l’exprimer en pourcentage (p. ex. de sol d’un emplacement contaminé) par kilogramme de sol sec.

Contaminant – Substance ou matière présente dans un système naturel ou présente à des concentrations accrues, souvent en raison, directement ou non, de l’activité humaine. Se dit souvent de substances ou de matières présentes à des concentrations susceptibles de causer des effets biologiques négatifs.

Contaminé – Se dit d’un sol renfermant des substances ou des matières à des concentrations posant une menace connue ou potentielle à la santé de l’environnement ou à la santé humaine.

Eau d’essai – Eau utilisée dans la préparation de solutions mères, le rinçage des organismes d’essai ou de la verrerie et des autres appareils utilisés pour l’élevage ou l’entretien et l’acclimatation des vers de terre et utilisée à d’autres fins exigées par la méthode d’essai biologique (p. ex. l’hydratation des échantillons de sol d’essai). L’eau d’essai doit être désionisée ou distillée, à défaut de meilleur traitement (p. ex. eau de qualité « réactif » obtenue par osmose inverse, passage sur cartouches à charbon ou cartouches échangeuses d’ions). [V. eau d’hydratation.]

Eau d’hydratation – Eau servant à hydrater le sol d’essai afin de fournir aux organismes en expérience la teneur en humidité qui leur convient. L’eau servant à l’hydratation est normalement de l’eau d’essai. C’est fréquemment de l’eau désionisée ou distillée, de l’eau purifiée par osmose inverse ou de l’eau du robinet déchlorée. Selon le plan et le but de l’étude, on pourrait utiliser de l’eau de surface ou de l’eau souterraine du site, au lieu d’eau désionisée ou distillée, pour l’hydratation de chaque sol d’essai (y compris du sol témoin négatif). [V. eau d’essai, eau désionisée, eau distillée.]

Eau désionisée – Eau ayant été purifiée par passage en colonnes de résines ou par osmose inverse, pour l’en débarrasser des ions tels que Ca⁺⁺ et Mg⁺⁺.

Eau distillée – Eau ayant été distillée dans un appareil en verre borosilicaté ou d’un autre matériau pour l’en débarrasser de ses impuretés.

Échantillon composite – Échantillonde sol constitué d’échantillons ponctuels ou en vrac provenant de ≥2 points d’échantillonnage d’un même emplacement (Crépin et Johnson, 1993).

Échantillon de sol en vrac – Échantillon ponctuel perturbé, habituellement assez volumineux (>1 L), constitué de ≥2 fractions individuelles de sol prélevées dans un lieu d’échantillonnage au moyen d’un échantillonneur. Il s’agit donc d’un échantillon ponctuel et non d’un échantillon composite. Souvent, on prélève des échantillons de sol en vrac afin d’obtenir les volumes élevés dont on a besoin pour les essais biologiques. (V. échantillon ponctuel, échantillon composite.)

Échantillon de sol intact – Échantillon prélevé au moyen d’une méthode n’altérant pas la structure du sol (ISO, 2005). Synonymes : échantillon non perturbé et échantillon non remanié. (V. échantillon de sol perturbé.)

Échantillon de sol perturbé – Échantillon prélevé sans tenter de préserver la structure du sol (ISO, 2005). Synonyme : échantillon remanié. (V. échantillon de sol intact.)

Échantillon ponctuel – Portion individuelle de sol prélevée sur un lieu d’échantillonnage au moyen d’un échantillonneur (p. ex. carottier).

Emplacement de référence – Emplacement où l’influence d’une ou de plusieurs sources de contamination est inexistante, mais il se trouve dans les environs du ou des emplacements de prélèvement de l’échantillon ou des échantillons du sol d’essai. (V. emplacement.)

Emplacement – Terrain délimité que l’on utilise ou que l’on envisage d’utiliser pour une étude, habituellement parce qu’il est considéré comme étant effectivement ou potentiellement contaminé par des activités humaines. (V. emplacement de référence.)

Enrichissement – Ajout d’une quantité connue de substance(s), de produit(s) chimique(s) ou encore d’autressubstance(s) ou matière(s) à l’étude [p. ex. un échantillon de boue résiduaire ou de boue de forage] à un sol naturel ou artificiel. Cette adjonction se fait habituellement dans un sol témoin négatif, un sol de référence ou un autre sol non contaminé, mais parfois dans un sol effectivement ou potentiellement contaminé. Après l’addition (enrichissement), on homogénéise le mélange. Si la matière d’essai que l’on ajoute est le sol de site, les documents d’Environnement et Changement climatique Canada parlent plutôt de dilution ou, simplement, d’addition. (V. sol enrichi avec une substance chimique, sol enrichi.)

Essai de toxicité de référence – Essai à concentrations multiples effectué à l’aide d’un toxique de référence, pour évaluer, pendant le déroulement d’un essai de toxicité d’un sol, la sensibilité des organismes ainsi que la précision et la fiabilité des résultats obtenus par le laboratoire pour ce toxique au moment où l’on évalue la matière ou la substance d’essai. Tout résultat s’écartant d’un intervalle normal établi rend suspectes la sensibilité des organismes ainsi que l’exécution et la précision de l’essai, et la cause de cet écart devrait être examinée. L’essai de toxicité de référence avec des vers de terre emploie un sol enrichi avec un étalon chimique.

Essai définitif (de toxicité d’un sol) – Se dit d’un essai décisif par opposition à un essai préliminaire. [V. aussi essai préliminaire.]

Essai préliminaire – Essai de toxicité d’un sol effectué pour obtenir une indication initiale de la toxicité de la matière d’essai dans des conditions définies et pour choisir la plage de concentrations qui sera utilisée dans un essai définitif à concentrations multiples. [V. aussi essai définitif (de toxicité d’un sol).]

Fertilité – Aptitude d’un sol à fournir aux plantes les éléments nutritifs dont elles ont besoin, dans les quantités, sous les formes et dans les proportions nécessaires à leur croissance optimale. On la mesure directement par dosage des ions et des composés importants pour la nutrition végétale. Les facteurs fondamentaux de la fertilité sont les éléments nutritifs essentiels (macronutriments, parmi lesquels C, H, O, N, P, K, Ca, Mg, S, et les micronutriments ou oligoéléments, parmi lesquels Fe, Mn, Mo, B, Cu, Zn et Cl). On mesure indirectement la fertilité en montrant la productivité du sol (c’est-à-dire son aptitude à produire des végétaux qui fournissent les aliments et les fibres essentiels; Hausenbuiller, 1985).

Horizon (pédologique ou de sol) – Couche de matière d’un sol minéral ou organique, approximativement parallèle à la surface de la terre et dont les caractéristiques sont modifiées par les processus de formation du sol. Un horizon pédologique ou de sol se différencie des horizons adjacents par des propriétés comme la couleur, la structure, la texture et la consistance ainsi que par sa composition chimique, biologique et minéralogique.

Horizon, v. horizon de sol.

Lieu d’échantillonnage – Endroit précis sur un emplacement, où le ou les échantillons de sol sont prélevés en vue d’essais de toxicité et d’analyses physicochimiques connexes. Synonyme : station d’échantillonnage.

Lot – Quantité totale d’un sol d’essai particulier (ou concentration précise de ce sol), préparée pour chaque variante expérimentale (concentration) employée dans un essai. Le lot est constitué de tout sol d’essai qui est hydraté et prêt à séparer en répétitions. Un lot pourrait également faire référence à un seul groupe de vers reçu d’une source externe au laboratoire à un moment précis.

Matière organique (MO) – Ensemble, principalement, des résidus de matière végétale et animale à différents stades de décomposition, y compris l’humus. L’accumulation de la matière organique dans le sol est un équilibre entre la restitution ou l’apport de résidus d’origine végétale et animale et entre leur perte ultérieure en raison de la décomposition de ces résidus par les microorganismes du sol. Dans de nombreux types de sols, l’équation suivante (AESA, 2001) permet d’estimer la teneur en matière organique (MO) totale du sol à partir des résultats du dosage du carbone organique total (COT) : % de MO = % de COT × 1,78; toutefois, comme la relation entre le COT et la matière organique varie légèrement d’un sol à un autre, la teneur en COT devrait être déterminée également au moyen d’analyses de laboratoire. (V. carbone organique total.)

Matière – Ce dont quelque chose est constitué. Ses caractéristiques seraient plus ou moins uniformes. Un sol, un sédiment, une eau de surface sont des matières. Habituellement, la matière renferme un nombre plus ou moins grand de substances.

Objectifs de qualité des données – Critères prédéfinis applicables aux données produites ou utilisées dans une étude afin de s’assurer que ces données seront d’une qualité acceptable en regard des besoins qu’elles sont censées combler.

Produit – Préparation du commerce renfermant une ou plusieurs substances chimiques. (V. produit chimique, substance.)

Sol artificiel – Sol préparé au laboratoire, dont la composition s’approche de celle d’un sol naturel et dont les constituants naturels (sable, argile et tourbe) sont en proportions précises. Ce sol peut servir de sol témoin négatif ainsi que de diluant pour la préparation de concentrations multiples de sol(s) de site ou de sol(s) enrichi(s) avec une substance chimique.

Sol d’essai – Échantillon de sol prélevé sur le terrain (p. ex. sol d’un emplacement) qui est contaminé ou potentiellement contaminé, ou de sol enrichi avec une substance chimique, dont on veut évaluer la toxicité pour les vers de terre. Les sols d’essai de la région boréale et de la taïga sont prélevés dans des horizons pédologiques distincts. Parfois, l’expression désigne également tout échantillon solide ou mélange d’échantillons solides (p. ex. sol témoin négatif, sol témoin positif, sol de référence, boue résiduaire, boue de forage) utilisé dans un essai de toxicité d’un sol.

Sol de référence – Sol non contaminé, prélevé sur le terrain, ou sol artificiel, choisi pour être employé dans un essai particulier de toxicité en même temps qu’un sol témoin négatif et un ou plusieurs échantillons du sol d’essai. Le sol de référence présente souvent des propriétés physicochimiques (p. ex. texture, teneur en matière organique, teneur en COT, pH et conductivité électrique) proches de celles du sol d’essai, sauf qu’il n’a pas été exposé à la source de contamination que l’on cherche à évaluer. Dans les essais sur le sol du site, on choisit souvent dans les environs de ce dernier un ou plusieurs échantillons de sol de référence qui, de ce fait, pourrait avoir été exposé à d’autres sources de contamination que celle(s) que l’on étudie. Le sol de référence sert à décrire les effets de la matrice sur l’essai et il peut également servir de diluant pour la préparation de concentrations multiples du sol d’essai. Dans les essais où l’on emploie un sol enrichi avec une substance chimique, on pourrait choisir un ou plusieurs échantillons de sol artificiel possédant des caractéristiques physicochimiques différentes pour examiner l’influence de certaines propriétés du sol (p. ex. la texture ou la teneur en matière organique) sur la toxicité d’une substance ajoutée à chacun de ces types de sols. (V. sol témoin négatif, sol de site, sol d’essai, sol non contaminé, sol artificiel, sol enrichi avec une substance chimique.)

Sol de site – Échantillon de sol destiné à un essai de toxicité employant des vers de terre, prélevé sur le terrain, dans un endroit (emplacement) que l’on pense être contaminé par une ou plusieurs substances. Parfois, l’expression englobe le sol de référence ou le sol témoin négatif provenant d’un emplacement de référence.

Sol enrichi avec une substance chimique – Sol naturel ou artificiel (habituellement sol témoin négatif, sol de référence ou autre sol non contaminé) auquel on a ajouté une ou plusieurs substances ou produits chimiques, que l’on a mélangés à fond pour en assurer l’homogénéisation à une concentration précise pour obtenir un lot que l’on pourra utiliser dans un essai de toxicité du sol. (V. sol enrichi.)

Sol enrichi – Sol naturel ou artificiel (habituellement un sol témoin négatif, un sol de référence ou un autre sol non contaminé) auquel on a ajouté, au laboratoire, un ou plusieurs substances ou produits chimiques ou encore d’autres substances ou matières d’essai (p. ex. un échantillon de boue résiduaire ou de boue de forage), le tout homogénéisé de façon à obtenir un lot de concentration précise, qui servira dans un essai de toxicité du sol. (V. sol enrichi avec une substance chimique, enrichissement.)

Sol non contaminé – Sol ne contenant ni substance ni matière provoquant des effets toxiques observables chez les organismes en expérience.

Sol témoin d’un solvant – Échantillon de sol (habituellement artificiel) employé dans un essai employant un sol enrichi avec une substance chimique, dans lequel il faut employer un solvant organique pour solubiliser la substance d’essai avant son mélange dans une quantité mesurée de sol témoin négatif. La quantité de solvant employé pour préparer ce témoin doit contenir la même concentration d’agent solubilisant que l’échantillon de sol enrichi renfermant la concentration maximale de la substance ou des substances d’essai. Cette concentration de solvant ne devrait pas diminuer les performances des vers de terre en expérience. Tout essai employant un solvant organique pour la préparation d’une concentration unique ou des concentrations multiples de sol enrichi avec une substance chimique doit comprendre un sol témoin du solvant. (V. sol artificiel, sol témoin négatif, sol enrichi avec une substance chimique.)

Sol témoin négatif – Sol non contaminé ne renfermant aucun contaminant pouvant modifier la survie, la reproduction, la croissance ou le comportement (p. ex. évitement) des organismes d’essai. Ce pourrait être un sol naturel provenant d’un lieu non contaminé ou un sol artificiel. Ce sol ne doit être enrichi avec aucune matière ou substance chimique à l’étude et il doit permettre une survie ou des performances acceptables des organismes d’essai. L’emploi d’un sol témoin négatif procure une base de comparaison pour l’interprétation des résultats des essais de toxicité effectués sur un ou des sols et renseigne sur l’état de santé (ou la qualité) des organismes d’essai provenant d’un élevage.

Sol témoin positif – Sol contaminé renfermant un ou plusieurs contaminants pouvant nuire à la reproduction ou au comportement (p. ex. évitement) des organismes d’essai dans les méthodes d’essai biologique exposées ci-après. On pourrait utiliser un tel sol comme toxique de référence pour évaluer la sensibilité des organismes au moment où l’on évalue la matière ou la substance d’essai et pour déterminer la précision des résultats obtenus par le laboratoire à l’égard de ce toxique de référence.

Sol témoin, v. sol témoin négatif.

Sol – Matière entière, intacte, représentative du milieu terrestre, ayant subi un minimum de manipulations après son prélèvement ou sa préparation. Dans la nature, il résulte de l’altération physique, chimique et biologique des roches et de la décomposition et du recyclage des éléments nutritifs provenant de la matière organique engendrée par la vie végétale et animale. Ses caractéristiques physicochimiques subissent l’influence des activités biologiques (p. ex. des microbes et des invertébrés [des vers de terre, notamment]) et des facteurs abiotiques qui s’y déroulent, ainsi que de l’activité humaine.

Solution mère – Solution concentrée de la substance ou des substances d’essai, dont on ajoute une quantité mesurée à un échantillon de sol naturel ou artificiel. On homogénéise ensuite le tout afin d’obtenir un lot de Sol enrichi en cette ou ces substances. Pour préparer la solution mère du titre nécessaire, on ajoute à l’eau d’essai (eau désionisée ou eau distillée ou l’équivalent) des masses ou des volumes mesurés de la ou des substances ou du ou des produits chimiques à l’étude, avec ou sans solvant organique.

Substance chimique – Tout élément, composé, préparation ou mélange de substances qui pourraient se retrouver associés à des sédiments ou à de l’eau ou y être mélangés ou ajoutés, ou qui pourrait pénétrer dans l’environnement par suite d’un déversement, d’un épandage ou d’un rejet.

Substance – Type particulier de matière, aux propriétés plus ou moins uniformes. Le terme a un sens plus restreint que matière et pourrait désigner un produit chimique ou un élément chimique particulier

Témoin négatif, v. témoin.

Témoin – Dans une enquête ou une étude, variante expérimentale reproduisant tous les facteurs ou toutes les conditions qui pourraient influer sur les résultats, sauf la condition particulière à l’étude. Dans un essai de toxicité, le témoin doit reproduire toutes les conditions d’exposition, mais il ne doit pas renfermer de matières ou substances contaminées auxquelles on s’intéresse. Le témoin sert à vérifier l’absence de toxicité mesurable attribuable aux conditions de base telles que la température, l’état de santé des organismes d’essai ou les effets dus à la manipulation de ces derniers. Sauf indication contraire, témoin est synonyme de témoin négatif.

Teneur en humidité – Pourcentage d’eau dans un échantillon de sol d’essai, par rapport au poids sec ou humide de celui-ci. Pour déterminer ce pourcentage, on mesure les poids secs et humides d’un sous-échantillon de sol. On calcule la teneur en humidité du sol par rapport à son poids sec en divisant le poids de l’eau du sous-échantillon (poids humide moins poids sec) par le poids du sol sec et en multipliant le résultat par 100. On doit utiliser la même unité de poids (p. ex., g ou mg) dans tous les cas.

Texture – Propriété d’un sol définie d’après le pourcentage pondéral de sable, de limon et d’argile dans la fraction minérale du sol. La texture renseigne sur les caractéristiques et le comportement généraux des substances présentes dans le sol, plus particulièrement lorsqu’on connaît la structure du sol et sa teneur en matière organique. La présente méthode se fonde sur les descriptions des textures de sol du Système canadien de classification des sols (AAC, 1998) et non du système de classification unifié des sols, de la United States Soil Conservation Service Classification ou de tout autre système de classification utilisé dans la science des sols, en ingénierie ou en géologie. La texture est déterminée au laboratoire par l’analyse granulométrique en deux étapes comportant d’abord la séparation des sables (fragments grossiers) par tamisage, des limons et des argiles. Ceux-ci sont séparés ensuite les uns des autres par leur sédimentation dans l’eau. Les classifications texturales se fondent sur des classes de sols délimitées par des intervalles précis de composition en sables, en limons et en argiles. Les trois grandes classes de textures sont les suivantes :

1. texture de moyenne granulométrie (loams, loams limoneux, limons, loams sableux très fins);
2. texture fine (argiles, loams limono-argileux, loams sablo-argileux, argiles limoneuses, argiles sableuses).
3. texture grossière (sables, sables loameux, loams sableux);

On peut encore distinguer la texture (p. ex. argiles sableuses, loams limoneux, loams) d’après les schémas canadiens de classification à l’aide des proportions relatives de sables, de limons et d’argiles dans le sol (AAC, 1998).

Toxique de référence – Substance ou matière étalon servant à mesurer la sensibilité des organismes d’essai afin d’établir le degré de confiance à accorder aux données obtenues sur la toxicité de la substance ou de la matière d’essai. Dans la plupart des cas, on réalise un essai de toxicité à concentrations multiples avec un toxique de référence ou une concentration témoin positive préparée à l’aide d’un toxique de référence pour évaluer la sensibilité des organismes au moment où l’on évalue la matière ou la substance d’essai ainsi que la précision et la fiabilité des résultats obtenus par le laboratoire à l’égard de cette substance.

Terminologie toxicologique et statistique

A priori – Se dit de ce qui est indépendant de l’expérience. Dans le contexte des plans d’expérience et de la statistique, un essai planifié avant la collecte de données constitue un essai a priori. Les objectifs et le plan d’expérience influeraient sur les décisions quant au choix de l’essai a priori à exécuter.

Aigu – Qui se manifeste dans une courte période d’exposition (en secondes, en minutes, en heures ou en quelques jours) relativement à la durée de vie de l’organisme d’essai; on l’utilise généralement pour décrire la durée d’un essai ou de l’exposition.

Ampleur cible avec effet – Ampleur de l’effet négatif dans une étude particulière qui est jugée importante, exprimée en pourcentage de réduction par rapport au témoin. Dans cette méthode d’essai, l’effet renvoie particulièrement à une réduction du nombre de jeunes. L’ampleur cible avec effet peut être liée à un énoncé de politique; elle peut aussi être établie en fonction de l’avis des experts, choisie pour s’aligner sur d’autres ampleurs d’effet dans le cadre d’une batterie d’essais de toxicité, ou calculée par d’autres moyens. On établit l’ampleur cible avec effet avant le début de l’essai. Il convient de noter que le fait d’établir l’ampleur cible avec effet ne signifie pas que des effets négatifs seront observés au cours d’un essai particulier; le choix de cette ampleur ne fait que lier le nombre de répétitions à la capacité de l’essai à « détecter » (pour ce qui est de l’importance statistique) un effet, le cas échéant.

Batterie d’essais – Combinaison de plusieurs essais de toxicité, normalement sur différentes espèces d’organismes (p. ex. série d’essais de toxicité de sol employant des vers de terre, des végétaux ou des collemboles), mesurant différents effets biologiques (p. ex. effets létaux et divers effets sublétaux) et éprouvant différentes durées d’exposition (p. ex. effets aigus et chroniques).

Carte de contrôle – Graphique permettant de suivre l’évolution de l’effet exercé par un toxique de référence. La date ou le numéro de l’essai se trouve sur l’axe horizontal. Pour les essais à concentrations multiples, on porte, sur l’axe logarithmique vertical, la concentration à laquelle l’effet est observé, tandis que pour les sols témoins positifs, le pourcentage d’effet par rapport au témoin est représenté sur l’échelle arithmétique verticale.

CE50 ou concentration efficace médiane – Concentration (p. ex. en pourcentage ou en mg/kg) de substance(s) ou de matière(s) que l’on estime causer certains effets toxiques définis chez la moitié des organismes d’essai. Dans la plupart des cas, on obtient la CE50 et ses limites de confiance à 95 % par analyse statistique des pourcentages des organismes touchés (p. ex. manifestant une réaction de fuite ou de phobie) à au moins cinq concentrations, après une période fixe d’exposition, dont il faut préciser la durée (p. ex. 48 h). La CE50 décrit des effets quantiques sublétaux (p. ex. effets entraînant une réponse binaire telle que l’évitement et le non-évitement) et ne s’applique pas aux effets continus quantitatifs (p. ex. effets pouvant être mesurés selon un continuum numérique tel que le nombre de jeunes ou le poids) [v. CIp]. Selon les objectifs de l’expérience, on pourrait calculer une CEp différente de la CE50 (p. ex. la CE25) ou en sus de cette dernière.

Chronique – Qui survient après une période d’exposition relativement longue (semaines, mois, années), habituellement une partie importante de la durée de vie de l’organisme; on l’utilise généralement pour décrire la durée d’un essai ou de l’exposition.

CIp ou concentration inhibitrice correspondant à un pourcentage d’effet (précisé) – Concentration estimative ponctuelle d’une substance ou de matière d’essai causant un pourcentage précisé d’inhibition (p), par rapport au témoin, dans la mesure d’un effet biologique quantitatif (continu) tel que le nombre de jeunes engendrés par individu, à la fin de l’essai (p. ex. CI25 ou CI50).

CL50 ou concentration létale médiane – Concentration (exprimée en pourcentage ou en milligrammes par kilogramme, p. ex., % ou mg/kg) d’une ou de plusieurs substances ou matières dans le sol, qui est censée être létale pour 50 % des organismes d’essai. La CL50 et ses limites de confiance à 95 % sont normalement dérivées de l’analyse statistique du pourcentage des mortalités survenues à chacune des cinq concentrations d’essai ou plus, après une période d’exposition donnée. La durée de l’exposition doit être précisée (p. ex., CL50 28 jours). Selon les objectifs de l’étude, une concentration létale autre qu’une CL50 (p. ex., CL25) pourrait être calculée en remplacement ou en plus de la CL50.

Coefficient de variation (C. V.) – Pourcentage exprimant le quotient de l’écart type (ET) d’un ensemble de données divisé par la moyenne de cet ensemble. On le calcule à partir de la formule suivante : C. V. (%) = 100 × (ET ÷ moyenne).

Concentration minimale avec effet observé (CMEO) – La plus faible des concentrations d’essai causant, chez l’organisme qui y est exposé, un effet négatif statistiquement significatif par rapport au groupe témoin.

Concentration sans effet observé (CSEO) – Concentration maximale de substance ou de matière à laquelle on n’observe aucun effet négatif statistiquement significatif chez l’organisme qui y est exposé, par rapport au groupe témoin.

Échantillons réitérés – Échantillon de sol prélevé indépendamment dans un même lieu d’échantillonnage pour obtenir une estimation de l’erreur d’échantillonnage ou d’améliorer la précision de l’estimation. Chaque échantillon de sol prélevé dans un lieu d’échantillonnage est considéré comme une répétition. Les échantillons supplémentaires sont considérés comme réitérés quand on les soumet au même traitement (peu importe qu’il s’agisse d’échantillons ponctuels ou d’échantillons composites provenant du même lieu), mais qu’on les conserve dans des récipients séparés (c’est-à-dire qu’ils ne forment pas d’échantillons composés ou, dans le cas d’échantillons composites, sans autre regroupement).

Écotoxicologie – Subdivision de la toxicologie. Elle insiste cependant sur les écosystèmes, les communautés naturelles et les espèces sauvages, sans exclure l’espèce humaine des écosystèmes.

Effet quantique – Dans un essai de toxicité, effet auquel chaque organisme d’essai réagit ou ne réagit pas. Par exemple, l’animal pourrait réagir en mourant ou en évitant un sol contaminé. En général, l’effet quantique s’exprime par des dénombrements ou des pourcentages issus de dénombrements. (V. effet quantitatif.)

Effet quantitatif – Dans un essai de toxicité, effet dont la valeur mesurée varie de façon continue sur une échelle numérique, par exemple le nombre de jeunes engendrés à la fin de l’essai. En général, on détermine l’effet quantitatif et on l’exprime par des mesures. (V. effet quantique.)

Effet sublétal – Effet négatif subi par un organisme subissant une exposition inférieure à la concentration ou au degré de contamination directement mortelle pendant l’essai.

Effet – En toxicologie, signifie un changement biologique mesurable. Le changement pourrait être structurel, physiologique, comportemental, etc. Dans un essai de toxicité, le changement biologique devrait être évalué par rapport à des mesures effectuées sur des organismes dans des conditions témoins. L’analyse statistique tient généralement compte des degrés d’effet qui dépassent les mesures témoins et qui devraient découler de l’exposition aux composants toxiques de la matière d’essai.

En conditions statiques – Se dit de l’essai de toxicité pendant lequel on ne renouvelle ni ne remplace le sol (ni aucune substance ou aucun produit chimique s’y trouvant).

Erreur de type I – Se produit lorsqu’un expérimentateur rejette une hypothèse nulle qui est vraie. Elle est couramment désignée par α (alpha). En d’autres termes, l’expérimentateur conclut qu’il y a une différence importante, alors qu’il n’y en a pas.

Erreur de type II – Se produit lorsqu’un expérimentateur ne rejette pas une hypothèse nulle lorsque cette dernière est fausse (c’est-à-dire qu’il conclut qu’il n’y a pas de différence importante, alors qu’il y a une). Elle est couramment désignée par ß(beta).

Essai de toxicité – Détermination de l’effet négatif d’une substance ou d’une matière par suite de l’exposition d’un groupe d’organismes choisis d’une espèce particulière (p. ex. Eisenia andrei ou Dendrodrilus rubidus), dans des conditions définies. L’essai employant des échantillons de sol permet habituellement de mesurer : a) la proportion d’organismes touchés par l’effet (effet quantique); b) le degré d’effet manifesté (effet quantitatif ou gradué), après exposition des organismes à l’échantillon entier (p. ex. sol non dilué de site) ou à des concentrations précises de cet échantillon.

Hétéroscédasticité – Hétérogénéité des résidus que présentent les données dans un nuage de points (v. EC, 2005a). Il y a hétéroscédasticité lorsque la variabilité des résidus diffère de façon significative de celle des variables indépendantes (c’est-à-dire les concentrations utilisées dans les essais ou les variantes expérimentales). Dans l’analyse statistique et l’évaluation des résidus (p. ex. dans le test de Levine), si les données expérimentales présentent une hétéroscédasticité (c’est-à-dire que les résidus ne sont pas homogènes), c’est qu’il existe une différence significative entre la variance des résidus correspondant aux différentes concentrations ou variantes expérimentales utilisées dans l’essai. (V. homoscédasticité, résidu.)

Homoscédasticité – Homogénéité des résidus que présentent les données dans un nuage de points (v. EC, 2005a). Il y a homoscédasticité lorsque la variabilité des résidus ne diffère pas de façon significative de celle des variables indépendantes (c’est-à-dire les concentrations utilisées dans les essais ou les variantes expérimentales). Dans l’analyse statistique et l’évaluation des résidus (p. ex. dans le test de Levine), si les données expérimentales présentent une homoscédasticité (c’est-à-dire que les résidus sont homogènes), c’est qu’il n’existe pas de différence significative entre la variance des résidus correspondant aux différentes concentrations ou variantes expérimentales utilisées dans l’essai. (V. hétéroscédasticité, résidus.)

Létal – Causant directement la mort chez l’organisme d’essai, c’est-à-dire l’interruption de tous les signes visibles de mouvement ou de toute autre fonction de la vie.

Limites d’avertissement – Limite située à plus ou moins deux écarts types (± 2 ET) de la moyenne découlant d’essais effectués avec un toxique de référence. Pour les essais à concentrations multiples, la limite d’avertissement est calculée logarithmiquement de part et d’autre d’une moyenne géométrique historique des paramètres de mesure (c.-à-d. CI50), tandis que pour les sols témoins positifs, la limite d’avertissement est calculée de façon arithmétique de part et d’autre d’une moyenne historique des paramètres de mesure (pourcentage d’effet par rapport au témoin).

Moyenne géométrique – Moyenne de mesures répétées, calculée logarithmiquement. Son avantage, contrairement à la moyenne arithmétique, est de faire en sorte que les valeurs extrêmes n’influent pas sur sa propre valeur. On peut la calculer comme la racine énième du produit de n valeurs ou comme l’antilogarithme de la moyenne des logarithmes de n valeurs.

Normalité (ou distribution normale) – Désigne une série de données d’observation décrivant une courbe symétrique en forme de cloche. Cette série met en lien la fréquence d’occurrence et l’ampleur du phénomène mesuré. Dans une distribution normale, la plupart des données d’observation se regroupent près de la valeur moyenne et deviennent progressivement moins nombreuses à mesure qu’on se rapproche des extrêmes de la plage de valeurs. La distribution normale joue un rôle central dans la théorie statistique en raison de ses propriétés mathématiques. Elle revêt également une grande importance dans les sciences biologiques du fait que beaucoup de phénomènes biologiques suivent la même courbe. Dans un bon nombre de tests statistiques, on présume que les données suivent une courbe de distribution normale, de sorte qu’il peut être nécessaire de déterminer si c’est le cas d’un ensemble de données en particulier.

Paramètre – Réaction (il peut y en avoir plus d’une) mesurée des organismes d’essai (p. ex., adultes morts, nombre de jeunes engendrés, ou pourcentage d’évitement) ou valeur (il peut y en avoir plus d’une) caractérisant les résultats d’un essai (CL50, CI25, CE50, etc.).

Précision – Accord entre les résultats de plusieurs mesures répétées, c’est-à-dire le degré de certitude entourant un résultat ou la petitesse de l’intervalle dans lequel se situe un paramètre calculé statistiquement tel que la CIp.

Puissance – Se dit de la probabilité de conclure correctement qu’une différence statistiquement significative existe entre les variables étudiées. Par définition, c’est « la probabilité de rejeter l’hypothèse nulle quand elle est fausse et qu’elle devrait être rejetée ». Il s’agit en fait du contraire d’une erreur de type II, lorsqu’un expérimentateur accepte l’hypothèse nulle alors qu’il y a effectivement une différence. La probabilité de faire cette erreur de type II est appelée ß, et la puissance est représentée par la formule (1 - ß). L’expérimentateur ne peut établir directement et avec précision la puissance qu’après avoir effectué un essai de toxicité. Il est toutefois possible d’accroître la puissance en optimisant la conception de l’essai de toxicité (plus d’organismes, plus de répétitions, réduction de la variabilité, etc.).

Répétition – En parlant d’une variante expérimentale, d’un récipient d’essai ou d’une enceinte expérimentale, le récipient d’essai renfermant le nombre prescrit d’organismes exposés à l’une des concentrations de la matière ou de la substance d’essai ou celui constituant le groupe témoin, ou encore, le groupe exposé à la matière de référence. La répétition d’une variante expérimentale doit être un récipient d’essai indépendant; en conséquence, tout transfert d’organismes ou de matière d’essai d’un récipient à un autre invalide l’analyse statistique fondée sur la répétition (v. § 5.1 et 5.6.1 plus loin, et 2.5 dans EC, 2005a). Dans le présent document, l’enceinte expérimentale servant à l’essai de réaction d’évitement est considérée comme une seule répétition.

Résidu – Dans le contexte du § 6.4.2.1, l’écart entre l’estimation prédite (modélisée) moins la valeur effectivement observée. (V. hétéroscédasticité, homoscédasticité.)

Sublétal – Se dit d’une toxicité nuisible à l’organisme, mais à une concentration ou à un degré de contamination inférieur à la concentration ou au degré de contamination directement mortelle pendant l’essai.

Substance toxique – Synonyme de toxique ou matière toxique.

Test biologique – Test mesurant la concentration ou l’activité d’une substance par la réaction qu’elle provoque chez des organismes vivants. En pharmacologie, un test biologique permet d’évaluer l’activité inconnue d’une préparation donnée d’un médicament par rapport à l’activité connue d’une préparation étalon. Dans le domaine de l’environnement, on utilise plutôt les termes essai de toxicité ou essai toxicologique, qui sont plus précis.

Toxicité aiguë – Effet négatif (létal ou sublétal), discernable, provoqué chez l’organisme d’essai après une courte période d’exposition (quelques jours, habituellement) à un sol.

Toxicité chronique – Manifestation d’effets négatifs discernables pendant ou après une exposition relativement longue à un ou à plusieurs contaminants, ces effets étant reliés à des modifications des fonctions de reproduction, de la croissance, du métabolisme, de la capacité de survie ou de toute autre variable biologique (p. ex. le comportement) observée.

Toxicité – Propriété inhérente d’une substance ou d’une matière de provoquer un ou des effets négatifs chez des organismes. Ces effets pourraient résulter d’une exposition à des concentrations létales ou sublétales de contaminants dans le sol.

Toxicologie – Science de la toxicité des matières, des substances ou des conditions toxiques. Elle fait appel à une gamme illimitée de disciplines scientifiques, d’outils de laboratoire ou de terrain ou d’études à divers niveaux d’organisation, que ce soit à celui de la molécule ou à celui de l’écosystème en passant par l’espèce et les populations. La toxicologie appliquée se propose normalement de définir la marge de sécurité de l’emploi d’une substance ou d’autres agents. (V. écotoxicologie.)

Toxique – Désigne ou qualifie une substance ou une matière ayant des effets néfastes sur des organismes si elle se trouve en quantité suffisante, au bon endroit (c.-à-d. un récepteur ou un organe). Toxique est un adjectif et, dans certains cas, un nom. Dans ce contexte, le terme substance toxique constitue le meilleur choix applicable.

Variante expérimentale – Sol d’essai particulier (p. ex. sol d’un emplacement, sol de référence, sol témoin négatif) provenant d’une station particulière d’échantillonnage ou concentration de sol enrichi avec une substance chimique (ou mélange constitué du sol d’essai, dilué dans du sol non contaminé), préparé au laboratoire. Dans un essai de toxicité, la variante expérimentale est habituellement représentée par plusieurs répétitions des échantillons du sol d’essai. (V. répétition et échantillons réitérés.)

Remerciements

Les auteurs de la première édition du présent document sur les méthodes d’essai biologique, publiée en juin 2004, sont D.J. McLeay (McLeay Environmental Ltd., de Victoria) et G.L. Stephenson (Aquaterra Environmental, d’Orton, en Ontario). Des remerciements sincères vont à J.A. Miller (Miller Environmental Sciences Inc., d’Innisfil, en Ontario) et à J.I. Princz (Division des méthodes biologiques [DMB], Centre de technologie environnementale (CTE), d’Environnement Canada et Changement climatique [ECCC], à Ottawa) pour leur contribution à certaines parties de la première édition de ce document. Nous sommes reconnaissants de l’apport de J.B. Sprague (Sprague Associates Ltd., de Salt Spring Island, en Colombie-Britannique) à certaines définitions de la rubrique « Terminologie » et de ses conseils en matière de statistique. Merci à B.A. Zajdlik (Zajdlik & Associates, de Rockwood, en Ontario) pour ses conseils sur les analyses de régression. N.C. Feisthauer (Stantec Consulting Ltd., de Guelph) et J. McCann (Université de Waterloo) ont donné des orientations techniques des plus utiles et des conseils particuliers dont il a été tenu compte dans le document.

Agissant en qualité d’autorité scientifique pour la première édition de la présente méthode, R.P. Scroggins (DMB, CTE, à Ottawa) a assuré au travail sa direction et son apport techniques. Les études ayant abouti aux méthodes d’essai biologique définies dans la première édition de ce document de méthode ont été mises au point par G.L. Stephenson, dans le cadre de sa thèse de doctorat. D’autres études ont été dirigées par M^me Stephenson et gérées et exécutées par N.C. Feisthauer et ses collègues de Stantec Consulting Ltd. (auparavant ESG International Inc.). Dans les laboratoires, une aide précieuse a également été fournie par de nombreux étudiants du premier cycle et des cycles supérieurs à Guelph. Nous remercions R. Pandey, de Guelph Chemical Laboratories Ltd. (à Guelph) et V. Marsielle-Kerslake des services d’analyse de l’Université de Guelph (Ontario) de leur aide sur les méthodes d’analyse physicochimique.

J. Princz (DMB, CTE) a coordonné les études interlaboratoires visant à valider les méthodes d’essai décrites dans la première édition de cette méthode. Ces études ont été réalisées avec la participation des laboratoires suivants : le Centre des sciences environnementales du Pacifique (CSEP) d’ECCC (North Vancouver), le Centre des sciences de l’environnement de la région de l’Atlantique d’ECCC (Moncton), le Laboratoire de toxicologie des sols d’ECCC (CTE, Ottawa), l’Institut de recherche en biotechnologie (IRB) du Conseil national de recherches Canada (CNRC, Montréal), le Centre d’expertise en analyse environnementale du Québec (Sainte-Foy), le ministère de l’Environnement de l’Ontario (Etobicoke), le Saskatchewan Research Council (Saskatoon), BC Research Inc. (Vancouver), EVS Consultants Ltd. (North Vancouver), HydroQual Laboratories Ltd. (Calgary), Stantec Consulting Ltd. (auparavant ESG International Inc.), Pollutech EnviroQuatics Ltd. (Point Edward, en Ontario) et Bodycôte Essais matériaux Canada Inc. (Sainte-Foy). Toute notre reconnaissance et nos remerciements à Buchanan Environmental Ltd. (Fredericton) pour sa contribution aux discussions ayant mené à ces études de validation des méthodes. Le nom des employés de laboratoire ayant participé à ces essais figure dans les rapports techniques de ces études (EC, 2004a).

Nous sommes sincèrement reconnaissants des nombreuses observations fournies par chacun des membres du Groupe consultatif scientifique (GCS) d’Environnement Canada et Changement climatique chargés des première et dernière révisions de la première édition du présent rapport, comme suit : C. Bastien (Centre d’expertise en analyse environnementale du Québec, ministère de l’Environnement, Sainte-Foy), C. Edwards (Département d’entomologie, université d’État de l’Ohio à Columbus), R. Kuperman (Geo-Centers, Inc., Aberdeen Proving Ground, Maryland), R. Lanno (Département d’entomologie de l’université d’État de l’Ohio à Columbus), F. Riepert (Biologische Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft [Centre fédéral de recherche biologique pour l’agriculture et la foresterie], Berlin), J. Römbke (ETC Ökotoxikologie G. m. b. H., Flörsheim am Main), G. Sunahara (IRB, CNRC, Montréal), G. van Aggelen (CSEP, ECCC, North Vancouver), C.A.M. van Gestel (Institut des sciences de l’environnement, université libre d’Amsterdam) et S. Visser (Département des sciences biologiques, Calgary). Les coordonnées de chaque membre du GCS pour la première édition du document sur les méthodes d’essai figurent dans l’annexe D.

Les personnes suivantes ont également transmis des observations utiles sur les versions initiale ou finale de la première édition du présent document : K. Becker-van Slooten et S. Campiche (École polytechnique fédérale de Lausanne); W. Diehl (Département des sciences biologiques, université d’État du Mississippi); J. Filser (Zentrum für Umweltforschung und Umwelttechnologie [UFT, Centre de recherche et de technologie environnementales], université de Brême); P. Hankard (CEH Monks Wood, Abbots Ripton, Huntington, R.-U.); J. Hatcher (HydroQual Laboratories Ltd., Calgary); M. Hughes (Université du Nord de la Colombie-Britannique [UNCB], Prince George); K. Hund-Rinke (Fraunhofer Institut für Molekularbiologie und Angewandte Oekologie [Institut Fraunhofer de biologie moléculaire et d’écologie appliquée], Fraunhofer-IME, Schmallenberg); L. Kapustka (Ecological Planning and Toxicology Inc., Corvallis, Oregon); G. Linder (station expérimentale du Service géologique des États-Unis à Brooks, Oregon); J. McCann (Département de biologie, U. de Waterloo, Ont.); J. Miller (Miller Environmental Sciences Inc., Innisfil); J. Princz (DMB, EC, Ottawa); J.M.L. Rodrigues (Département de biologie, U. d’Aveiro, Portugal); M. Rutherford (UNCB, Prince George); M. Schaefer (UFT, U. de Brême); J. Scott-Fordsmand (Département d’écologie terrestre, Institut national de recherche environnementale, Silkeborg, Danemark); J.P. Sousa (Instituto do Ambiente e Vida, Université de Coimbra, Portugal); J.B. Sprague (Sprague Associates Ltd., Salt Spring Island); B.-J. Unis (HydroQual Laboratories Ltd., Calgary); M. Warne (Administration de la protection de l’environnement, Sydney, Australie).

Cette (deuxième) édition a été préparée par Jennifer Miller (Miller Environmental Sciences Inc., Uxbridge, Ontario), avec l’aide et les conseils de Juliska Princz, Patrick Boyd et Jessica Velicogna (Laboratoire de toxicologie des sols, ECCC, Ottawa, Ontario) et Rick Scroggins (ECCC, Ottawa, Ontario). Les études liées à la révision de ces méthodes pour Eisenia andrei et à l’élaboration des méthodes d’essai biologique définies dans le présent document pour Dendrodrilus rubidus, menées au Laboratoire de toxicologie des sols d’ECCC, ont été dirigées par Juliska Princz et Rick Scroggins et nous remercions le personnel de laboratoire suivant qui a participé à ces études au fil du temps : Patrick Boyd, Heather Lemieux, Jessica Velicogna, Emily Welsh-Crack, Christopher Fraser, Ellyn Ritchie, Leana Van der Vliet et les divers étudiants du programme d’enseignement coopératif qui ont fourni une assistance technique. Nous remercions sincèrement Leana Van der Vliet et Carolyn Martinko (ECCC, Ottawa, Ontario) pour leurs conseils et leur contribution relativement au calcul de la puissance. Nous remercions également Rick Scroggins qui a agi en tant qu’autorité scientifique et a fourni des conseils tout au long de la préparation de ce rapport. Nous tenons à remercier Rick Scroggins, Juliska Princz, Patrick Boyd, Emily Welsh-Crack, Heather Lemieux et Jessica Velicogna pour leurs nombreux commentaires utiles sur les premières versions de ce document, ainsi que Gladys Stephenson (Ph. D.) pour ses commentaires sur la version finale. Nous remercions également Sylvain Trottier et Charles Faille du Laboratoire des essais environnementaux du Québec pour leur révision de la traduction française.

La Section de l’évaluation biologique et normalisation tient à remercier Leana Van der Vliet, Jill Clapperton (Ph. D.) et John Reynolds (Ph. D.) pour l’aide qu’ils ont apportée au Laboratoire de toxicologie des sols d’ECCC en vue de recueillir des spécimens de vers de terre sur le terrain et de les identifier, démarche ayant permis d’identifier et d’élever D. rubidus pour ces méthodes d’essai. Nous remercions également l’Université de Guelph et son initiative « code à barres de la vie » (Barcode of Life) qui a procédé à l’identification génomique des espèces à l’étude, y compris les efforts de Stacey Saucier au sein du Laboratoire de toxicologie des sols pour la confirmation génomique. Nous tenons à remercier Jason Nelson de Ecodynamics Consulting Inc. et Mary Moody pour leur travail dans l’identification et la collecte des sols de référence et des sols contaminés de la forêt boréale. Nous sommes très reconnaissants du soutien financier fourni par le Programme de recherche et de développement énergétiques (PRDE), qui a permis à ECCC de mener des recherches afin d’améliorer ces méthodes d’essai.

Nous sommes reconnaissants du soutien continu des membres des laboratoires d’essai environnemental régionaux d’ECCC (annexe C) et du Groupe intergouvernemental sur les essais écotoxicologiques (annexe B).

Section 1 : Introduction

1.1 Contexte

L’Unité de l’élaboration et de l’application des méthodes (UEAM) d’Environnement et Changement climatique Canada (ECCC; anciennement Environnement Canada) est chargée de l’élaboration, de la normalisation et de la publication (v. annexe A) d’une collection de méthodes d’essai biologique pour la mesure et l’évaluation de l’effet ou des effets toxiques subis par une espèce terrestre ou aquatique exposée à des échantillons de matières ou de substances d’essai dans des conditions contrôlées et définies de laboratoire. En 1994, l’UEAM, l’Association canadienne des producteurs pétroliers et le gouvernement fédéral, par l’intermédiaire du Programme de recherche et de développement énergétiques, ont lancé un programme pluriannuel de recherche, de développement, de validation et de publication d’un certain nombre de méthodes normalisées d’essai biologique pour la mesure de la toxicité d’échantillons de sol effectivement ou potentiellement contaminés à l’aide d’espèces terrestres appropriées. Le programme avait pour but de mettre au point des méthodes applicables à divers types de sols canadiens auxquels seraient exposées des espèces terrestres représentatives des écosystèmes de ces sols. Lors d’un atelier organisé en 2003 par l’UEAM d’Environnement Canada, il a été recommandé de consacrer en priorité des ressources à l’élaboration de méthodes d’essai utilisant des espèces qui reflètent davantage les sols ou les habitats non agricoles. Puisque les écozones de la forêt boréale et de la taïga recouvrent plus de 50 % de la masse terrestre totale du Canada, et que les ressources de ces écozones contribuent à l’économie canadienne par l’intermédiaire des industries pétrolière, gazière, minière et forestière, la priorité a été accordée à l’élaboration d’essais normalisés applicables à l’évaluation des contaminants présents dans les sols boréaux. Depuis, plusieurs années de recherche ont été menées sur la sélection d’organismes sensibles, convenant à la mesure de la toxicité des sols, y compris ceux de la forêt boréale (EC, 2010, 2013a), pour répondre aux besoins de l’industrie et aux exigences canadiennes en matière de réglementation et de surveillance et sur la mise au point de méthodes appropriées d’essai biologique. Trois examens exhaustifs des méthodes d’essai biologique utilisées dans le monde ont été effectués afin d’évaluer la toxicité des contaminants pour les invertébrés terrestres (Bonnell Environmental Consulting, 1994; Römbke et al., 2006; van Gestel, 2012).

L’initiative d’ECCC a donné lieu à la publication de cinq méthodes d’essai biologique normalisées : i) Essai pour déterminer la toxicité de sols contaminés pour les vers de terre (Eisenia andrei, Eisenia fetida ou Lumbricus terrestris), SPE 1/RM/43 (EC, 2004b, modifiée en 2007); Essai de mesure de la levée et de la croissance de plantes terrestres exposées à des contaminants dans le sol, SPE 1/RM/45 (EC, 2005b, modifiée en 2007); iii) Essai de mesure de la survie et de la reproduction de collemboles exposés à des contaminants dans le sol, SPE 1/RM/47 – 2e édition (EC, 2014a); iv) Essai de croissance de plantes terrestres indigènes de la région boréale exposées à un sol contaminé, SPE 1/RM/56 (EC, 2013b); et v) Essai de mesure de la reproduction des exposés à des acariens oribates contaminants dans le sol, DGST 1/RM/61 (ECCC, 2020a).

Depuis sa publication en 2004, la première édition du présent document sur les méthodes d’essai (Essai pour déterminer la toxicité de sols contaminés pour les vers de terre (Eisenia andrei, Eisenia fetida ou Lumbricus terrestris), a été utilisée par de nombreux laboratoires d’essai des secteurs public et privé pour les essais de toxicité des sols (CE, 2004b). Toutefois, après avoir appliqué ces méthodes pendant 16 ans, l’UEAM d’ECCC a reconnu la nécessité de les mettre à jour et de préparer une deuxième édition du document sur les méthodes d’essai. En 2014, ECCC a commandé un examen des données historiques en vue de résoudre les problèmes techniques et d’étudier la performance de la méthode d’essai pour la survie, la reproduction et la croissance du ver de terre à l’aide de l’espèce d’expérience primaire Eisenia andrei (MESI, 2014)^{Note de bas de page 1}. Les recommandations de cet examen ont permis d’orienter plusieurs années de recherche sur l’amélioration de la méthode portant sur le ver de terre menées par le personnel du Laboratoire de toxicologie des sols d’ECCC (ECCC, 2020b). Les résultats de cette recherche, outre l’établissement des conditions d’élevage et des procédures d’essai requises pour l’ajout d’une nouvelle espèce d’expérience représentative des régions boréales du Canada (Dendrodrilus rubidus), sont inclus dans cette deuxième édition du document sur les méthodes d’essai (EC, 2010, 2013a; ECCC 2020b).

Dans le présent document, on précise les conditions et modes opératoires détaillés de la préparation et de la réalisation deux méthodes. Les voici :

1. un essai d’une durée de 56 jours déterminant les effets sur la reproduction des vers de terre;
2. un essai sublétal de 48 heures sur la réaction d’évitement.

On décrit les modes opératoires universels de la préparation et de la réalisation d’essais de toxicité de sols au moyen d’une espèce choisie de vers de terre (c’est-à-dire E. andrei ou D. rubidus). On présente également les conditions et les modes opératoires particuliers qui sont obligatoires ou recommandés lorsqu’on utilise n’importe laquelle de ces méthodes pour évaluer différents types de substances ou de matières (p. ex. des échantillons de sol prélevés sur le terrain ou de déchet particulaire semblable ou encore des échantillons d’une ou de plusieurs substances ou produits chimiques, mélangés à des fins expérimentales à un sol naturel ou artificiel ou placés à son contact).

Dans l’organigramme de la figure 1 sont énumérés les sujets universels abordés dans le document et les sujets propres à l’essai d’échantillons de sol prélevés sur le terrain, de déchet particulaire semblable (p. ex. boue résiduaire, boue de forage ou déblais de dragage) ou de sol enrichi, à des fins expérimentales, de produit(s) ou de substance(s) chimique(s).

Ces méthodes d’essai biologique sont destinées à servir à l’évaluation de la toxicité létale et sublétale d’échantillons de matières telles que :

• un sol prélevé sur le terrain, qui est effectivement ou potentiellement contaminé;
• des sols dont on envisage l’enlèvement et l’élimination ou la décontamination;
• des déblais de dragage destinés à l’épandage ou dont on envisage l’épandage après déshydratation;
• des boues industrielles ou urbaines ou des déchets particulaires semblables, qui pourraient être épandus;
• un sol contaminé ou non contaminé (naturel ou artificiel), enrichi avec un ou plusieurs produits ou substances chimiques (p. ex. pour l’évaluation du risque posé par les produits chimiques nouveaux ou ceux d’utilisation courante).

Dans la préparation de ces méthodes, on a tenté d’instaurer un juste équilibre entre les considérations scientifiques, pratiques et pécuniaires et de faire en sorte que les résultats seraient suffisamment précis dans la plupart des situations auxquelles ils seraient appliqués. On suppose que l’utilisateur possède un certain degré de connaissances ou qu’il connaît dans une certaine mesure les essais de toxicité des sols. Le présent document ne donne pas les consignes explicites qu’il faudrait suivre dans un protocole réglementaire, bien que le présent document soit destiné à servir de guide utile à cette application et à d’autres.

Pour obtenir des conseils sur la mise en œuvre de ces méthodes et d’autres méthodes d’essai biologique ainsi que sur l’interprétation et l’application des résultats des essais de toxicité des sols, le lecteur devrait consulter les § 4.1.2, 5.5 et 5.6.4 du Guide des essais écotoxicologiques employant une seule espèce et de l’interprétation de leurs résultats (EC, 1999).

Des directives détaillées sur l’utilisation des statistiques afin de déterminer les critères d’effet dans les essais d’écotoxicologie sont disponibles dans le Document d’orientation sur les méthodes statistiques applicables aux essais d’écotoxicité d’Environnement Canada (EC, 2005a).

Figure 1. Points à considérer dans les préparatifs et l’exécution d’essais de toxicité des sols employant des vers de terre (E. andrei ou D. rubidus) et divers types de matières ou de substances

1.2 Identification, aire de répartition et cycle reproductif des vers E. andrei et D. rubidus

Les vers de terre à utiliser dans l’une ou l’autre des méthodes d’essai biologique décrites dans le présent document (c’est-à-dire Eisenia andrei ou Dendrodrilus rubidus) appartiennent à la famille Lumbricidae (lombricidés) [embranchement Annelida; classe Clitellata; sous-classe Oligochaeta; ordre Haplotaxida; superfamille Lumbricoidea; famille Lumbricidae). Les lombricidés ne sont pas indigènes des sols canadiens. Ils ont très probablement été introduits d’Europe par les premiers colons (Bonnell Environmental Consulting, 1994). On trouve des renseignements définitifs sur l’identification, la répartition, la biologie et le cycle reproductif des lombricidés E. andrei et D. rubidus dans un certain nombre de publications, notamment : Edwards et Lofty, 1977; Reynolds, 1977, 1994, 2015; Bengtsson et al., 1986; Fender, 1985; Sims et Gerard, 1985, 1999; Curry, 1988; Bouché, 1992; Frenot, 1992; Christensen et Mather, 1994; Edwards et Bohlen, 1996; Blakemore, 2008 cité dans Csuzdi et al., 2017; Addison, 2009; Berman et al., 2010; Domínguez et Edwards, 2010; ainsi que Coulson et al., 2013. Les lombricidés sont d’importants membres de la faune du sol et sont des organismes convenant à l’évaluation des sols potentiellement toxiques. Avec les autres vers de terre, ils constituent jusqu’à 92 % de la biomasse des invertébrés du sol et ils contribuent de façon importante au maintien de la structure du sol et du cycle des éléments nutritifs (Edwards et Lofty, 1977; Lee, 1985). En outre, ces vers et d’autres vers de terre représentent un élément important du régime alimentaire de nombreuses espèces d’oiseaux, de petits mammifères, de reptiles, d’amphibiens et d’invertébrés (Macdonald, 1983; Cooke et al., 1992). Les vers de terre peuvent accumuler divers composés organiques et inorganiques qui pourraient (ou non) leur être nocifs (Edwards et Bohlen, 1992). Une modification importance de l’abondance des lombricidés pourrait avoir des effets écologiques fâcheux pour tout le système terrestre (ASTM, 2012).

1.2.1 Eisenia andrei

Les vers Eisenia andrei sont souvent appelés vers du fumier (Aquaterra Environmental, 1998). Les taxonomistes distinguent E. andrei d’E. fetida avec difficulté, les caractères morphologiques seuls étant insuffisants à cet égard (Blakemore, R., VermEcology, communication personnelle, 2000; Diehl, W.J., U. d’État du Mississippi, communication personnelle, 2000). Sur le plan historique, il semble qu’une très grande partie des publications ait confondu E. fetida pour E. andrei (ou E. fetida andrei), E. andrei étant l’espèce jumelle trouvée le plus souvent dans les composts ou les élevages nord-américains de fournisseurs d’eisénies (Diehl, W.J. U. d’État du Mississippi, communication personnelle, 2000; McCann, 2004; Römbke et al., 2016). Les premières méthodes de détection de la variation génétique ont toutefois indiqué qu’une identification définitive pouvait être effectuée sur la base des différents profils électrophorétiques de certaines enzymes pour ces deux espèces (Jaenike, 1982; Øien et Stenersen, 1984; McElroy et Diehl, 2001; McCann, 2004). Aujourd’hui, le code à barres de l’ADN est recommandé pour pouvoir identifier correctement E. andrei (v. § 2.1).

Par le passé, certains ont qualifié E. fetida de « complexe d’espèces » (Bouché, 1992; Christensen et Mather, 1994). Des taxonomistes ont également décrit E. fetida/andrei comme ayant deux sous-espèces ou races morphologiquement semblables (c’est-à-dire E. fetida, qui possède, sur ses segments, des bandes transversales, et E. fetida andrei, non rayé, mais d’une couleur rougeâtre panachée). Ce critère (désormais périmé) de classification a été adopté dans certaines méthodes d’essai biologique pour la mesure de la toxicité des sols à l’aide de vers de terre (OECD, 1984; ISO, 1993; ASTM, 1999, 2012). Cependant, les taxonomistes considèrent désormais E. andrei et E. fetida comme des espèces distinctes, tout en reconnaissant que leurs caractéristiques morphologiques, notamment la couleur et les rayures ou bandes segmentaires, sont insuffisantes pour les distinguer avec certitude (Blakemore, R., VermEcology, communication personnelle, 2000; Diehl, W.J., U. d’État du Mississippi, communication personnelle, 2000). Dans des méthodes plus récentes, on a reconnu le caractère distinct des espèces E. fetida (ou E. fetida fetida) et E. andrei (ou E. fetida/andrei) [Sheppard, 1988; ISO, 2008, 2012; OECD, 2016]. Cela est conforté par les résultats d’expériences de croisement de ces deux espèces, qui ont permis de constater la production de cocons lors du croisement d’E. fetida et d’E. andrei, bien qu’aucun n’ait été viable (Ferreiro et al., 2002; Domínguez et al., 2005). Jusqu’ici, les organismes Eisenia habituellement utilisés dans les laboratoires canadiens pour les essais de toxicité des sols se sont révélés appartenir à l’espèce E. andrei (Diehl, W.J., U. d’État du Mississippi, communication personnelle, 2000; McCann, 2004; Römbke et al., 2016), bien que l’espèce ait été officiellement identifiée comme étant E. fetida (p. ex. Aquaterra Environmental, 1998; Aquaterra Environmental et ESG, 2000). Peu d’études ont porté sur la sensibilité relative de ces deux espèces apparentées à des échantillons de sol contaminé. Des essais parallèles en laboratoire, réalisés par Ingraldi et al. (2004) dans le cadre d’essais de létalité aiguë d’une durée de 14 jours ont montré qu’E. andrei était quelque peu plus sensible qu’E. fetida à l’acide borique dans un sol artificiel, les CL50 après 7 jours étant de 3 236 et de 4 365 mg/kg, respectivement, sans recouvrement des limites de confiance à 95 % de ces deux valeurs. De même, les résultats d’essais de mesure de la CL50 après 14 j, effectués en même temps par ces chercheurs, qui ont exposé chacune des deux espèces à un échantillon de sol contaminé par un condensat et mélangé à un loam argileux non contaminé, ont révélé la sensibilité quelque peu plus grande d’E. andrei. Des essais d’une durée de 48 heures de comparaison de la réaction d’évitement à de multiples concentrations du même sol contaminé par un condensat, puis mélangé à un loam argileux non contaminé, effectués conformément au § 4.3, ont également révélé la réaction plus sensible d’E. andrei au sol contaminé (Ingraldi et al., 2004). Bien qu’E. fetida ait été inclus comme option d’espèce dans la première édition de ce document sur les méthodes d’essai, il a été abandonné comme option d’espèce d’expérience dans cette version de deuxième édition (v. § 2.1).

Chez les producteurs nord-américains de compost, on trouve souvent des vers des espèces Eisenia andrei, qui sont vendus dans le commerce comme appâts de pêche (sous l’appellation de « red wigglers ») et pour le compostage (sous l’appellation de « vers de compost »). Les adultes de cette espèce mesurent en moyenne 35 à 130 mm de longueur, en moyenne 3 à 5 mm de diamètre, et comptent entre 80 et 110 segments. Dans la diagnose des espèces, on trouve comme termes un prostomium épilobique, le premier pore dorsal sur les segments 4/5 ou, parfois 5/6, et un clitellum sur les segments 24 à 32 (Reynolds, 1977). Les tubercules de la puberté se trouvent sur les segments 28 à 30. Les soies sont étroitement géminées, en présentant une variation caractéristique de leur répartition qui diffère de l’extrémité antérieure à la postérieure du ver. Des tumescences génitales pourraient être présentes autour de n’importe lesquelles des soies des segments 9 à 12 du corps cylindrique, dont la couleur peut varier du rouge au pourpre en passant par le rouge foncé puis le rouge brunâtre, avec des bandes alternantes pigmentées de rouge-brun et des zones intersegmentaires non pigmentées jaunes (Reynolds, 1977). Les pores mâles portent habituellement de grosses papilles glandulaires sur le segment 15. Les canaux des deux paires de spermathèques s’ouvrent sur les segments 9/10 et 10/11. Sur les segments 9 à 12, on trouve quatre paires de vésicules séminales.

E. andreiest indigène de la région paléarctique, et on la trouve également en Europe, en Amérique du Nord et en Amérique du Sud, en Asie, en Afrique, en Islande et en Australasie (Reynolds, 1977). Cette espèce grégaire est généralement associée aux activités anthropiques, et on la trouve généralement dans toute l’Amérique du Nord, dans les jardins, les tas de compost et les tas de fumier (Edwards et Lofty, 1977). Au Canada, on l’a trouvée en Colombie-Britannique, en Alberta, en Ontario, au Québec, au Nouveau-Brunswick, en Nouvelle-Écosse et dans l’Île-du-Prince-Édouard (Reynolds, 1977; M.J. Clapperton, Agriculture et Agroalimentaire Canada, communication personnelle, 2000). Cette espèce préfère les sols humides, riches en matière organique. Elle se cantonne généralement dans les couches supérieures du sol, et on la considère comme épigées, se nourrissant de façon sélective (en ingérant peu de sol) de la matière organique dispersée dans le sol (Wallwork, 1983). E. andrei tolère une large gamme de pH du sol (c’est-à-dire de 4 à 8) [Stephenson, 2002], bien qu’il préfère les sols dont le pH se situe entre 7 et 8 (Edwards et Lofty, 1977).

La longévité d’E. andrei serait de 4 à 5 années, bien que, le plus souvent, elle soit de 1 à 2 années (Reynolds, 1977). Sa reproduction est obligatoirement sexuée, bien que l’on ait signalé une reproduction uniparentale (Reynolds, 1977, 1995). E. andrei s’accouple et rejette ses excréments sous terre. Cette espèce se reproduit rapidement dans la gamme de températures de 20 à 25 °C et elle peut atteindre la maturité sexuelle en moins de 52 jours. Le cycle de reproduction est sensiblement plus long à de plus basses températures (p. ex. >166 jours à 13 ̊C) [ASTM, 2012]. Les cocons sont produits à la fréquence de 1 ou 2 à tous les 3 ou 4 jours; chaque cocon peut donner au moins 6 jeunes vers, bien que l’on observe plus fréquemment 1 à 4 vers par cocon (Reinecke et Viljoen, 1991; Reinecke et al., 1992; Edwards et Bohlen, 1996). Ces caractéristiques (c’est-à-dire production rapide de cocons, progéniture nombreuse, court cycle de reproduction, maturité sexuelle rapide) et le fait qu’E. andrei sont faciles à élever en laboratoire (ASTM, 2012; ISO, 2008, 2012; OECD, 2016) font de ce vers l’une des espèces les plus utilisées pour les essais de reproduction des vers de terre (Aquaterra Environmental, 1998).

1.2.2 Dendrodrilus rubidus

Le ver Dendrodrilus rubidus est souvent appelé le lombric rouge (Sims et Gerard, 1985; GISD, 2020). Les taxonomistes reconnaissent généralement la nature polymorphe du ver D. rubidus, auquel sont associés quatre morphes ou sous-espèces reconnus : rubidus (Savigny, 1826), tenuis (Eisen, 1874), norvegicus (Eisen, 1874) et subrubicundus (Eisen, 1874) (Sims et Gerard, 1985, 1999; Frenot, 1992; GISD, 2020). Certains morphes ont une reproduction sexuée, tandis que d’autres se reproduisent de façon parthénogénétique. Le morphe tenuis est totalement dépourvu de tubercules et de spermathèques. Quant au morphe rubidus, les spermathèques sont parfois présentes, mais généralement vides, et des tubercules indistincts sont visibles sur les segments 29 à 30. Des spermathèques sont présentes chez norvegicus; dans le cas du morphe subrubicundus, des spermathèques remplies de façon égale peuvent être observées, et l’on peut facilement reconnaître les tubercules sur les segments 28 à 30 (Blakemore, 2008 cité dans Csuzdi et al., 2017). Les adultes sont petits et mesurent en moyenne 20 à 100 mm de longueur, pour un diamètre moyen de 2 à 5 mm, et leur corps compte entre 50 et 120 segments. Dans la diagnose figurent notamment les caractères suivants : un prostomium épilobique, des pores dorsaux peu visibles commençant sur le segment 5/6, et le clitellum (en forme de selle) sur les segments 25, 26 à 31, 32. Les tubercules, lorsqu’ils sont présents, se trouvent sur les segments 29 et 30 ou 28 à 30, soit sous la forme d’une large bande rectangulaire, soit réduits à une bande mince (lorsqu’ils recouvrent deux segments) et interrompus par le sillon 29/30 (Sims et Gerard, 1985). Les soies sont modérément géminées, plus proches ventralement et plus larges latéralement. Le ver D. rubidus est fortement pigmenté de rouge-violet; sa surface dorsale est plus foncée, sa surface ventrale est pâle, et l’extrémité de la queue est de couleur jaune-orange. Le pore génital femelle est situé sur le segment 14, à l’arrière des soies b. Les pores mâles sont situés sur le segment 15, équatorial juste au-dessus des soies b, sur un petit porophore confiné à son propre segment. On observe un léger épaississement du dissépiment sur les segments 5/6 à 10/11. Des glandes calcifères se trouvent sur les segments 10 à 20 avec de grands diverticules présents dans le segment 10. Le système excréteur est holoïque. Les vessies néphridiales sont en forme de U et comportent des membres situés vers l’intérieur courbés vers l’avant. Les typhlosoles sont bien développés et lamelliformes (Reynolds, 1977; Sims et Gerard, 1985; Blakemore, 2008 cité dans Csuzdi et al., 2017).

Le ver D. rubidus est une espèce holarctique avec une répartition cosmopolite, ayant été trouvée sur tous les continents du monde sauf l’Antarctique (Berman et al., 2010). Ce ver étant considéré comme un résident de grandes parties des zones holarctiques et une composante naturelle de la faune terrestre subarctique et arctique, sa vaste répartition dans les climats nordiques est bien connue (Bengtsson et al., 1986; Frenot, 1992; Reynolds, 1977, 1994; Berman et al., 2010; Coulson et al., 2013). Au Canada, on le trouve dans toutes les provinces, ainsi que dans le territoire du Yukon, mais on ne l’a pas encore repéré dans les Territoires du Nord-Ouest ou au Nunavut (Addison, 2009; Reynolds, 1977, 2015). Bien que les vers soient sensibles au froid, ne pouvant survivre même après une brève exposition à des températures inférieures à 0 °C, les cocons (les embryons) peuvent supporter des températures aussi basses que -196 °C (Berman et al., 2010). Ainsi, seuls les cocons passent l’hiver dans les climats plus froids. Le ver D. rubidus est une espèce épigée, que l’on trouve le plus souvent dans la couche supérieure (c’est-à-dire 10 cm) du sol, et qui habite dans divers habitats et types de sol. Bien qu’il ait été démontré qu’il tolère les sols à faible pH (Edwards et Bohlen, 1996), une diminution de la production de cocons, de la survie et de la croissance a été mise en évidence dans les sols à pH inférieur ou égal à 4,5 (Bengtsson et al., 1986; Rundgren et Nilsson, 1997). Il a également été démontré qu’il évite les sols à faible pH (EC, 2010). Il préfère les substrats riches en matière organique (EC, 2010) et il habite généralement les forêts de conifères et les sols cultivés; toutefois, on le trouve également dans des branches sur le sol de grottes ou dans des poutres de soutien de mines. On le trouve fréquemment dans un lit de feuilles, les détritus et sous l’écorce des troncs en décomposition (McAlpine et Reynolds, 1977). Il s’agit d’une espèce active, et pendant les nuits humides, on l’a vue ramper à la surface du sol et grimper aux arbres (Reynolds, 1977). Le ver D. rubidus est considéré comme un décomposeur primaire, se nourrissant principalement de litière plutôt que de détritus (Scheu et Falca, 2000).

Il présente un taux de reproduction élevé, ce qui le rend favorable à une utilisation comme appât pour les poissons et comme vers de compostage. À 20-25 °C, il atteint sa maturité moyenne après 51 à 54 jours et présente un taux moyen de production de cocons de 0,2-0,4 cocon par ver de terre par jour. Le taux de réussite de production de jeunes est de 85 %, avec une durée moyenne d’incubation de 22 jours; un à trois jeunes sortent de chaque cocon (Elvira et al., 1997). Le ver D. rubidus peut effectuer son cycle reproductif en 75 jours; cependant, la maturité est généralement atteinte entre 18 et 20 semaines, le clitellum se développant à 100 jours et disparaissant à 320 jours. Sa durée de vie est généralement d’un an et il n’a qu’une seule période d’activité sexuelle au cours de laquelle il produit 40 à 95 cocons (Bengtsson et al., 1986). Ces caractéristiques (c’est-à-dire production rapide de cocons, progéniture nombreuse, court cycle de reproduction, maturité sexuelle rapide) le rendent idéal pour un élevage en laboratoire.

1.3 Utilisation traditionnelle des vers de terre dans les essais de toxicité

Dans le sol, les vers de terre sont fréquemment exposés aux toxiques. Outre une myriade d’engrais, d’insecticides, d’herbicides et de fongicides employés en agriculture et dans des applications domestiques, ils sont parfois exposés à des métaux lourds, à des hydrocarbures pétroliers et à d’autres matières chimiques telles que les agents de conservation du bois (p. ex. le pentachlorophénol) ou aux composés explosifs à cycle(s) aromatique(s) nitré(s) présents dans des sols contaminés.

Les vers de terre sont utilisés à grande échelle dans les essais monospécifiques de laboratoire visant à mesurer la toxicité de substances pures, de produits chimiques ou d’échantillons de sols prélevés sur le terrain, effectivement ou potentiellement contaminés par des substances chimiques ou contaminés en laboratoire (à des fins expérimentales). On connaît la toxicité de diverses substances ou de divers produits chimiques pour les vers de terre, qui a été bien étudiée au laboratoire dans des conditions normalisées, mesurée par des effets létaux et/ou sublétaux, par des expositions de courte durée (heures ou quelques jours) ou de longue durée (plusieurs semaines) (Natal-da-Luz et al., 2008; Chelinho et al., 2011; Hirano et Tamae, 2011; Sivakumar, 2015; Princz et al., 2017; Uwizeyimana et al., 2017).

De plus en plus au Canada et ailleurs, on recourt à des essais de toxicité employant des vers de terre comme outils d’évaluation écotoxicologique de la toxicité de sols de site, effectivement ou potentiellement contaminés (Callahan, 1988; Menzie et al., 1992; Römbke et al., 1994; Kula et Larink, 1997; Spurgeon et al., 1994; Spurgeon et Hopkin, 1995, 1996a; Yeardley et al., 1996; Chang et al., 1997; Meier et al., 1997; Stephenson et al., 1997; Aquaterra Environmental, 1998; Saterbak et al., 1999; Stephenson et al., 2002; Stephenson, 2003a; Princz et al., 2012; Renoux et al., 2013). Les études comparant les résultats d’essais monospécifiques, effectués en laboratoire, et les résultats d’enquêtes de terrain sur les effets subis par les organismes terrestres ont généralement constaté une forte corrélation entre les résultats obtenus en laboratoire et ceux du terrain (Edwards et Bohlen, 1992; Kula et Kokta, 1992; Menzie et al., 1992; van Gestel, 1992, 1997; Heimbach, 1993, 1997; Christensen et Mather, 1994; Kula, 1995). Cependant, les scientifiques ont souvent affirmé qu’il est difficile d’extrapoler aux terrains les résultats d’essais en laboratoire, monospécifiques employant des vers de terre. Un certain nombre de chercheurs ont discuté de la façon d’améliorer la valeur prédictive des essais en laboratoire (c’est-à-dire de la capacité de discerner par ce moyen les conditions ou effets environnementaux défavorables). Constituent notamment des améliorations prometteuses les modes opératoires fiables permettant d’estimer la biodisponibilité des contaminants inorganiques et organiques dans le sol, les stratégies d’essai étagées et les plans d’évaluation des risques découlant de la toxicité des sols qui englobent des essais de toxicité employant des vers de terre (Bouché, 1988; Callahan, 1988; Lofs-Holmin et Bostrom, 1988; NERI, 1993; Keddy et al., 1995; Leon et van Gestel, 1994; Christensen et Mather, 1994; Sauvé et al., 1996, 1998, 2000; Barber et al., 1997; Meier et al., 1997; Saterbak et al., 1999; Conder et Lanno, 2000; Wells et Lanno, 2001; Chelinho et al., 2011; Princz et al., 2012c; Velicogna et al., 2012, 2016; Cermak et al., 2013; Renoux et al., 2013; Brami et al., 2017; Ritchie et al., 2017; Niemeyer et al., 2018; Renaud et al., 2018; de Santo et al., 2019; Prodana et al., 2019; Kilpi-Koski et al., 2020).

Un certain nombre de chercheurs ont étudié les effets des variations des caractéristiques naturelles du sol de site ou d’un sol enrichi avec une substance chimique sur la toxicité de ce sol pour les vers de terre. Les variables qu’ils ont examinées sont notamment le pH du sol, sa teneur en carbone organique, sa granulométrie et sa teneur en humidité (Heimbach et Edwards, 1983; van Gestel et van Dis, 1988; van Gestel, 1991; Christensen et Mather, 1994; Spurgeon et Hopkin, 1996b; Yeardley et al., 1996; Bauer et Römbke, 1997; Puurtinen et Martikainen, 1997; Meharg et al., 1998; Aquaterra Environmental et ESG, 2000; Robidoux et al., 2004; Bradham et al., 2006; Natal-da-Luz et al., 2008; Chelinho et al., 2011; Scheffczyk et al., 2014; Alves et al., 2018; Lanno et al., 2019; Velicogna et al., 2020). L’influence de ces variables du sol sur la toxicité chimique dépend des interactions entre les caractéristiques physicochimiques du sol et le ou les types et espèces de contaminants qui s’y trouvent.

Les essais qui permettent de mesurer en laboratoire les effets d’un sol contaminé sur le comportement des vers de terre sont de plus en plus utilisés (v. § 1.3.2), tout comme les essais permettant de mesurer les effets d’expositions prolongées de vers de terre sur leur reproduction (v. § 1.3.1). Des chercheurs ont également étudié et examiné d’autres effets sublétaux (p. ex. sur la gamétogenèse, la tératogenèse, la neurotoxicité, l’immunotoxicité) de sols contaminés par des substances chimiques sur les vers de terre (Drewes et al., 1984; Zoran et al., 1986; Edwards et Bohlen, 1992; Fitzpatrick et al., 1992; Cikutovic et al., 1993; Goven et al., 1993, 1994; Christensen et Mather, 1994; Suzuki et al., 1995; Brousseau et al., 1997; Giggleman et al., 1998; Scott-Fordsmand et al., 2000; Plytycz et al., 2009; Button et al., 2010, 2012; Vasseur et Bonnard, 2014; Demuynck et al., 2016; Cao et al., 2017; Lackmann et al., 2018; Tatsi et al., 2018; Bouguerra et al., 2019; Saggioro et al., 2019; Chen et al., 2020; Pereira et al., 2020; Ramires et al., 2020).

1.3.1 Essais de reproduction

Les effets d’une exposition d’une espèce à des substances ou matières toxiques sur sa survie, sa reproduction et sa croissance, dans les conditions contrôlées de laboratoire, sont reconnus et acceptés par les écotoxicologues comme des réactions écologiquement pertinentes. Du point de vue écologique, ces effets biologiques sont idéals pour les essais de toxicité en laboratoire employant des vers de terre (Christensen et Mather,1994). Christensen et Mather (1994) ont recommandé l’inclusion de ces essais dans un protocole d’évaluation après leur examen de l’emploi des vers de terre pour l’évaluation du risque écologique que présentaient les toxiques dans le sol.

En 1988, on a entrepris, à l’échelle internationale, l’élaboration et la normalisation des essais de mesure des effets de l’exposition à long terme aux contaminants du sol sur la survie, la reproduction et la croissance des vers de terre (van Gestel et al., 1988). On a élaboré un certain nombre de méthodes ou de lignes directrices normalisées qui employaient E. andrei et E. fetida; couramment appliquées, ces méthodes sont de plus en plus utilisées.

E. andrei et E. fetida sont des organismes recherchés pour l’étude des effets de l’exposition prolongée à des contaminants sur la survie, la reproduction et la croissance des vers de terre, en raison des connaissances et de l’expérience répandues dans l’élevage de ces espèces, de leur cycle reproductif court, de leur aire de répartition internationale et de leur utilisation fréquente dans les essais de toxicité (OECD, 1984, 2016; USEPA, 1989, 2012; ISO, 2008, 2012; ASTM, 2012). La biologie de leur développement, de leur croissance et de leur reproduction en laboratoire a été largement étudiée et elle est bien connue (p. ex. Edwards et Lofty, 1977; Tsukamoto et Watanabe, 1977; Sheppard, 1988; van Gestel et al., 1992a). Les effets toxiques de leur exposition prolongée à un sol contaminé sur leur survie, leur reproduction et/ou leur croissance ont été soigneusement consignés dans des études en laboratoire ayant porté sur des échantillons de sols enrichis ou contaminés par :

• des pesticides (Lofs-Holmin, 1980; Venter et Reinecke, 1988; Neuhauser et Callahan, 1990; van Gestel et al., 1992b; Riepert et Kula, 1996; Bauer et Römbke, 1997; Heimbach, 1997; Kula et Larink, 1997; ESG et Aquaterra Environmental, 2002; Rico et al., 2016; Lackmann et al., 2018; Alves et al., 2019; de Santo et al., 2019; Saggioro et al., 2019; de Lima e Silva et al., 2020; Pereira et al., 2020);
• des métaux lourds (Neuhauser et al., 1984; van Gestel et al., 1989, 1992b; Spurgeon et al., 1994; Reinecke et Reinecke, 1996; Spurgeon et Hopkin, 1996a; Fischer et Molnár, 1997; Kula et Larink, 1997; Aquaterra Environmental et ESG, 2000; Scott-Fordsmand et al., 2000; ESG, 2002; Bradham et al., 2006; Renoux et al., 2013; Velicogna et al., 2016; Jesmer et al., 2017; Ritchie et al., 2017, 2019; Alves et al., 2018; Kilpi-Koski et al., 2020; McGuirk et al., 2020);
• des hydrocarbures pétroliers (Aquaterra Environmental, 1998; Stephenson et al., 1998, 1999a, 1999b, 2000a; ESG, 2001; Princz et al., 2012; Cermak et al., 2013);
• d’autres produits chimiques, y compris des toxiques de référence(Hartenstein, 1982; van Gestel et al., 1989, 1992b; Neuhauser et Callahan, 1990; Gibbs et al., 1996; Aquaterra Environmental, 1998; Robidoux et al., 2000, 2001; Becker et al., 2011; Velicogna et al., 2012, 2016; Dodard et al., 2013; Ritchie et al., 2013, 2017; Scheffczyk et al., 2014; Bouguerra et al., 2016; Jesmer et al., 2017; Princz et al., 2017).

Dans leurs premiers efforts pour mettre au point une méthode d’essai normalisée pour la mesure des effets de substances chimiques sur la reproduction d’E. andrei/fetida, van Gestel et al. (1988) ont effectué des études d’incubation d’une durée de 5 semaines qui ont permis de mesurer la viabilité des cocons et le nombre de jeunes éclos par cocon, après récupération des cocons produits au cours d’études antérieures sur l’exposition de vers de terre adultes à des substances, puis leur incubation dans l’eau ou dans un sol artificiel. Ensuite, van Gestel et al. (1989) ont décrit une méthode néerlandaise d’essai en vertu de laquelle on habituait des adultes d’E. andrei/fetida pendant une semaine à un sol artificiel, après quoi on les exposait à une série de concentrations de substances chimiques dans un sol artificiel, puis on faisait incuber les cocons produits pendant encore 5 semaines dans un sol artificiel non traité, afin d’évaluer leur éclosabilité.

En 1990, un groupe de travail allemand créé par le Biologische Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft (BBA) [Centre fédéral de recherche biologique pour l’agriculture et la foresterie] auquel s’étaient joints des spécialistes néerlandais et suisses a mis au point une méthode d’essai légèrement différente, en vertu de laquelle on expose des adultes d’E. andrei/fetida à un sol artificiel enrichi avec une substance chimique pendant 4 semaines. Ensuite, on retire les vers de ce milieu et on maintient l’exposition de leur progéniture pendant encore 4 semaines. L’Allemagne a présenté cette méthode, à l’état d’ébauche, au groupe de travail « Faune du sol » (WG 2) de l’ISO en 1990. Le BBA (1994) l’a ensuite publiée en tant que ligne directrice pour l’essai de toxicité des pesticides. Après évaluation et prise en considération par d’autres scientifiques, l’ISO (1998) a publié une version modifiée de la méthode du BBA (1994). La méthode normalisée, publiée par l’ISO (1998), consiste à exposer pendant 4 semaines des adultes d’E. andrei/fetida à une série de concentrations de sol enrichi avec une substance chimique ou de sols d’un emplacement contaminés, en les observant (survie des adultes ou gain ou diminution de leur poids humide) puis à exposer pendant 4 semaines leur progéniture au même sol, le paramètre mesuré à la fin de l’essai étant le nombre de jeunes engendrés à chaque variante expérimentale éprouvée (v. annexe E). Cette norme ISO a été mise à jour à la suite d’un examen périodique (ISO, 2012), et les détails sont présentés à l’annexe E. Cette norme ISO (11268-2) fait actuellement l’objet d’une modification en vue d’ajouter de nouvelles annexes contenant des instructions sur la culture et les essais utilisant l’espèce boréale, D. rubidus et d’autres espèces de vers de terre. La préparation de l’annexe de la norme ISO 11268-2 sur D. rubidus est menée par des experts canadiens. L’Organisation de coopération et de développement économiques (OCDE) a également publié une méthode d’essai semblable (OECD, 2016; v. annexe E pour les détails). Un essai plus rapide (28 jours), limité à la détermination de la survie et de la modification de poids d’adultes E. andrei/fetida pendant l’exposition, a été publié par l’Environmental Protection Agency (EPA) des États-Unis (2012) en tant que méthode de dépistage d’échantillons de sol contaminé. Cette méthode abrégée est cependant peu utilisée, parce qu’elle ne permet pas de mesurer les effets sur la reproduction des vers de terre ou sur la survie de leur progéniture.

En 2006, Römbke et al. ont indiqué que le vers D. rubidus était une bonne espèce candidate à inclure dans la série de méthodes d’essai biologique d’ECCC, dans le cadre d’une batterie d’options d’essai pertinentes pour les écozones de la forêt boréale canadienne, de la taïga et de la toundra. Parmi les critères de sélection des espèces candidates figurent l’habitat, la fréquence et l’abondance, l’origine, la taxonomie, la praticabilité et la tolérance au stress. En 2012, Princz et al. ont évalué de manière plus approfondie la praticabilité et la sensibilité du ver D. rubidus dans le cadre d’essais de toxicité pour la reproduction d’une durée de 56 jours en utilisant des sols d’emplacement contaminés par des hydrocarbures pétroliers (CP) et du sel. Les résultats de cette étude ont démontré l’applicabilité de cette espèce boréale avec une sensibilité et des performances comparables à celles des espèces d’expérience standard (agronomiques) (c’est-à-dire E. andrei). Plusieurs années de recherche entreprises par la Section de l’évaluation biologique et normalisation d’ECCC ont permis de définir des procédures d’élevage du ver D. rubidus ainsi qu’un plan d’expérience pour évaluer les effets sur la survie et la reproduction (EC, 2010, 2013a; ECCC, 2020b).

On expose dans le présent document (v. § 4.2) les modes opératoires et les conditions normalisées d’une méthode d’essai biologique mesurant les effets toxiques de l’exposition d’E. andrei et de D. rubidus à un sol enrichi avec une substance chimique ou au sol de site, sur la reproduction de ces vers^{Note de bas de page 2}. Cette méthode d’essai biologique a beaucoup de points communs avec les méthodes de l’ISO (2012) et de l’OCDE (2016).

1.3.2 Essais de réaction d’évitement

On sait que les lombricidés, E. andrei et D. rubidus notamment, sont très mobiles (Karnak et Hamelink, 1982; Mather et Christensen, 1992; McAlpine and Reynolds, 1977). Des chercheurs ont conclu à la pertinence écologique, à l’échelle de la population, d’une réaction comportementale d’évitement manifesté par les vers de terre à l’égard de concentrations sublétales de substances chimiques dans le sol (Christensen et Mather, 1994; Tomlin, 1995; Yeardley et al., 1996). Des observations portent à croire que ces invertébrés terrestres et d’autres sont capables de réduire au minimum leur exposition à des substances nocives, grâce à ce comportement (Yeardley et al., 1996; Haimi et Paavola, 1998). Christensen et Mather (1994) ont examiné l’emploi de vers de terre pour évaluer les dangers que présentent des substances chimiques, dans le cadre d’évaluations des risques écologiques pour l’agence danoise de protection de l’environnement. Ils ont conclu que, du point de vue écologique, à l’échelle de la population, les essais de toxicité qui mesuraient les effets sur le comportement migratoire (réaction de phobie) faisaient partie des essais que l’on considérait comme permettant de mesurer des effets « idéals » et ils en ont recommandé l’application. Les avantages des essais de réaction d’évitement sont leur courte durée (par rapport aux essais de létalité plus longs cherchant à mesurer les effets sur la reproduction) et leur sensibilité (c’est-à-dire leur capacité de déceler une réaction comportementale à des concentrations sublétales). Les vers exposés à un sol contaminé manifestent de façon typique une réaction d’évitement à des concentrations sublétales en 24 à 72 h (Wentsel et Guelta, 1988; Yeardley et al., 1996; Slimak, 1997; Hund, 1998; Stephenson et al., 1998; Hund-Rinke et Wiechering, 2001; ESG et Aquaterra Environmental, 2002; Hund-Rinke et al., 2003, 2005; Schaefer, 2003; Stephenson, 2003a; ISO, 2003, 2008). Des essais de réaction d’évitement employant E. andrei à qui on donnait à choisir entre un sol témoin négatif (naturel ou artificiel) et diverses concentrations d’un sol d’un emplacement contaminé par un condensat dilué avec le sol témoin négatif respectif ont révélé une réaction d’évitement proportionnel à la concentration, aux concentrations sublétales. Des essais connexes d’exposition prolongée d’E. andrei au même échantillon de sol d’un emplacement contaminé par un condensat ont montré que la concentration seuil évitée par l’espèce était semblable à la concentration seuil qui réduisait la réussite de la reproduction et ralentissait ultérieurement la croissance de la progéniture. On a obtenu des résultats semblables avec le sol d’un emplacement contaminé par des amines et des produits du glycol : les vers ont évité les concentrations sublétales qui, dans le sol, entraînaient des effets indésirables sur leur reproduction (Aquaterra Environmental, 1998; Stephenson, 2003a).

Les essais en laboratoire permettant de mesurer la réaction d’évitement sont particulièrement utiles, du point de vue écologique, lorsqu’ils sont effectués conjointement avec des essais de toxicité normalisés tels que ceux qui permettent de mesurer les effets sublétaux sur la reproduction. On a déterminé que l’essai de réaction d’évitement des vers de terre est un outil de dépistage utile pour évaluer la fonction d’habitat des sols. La réaction d’évitement en présence de produits chimiques organiques et de métaux lourds s’est avérée une méthode de dépistage rapide et appropriée pour cerner les emplacements ou les sols dont la fonction d’habitat est modifiée, et pour sélectionner les échantillons de sol pour lesquels des essais plus définitifs (c’est-à-dire un essai de reproduction d’une durée de 56 jours) pourraient être nécessaires (Hund-Rinke et Wiechering, 2001; Hund-Rinke et al., 2003, 2005; ISO, 2008; CE, 2012). Le manque de pertinence écologique des constatations découlant d’un essai de réaction d’évitement, faute de résultats comparables d’essais normalisés de toxicité (c’est-à-dire un essai de reproduction d’une durée de 56 jours), pourrait engendrer des résultats déroutants ou douteux, puisque les vers pourraient éviter des concentrations de contaminants qui ne sont pas préjudiciables pour leurs tissus ou pourraient ne pas éviter des concentrations qui le sont. Cependant, l’essai de réaction d’évitement des vers de terre s’est avéré extrêmement efficace et pertinent en tant qu’outil de dépistage des zones pouvant présenter une toxicité sublétale avant ou après la caractérisation chimique dans les évaluations des risques (niveaux 1 et 2), ou en tant qu’essai préliminaire pour mener une évaluation toxicologique plus poussée (c’est-à-dire un essai de reproduction d’une durée de 56 jours) de sols contaminés ou enrichis avec une substance chimique (Hind-Rinke et al., 2005; EC, 2012).

Les appareils et les modes opératoires utilisés pour mesurer le comportement d’évitement des vers de terre à l’égard d’un sol contaminé ont été variés. En utilisant une enceinte expérimentale à deux compartiments et une enceinte expérimentale à six compartiments, Hund-Rinke et al. (2005) ont déterminé qu’E. fetida évitait le sol contaminé par des produits chimiques organiques et des métaux lourds lors d’expositions de 48 heures à des concentrations sublétales égales ou inférieures à celles provoquant des effets sur la reproduction chez les adultes dans le cadre d’essais de reproduction d’une durée de 56 jours. Dans des essais en enceintes circulaires, Yeardley et al. (1996) ont constaté qu’E. andrei/fetida évitait en un ou deux jours d’exposition à peine des concentrations sublétales de sols enrichis avec une substance chimique ou de sols de site. ECCC (2020b) a effectué des essais de réaction d’évitement de 24 et 48 heures à l’aide du vers D. rubidus exposé à une gamme de concentrations d’acide borique ajoutées dans un sol artificiel non contaminé. On n’a observé aucune tendance évidente dans la réaction d’évitement à 24 heures, mais une réaction d’évitement dépendante de la concentration à l’acide borique a été observée lors d’une exposition de 48 heures (ECCC 2020b).

Les effets confusionnels dus aux différentes caractéristiques physiques et chimiques du sol (p. ex. la granulométrie, la teneur en carbone organique, la teneur en azote total, le pH, la capacité de rétention en eau) se sont avérés minimes (Yeardley et al., 1996; Hund, 1998; Hund-Rinke et Wiechering, 2001); toutefois, Delgadillo et al. (2017) ont déterminé que la conductivité électrique et la teneur en matière organique du substrat témoin peuvent influencer la réaction d’évitement. Une méthode publiée par l’ISO en 2008 (ISO 17512-1) fournit une approche normalisée pour la réalisation d’essais de réaction d’évitement de 48 heures avec E. andrei ou E. fetida dans un sol contaminé ou enrichi à l’aide d’une enceinte expérimentale à deux ou à six compartiments pour des expositions à une concentration unique ou à des concentrations multiples (ISO, 2008).

Depuis de nombreuses années, un certain nombre d’études ont été réalisées au Canada afin de mettre en place et de normaliser davantage d’essais de réaction d’évitement pour déterminer la toxicité du sol en utilisant E. andrei et D. rubidus (Stephenson, 2003a; EC, 2010; ECCC, 2020b). L’appareillage expérimental utilisé, et recommandé dans le présent document, est l’enceinte expérimentale à six compartiments dont une illustration photographique est indiquée dans Stephenson et al. (1998) et dont le schéma est présenté dans le § 3.2.3 (figures 2 et 3).

Dans le § 4.3, on définit les modes opératoires et les conditions normalisées de réalisation d’une méthode d’essai biologique mesurant la réaction d’évitement d’un sol enrichi avec une substance chimique ou d’un sol de site par des vers de terre (E. andrei ou D. rubidus).

Section 2 : Organismes d’essai

2.1 Espèces et stade de leur développement

L’essai de reproduction d’une durée de 56 jours (§ 4.2) et l’essai de réaction d’évitement d’une durée de 48 heures (§ 4.3), décrits dans le présent document, doivent être effectués à l’aide de vers Eisenia andrei ou Dendrodrilus rubidus (§ 1.2.1 et 1.2.2)^{Note de bas de page 3}. L’identification, la répartition et le cycle reproductif d’E. Andrei et de D. rubidus sont résumés au § 1.2. L’identification de l’espèce doit être confirmée et attestée^{Note de bas de page 4} lors de l’établissement d’un nouvel élevage, ou avec chaque nouveau lot de vers de terre prélevé aux fins d’essai ou introduit dans l’élevage de laboratoire (Römbke et al., 2016). Tous les deux ans au moins, on devrait identifier, jusqu’au niveau de l’espèce, les élevages d’E. andrei et de D. rubidus gardés longtemps dans un laboratoire d’essais. L’identification des espèces peut être faite par l’intermédiaire des caractéristiques taxonomiques distinctives qui sont décrites et illustrées dans les clés taxonomiques ainsi que par des personnes compétentes, expérimentées dans l’identification des espèces visées (v. § 1.2) de vers de terre que l’on se propose d’utiliser dans l’essai de toxicité, ou par l’intermédiaire de l’identification taxonomique fondée sur le code à barres de l’ADN (ISO, 2019). Il est fortement recommandé de procéder à l’identification des espèces en utilisant une identification taxonomique fondée sur l’ADN pour E. andrei et D. rubidus^{Note de bas de page 5}. Le poids humide de chaque ver adulte utilisé au début de l’essai de reproduction ou l’essai de réaction d’évitement doit être compris entre 250 et 600 mg pour E. andrei et entre 50 et 200 mg pour D. rubidus (v. § 4.2.1 et 4.3.1). En outre, au début de l’un ou l’autre des essais, il faut utiliser des vers pourvus d’un clitellum (c’est-à-dire des vers adultes).

2.2 Sources

Les vers de terre élevés en laboratoire doivent être utilisés comme source d’organismes d’essai pour l’essai de reproduction de 56 jours (§ 4.2) et l’essai de réaction d’évitement de 48 heures (§ 4.3). On peut élever les vers E. andrei et D. rubidus au laboratoire qui effectue l’essai (c’est-à-dire à l’interne; v. § 2.3) ou les obtenir d’une source externe et les acclimater aux conditions régnant dans le laboratoire (§ 2.4) avant d’entreprendre l’essai^{Note de bas de page 6}. Les sources d’E. andrei et de D. rubidus utilisés dans les essais de toxicité doivent provenir des laboratoires d’État ou privés qui élèvent ces espèces de vers de terre pour les essais de toxicité du sol. Ces mêmes sources sont recommandées pour établir des élevages internes d’E. andrei ou de D. rubidus^{Note de bas de page 7}. Les élevages internes peuvent être créés en utilisant des jeunes ou des adultes. On peut obtenir des cocons (plutôt que des vers juvéniles ou adultes) pour créer un élevage plus rapidement ou pour normaliser l’âge et le poids de chaque vers dans l’élevage.

Pour des renseignements à jour sur les fournisseurs d’E. andrei et de D. rubidus, communiquez avec la ressource suivante :

Unité de l’élaboration et de l’application des méthodes
Direction générale de la science et de la technologie
Environnement et Changement climatique Canada
335, chemin River
Ottawa (Ontario) K1A 0H3
Courriel : methods@ec.gc.ca

Tous les vers de terre utilisés dans un essai de toxicité du sol doivent provenir de la même population. Les vers destinés à servir de reproducteurs ou aux essais devraient être transportés au laboratoire avec une partie du sol ou du substrat auquel ils sont adaptés. On peut obtenir des quantités supplémentaires de ce substrat pour les besoins de l’élevage et de la conservation, selon les conditions et les exigences en matière d’élevage (§ 2.3) et d’acclimatation (§ 2.4). Les récipients utilisés pour l’expédition et le transport devraient être isolés afin de réduire au minimum les fluctuations de température pendant le transport; la température devrait être maintenue entre 17 et 23 °C. On devrait transporter rapidement les organismes vivants pour s’assurer de leur livraison rapide (c’est-à-dire dans les 24 h). On devrait éviter une densité excessive d’animaux pendant le transport ou l’expédition, pour les stresser le moins possible.

À l’arrivée au laboratoire, on peut conserver les vers dans le sol (ou dans un autre substrat) utilisé pour le transport en effectuant des ajustements de température. On peut aussi les transférer dans un autre substrat d’élevage (§ 2.3.5) ou dans un substrat permettant leur entretien et leur acclimatation (§ 2.4.5). Si la nature du substrat (y compris la texture et sa teneur en humidité) dans lequel les vers ont d’abord été gardés (p. ex. par un fournisseur) ou transportés diffère sensiblement de celle du substrat dans lequel ils doivent être élevés (§ 2.3.5) ou acclimatés (§ 2.4.5), il est prudent de les adapter à un pourcentage croissant du nouveau substrat, sur plusieurs semaines, jusqu’à ce qu’on puisse les garder dans 100 % du substrat en question^{Note de bas de page 8}.

On devrait ajuster graduellement la température du sol (p. ex. ≤ 3 °C par jour) pour l’amener à la température à utiliser pendant l’élevage (§ 2.3.4) ou pour l’acclimatation des vers aux conditions expérimentales (§ 2.4.4). Il faudrait suivre les conseils donnés sur la manipulation des vers dans les § 2.3.7 et 2.4.7 lors du transfert des vers d’une source externe aux récipients d’élevage (§ 2.3.2) ou à des récipients d’acclimatation (§ 2.4.2). Les autres conditions existantes pendant cette période transitoire pour l’acclimatation des reproducteurs ou des organismes d’essai aux conditions du laboratoire devraient être aussi semblables que possible à celles que l’on emploie pour maintenir les élevages (§ 2.3) ou pour acclimater les vers obtenus pour les essais (§ 2.4).

2.3 Élevage d’E. andrei et de D. rubidus

2.3.1 Généralités

Nous donnons ici des orientations et des recommandations générales pour l’élevage d’E. andrei et de D. rubidus pendant les préparatifs des essais de toxicité de sols. Conformément au dicton selon lequel ce qui pourrait bien fonctionner dans un laboratoire pourrait ne pas fonctionner aussi bien dans un autre (EC, 2005b, 2013b, 2014a; ECCC, 2020a), les conseils explicites concernant de nombreux aspects de l’élevage, notamment le choix du récipient d’élevage, le nombre d’organismes par récipient, les conditions de renouvellement du sol, le substrat d’élevage, le type de nourriture et la grosseur des portions, tout cela est laissé à la discrétion et à l’expérience du personnel du laboratoire, bien que des conseils et des recommandations soient fournis dans les rubriques qui suivent. On utilise des indices^{Note de bas de page 9} fondés sur le rendement pour évaluer la qualité des organismes d’élevage pour les essais et l’acceptabilité des résultats des essais. Pour convenir aux essais, les élevages doivent connaître de faibles taux de mortalité, et les organismes élevés doivent sembler en bonne santé ainsi que se comporter et se nourrir normalement^{Note de bas de page 10}. En outre, les organismes témoins doivent satisfaire à tous les critères de validité d’un essai de toxicité (v. § 4.2.3 et 4.3.3). L’acceptabilité de l’élevage est également démontrée au moyen d’essais de toxicité de référence ou au moyen de sols témoins positifs à l’aide d’un toxique de référence (v. 4.4). Si un élevage ne satisfait pas à ces critères, il faudrait rechercher les causes en lien avec cette situation. Il faut prendre soin d’éviter toute contamination d’un élevage avec d’autres espèces semblables (c.-à-d. mélangé avec des espèces de vers différentes). En conséquence, il est recommandé de procéder à des vérifications taxonomiques périodiques (p. ex. tous les deux ans) des élevages conservés au laboratoire (v. § 2.1).

Il incombe au laboratoire de montrer sa capacité d’obtenir des résultats constants, précis, à l’aide d’un toxique de référence, lorsque, au départ, il se prépare à effectuer des essais de toxicité d’un sol avec E. andrei ou D. rubidus d’élevage. À cette fin, il devrait déterminer sa précision intralaboratoire, exprimée en tant que coefficient de variation des données respectives sur les effets mesurés, en effectuant au moins 5 essais avec des lots (groupes) différents d’organismes d’essai provenant de la même source, avec le même toxique de référence et un mode opératoire et des conditions expérimentales identiques pour chaque essai (v. § 3.2.1 et 4.4).

Dans les essais de toxicité de sols réguliers employant E. andrei ou D. rubidus, une certaine cohérence doit être démontrée, soit en incluant une concentration témoin positive avec chaque essai définitif (v. § 4.4), soit en effectuant des essais toxicologiques de référence à réaliser au minimum deux fois par an avec des élevages du laboratoire, dans les conditions et avec les modes opératoires exposés au § 4.4. En outre, on devrait vérifier les performances de tout élevage ayant été établi récemment, à l’aide de nouveaux reproducteurs (§ 2.2), à l’aide d’un essai de toxicité de référence ou d’un témoin positif, et les résultats devraient se révéler acceptables (v. § 2.3.9 et 4.4) avant de s’approvisionner en organismes dans ces élevages.

On devrait observer régulièrement les élevages d’E. andrei et de D. rubidus (p. ex. toutes les deux semaines). Idéalement, on devrait consigner les données suivantes :

• la date de démarrage d’un élevage et le nombre estimé d’organismes utilisés pour le démarrage de l’élevage;
• les dates de renouvellement du substrat;
• le régime d’alimentation et d’arrosage (y compris leur type et la quantité ajoutée chaque fois);
• les conditions ambiantes et la qualité du substrat (p. ex. température ambiante, photopériode et qualité de la lumière, pH du substrat);
• des observations de l’état de santé et de la densité de l’élevage (p. ex. comportement et aspect des vers dans l’élevage, aspect et odeur du substrat, quantité des vers et endroit où ils se trouvent dans l’enceinte, quantité de nourriture délaissée dans l’enceinte).

Le tableau 1 qui suit présente une liste de contrôle des conditions et modes opératoires recommandés et exigés pour l’élevage d’E. andrei et de D. rubidus afin d’obtenir des organismes utilisables dans les essais de toxicité des sols. De nombreuses particularités qui ont vraisemblablement donné de bons résultats pour l’obtention d’adultes d’E. andrei pour les essais de toxicité de sols sont présentées dans d’autres documents (ISO, 2008, 2012; ASTM 2012; OECD, 2016), et, sauf indication contraire dans le présent rapport, elles pourraient donner des orientations utiles, qui peuvent s’appliquer ici.

Tableau 1. Liste de contrôle des conditions et des modes opératoires recommandés et exigés pour l’élevage d’E. andrei et de D. rubidus destinés à des essais de mesure de la toxicité des sols

Origine du stock de géniteurs de l’élevage	Jeunes, adultes et/ou cocons provenant d’un laboratoire d’essais de toxicité privé ou de l’État; l’identification jusqu’au niveau de l’espèce (c’est-à-dire E. andrei ou D. rubidus) est confirmée.
Acclimatation	Graduelle (on ne recommande pas plus de 3 °C/j) pour ce qui concerne les écarts de température et de substrat à l’arrivée.
Récipients d’élevage	Des enceintes de reproduction de 6 à 50 L de capacité conviennent (p. ex. bacs de plastique mesurant environ 30 × 40 × 15 cm ou 60 × 40 × 20 cm pour E. andrei, bacs de plastique plus petits mesurant environ 32 × 17 × 12 cm pour D. rubidus, à couvercle de plastique perforé pour permettre l’aération et réduire au minimum l’évaporation); côtés et/ou couvercle transparents ou translucides pour permettre l’éclairage de la surface du substrat d’élevage; profondeur minimale recommandée : 10 cm.
Température ambiante	20 ± 2 °C, moyenne journalière; 20 ± 3 °C, température instantanée.
Éclairage	À incandescence, fluorescent ou DEL; intensité : 400 à 800 lux à la surface du récipient d’élevage; photopériode dans l’obscurité continue ou fixe (p. ex. 16 h de lumière; 8 h d’obscurité ou 12 h de lumière; 12 h d’obscurité).
Type de substrat	Facultatif (p. ex. mélange de terreau, de sol artificiel et de tourbe)
Hydratation du substrat	Avec l’eau d’essai; teneur en humidité suffisante pour maintenir la surface de la litière humectée, mais sans accumulation d’eau stagnante au fond du récipient d’élevage; les particules de sol ne devraient pas adhérer aux vers.
pH du substrat	Ajusté dans l’intervalle de 6,0 à 7,5 au moyen de carbonate de calcium de qualité « réactif ».
Renouvellement ou rafraîchissement du substrat	Au besoin; trier et transférer vers et cocons à la main; on peut aussi utiliser un éclairage ininterrompu pour transférer les vers de la couche supérieure de la vieille litière vers la litière fraîche placée sous la vieille litière ou dans la moitié inférieure de cette dernière; on peut se débarrasser de la vieille litière et la remplacer par une litière fraîche.
Surveillance de la qualité du substrat	Mesurer régulièrement, dans chaque récipient d’élevage, la température, le pH et la teneur en humidité du substrat.
Alimentation	Il est recommandé d’utiliser Magic® Worm Food et des céréales biologiques mixtes, moulues et tamisées; des flocons d’avoine, des agglomérés de luzerne et/ou d’autres compléments alimentaires facultatifs; distribuer au moins une fois toutes les deux semaines en déposant la nourriture dans une petite dépression du substrat, en l’hydratant avec de l’eau déionisée, puis recouvrir d’une mince couche de substrat; ajuster les quantités en fonction des observations de la consommation de nourriture; se débarrasser de toute nourriture excédentaire (non consommée) ainsi que de toute moisissure, de tout champignon ou de tout acarien visible à proximité avant de nourrir les animaux.
Maintien de l’élevage	Examiner le substrat du récipient d’élevage régulièrement (p. ex. une fois toutes les deux semaines); retourner manuellement et doucement le contenu du récipient d’élevage; se débarrasser des vers morts, blessés ou atypiques (léthargiques); consigner l’état de l’élevage; maintenir le chargement du récipient d’élevage à pas plus de 0,03 g/cm3.
Âge et taille des vers destinés aux essais	Adultes (pourvus d’un clitellum) pour les essais de réaction d’évitement et de reproduction; le poids humide de chaque ver doit se situer dans l’intervalle 250–600 mg pour E. andrei et 50–200 mg pour D. rubidus.
Indices de la santé de l’élevage	Considéré comme en bonne santé si : (1) les vers se déplacent activement dans le substrat, ne tentent pas de le fuir et s’y reproduisent continuellement; (2) les résultats des essais de toxicité de référence ou des sols témoins positifs à l’aide de vers de l’élevage se situent à l’intérieur des limites d’avertissement; les données sur la reproduction des sols témoins négatifs sont contrôlées. On se débarrasse de l’élevage si, à un moment donné, plus de 20 % des jeunes ou des adultes sont morts, inactifs ou en mauvaise santé.

* Les renseignements contenus dans ce tableau ne sont qu’un résumé. Les exigences et recommandations définitives de cette méthode d’essai figurent dans le corps du présent document.

2.3.2 Équipement et appareillage

Il faudrait élever les vers dans une installation de laboratoire à température contrôlée. L’équipement de maintien de la température (c’est-à-dire un incubateur ou une pièce thermostatée) devrait permettre de conserver la température entre les valeurs de consigne (§ 2.3.4).

Le secteur des élevages devrait être isolé de celui des essais, de l’entreposage ou de préparation des échantillons pour éviter la contamination de ces sources. Il doit être conçu et construit de façon à prévenir la contamination des élevages (p. ex. suppression des tuyaux, garnitures ou accessoires de cuivre ou galvanisés qui pourraient laisser dégoutter des condensats contaminés par des métaux).

Dans l’élevage, tout l’équipement, tous les récipients et tous les accessoires qui pourraient entrer en contact avec les organismes ou le substrat doivent être propres, rincés convenablement et fabriqués de matériaux non toxiques (p. ex. verre, téflon, acier inoxydable de type 316, nylon, Nalgene^®, porcelaine, polyéthylène, polypropylène). Les matières toxiques, notamment le cuivre, le zinc, le laiton, le métal galvanisé, le plomb et le caoutchouc naturel, ne doivent pas entrer en contact avec cet appareillage et équipement ni avec le substrat d’élevage ou l’eau.

Divers récipients d’élevage tels que les bacs de plastique ou les vivariums de reproduction de 6 à 50 L de capacité (p. ex. des bacs de plastique mesurant environ 30 × 40 × 15 cm ou ~ 60 × 40 × 20 cm pour E. andrei, et des bacs de plastique plus petits mesurant environ 32 × 17 × 12 cm pour D. rubidus), conviennent à l’élevage d’E. andrei et de D. rubidus. Les côtés et/ou le couvercle devraient être translucides ou transparents pour permettre à la lumière d’atteindre le substrat d’élevage (v. § 2.3.3). Chaque récipient d’élevage devrait posséder un couvercle perforé (p. ex. d’orifices couverts d’un grillage de fibre de verre) pour réduire au minimum l’assèchement du substrat en surface et le risque de contamination, tout en permettant l’échange d’air et en empêchant les vers de s’échapper. L’emploi de récipients d’élevage en bois n’est pas recommandé, en raison de la présence possible de contaminants toxiques (p. ex. colles pour contreplaqué, fongicides anticoloration ou extraits du bois tels que les acides résiniques et les juvabiones). Le choix de la taille et du nombre de récipients d’élevage nécessaires pourrait être influencé par le nombre de vers de terre adultes dont le laboratoire a besoin pour un ou plusieurs essais de toxicité des sols. Chaque récipient devrait pouvoir recevoir au moins 10 cm d’épaisseur de sol ou d’un autre substrat d’élevage.

2.3.3 Éclairage

E. andrei et D. rubidus peuvent être élevés sous un éclairage incandescent, fluorescent ou à diode électroluminescente (DEL), et une photopériode régulée (p. ex. 16 h de lumière; 8 h d’obscurité ou 12 h de lumière; 12 h d’obscurité). Si un éclairage est utilisé, l’intensité lumineuse adjacente à la partie supérieure des récipients d’élevage devrait varier entre 400 et 800 lux. Cet intervalle équivaut à un flux quantique de 5,6 à 11,2 μmol/(m² · s) pour la lumière fluorescente blanche et crue, de 6,4 à 12,8 μmol/(m² · s) pour la lumière fluorescente à spectre continu ou de 7,6 à 15,2 μmol/(m² · s) pour l’éclairage à incandescence. Les sources lumineuses devraient être suffisamment éloignées des récipients d’élevage pour empêcher l’évaporation causée par l’accumulation de chaleur.

2.3.4 Température

Pour E. andrei et D. rubidus, la moyenne quotidienne de la température ambiante dans l’installation d’élevage devrait être de 20 ± 2 °C, et sa valeur instantanée de 20 ± 3 °C.

2.3.5 Substrat d’élevage

Le choix du substrat est laissé à la discrétion et à l’expérience du personnel du laboratoire; cependant, les substrats d’élevage suivants sont recommandés.

Un mélange de terreau (mélange de fumier, de tourbe et de loam)^{Note de bas de page 11}, de tourbe à sphaignes passée par un tamis à mailles de 2 mm et de sol artificiel s’est révélé un substrat convenable pour l’élevage d’E. andrei et de D. rubidus. On prépare comme suit 10 L de ce mélange :

1. Mélanger environ 3 L de terreau avec environ 4 L de tourbe (ces deux matières étant à l’état sec).
2. Ajouter de l’eau désionisée (~ 1 L) au substrat et soumettre à un mélange mécanique (mélangeur portatif) jusqu’à ce que la teneur en humidité, la couleur et la texture du mélange semblent homogènes.
3. Ajouter environ 1,5 L de sol artificiel (v. § 3.3.2).
4. Ajouter de l’eau désionisée (~ 1 L) au mélange, tout en remuant mécaniquement, jusqu’à ce que la teneur en humidité équivaille à environ 70 % de la capacité de rétention du mélange.
5. Mesurer le pH du sol et, selon la valeur mesurée, parsemer environ 30 g de carbonate de calcium (CaCO₃) à la surface du substrat à l’aide d’un tamis fin, puis les incorporer au sol à l’aide d’un mélangeur mécanique, jusqu’à la disparition de la poudre blanche.

On conserve ce mélange dans un récipient couvert, à la température ambiante du laboratoire, pendant au moins trois jours. On remue ensuite le substrat et on en mesure le pH pour s’assurer qu’il se situe entre 6,0 et 7,5. Si le pH est inférieur à 6,0, on ajoute du carbonate de calcium (Stephenson, G.L., Aquaterra Environmental, communication personnelle, 2001).

2.3.6 Alimentation des vers

On a réussi l’élevage d’E. andrei et de D. rubidus grâce à l’emploi de Magic® Worm Food, de grains mixtes organiques moulus et tamisés (MESI, 2014, 2020; ECCC, 2020b), de flocons d’avoine cuits (Aquaterra Environmental, 1998; Stephenson et al., 1999a, 1999b; Aquaterra Environmental et ESG, 2000; EC, 2010, 2013a) ou des agglomérés de luzerne déshydratée (ASTM, 2012; USEPA, 2012), avec des compléments alimentaires facultatifs (p. ex. compost de cuisine, céréales pour bébés enrichies, fumier organique composté). Les détails de la préparation de ces types d’aliments recommandés, ainsi que les régimes alimentaires acceptables, sont décrits dans ce paragraphe. Les élevages doivent être alimentés au moins une fois toutes les deux semaines. Pendant l’alimentation des élevages, on devrait retirer et éliminer toute vieille nourriture ainsi que la moisissure, les champignons ou les acariens qui se manifestent à la surface du substrat d’élevage.

Magic® Worm Food (MWF) est un aliment disponible dans le commerce, utilisé par les laboratoires d’essais de toxicité canadiens pour l’élevage et l’analyse avec vers. On le recommande dans le présent document comme source alimentaire principale pour l’élevage et l’analyse (essai de reproduction d’une durée de 56 jours; v. § 4.2.4)^{Note de bas de page 12,Note de bas de page 13}. La nourriture MWF devrait être traitée avant d’être utilisée afin d’éliminer toute contamination potentielle des élevages par d’autres organismes. Pour y parvenir, il est nécessaire de la sécher au four à 60 °C pendant 48 heures, puis de la conserver au congélateur (p. ex. à -20 °C). Elle peut être utilisée directement à partir du congélateur pour alimenter les élevages (ou les organismes d’essai). À l’aide d’une cuiller, il faudrait ajouter environ 5 à 10 ml de MWF à chaque récipient d’élevage en pratiquant une petite dépression dans le substrat d’élevage, en y déposant la nourriture, en l’hydratant avec une petite quantité d’eau déionisée, puis en la recouvrant d’une mince couche de substrat (J. Princz, ECCC, communication personnelle, 2020). Il faudrait ajuster la quantité de nourriture en fonction des observations de la nourriture consommée ou non au cours de la distribution précédente de nourriture.

Il est également recommandé d’utiliser les céréales mixtes biologiques comme principale source alimentaire pour l’élevage et l’analyse avec vers de terre, en plus ou en remplacement du MWF^{Note de bas de page 14}. Comme pour la nourriture MWF, il est recommandé de traiter les céréales mixtes biologiques avant de les utiliser afin d’éliminer la contamination potentielle des élevages par d’autres organismes. En outre, les céréales mixtes biologiques doivent être broyées et tamisées (1-2 mm de diamètre), puis congelées jusqu’à leur utilisation. Les céréales mixtes biologiques peuvent être utilisées pour nourrir les élevages en suivant les conseils fournis ci-dessus pour le MWF.

Des flocons d’avoine cuits peuvent être utilisés pour nourrir les élevages d’E. andrei et de D. rubidus^{Note de bas de page 15}. Ainsi, on recommande d’utiliser une préparation de flocons d’avoine de Quaker® Oats, car l’expérience avec des flocons d’avoine génériques ou d’autres marques a parfois indiqué des problèmes de production excessive de moisissures dans les élevages ou pendant l’essai. On devrait hydrater les flocons d’avoine avec de l’eau désionisée (p. ex. un volume de 1:2 de flocons d’avoine et d’eau désionisée bouillie) et les refroidir avant d’alimenter les élevages. On devrait ajouter, à l’aide d’une cuiller, environ 5 ml à 10 ml de flocons cuits à chaque vivarium, en pratiquant une petite dépression dans le substrat, en y déposant l’avoine, puis en recouvrant ce dernier d’une mince couche de substrat pour réduire au minimum la croissance de moisissure ou la prolifération d’acariens (Stephenson, G.L., Aquaterra Environmental, communication personnelle, 2001). Au moment d’enlever toute vieille avoine (non consommée), il faudrait prendre soin de ne pas retirer des vers en même temps (les vers nouveau-nés ayant tendance à creuser des galeries dans le bol de gruau).

On peut également utiliser les agglomérés de luzerne comme source de nourriture pour l’élevage d’E. andrei (ASTM, 2012; USEPA, 2012)^{Note de bas de page 16}. On peut se procurer les agglomérés séchés auprès d’un fournisseur d’aliments du bétail. Avant de les utiliser, on devrait les saturer d’eau désionisée ou distillée (à raison d’environ 1 g d’agglomérés séchés pour 2 ml d’eau). Bien que l’EPA des États-Unis (2012) recommande la maturation, pendant au moins deux semaines, de la luzerne hydratée dans un récipient couvert, l’expérience d’un laboratoire d’essais d’Environnement Canada montre que cette étape est inutile et que la luzerne hydratée peut être servie dans les heures suivant l’hydratation (Moul, D., Environnement Canada, communication personnelle, 2001). À chaque distribution d’aliment, on devrait se débarrasser, au moyen d’une cuiller ou de pincettes, de tout reste d’aliment que l’on trouve à la surface du substrat. On dépose ensuite à la surface du substrat de la luzerne hydratée fraîche et on la couvre d’une mince couche de substrat pour réduire au minimum la croissance de parasites (acariens et collemboles) [Moul, D., Environnement Canada, communication personnelle, 2001].

On peut compléter la distribution de MWF, de céréales mixtes biologiques, de gruau ou de luzerne dans les élevages par l’addition régulière d’un peu de matière végétale compostée ou de fumier composté pour améliorer et maintenir la santé des vers. L’ajout de compost déshydraté (p. ex. à raison de 15 à 30 ml par vivarium renfermant environ 6 à 8 L de substrat) peut compléter l’apport toutes les deux semaines de MWF, de céréales mixtes biologiques, de gruau cuit et hydraté ou de luzerne^{Note de bas de page 17}.

La quantité d’aliments ajoutés (gruau cuit, luzerne hydratée) dépend de la densité des vers et de leur stade de développement. Elle devrait se fonder sur les observations et les statistiques relatives aux aliments consommés et non consommés, et recueillies pendant les distributions antérieures.

2.3.7 Manipulation des organismes et maintien des élevages

On devrait manipuler le moins possible les embryons (dans les cocons), les jeunes et les adultes d’E. andrei et de D. rubidus pour éviter de les blesser ou de les stresser inutilement. S’il faut les manipuler, il faudrait le faire doucement, soigneusement et rapidement, pour réduire au minimum le stress subi par les animaux. Pour transporter les vers de l’élevage aux récipients d’essai, on peut y aller avec la main gantée et/ou avec les mors émoussés d’une pince. Pendant les manipulations, on devrait se débarrasser de tout ver blessé, qui semble stressé ou que l’on a laissé échapper, et il ne faut pas l’utiliser dans l’essai.

Il est recommandé d’inspecter régulièrement le contenu de chaque récipient d’élevage immédiatement avant chaque distribution de nourriture, pour déterminer l’état apparent des vers et celui du substrat de la litière. Si, pendant cette inspection, on observe de l’accumulation d’eau excédentaire dans le bas du substrat, on devrait alors retourner soigneusement la litière pour redistribuer cette eau dans tout le substrat^{Note de bas de page 18}. Il faut veiller, quand on retourne le contenu du récipient, à ne pas blesser les vers. Il faut alors se débarrasser de tout cadavre de ver que l’on observe. Tout ver blessé ou apparemment atypique (p. ex. léthargique) que l’on observe devrait subir le même sort. Il faudrait consigner dans un registre l’état apparent de l’élevage (vers et substrat) au moment de chaque observation (v. 2.3.1).

Il faudrait limiter le chargement ou la densité de peuplement de chaque récipient d’élevage pour prévenir une densité excessive et ses effets indésirables sur la croissance et la reproduction des vers ainsi que sur la santé de l’élevage. La valeur maximale du chargement, 0,03 g de poids humide de ver/cm³ recommandée par l’ASTM (2012), est un critère utile. Pour réduire le nombre excédentaire de vers d’un récipient d’élevage, on peut suivre l’un des deux modes opératoires suivants (ou quelque modification convenable de ce dernier). Le premier a comme avantage supplémentaire qu’il permet de trier les vers en deux catégories de tailles (c’est-à-dire en jeunes et en adultes).

Mode opératoire (option) 1 (d’après ESG International Inc., de Guelph, Ont.) [Stephenson, G.L., Aquaterra Environmental, communication personnelle, 2001] :

1. Préparer un mélange frais du substrat d’élevage (v. § 2.3.5).
2. Transvaser une aliquote de 1 L environ de substrat frais dans chacun des deux récipients de conservation temporaire.
3. Déposer le contenu d’un vieux récipient d’élevage (où le chargement est excessif, dont le milieu est trop humide ou dont l’odeur est nauséabonde) sur une feuille de plastique ou dans un récipient de plastique peu profond, dont la surface est suffisante pour permettre le tri du contenu.
4. Retirer les vers vivants et apparemment en bonne santé, jeunes et adultes, puis les transférer dans les deux récipients provisoires, séparément, en deux classes de tailles (c’est-à-dire les jeunes dans un récipient, les adultes dans l’autre).
5. Préparer deux nouveaux récipients d’élevage, en mélangeant une partie du vieux substrat et du nouveau substrat selon un rapport respectif de 1/3. Après mélange, corriger la teneur en humidité et le pH du substrat de chaque récipient d’élevage, au besoin (§ 2.3.5, 2e alinéa).
6. Transférer les jeunes vers de l’un des récipients provisoires à la surface du substrat de l’un des deux récipients d’élevage et les vers adultes à la surface du substrat de l’autre récipient.
7. Répartir doucement les vers un à un sur la surface, pour qu’ils puissent pénétrer dans le substrat de tout le récipient.
8. Étiqueter chaque récipient d’élevage et consigner le nom de l’espèce, son stade évolutif, l’origine des vers, leur nombre approximatif et la date du renouvellement du substrat.

Mode opératoire (option) 2 (d’après ASTM, 2012) :

1. Préparer un récipient d’élevage avec du substrat neuf (frais), mais sans ver, et déposer la moitié de son contenu sur une feuille de plastique.
2. Transférer le contenu du récipient d’élevage où le chargement de vers est excessif sur une autre feuille de plastique.
3. Soigneusement, retirer les vers (y compris les cocons, les jeunes et les adultes) du substrat et les transférer temporairement en nombres égaux, en tenant compte approximativement des classes d’âge dans chacun des deux récipients de transfert convenables.
4. Transférer la moitié du vieux substrat dans le nouveau récipient d’élevage et en mélanger le contenu doucement, à la main (gantée) ou à l’aide d’une spatule ou d’une cuiller de plastique.
5. Mélanger la moitié du nouveau substrat se trouvant sur la feuille de plastique avec la moitié restante du vieux substrat, puis transférer le mélange dans le récipient d’élevage où le chargement était excessif.
6. Transférer ensuite dans chacun des deux récipients d’élevage fraîchement préparés l’un des deux groupes de vers gardés peu de temps dans chaque récipient de transfert.

La litière d’élevage devrait être réapprovisionnée (en ajoutant du substrat frais) ou renouvelée (c’est-à-dire remplacée) au besoin, en fonction de la qualité du substrat, de la densité et de la santé des vers de terre^{Note de bas de page 19}. Une méthode efficace à cette fin (ASTM, 2012) consiste à préparer un nouveau bac de litière, à déposer le contenu de la vieille litière (y compris les vers qui s’y trouvent) par-dessus la nouvelle litière. On conserve les litières superposées (la vieille sur la neuve) dans un bac non couvert, à 20 ± 2 °C, sous éclairage ininterrompu, pendant deux jours, pour inciter les vers à creuser leurs terriers dans la nouvelle litière. À la fin de ces deux jours, on se débarrasse de la vieille litière^{Note de bas de page 20}. On peut aussi utiliser un éclairageininterrompu pour encourager les vers à s’éloigner de la couche supérieure de la litière d’élevage. Après un minimum de deux heures, on retire la couche supérieure de la litière et on la tamise pour détecter les vers restant dans la litière, puis on s’en débarrasse. On ajoute ensuite de la litière fraîche à la surface (P. Boyd, Environnement et Changement climatique Canada, communication personnelle, 2021).

Il faudrait surveiller régulièrement le pH, la température et la teneur en humidité de la litière de chaque récipient d’élevage et effectuer les ajustements nécessaires (v. § 2.3.4 et 2.3.5).

2.3.8 Élevage des vers destinés aux essais de toxicité

Les méthodes d’élevage, pour être couronnées de succès, doivent produire le nombre nécessaire d’organismes en bonne santé, d’un stade connu de développement et de tailles semblables. Le poids humide de chaque vers au début de chacun des essais de toxicité d’un sol décrits dans les § 4.2 ou 4.3 doit se situer dans l’intervalle précisé dans le § 2.1. En outre, les organismes d’élevage doivent satisfaire à des indices de santé et de performance précis (v. 2.3.9). On peut utiliser des élevages synchrones dans l’essai de réaction d’évitement ou dans l’essai de reproduction^{Note de bas de page 21}.

Lorsque les vers E. andrei ou D. rubidus sont élevés en laboratoire afin d’être utilisés au début d’un essai de toxicité de 56 jours en vue de déterminer les effets sur la reproduction (§ 4.2), on recommande de les acclimater en laboratoire aux conditions de cet essai de toxicité, pendant au moins 7 jours (ou au moins 14 jours, si les vers proviennent d’un autre laboratoire pour être utilisés dans un essai de reproduction de 56 jours; v. § 2.4.8). Si le substrat d’élevage utilisé est essentiellement constitué de sol (ou d’un mélange de sol et de tourbe; v.§ 2.3.5) et que la nourriture donnée aux élevages est la même que celle qui servira pendant l’essai de reproduction (c’est-à-dire Magic® Worm Food ou céréales mixtes biologiques; v. § 2.3.6 et 4.2.4), ces vers sont déjà acclimatés à ces conditions expérimentales, et tout transfert et toute manipulation supplémentaires des vers à cette fin sont déconseillés. Cependant, si les conditions d’élevage du substrat et/ou de la nourriture diffèrent sensiblement de celles auxquelles les vers se trouvant dans le sol témoin négatif et que ceux-ci seront exposés pendant l’essai de reproduction, il faudrait acclimater tous les vers à utiliser dans l’essai de toxicité pendant au moins 7 jours (v. § 2.4), dans un sol témoin négatif. Pendant cette période d’acclimatation, l’éclairage et la température devraient être les mêmes que dans l’essai de reproduction de 56 jours, et il faut alimenter les vers avec la même nourriture (c.-à-d. MWF ou céréales mixtes biologiques) que celle qui sera utilisée dans l’essai (v. § 2.4, 2.4.3, 2.4.4, 2.4.6 et 4.2.2).

Dans le cas de l’essai de réaction d’évitement employant tout E. andrei ou D. rubidus élevé en laboratoire et utilisé au début d’un essai, on recommande fortement de les acclimater dans le laboratoire aux conditions thermiques représentatives de l’essai, pendant au moins 7 jours (v. § précédent et 2.4.4, 2.4.5 et 4.3.2). Les vers à utiliser dans un essai de réaction d’évitement n’ont toutefois pas besoin d’acclimatation préalable aux conditions d’obscurité totale qui règnent au cours de cet essai (v. § 2.4.3 et 4.3.2).

2.3.9 Indices de santé et de performances

Chaque récipient d’élevage devrait, au besoin, faire l’objet d’une vérification pour contrôler et consigner les performances de l’élevage (v. § 2.3.1, 2.3.6 et 2.3.7). On devrait évaluer régulièrement et corriger au besoin les modes opératoires et les conditions utilisés pour le maintien de chaque élevage, afin de préserver ou de restaurer sa santé. On devrait se débarrasser de tout jeune ou adulte qui semble mort, inactif, qui ne fouit pas dans le substrat de la litière ou qui, par ailleurs, semble en mauvaise santé ou atypique. Si l’élevage semble en mauvaise santé ou atypique pendant une vérification, on devrait le vérifier plus fréquemment, pour s’assurer qu’il n’y survient pas une mortalité en cascade (c’est-à-dire que le taux de mortalité augmente exponentiellement en fonction du temps). Si plus de 20 % des jeunes ou adultes d’un récipient d’élevage semblent morts, inactifs ou en mauvaise santé au cours d’une période d’observation, on devrait se débarrasser de tout le groupe se trouvant dans le récipient. En outre, si le nombre combiné de mortalités et de vers semblant en mauvaise santé que l’on observe à la surface du substrat d’élevage persiste ou augmente au fil des jours, on devrait également se débarrasser du contenu du récipient d’élevage.

Il existe deux possibilités pour satisfaire aux exigences minimales en matière d’assurance de la qualité pour évaluer la sensibilité des organismes d’essai lorsqu’il est question d’utiliser une substance de référence connue (p. ex. l’acide borique) pour les essais de reproduction et de réaction d’évitement. La première option consiste à effectuer deux essais de toxicité de référence à concentrations multiples annuellement (c.-à-d. une fois tous les six mois) à l’aide de vers provenant des mêmes élevages que ceux provenant des organismes d’essai pour les essais définitifs (v. § 4.4). La deuxième option consiste à inclure une concentration témoin positive avec chaque essai de toxicité en utilisant une partie des vers adultes issus de ceux utilisés pour l’essai définitif de toxicité (v. § 4.4 pour plus de détails)^{Note de bas de page 22}. Tous les essais réalisés avec le ou les toxiques de référence doivent avoir lieu dans les conditions et avec les modes opératoires exposés dans le § 4.4. On expose dans les § 4.2.3 et 4.3.3 les critères expérimentaux utilisés pour juger de la validité d’un essai particulier de toxicité d’un sol (et, indirectement, de la santé de l’élevage) d’après les performances des organismes d’essai dans le sol témoin négatif.

Un laboratoire qui effectue des essais réguliers de toxicité pour la reproduction (§ 4.2) pourrait trouver utile de surveiller les données sur le nombre de jeunes engendrés dans le sol témoin négatif, comme mesure de la santé et des performances de l’élevage. Un graphique de ces données en fonction du temps pourrait révéler des difficultés de reproduction attribuables au régime ou à d’autres conditions auxquelles les élevages sont exposés (Stephenson, G., Stantec Consulting Ltd., communication personnelle, 2004).

2.4 Acclimatation d’E. andrei et de D. rubidus

2.4.1 Généralités

Pour tout groupe de vers de terre (E. andrei ou D. rubidus) employé dans l’un ou l’autre des essais de toxicité d’un sol ou de sols que l’on décrit dans le présent document, on recommande fortement de les acclimater d’abord aux conditions régnant dans le laboratoire auxquelles il sera exposé dans l’essai ou les essais. Nous décrivons ici les modes opératoires et les conditions de l’acclimatation de tout groupe d’E. andrei ou de D. rubidus élevé au laboratoire effectuant l’essai ou transporté au laboratoire en provenance d’un autre laboratoire pour être employé dans un essai de reproduction d’une durée de 56 jours (§ 4.2) ou dans un essai de réaction d’évitement d’une durée de 48 h (§ 4.3). Nous les résumons dans le tableau 2. Des conseils sur les sources d’approvisionnement d’un laboratoire en vers de terre destinés à l’un ou l’autre des essais sont fournis dans le § 2.2. Consulter le § 2.3 pour connaître les conditions et les modes opératoires de l’élevage des vers de terre (E. andrei ou D. rubidus) à employer dans l’essai de réaction d’évitement ou l’essai de reproduction.

Comme dans le cas des essais initiaux employant des vers de terre élevés dans le laboratoire d’essai (v. § 2.3.1 et 3.2.1), il incombe à chaque laboratoire novice dans l’emploi de la ou des méthodes d’essai biologique décrites dans le présent document de montrer sa capacité d’obtenir des résultats constants, précis, avec un toxique de référence, quand il se prépare à effectuer des essais de réaction d’évitement ou de reproduction avec des groupes de vers de terre (E. andrei ouD. rubidus) qu’il s’est procurés auprès d’un autre laboratoire. À cette fin, on devrait déterminer la précision intralaboratoire, exprimée par le coefficient de variation des données appropriées sur les effets mesurés, en effectuant au moins cinq essais avec différents lots (groupes) d’organismes provenant du même fournisseur, en utilisant le même toxique de référence et des modes opératoires ainsi que des conditions identiques dans chaque essai (v. § 4.4). Le laboratoire devrait alors également confirmer la précision qu’il obtient dans les essais en question, en effectuant au moins 5 essais de toxicité employant un sol témoin négatif et différents groupes d’organismes (EC, 2005b, 2013b, 2014a; ECCC, 2020a). Les conditions et modes opératoires de l’exécution de ces essais initiaux employant un sol témoin négatif devraient être identiques et conformes à ceux qui sont exposés dans les § 4.2 (essais pour mesurer les effets sur la reproduction) ou 4.3 (essais de réaction d’évitement).

Tableau 2. Liste de contrôle des conditions et des modes opératoires recommandés et exigés pour l’acclimatation des vers des espèces E. andrei et D. rubidus destinés à des essais de toxicité des sols

Origine des vers	Laboratoire de l’État ou laboratoire privé possédant déjà un élevage des vers; ils proviennent de la même source.
Stade de développement et taille à la réception	Selon le moment où aura lieu l’essai de toxicité, les vers peuvent être obtenus jeunes ou adultes (dans ce dernier cas, dotés d’un clitellum); le poids humide individuel des vers doit se situer dans l’intervalle précisé (§ 2.1).
Récipients d’entretien et d’acclimatation	« Enceintes de reproduction » de 6 à 50 L de capacité conviennent (p. ex. bacs de plastique mesurant environ 30 × 40 × 15 cm ou environ 60 × 40 × 20 cm pour E. andrei, bacs de plastique plus petits mesurant environ 32 × 17 × 12 cm pour D. rubidus) à couvercle perforé pour permettre l’aération et réduire au minimum l’évaporation; côtés et/ou couvercle transparents ou translucides pour permettre l’éclairage de la surface du substrat; profondeur minimale recommandée : 10 cm.
Température ambiante	Il est recommandé de l’ajuster graduellement (p. ex. pas plus de 3 °C/j) pour combler les écarts de température à l’arrivée; ensuite, maintenir les vers à une température journalière moyenne de 20 ±2 °C et à une température instantanée de 20 ± 3 °C; les acclimater à ces conditions pendant au moins 7 jours précédant immédiatement l’essai.
Éclairage	À incandescence, fluorescent ou DEL; intensité : 400 à 800 lux à la surface de l’enceinte de maintien ou d’acclimatation; photopériode fixe (p. ex. 16 h de lumière; 8 h d’obscurité ou 12 h de lumière; 12 h d’obscurité); pour l’acclimatation en vue de l’essai de réaction d’évitement, les vers peuvent être conservés dans l’obscurité; acclimater les vers à ces conditions pendant au moins les 7 jours précédant immédiatement l’essai.
Type de substrat	Facultatif : sol témoin négatif (naturel ou artificiel); mélange de terreau, de sol artificiel et de tourbe.
Hydratation du substrat	Avec l’eau d’essai; teneur en humidité suffisante pour maintenir humectée la surface de la litière du substrat, mais sans eau stagnante au fond du récipient de maintien ou d’acclimatation; les particules de sol ne devraient pas adhérer aux vers.
pH du substrat	Presque neutre; ne pas ajuster si le sol est un témoin négatif naturel (prélevé sur le terrain); au besoin, ajuster entre 6,0 et 7,5 au moyen de carbonate de calcium de qualité « réactif ».
Renouvellement ou rafraîchissement du substrat	Au besoin; si les vers sont conservés pendant une période prolongée avant d’être utilisés dans l’essai de toxicité du sol; trier et transférer vers et cocons à la main; on peut aussi utiliser un éclairage ininterrompu pour transférer les vers de la couche supérieure de la vieille litière vers la litière fraîche placée sous la vieille litière ou dans la moitié inférieure de cette dernière; on peut se débarrasser de la vieille litière et la remplacer par une litière fraîche.
Durée de l’acclimatation	Au moins 7 jours, durant la période précédant immédiatement l’essai, aux conditions existant dans le laboratoire; forte recommandation d’au moins 14 jours pour les vers obtenus d’une source externe à utiliser dans l’essai de reproduction d’une durée de 56 jours.
Surveillance de la qualité du substrat	Mesurer régulièrement, dans chaque récipient de maintien et d’acclimatation, la température, le pH et la teneur en humidité du substrat.
Alimentation	Soit de la nourriture Magic® Worm Food ou des céréales biologiques mixtes, moulues et tamisées données lors de la mise en place du récipient d’acclimatation, puis une fois toutes les deux semaines en déposant la nourriture dans une petite dépression du substrat, en l’hydratant avec de l’eau déionisée, puis recouvrir d’une mince couche de substrat; il faudrait se débarrasser de toute nourriture excédentaire (non consommée) ainsi que de toute moisissure, de tout champignon ou de tout acarien visible à proximité avant de nourrir les animaux.
Entretien	Examiner le substrat régulièrement (p. ex. une fois toutes les deux semaines); réhydrater et retourner manuellement et doucement le contenu du récipient de maintien et d’acclimatation; se débarrasser des vers morts, blessés ou atypiques (léthargiques); consigner l’état apparent du substrat et des vers; maintenir le chargement du récipient à pas plus de 0,03 g/cm3.
Âge et taille des vers destinés aux essais	Adultes (pourvus d’un clitellum) pour les essais de réaction d’évitement et de reproduction; le poids humide de chaque ver doit se situer dans l’intervalle 250–600 mg pour E. andrei et 50–200 mg pour D. rubidus.
Indices de la santé	Dans le récipient d’entretien ou d’acclimatation, les vers sont considérés comme en bonne santé si : (1) ils semblent actifs quand on les observe et ils ne tentent pas de s’échapper du substrat; (2) les résultats des essais de toxicité de référence ou les témoins positifs à l’aide de vers provenant de l’élevage d’origine se situent à l’intérieur des limites d’avertissement déterminées par contrôle permanent. On se débarrasse de tout le groupe si, à un moment donné, plus de 20 % des jeunes ou des adultes sont morts, inactifs ou en mauvaise santé.

* Les renseignements contenus dans ce tableau ne sont qu’un résumé. Les exigences et recommandations définitives de cette méthode d’essai figurent dans le corps du présent document.

2.4.2 Équipement et appareillage

Il faudrait entretenir les vers et les acclimater dans une installation de laboratoire à température contrôlée, isolée de tout local où l’on effectue des essais, entrepose ou prépare des d’échantillons. Consulter le § 2.3.2 pour obtenir des conseils sur les installations d’entretien ou d’acclimatation des vers à utiliser dans les essais de toxicité d’un sol et les récipients convenant à cette fin (c’est-à-dire les vivariums) et leurs couvercles.

2.4.3 Éclairage

Les récipients servant à l’acclimatation des vers destinés aux essais de toxicité de sols pour la reproduction sur 56 j devraient être éclairés au moyen de lampes à incandescence, de lampes fluorescentes ou de DEL. On devrait réguler la photopériode (p. ex. 16 h de lumière; 8 h d’obscurité ou 12 h de lumière; 12 h d’obscurité), qui devrait être la même que celle utilisée dans l’essai. L’intensité lumineuse adjacente à la partie supérieure de ces récipients devrait varier de 400 à 800 lux. Cet intervalle équivaut à un flux quantique de 5,6 à 11,2 μmol/(m² · s) pour la lumière fluorescente blanche et crue, de 6,4 à 12,8 μmol/(m² · s) pour la lumière fluorescente à spectre continu ou de 7,6 à 15,2 μmol/(m² · s) pour l’éclairage à incandescence. Les vers acclimatés à utiliser dans les essais de réaction d’évitement de 48 heures peuvent être maintenus dans une obscurité ininterrompue. On devrait acclimater les vers à ces conditions d’éclairage pendant au moins 7 jours immédiatement avant de les employer dans un essai^{Note de bas de page 23}.

2.4.4 Température

La température ambiante dans chaque installation d’entretien devrait être de 20 ± 2 °C durant l’acclimatation. En outre, la température instantanée devrait être de 20 ± 3 °C durant la même période. À cette fin, on devrait utiliser un incubateur ou un local à température contrôlée, isolé des laboratoires. Au besoin, il faudrait habituer les vers progressivement (p. ex. pas plus de 3 °C/jour) à la température d’acclimatation.

À la réception des vers au laboratoire d’essais, on devrait mesurer et consigner la température du substrat dans le récipient ayant servi au transport. Dans le cas des groupes de vers d’élevage expédiés à un laboratoire d’essai par un autre laboratoire, on devrait ajuster graduellement la température du substrat et des vers qui s’y trouvent (p. ex. ≤ 3 °C/jour) à la température d’acclimatation; ces vers devraient être acclimatés à la température moyenne de l’essai de toxicité (c’est-à-dire 20 ± 2 °C) pendant ≥ 7 jours précédant immédiatement leur emploi dans cet essai.

2.4.5 Substrat

La litière servant à l’acclimatation des vers de terre en vue des essais de toxicité de solspeut être la
même que celle que l’on envisage d’utiliser comme sol témoin négatif dans ces essais. Ce peut êtreun sol naturel, prélevé sur le terrain d’un emplacement non contaminé (§ 3.3.1) ou un sol artificiel (§ 3.3.2). La litière que l’on recommande pour l’élevage d’E. andrei et de D. rubidus (§ 2.3.5) peutégalement servir à l’acclimatation de ces vers.

La teneur en humidité du substrat devrait suffire pour garder la litière humide, tout en ne causant pas l’accumulation d’eau au fond du récipient d’acclimatation. On pourrait devoir ajuster la teneur en humidité^{Note de bas de page 24} (v. § 2.3.5).

Le pH du substrat d’acclimatation des organismes d’essai devrait se situer près de la neutralité, pour ne pas stresser les organismes. On peut l’ajuster (v. § 2.3.5), au besoin, pour l’amener dans un intervalle convenable (c’est-à-dire de 6,0 à 7,5).

On devrait acclimater les vers à ces conditions du substrat pendant ≥ 7 jours immédiatement avant de les employer dans un essai.

2.4.6 Alimentation des vers

Les vers placés dans un ou plusieurs récipients d’acclimatation doivent être nourris pendant cette période, soit avec Magic® Worm Food, soit avec des céréales mixtes biologiques moulues et tamisées (v. § 2.3.6). On doit nourrir deux fois par semaine ceux que l’on garde plus longtemps. On devrait suivre les conseils du § 2.3.6 concernant la préparation et la distribution de la nourriture.

2.4.7 Manipulation et maintien des organismes

Les conseils du § 2.3.7 s’appliquent à la manipulation et au maintien des vers gardés au laboratoire avant d’être employés dans des essais de toxicité. Si la période d’acclimatation excède deux semaines, on devrait manuellement retourner le contenu de chaque récipient d’acclimatation, au besoin (p. ex. juste avant la distribution de nourriture). On devrait alors observer et consigner l’état apparent du substrat de la litière et des vers. On devrait se débarrasser de tout animal mort, blessé ou d’apparence atypique (c’est-à-dire léthargique).

On devrait limiter le chargement des vers dans chaque récipient d’acclimatation pour prévenir une surpopulation et les effets négatifs qui en découlent pour l’état, les performances et la santé des vers. La valeur maximale du chargement de 0,03 g de poids humide de ver/cm³ que recommande l’ASTM (2012) pour les élevages d’E. andrei et de D. rubidus (v. § 2.3.7) devrait servir de guide à cet égard. Si la période de conservation des vers au laboratoire est prolongée (p. ex. plusieurs mois) et si la densité des vers augmente pendant cette période, on devrait prévenir la surpopulation en divisant le lot d’un récipient d’entretien et d’acclimatation et le rafraîchir en y ajoutant de la nouvelle litière (v. § 2.3.7).

Au début de la période d’acclimatation, on devrait mesurer et consigner la température, le pH et la teneur en humidité du substrat de chaque récipient d’entretien et d’acclimatation. On devrait mesurer régulièrement chacune de ces variables de la qualité des sols, si la période d’acclimatation excède deux semaines, et on devrait ajuster ces paramètres au besoin.

2.4.8 Vers acclimatés destinés aux essais de toxicité

Tous les vers utilisés dans un essai de toxicité d’un sol doivent sembler en bonne santé et être de tailles semblables. En outre, il est fortement recommandé de les avoir entretenus et acclimatés conformément aux modes opératoires et aux conditions exposés dans le présent document (§ 2.4.1 à 2.4.7). Chaque ver destiné à un essai de réaction d’évitement ou de reproduction doit avoir un poids humide se situant dans l’intervalle précisé au § 2.1. Les animaux utilisés dans un essai de toxicité doivent satisfaire à des indices précis de santé et de performance (§ 2.4.9). Les conditions et les modes opératoires décrits au § 2.3.8 s’appliquent à l’acclimatation des vers en vue de leur utilisation dans un essai de réaction d’évitement ou de reproduction.

Tout ver de terre (E. andrei ou D. rubidus) issu d’un autre laboratoire et employé au début d’un essai de reproduction d’une durée de 56 jours (§ 4.2) doit être acclimaté pendant au moins 7 jours immédiatement avant d’effectuer l’essai; cependant une période plus longue (c’est-à-dire au moins 14 jours) est fortement recommandée. Si les vers de terre à utiliser dans un essai de réaction d’évitement de 48 heures (§ 4.3) proviennent d’une source externe, ils doivent être acclimatés pendant au moins 7 jours, immédiatement avant d’effectuer l’essai. Il faut également suivre les conseils applicables des § 2.3.8 et 2.4.

2.4.9 Indices de santé et de performances

On devrait régulièrement vérifier chaque récipient d’entretien et d’acclimatation et, alors, surveiller et consigner l’état des vers et du substrat qui s’y trouvent (v. § 2.4.7). On devrait évaluer régulièrement et ajuster au besoin à leur valeur optimale les modes opératoires et les conditions de maintien des vers dans chaque récipient d’entretien et d’acclimatation. On devrait se débarrasser de tout jeune ou adulte qui semble mort, inactif, qui ne fouit pas dans le substrat de la litière ou qui, par ailleurs, semble en mauvaise santé ou atypique. Si plus de 20 % des vers jeunes ou adultes d’un récipient de conservation ou d’acclimatation semblent morts, inactifs ou en mauvaise santé durant une période quelconque d’observation, il faudrait se débarrasser du contenu complet du récipient.

Les exigences d’assurance de la qualité pour l’évaluation de la sensibilité des organismes d’essai à l’aide d’une substance de référence connue, décrites au § 2.3.9, doivent également être appliquées aux organismes issus d’un autre laboratoire à utiliser dans un essai^{Note de bas de page 25}. Tous les essais employant un ou des toxiques de référence doivent être effectués dans les conditions et selon les modes opératoires exposés au § 4.4.

Les critères de validité d’un essai particulier de toxicité d’un sol (et, indirectement, de la santé de la population des vers acclimatés) fondés sur les performances des organismes d’essai dans le sol témoin négatif sont exposés dans les § 4.2.3 et 4.3.3.

Section 3 : Système expérimental

3.1 Équipement et appareillage

On doit effectuer les essais dans une chambre climatique ou dans une installation équivalente, possédant des moyens acceptables de régulation de la température et de l’éclairage (v.§ 4.2.2 et 4.3.2). Le laboratoire d’essais devrait être bien ventilé pour empêcher l’exposition du personnel à des émanations nocives et être isolé des causes physiques de perturbation ou de tout contaminant qui pourrait nuire aux organismes d’essai. Le local de préparation des sols d’essai devrait également comporter une hotte et être aéré convenablement.

Le laboratoire d’essais devrait être isolé de l’élevage de vers (§ 2.3) ou du local où ils sont entretenus et acclimatés (§ 2.4), pour éviter une éventuelle contamination. En outre, le laboratoire devrait être éloigné des lieux d’entreposage et de préparation des échantillons, pour prévenir une éventuelle contamination des récipients d’essai et de leur contenu par ces sources. Le système de ventilation devrait être conçu, inspecté et exploité de façon à empêcher l’air de l’intérieur du laboratoire de contaminer les installations d’élevage ou d’entretien et d’acclimatation. L’air vicié des installations de manutention et d’entreposage des échantillons ou de traitement ou d’essai des produits chimiques ne devrait pas être dirigé vers les locaux d’essais du laboratoire.

Tout matériau pouvant entrer en contact avec les organismes, le sol, l’eau ou les récipients d’essai de cette installation doit être non toxique (v. § 2.3.2) et devrait se prêter le moins possible à la sorption de substances chimiques. On devrait utiliser chaque fois que c’est possible le verre borosilicaté, le nylon, le polyéthylène et le polystyrène haute densité, le polycarbonate, les plastiques fluorés, le Téflon^MC, le Nalgene®, la porcelaine, la fibre de verre et l’acier inoxydable 316 pour réduire au minimum la sorption et la désorption de substances. On doit éviter les matériaux toxiques, dont le cuivre, le zinc, le laiton, le métal galvanisé, le plomb et le caoutchouc naturel.

Le laboratoire d’essais doit être doté des instruments de base nécessaires à la surveillance de la qualité (p. ex. température, pH) du sol d’essai et de l’eau d’essai (d’hydratation) à employer avec ce sol. En outre, il devrait être équipé d’appareils assurant l’analyse rapide et fidèle de la teneur en humidité des sols d’essai. Entre autres appareils nécessaires, mentionnons : une étuve, qui peut être réglée à 105 °C pour assécher les sols; une balance précise à 0,1 mg près; un pH-mètre. Il faut, lors de la préparation des mélanges et des aliquotes de sol d’essai, de l’équipement de protection, notamment un respirateur doté d’un appareil de protection contre les poussières, des gants, des vêtements de laboratoire et des verres pour la protection des yeux.

Tous les récipients d’essai, tout l’équipement et toutes les fournitures qui pourraient entrer en contact avec les sols de site, les sols d’essai, l’eau d’essai (d’hydratation), les solutions mères ou les solutions filles (d’essai) doivent être propres et avoir été rincés à l’eau désionisée ou à l’eau distillée (c’est-à-dire à l’eau d’essai) avant usage. Après usage, on devrait laver tous les matériaux réutilisables. On recommande de procéder comme suit pour le nettoyage (EC, 2005b, 2013b, 2014a; ECCC, 2020a)^{Note de bas de page 26} :

1. Faire tremper dans l’eau du robinet (avec ou sans détersif) pendant 15 minutes, puis nettoyer à fond au détersif ou laver dans un lave-vaisselle automatique;
2. Rincer deux fois à l’eau du robinet;
3. Rincer soigneusement à l’acide nitrique (HNO₃) ou chlorhydrique (HCl) fraîchement préparé, dilué (10 %, v/v^{Note de bas de page 27}), garanti sans métal, pour supprimer le tartre, les métaux et les bases;
4. Rincer deux fois à l’eau désionisée (ou à une autre eau d’essai);
5. Rincer une fois à l’acétone non diluée, de qualité convenant à l’analyse des pesticides, pour éliminer les composés organiques, et à l’hexane de qualité « réactif » (p. ex. de qualité « CLHP », pure à 98,5 %, au moins) pour éliminer les résidus huileux (travailler sous hotte)^{Note de bas de page 28};
6. Laisser le solvant organique se volatiliser de la verrerie sous la hotte et relaver la verrerie (en frottant au besoin) au détersif;
7. Rincer trois fois à l’eau désionisée (ou à toute autre eau d’essai).

On devrait rincer à fond les récipients d’essai et l’appareillage susceptibles d’entrer en contact avec le sol ou l’eau d’essai (d’hydratation) avec de l’eau d’essai, immédiatement avant de les utiliser dans l’essai.

3.2 Essais initiaux et essais définitifs

3.2.1 Essais initiaux

Avant d’effectuer pour la première fois des essais définitifs de toxicité d’un sol selon l’une des méthodes exposées dans les § 4.2 ou 4.3, il est recommandé d’effectuer au moins cinq essais témoins pour déterminer la réaction des animaux témoins, en employant au moins un échantillon de sol artificiel ou naturel non contaminé, destiné (ou que l’on envisage de destiner) à servir de sol témoin négatif dans au moins un essai définitif de toxicité de ce sol (v. § 3.3). En outre, au moins cinq essais de toxicité de référence devraient être réalisés en utilisant au moins un échantillon d’un sol témoin négatif naturel ou artificiel que l’on envisage d’utiliser régulièrement à cette fin, en même temps que les essais définitifs de toxicité du sol (v. § 4.4). Ces essais initiaux sont recommandés afin de confirmer les performances acceptables des espèces retenues pour l’essai (E. andrei ou D. rubidus) dans un tel sol témoin négatif (v. § 3.3), dans un laboratoire précis et dans les conditions et modes opératoires d’élevage, d’entretien ou d’acclimatation précisés dans le présent document (v. § 2.3 et 2.4).

Les conditions et modes opératoires de l’exécution de ces essais initiaux employant un sol témoin négatif devraient être identiques et conformes à ceux qui sont exposés dans les § 4.2 (essais de reproduction d’une durée de 56 j) ou 4.3 (essais de réaction d’évitement)^{Note de bas de page 29}. Les conditions et modes opératoires retenus pour exécuter ces essais initiaux de toxicité de référence devraient être identiques et conformes à ceux du 4.4. Chaque essai employant un sol témoin négatif ou un ou des toxiques de référence devrait employer un lot (groupe) différent d’organismes de la même espèce de la même source.

Les résultats des essais (n ≥5) de détermination de la réaction des animaux doivent montrer que le ou les critères de validité (v. § 4.2.3 et 4.3.3) peuvent être respectés pour l’espèce que l’on prévoit d’utiliser avec un sol naturel ou artificiel destiné à servir de sol témoin négatif dans un essai définitif de toxicité du sol. Les résultats des essais initiaux de toxicité de référence (n ≥5) devraient être comparés par calcul et évaluation du coefficient de variation des séries respectives d’essais et des valeurs des effets mesurés (paramètres ultimes) (v. §4.4).

3.2.2 Essai de reproduction

On doit utiliser des bocaux en verre d’une capacité de 500 ml pour E. andrei et d’une capacité de 250 ml pour D. rubidus comme récipients d’essai. Des bocaux Mason en verre à large ouverture ont été utilisés avec succès comme récipients pour l’essai de reproduction d’une durée de 56 jours. Chaque bocal (neuf ou usagé) doit être nettoyé à fond (v. § 3.1) avant et après usage et être bien rincé à l’eau désionisée ou à une autre eau d’essai immédiatement avant usage. Pour E. andrei, chaque récipient d’essai devrait être recouvert d’un couvercle perforé d’au moins 5 petits trous (p. ex. environ 1-2 mm, afin de minimiser l’évaporation et permettre l’échange d’air) ou d’un morceau de grillage Nitex de 50 μm (v. les conseils du paragraphe suivant pour D. rubidus) et fixé au rebord de chaque bocal à l’aide d’un élastique ou d’un anneau à vis serré sur le récipient d’essai. Si on sait ou pense que le sol renferme des composés volatils (comme des HAP), il est recommandé de recouvrir l’enceinte d’une feuille d’aluminium opaque, tout en assurant un éclairage latéral suffisant pour fournir l’intensité lumineuse minimale dont on a besoin à la surface du sol (v. note 51 du présent paragraphe [4.2.1]).

Pour D. rubidus, chaque récipient devrait être recouvert d’un morceau de grillage Nitex de 50 μm, ou l’équivalent, puis fixé à chaque bocal à l’aide d’un anneau à vis. Chaque récipient et son couvercle devraient ensuite être lâchement recouverts afin de réduire la perte d’humidité par évaporation. Pour ce faire, on place la partie métallique du couvercle du bocal Mason sur le dessus du grillage Nitex et de l’anneau à vis^{Note de bas de page 30}.

3.2.3 Essai de réaction d’évitement

L’appareillage recommandé pour cet essai avec des vers de terre est montré dans la fig. 2^{Note de bas de page 31}. Chaque enceinte expérimentale consiste en un récipient circulaire, d’un diamètre extérieur d’environ 230 mm, muni d’une cheminée centrale, d’un diamètre intérieur d’environ 54 mm, entourée de 6 compartiments sectoriels reliés entre eux, d’une capacité d’environ 350 ml de sol. Des orifices de 1 cm de diamètre percés dans le bas de la paroi de la cheminée (deux par compartiment) et des cloisons latérales de chaque compartiment (trois par côté) permettent le libre mouvement des vers entre la cheminée (dépourvue de substrat) et les compartiments renfermant les sols d’essai et entre les compartiments. On a besoin d’un jeu de six séparations amovibles, de tôle d’acier rigide (v. fig. 2 pour la représentation et les dimensions) pour les glisser le long de chaque cloison, de façon à séparer les compartiments à la fin de l’essai (§ 4.3.6).

Figure 2 Caractéristiques recommandées de l’enceinte devant servir à l’essai de réaction d’évitement employant des vers de terre (E. andrei ou D. rubidus) dans un sol non contaminé ou contaminé

L’appareillage peut être construit de tôle d’acier de qualité (1 à 4 mm d’épaisseur) ou de feuilles de plexiglas^MC (5 à 6 mm d’épaisseur) et comporte un couvercle amovible (également de l’un des deux matériaux) qui n’est pas étanche et permet l’aération des compartiments. Il est recommandé d’employer l’appareillage d’acier inoxydable avec les sols contaminés ou enrichis avec des composés organiques (particulièrement des produits pétroliers), puisque ce matériau absorbe moins les substances organiques que le plexiglas^MC et qu’on peut le rincer à l’acétone et/ou l’hexane sans dommages. Il est recommandé d’employer l’appareillage de plexiglas^MC avec les sols contaminés par les métaux lourds. L’enceinte expérimentale devrait être utilisée selon la description ci-dessus pour E. andrei.

Pour D. rubidus, cependant, l’enceinte expérimentale doit être modifiée en ajoutant un faux fond à chaque segment de l’enceinte expérimentale (v. fig. 3C) afin de réduire le volume de sol requis pour chaque compartiment (v. § 4.3.1)^{Note de bas de page 32}. Un support en acier en forme de U (85 mm de long × 85 mm de haut × 25 mm de long, côtés pliés à des angles de 120°) peut être utilisé à cet effet (v. fig. 3A et 3B). Les cloisons latérales amovibles, utilisées pour séparer les compartiments à la fin de l’essai, peuvent être utilisées pour créer un faux fond pour chaque compartiment (v. fig. 3C).

Figure 3 Modification de l’enceinte expérimentale nécessaire à la réalisation d’un essai de réaction d’évitement employant des vers D. rubidus (A) Faux fond placé dans un compartiment de l’enceinte expérimentale. (B) Faux fond en position dans un compartiment de l’enceinte expérimentale. (C) Deux options pour créer un faux fond dans chaque compartiment de l’enceinte expérimentale.

Comme ces séparations sont légèrement plus hautes que le haut de l’enceinte expérimentale, le couvercle est posé lâchement sur le dessus de l’enceinte expérimentale, ce qui crée un petit espace entre le couvercle et le haut de l’enceinte. S’il y a un espace entre le haut de l’enceinte expérimentale et le couvercle ou entre le bas de l’enceinte expérimentale et la base (c’est-à-dire en raison de la hauteur et/ou de la déformation des faux fonds insérés), une bande de Parafilm devrait être placée autour du couvercle et du côté de l’enceinte et une seconde autour du bas de l’enceinte et de la base en acier pour sceller l’enceinte expérimentale. Cela est important pour empêcher D. rubidus de s’échapper des enceintes expérimentales.

Il faut au moins 5 enceintes expérimentales pour chaque essai de toxicité à une concentration unique ou à des concentrations multiples (ou moins si l’essai à une concentration est uniquement destiné aux fins de dépistage ou d’essai préliminaire), et au moins 2 enceintes expérimentales par concentration d’essai (c’est-à-dire au moins 10 enceintes par essai) pour chaque essai à concentrations multiples (v. § 4.3.1). Chaque enceinte doit être nettoyée à fond avant et après usage et être bien rincée à l’eau désionisée ou à une autre eau d’essai avant usage.

3.3 Sol témoin négatif

Chaque essai de toxicité d’un sol doit comprendre un sol témoin négatif comme variante expérimentale. C’est un sol essentiellement exempt de tout contaminant susceptible de nuire aux vers de terre pendant l’essai. Son emploi permet de mesurer l’acceptabilité de l’essai, de révéler l’état de santé et les performances des organismes d’essai, de s’assurer du caractère convenable des conditions expérimentales et des modes opératoires, tout en servant de base à l’interprétation des données obtenues sur les sols d’essai.

Un essai de toxicité peut utiliser un sol naturel non contaminé et/ou un sol artificiel comme sol témoin négatif. Le choix du sol témoin négatif approprié dépend de considérations telles que le plan de l’étude, les caractéristiques physicochimiques du ou des sols d’essai et la disponibilité d’un sol naturel non contaminé, aux propriétés acceptables^{Note de bas de page 33}. Dans le cas des essais définitifs effectués sur des échantillons de sol prélevés dans la forêt boréale ou la taïga, il est recommandé d’utiliser comme sol témoin négatif un sol naturel non contaminé. Quel que soit le type de sol, on doit posséder des preuves expérimentales préalables (v. § 3.2.1) selon lesquelles le sol choisi pour servir de sol témoin négatif avec les espèces d’expérience choisies satisfera constamment et de façon fiable aux critères de validité des essais définis dans le présent document à l’égard de chaque méthode d’essai (§ 4.2.3 et 4.3.3).

La première édition de ces méthodes d’essai décrites dans la présente publication a été élaborée et éprouvée à l’aide de 5 sols témoins négatifs possédant diverses caractéristiques physicochimiques (Aquaterra Environmental, 1998; Stephenson et al., 1999a, 1999b, 2000a; Aquaterra Environmental et ESG, 2000; ESG 2000, 2001, 2002; ESG et Aquaterra Environmental, 2002). Ces sols non contaminés comprenaient un sol artificiel et quatre sols naturels (c’est-à-dire des échantillons de sols agricoles loameux sableux et loameux limoneux du sud de l’Ontario, d’un sol de prairie loameux argileux de l’Alberta et d’un sol forestier loameux du nord de l’Ontario, dans le Bouclier canadien). Les méthodes d’essai décrites dans la deuxième édition du présent document ont été élaborées pour de nouveaux plans d’expérience (essai de reproduction d’une durée de 56 j et essai de réaction d’évitement d’une durée de 48 h) et pour effectuer des essais de toxicité des sols boréaux à l’aide de D. rubidus et de divers sols propres, y compris : un sol artificiel, un sol agricole standard d’Europe (LUFA 2.2), 2 sols agronomiques (pour E. andrei uniquement), et 7 sols naturels prélevés dans la région boréale du Canada (pour D. rubidus uniquement). Ces sols boréaux comprennent : des podzols humo-ferriques gleyifiés de Terre-Neuve, du Nouveau-Brunswick et de l’Ontario; un luvisol gris foncé, un brunisol eutrique orthique et un brunisol dystrique éluvié de la Saskatchewan; ainsi qu’un tchernoziome régosolique gris foncé de l’Alberta. La composition de ces sols différait quant aux caractéristiques physicochimiques susceptibles d’influer sur le devenir et les effets des contaminants. Tous les sols prélevés sur le terrain provenaient de lieux non contaminés, qui n’avaient pas été exposés à une application directe de pesticide au cours des années antérieures récentes et qui, par conséquent, étaient considérés comme non contaminés. L’origine et les caractéristiques physicochimiques de ces sols naturels sont en outre décrits dans l’annexe H. Les critères de validité des essais employant des E. andrei ou D. rubidus et décrits dans les § 4.2.3 et 4.3.3 se fondent sur les données relatives aux performances de ces vers dans un sol témoin négatif, obtenues dans un sol témoin négatif, données qui ont été obtenus pour chacun des divers sols (EC, 2010; ECCC, 2020b). Pendant l’élaboration de la méthode d’essai de reproduction d’une durée de 56 jours pour D. rubidus, on a observé une tendance à la baisse du nombre de jeunes produits dans certains des horizons pédologiques, souvent, mais non exclusivement, des sols ayant un pH < 4.

3.3.1 Sol naturel

Le sol témoin négatif peut être un sol naturel, prélevé en un endroit non contaminé, réputé pour ne pas avoir été exposé à des applications de pesticides ou d’engrais pendant les cinq années antérieures. L’origine de ce sol témoin négatif pourrait être la même que celle du lieu de capture des vers de terre pour établir un élevage ou obtenir des organismes d’essai (§ 2.2).

Il est recommandé de vérifier en permanence tous les échantillons de sol naturel pouvant servir de sol témoin négatif dans les essais de toxicité des sols afin de s’assurer que les organismes d’essai continuent de répondre aux critères de validité des essais, car il est possible que certains sols témoins naturels se dégradent lorsqu’ils sont entreposés pendant des périodes prolongées (ECCC, 2020b)^{Note de bas de page 34}. Tous les échantillons de sol naturel choisis pour éventuellement servir de sol témoin négatif dans des essais de toxicité d’un sol (de même que des échantillons du sol candidat de référence) doivent être analysés relativement aux caractéristiques physicochimiques suivantes :

• la répartition granulométrique (% de sables, de limons et d’argiles);
• la teneur en carbone organique total (COT) (%)^{Note de bas de page 35};
• la teneur en matière organique (%)^{Note de bas de page 35};
• le pH;
• la conductivité électrique;
• la teneur en humidité;
• la capacité de rétention en eau;
• la capacité d’échange cationique.

En outre, on devrait analyser :

• les anions et cations majeurs (Na⁺, K⁺, Mg²⁺, Ca²⁺, Al³⁺, S^2-, Cl^-);
• l’azote total, nitrate (NO₃^-), nitrite (NO₂^-) et ammonium (NH₄⁺);
• le phosphore phytodisponible ou total;
• le potassium phytodisponible ou total;
• le rapport C/N.

Il est recommandé de procéder aux analyses préalables suivantes pour confirmer que le sol témoin négatif ou le sol de référence ne sont pas contaminés :

• insecticides organophosphorés;
• insecticides organochlorés;
• une série d’herbicides;
• métaux;
• hydrocarbures pétroliers (y compris les HAP);
• autres contaminants préoccupants propres à l’emplacement ou à la région.

Les concentrations de pesticides et de métaux ne devraient pas excéder celles qui sont exposées dans les Recommandations canadiennes pour la qualité des sols, si elles s’appliquent (v. note 33). Si des organismes indigènes sont présents dans l’échantillon ou les échantillons de sol naturel ou qu’ils soulèvent des problèmes à tout moment (p. ex. pendant l’entreposage ou les essais), il faudrait prendre note de ce fait (p. ex. fournir une description physique et indiquer leur nombre estimatif) et enlever si possible ces organismes à la main (par tamisage, notamment). Par ailleurs, la plupart des organismes indigènes peuvent être tués par au moins un ou plusieurs cycles de gel et de dégel si l’on soupçonne qu’ils sont trop petits pour être éliminés à la main (v. note 110 du § 5.3 et 5.6.6 d’EC, 2012). Si les résultats des essais biologiques et des analyses physicochimiques initiaux sont satisfaisants, on peut prélever un plus gros échantillon de ce sol naturel, le faire sécher à l’air pour fixer sa teneur en humidité entre 10 et 20 %, le passer sur un tamis à mailles larges (p. ex. 4 à 10 mm)^{Note de bas de page 36}, le transférer dans des seaux de plastique propres et bien rincés et le conserver à l’obscurité à 4 ± 2 °C jusqu’au moment de l’utilisation. On ne devrait pas utiliser de seaux en plastique pour le prélèvement et l’entreposage des échantillons de sol s’il y a un risque de lixiviation des composantes chimiques du plastique dans le sol.

3.3.2 Sol artificiel

Le sol témoin négatif peut être un sol artificiel préparé au laboratoire. L’emploi de sol artificiel offre une solution normalisée, cohérente et avantageuse pour l’essai de la toxicité de substances ou de produits chimiques ajoutés à un sol témoin négatif (section 6).

Conformément à la composition du sol artificiel utilisé dans quatre autres méthodes d’essai de toxicité des sols d’Environnement Canada et Changement climatique (EC, 2005b, 2013b, 2014a; ECCC, 2020a), on devrait utiliser les ingrédients suivants pour préparer le sol artificiel à utiliser dans les méthodes d’essai biologiques décrites dans le présent document (en fonction de la masse sèche) :

1. 10 % de tourbe à sphaignes, séchée à l’air et passée sur un tamis à mailles de 2 mm, par exemple;
2. 20 % d’argile kaolinique, d’une granulométrie inférieure à 40 μm;
3. 70 % de sable de silice 70.

Les ingrédients (les pourcentages ci-dessus sont exprimés en tant que fraction de la masse sèche) à l’état sec devraient être mélangés avec soin à l’aide d’un agitateur mécanique ou manuellement (porter des gants)^{Note de bas de page 37}. On devrait ajouter au mélange sec du carbonate de calcium de qualité « réactif » en quantité suffisante pour que le pH du sol artificiel se situe entre 6,0 et 7,5, une fois hydraté^{Note de bas de page 38}. Ensuite, on devrait hydrater graduellement le mélange, avec de l’eau d’essai (c’est-à-dire de l’eau désionisée ou distillée) jusqu’à ce que sa teneur en humidité soit d’environ 20 % (ce qui est à peu près 28 % de la capacité de rétention en eau)^{Note de bas de page 39}, tout en poursuivant le mélange jusqu’à ce que le sol soit d’une texture et d’une couleur visiblement uniformes. Au besoin, on devrait ajouter du carbonate de calcium de qualité « réactif » au mélange hydraté, en quantité suffisante pour maintenir un pH variant de 6,0 à 7,5. On devrait conserver les échantillons de sol artificiel au pH ajusté à l’obscurité, à 20 ± 2 ̊C pendant au moins trois jours avant de les utiliser dans un essai de toxicité, pour laisser suffisamment de temps à l’équilibration du pH (v. note 38). Ensuite, on peut entreposer le sol artificiel à 4 ± 2 °C. Quand on en aura besoin pour un essai de toxicité du sol, on devrait hydrater une quantité suffisante du sol artificiel entreposé avec de l’eau d’essai, pour en relever la teneur en humidité à environ 70 % de la capacité de rétention en eau ou jusqu’à ce qu’il ait la texture optimale pour l’essai (c’est-à-dire une consistance grumeleuse homogène avec des grumeaux d’environ 1-3 mm de diamètre; v. § 5.3).

Les échantillons de sol artificiel choisis pour être éventuellement utilisés comme sol témoin négatif dans des essais de toxicité d’un sol doivent être analysés par rapport aux caractéristiques physicochimiques suivantes :

• la répartition granulométrique (% de sables, de limons et d’argiles);
• la teneur en COT (%)^{Note de bas de page 35};
• la teneur en matière organique (%)^{Note de bas de page 35};
• pH
• la conductivité électrique;
• la teneur en humidité;
• la capacité de rétention en eau;
• la capacité d’échange cationique.

Des analyses supplémentaires, telles que celles décrites pour les sols naturels (v. § 3.3.1), peuvent également être effectuées, au besoin.

3.4 Sol témoin positif

On recommande d’employer au moins un échantillon de sol témoin positif dans chaque série d’essais de toxicité d’un sol avec les vers de terre, pour aider à l’interprétation des résultats des essais. On veut ainsi provoquer chez les organismes d’essai une réaction prévisible, à la lumière d’essais antérieurs de toxicité ayant employé cette matière. Le sol témoin positif peut être un échantillon de sol témoin négatif que l’on a enrichi d’un toxique de référence, pour lequel on possède des données sur sa toxicité pour les vers de terre, données rassemblées à la faveur de conditions expérimentales et des modes opératoires spécifiés. Pour chacune des trois méthodes d’essai biologique décrites dans le présent document, il faut utiliser au moins un toxique de référence dans un essai à concentrations multiples ou en tant que répétitions d’un sol témoin positif (c’est-à-dire à une concentration précisée) pour évaluer la sensibilité des organismes d’essai ainsi que la précision et la fiabilité des résultats obtenus par le laboratoire sur cette matière (v. § 4.4). Un essai pourrait également comprendre un échantillon de sol témoin négatif (naturel ou artificiel; v. § 3.3) ayant été ajouté, à des fins expérimentales (section 6) d’une ou de plusieurs substances ou produits chimiques toxiques présentant un intérêt particulier pour l’évaluation de l’échantillon ou des échantillons de sol d’essai, à une concentration toxique pour les vers de terre, selon la méthode d’essai biologique à utiliser. Dans certains cas, l’essai pourrait comprendre un sol témoin positif constitué d’un échantillon fortement contaminé de sol ou de boue prélevé sur le terrain s’étant révélé constamment toxique pour les vers de terre selon la méthode d’essai biologique à utiliser^{Note de bas de page 40}.

3.5 Sol de référence

On pourrait inclure un ou plusieurs échantillons de sol de référence dans un essai de toxicité d’un sol employant des vers de terre. Le type et la nature de l’échantillon ou des échantillons de sol utilisé comme sol de référence dans une étude particulière dépendent du plan d’expérience et des objectifs de l’étude. Si on étudie la toxicité des échantillons de sol prélevés sur le terrain dans un lieu effectivement ou potentiellement contaminé, le sol de référence englobé dans l’étude pourrait être constitué d’au moins un échantillon de sol prélevé sur le terrain, dans un endroit non contaminé, où les propriétés physicochimiques (p. ex. la teneur en carbone organique total, la teneur en matière organique, la répartition granulométrique, la texture, le pH, la conductibilité électrique) représentent autant que possible l’échantillon ou les échantillons de sol d’essai (contaminé). Idéalement, on prélève le sol de référence se trouvant près du lieu ou des lieux de prélèvement des échantillons de sol d’essai, mais à l’écart de la ou des sources de contamination. On pourrait choisir un ou plusieurs échantillons de sol de référence non contaminé prélevé sur le terrain, près du ou des lieux à l’étude, en raison de son innocuité, avérée au cours d’essais antérieurs ayant employé des vers de terre, et de ses caractéristiques physicochimiques, semblables à celles des échantillons du sol d’essai. Les sols de référence de la forêt boréale et de la taïga doivent être échantillonnés par horizon pédologique dans toute la mesure du possible. Chaque échantillon doit ensuite être entreposé et mis à l’essai individuellement (en d’autres termes, chaque horizon doit être traité comme un échantillon distinct) (v. § 5.1 et EC, 2012). L’échantillon ou les échantillons de sol de référence prélevés sur le terrain, utilisés dans une étude, pourraient être soumis à un essai pour déterminer leurs effets toxiques uniquement à l’état non dilué ou on pourrait les mélanger avec l’échantillon ou les échantillons de sol d’essai pour préparer une série de dilutions à englober dans un essai à concentrations multiples^{Note de bas de page 41} (v. § 3.6, 4.1, 5.3 et 5.6.1). Les échantillons de sol de référence ne devraient pas être prélevés dans des endroits que l’on sait avoir reçu des applications de pesticides ou d’engrais au cours des cinq années antérieures, au moins.

On pourrait choisir d’englober un ou plusieurs échantillons de sol artificiel comme sol de référence dans un essai particulier. Par exemple, on pourrait les utiliser dans des essais à concentrations multiples, avec des sols de site ou des sols enrichis avec une substance chimique pour étudier l’influence de certaines caractéristiques physicochimiques (p. ex. un certain nombre de sols de référence artificiels préparés pour fournir une gamme de valeurs pour la texture et/ou le taux de matière organique (%); Sheppard et Evenden, 1998; Stephenson et al., 2002) sur la toxicité du sol de site contaminé ou d’un sol enrichi avec une substance chimique. On pourrait également utiliser à cette fin des échantillons multiples d’un sol non contaminé, prélevé sur le terrain en divers endroits, qui diffèrent nettement, pour ce qui concerne une ou plusieurs caractéristiques physicochimiques. Pour une telle étude, on devrait inclure dans l’essai, sans la diluer (c’est-à-dire du sol de référence à 100 %), une partie de chaque sol de référence employé dans la préparation d’une série de concentrations du sol d’essai.

Chaque essai employant un ou plusieurs échantillons de sol de référence doit comprendre un échantillon de sol témoin négatif (v. § 3.3). Inversement, certains essais (p. ex. un essai comportant une série de concentrations d’un sol enrichi avec une substance chimique et préparé au moyen d’un sol témoin négatif artificiel ou naturel) n’ont pas besoin d’un échantillon de sol de référence. Pour les essais employant le sol de site, il est préférable d’inclure un ou plusieurs échantillons de sol de référence d’un lieu voisin, pour les besoins de la comparaison (v. § 5.6); la décision de diluer le sol de site avec le sol de référence (plutôt qu’avec un sol témoin négatif) lors de la préparation de dilutions multiples à des fins expérimentales dépend des objectifs de l’étude.

3.6 Sol d’essai

Les méthodes d’essai biologique exposées dans le présent document visent à mesurer la toxicité d’un ou de plusieurs échantillons ou mélanges de sol effectivement ou potentiellement contaminé (sol d’essai), en employant des vers de terre. L’échantillon ou les échantillons de sol d’essai pourraient être soit un sol prélevé sur le terrain, sur un emplacement industriel ou autre auquel on s’intéresse, ou des biosolides industriels ou urbains (p. ex. déblais de dragage, boues urbaines d’une station d’épuration des eaux usées, compost ou fumier) dont on envisage l’épandage. On pourrait soumettre à l’essai une seule concentration du sol prélevé sur le terrain (habituellement non dilué), ou en évaluer la toxicité dans un essai à concentrations multiples, préparées par mélange de quantités mesurées avec soit un sol témoin négatif, soit un sol de référence (v. section 5).

Le fait de prélever des échantillons de sol par horizon permet de tenir compte de la stratification de la contamination attribuable, en partie, à la spéciation des contaminants et à leur mobilité résultante (EC, 2012). C’est pourquoi il faut prélever par horizon les échantillons de sol de référence et de sol contaminé provenant des écozones de la région boréale ou de la taïga. Les sols prélevés par horizon doivent être traités comme des échantillons individuels et mis à l’essai séparément (v. § 4.1). L’échantillonnage des sols dont les horizons pédologiques sont indistincts (p. ex. dont les horizons superficiels ont été mélangés ou perturbés par des activités anthropiques) devrait se faire en fonction de la profondeur (v. § 5.1). Le sol pourrait également être constitué d’une concentration unique ou de concentrations multiples d’un sol enrichi avec une substance chimique, préparées au laboratoire par mélange d’une ou de plusieurs substances ou produits chimiques avec un sol témoin négatif, un sol de référence ou le sol de site (v. section 6). La section 5 fournit des conseils sur le prélèvement, la manipulation, les analyses et les essais liés aux sols prélevés sur le terrain.

Section 4 : Modes opératoires universels

Les conditions et les modes opératoires généraux décrits dans cette section à l’égard de chacune des deux méthodes d’essai biologique employant des vers de terre s’appliquent lorsque l’on détermine la toxicité d’échantillons de sols, de déchets particulaires ou de substances chimiques. Ils s’appliquent également aux essais de toxicité de référence connexes. Dans la section 5, on expose des modes opératoires plus particuliers d’essais avec des échantillons prélevés sur le terrain de sols ou d’autres matières particulaires semblables (p. ex. de boues, de stériles déshydratés, de résidus de boues de forage, de compost, de biosolides). Dans la section 6, on donne des conseils et on expose les modes opératoires précis permettant d’effectuer les essais avec un sol témoin négatif ou d’autres sols enrichis, à des fins expérimentales, avec un ou plusieurs produits ou substances chimiques. Des indications particulières ayant trait à la réalisation d’essais sur des sols de la région boréale et de la taïga ont été intégrées dans l’ensemble de la présente méthode d’essai.

Dans ces modes opératoires universels, il faut intégrer tous les aspects du système expérimental décrit dans la section 3. Les conditions et modes opératoires décrits dans la section 2 à l’égard de l’élevage et de l’acclimatation d’E. andrei et de D. rubidus, en vue des essais de toxicité d’un sol s’appliquent également.

4.1 Préparation des sols d’essai

Chaque récipient d’essai (v. § 3.2.2) ou enceinte utilisée pour l’essai de réaction d’évitement (v. § 3.2.3) du laboratoire doit être clairement codé ou étiqueté pour permettre l’identification de l’échantillon et (si celui-ci est dilué) la détermination de sa concentration. Pour l’essai de réaction d’évitement (v. § 4.3), chacun des six compartiments de chaque enceinte (v. § 3.2.3) doit également être codé (p. ex. identifié par des chiffres ou des lettres) ou par ailleurs marqué pour distinguer le sol d’essai qu’il renferme. Il faut consigner la date et l’heure du début de l’essai, soit directement sur les étiquettes, soit sur des feuilles de données distinctes réservées à l’essai.

La première journée d’exposition des vers de terre aux échantillons de matières ou de substances d’essai est appelée jour 0. La veille (c’est-à-dire au jour − 1), on devrait mélanger à fond chaque échantillon ou sous-échantillon de sol d’essai ou de matière particulaire semblable, y compris le sol témoin négatif et, le cas échéant, le sol de référence^{Note de bas de page 42} (v. § 5.3 et 6.2) pour obtenir un mélange homogène en ce qui concerne la couleur, la texture et la teneur en humidité. Si on prépare, en vue d’un essai, des échantillons prélevés sur le terrain du sol de site, on devrait le débarrasser, avant le mélange, des grosses particules (p. ex. pierres, chaume, brindilles, débris) ainsi que de toute végétation ou de tout invertébré macroscopique (v. § 5.3). En cas de préoccupations concernant la volatilisation, la dégradation ou le métabolisme des contaminants ou des substances chimiques dans les sols d’essai, l’essai peut être démarré immédiatement après la préparation du sol d’essai (v. §6.2).

La quantité de chaque sol d’essai ou d’horizon pédologique que l’on mélange en tant que lot devrait suffire pour préparer les répétitions de cette variante expérimentale (v. tableaux 3 et 4) et englober, en plus, une quantité supplémentaire destinée aux analyses physicochimiques à effectuer (§ 4.2.5 et 4.3.5) plus un excédent pour tenir compte de la fraction inutilisée de sol qui adhère aux parois du récipient de mélange. On devrait connaître ou mesurer la teneur en humidité (%) de chaque sol d’essai et on devrait l’ajuster, au besoin, en mélangeant au sol de l’eau d’essai (ou, si besoin est, en déshydratant l’échantillon) jusqu’à l’obtention du taux souhaité d’humidité (v. § 5.3 et 6.2). On peut quantifier l’homogénéité d’un lot en prélevant des aliquotes du mélange pour des mesures telles que l’analyse granulométrique, le COT (%), la matière organique (%), la teneur en humidité (%) et une ou plusieurs substances particulières.

Dans le cas des sols échantillonnés par horizon (p. ex. sols de la région boréale ou de la taïga), chaque horizon doit être préparé et mis à l’essai séparément dans des essais définitifs individuels^{Note de bas de page 43}. Pour les sols soumis à des essais à concentrations multiples, il faudrait mélanger chaque horizon de sol d’essai avec l’horizon correspondant du sol témoin négatif ou de référence (v. § 5.3) aux diverses concentrations prévues (p. ex. 0 %, 6,25 %, 12,5 %, 25 %). Dans certains cas, il pourrait être impossible de prélever les mêmes horizons de sol témoin négatif et de sol d’essai. Par exemple, un sol témoin négatif peut être prélevé par horizon, mais non pas le sol d’emplacement parce qu’un ou des horizons de sol d’essai en sont absents ou sont mélangés. Il faudrait alors préparer les concentrations en mélangeant le poids qui convient de sol d’essai et l’horizon (il peut y en avoir plus d’un) disponible du sol témoin négatif aux concentrations voulues.

Pour tout essai à concentrations multiples devant être exécuté conformément aux modes opératoires exposés ci-après (v. § 4.2 et 4.3), on devrait choisir les concentrations de façon à couvrir un grand intervalle, c’est-à-dire une faible concentration n’ayant aucun effet (comme la concentration du témoin négatif) et une concentration forte qui produit tous les effets ou des effets graves. Si la concentration anticipée correspondant à l’effet à mesurer est encadrée par une série de concentrations très rapprochées, elles pourraient toutes se révéler soit trop faibles, soit trop fortes. Pour conserver le large intervalle de concentrations et, également, pour obtenir les importants effets médians, on pourrait devoir utiliser des variantes expérimentales supplémentaires pour subdiviser plus finement l’intervalle choisi. En tout cas, on devrait utiliser une suite géométrique constante (v. annexe G). On trouve, dans EC (2005a), des conseils supplémentaires sur le choix des concentrations d’essai.

Lorsque l’incertitude entourant la toxicité d’un échantillon est appréciable, il pourrait être avantageux de procéder à un essai préliminaire pour choisir plus précisément les concentrations à utiliser dans l’essai définitif. Pour un essai préliminaire, une large gamme de concentrations peut être mise à l’essai en utilisant moins de répétitions (p. ex. un seul récipient d’essai ou une seule enceinte servant à l’essai de réaction d’évitement) par concentration (v. § 4.2.1 et 4.3.1).

4.2 Essai de reproduction

Cette méthode d’essai biologique mesure les effets d’une exposition de vers de terre (E. andrei ou D. rubidus élevés en laboratoire) à un sol contaminé sur le succès de leur reproduction^{Note de bas de page 44}.

Le tableau 3 présente une liste de contrôle sommaire des conditions et modes opératoires exigés et recommandés, d’application universelle, pour chaque essai employant des échantillons de sol effectivement ou potentiellement contaminés ainsi que des conditions et modes opératoires recommandés pour l’essai de types précis de matières ou de substances. Ces matières ou substances pourraient comprendre des échantillons du sol de site (y compris des sols de la région boréale et de la taïga), de biosolides mélangés au sol (p. ex. déblais de dragage, boues d’une station d’épuration des eaux usées, compost, fumier) ou un sol témoin négatif (ou un autre sol, contaminé ou non) enrichi au laboratoire d’une ou de plusieurs substances ou produits chimiques d’essai. Au départ, cette méthode a été mise au point sous la houlette de l’ISO (1991, 1998) et de l’OCDE (OECD, 2000) pour l’exécution d’essais sur les effets d’un sol enrichi avec une substance chimique sur la reproduction d’E. andrei (v. annexe G). Elle a été mise à jour sur la base des commentaires reçus après 16 ans d’utilisation par les laboratoires canadiens ainsi que des recherches menées à Environnement et Changement climatique Canada aux fins d’amélioration de la variabilité et de l’efficacité de la méthode, et aux fins d’inclusion d’une espèce boréale (D. rubidus) (v. annexe E).

Les modes opératoires universels de l’essai de mesure des effets sur la reproduction des vers de terre sont décrits dans la présente section. Il s’agit d’un essai de toxicité d’un sol entier, lequel n’est pas renouvelé pendant les 56 jours (c’est-à-dire statique). Ce dernier débute par le prélèvement de vers de terre adultes dans des élevages d’E. andrei ou de D. rubidus de laboratoire (c’est-à-dire élevés au laboratoire effectuant l’essai ou issus de l’élevage d’un autre laboratoire d’essais de toxicité et acclimatés dans le laboratoire d’essais avant leur utilisation dans l’essai; v. § 2). Le plan d’expérience prévoit un certain nombre de récipients d’essai (répétitions) par variante expérimentale, avec quatre vers adultes par récipient. Après 28 jours (4 semaines) d’exposition des vers adultes, on retire les adultes et on consigne le nombre de vers survivants dans chaque récipient et dans chaque variante expérimentale^{Note de bas de page 45}. On poursuit l’essai pendant encore 28 jours sans la présence de vers adultes pour mesurer les effets sur la production de la progéniture (c’est-à-dire le nombre de vers jeunes). Tout au long de l’essai de 56 jours, on nourrit les vers adultes et leur progéniture.

Tableau 3. Liste de contrôle des conditions et des modes opératoires recommandés et exigés pour les essais visant à mesurer les effets d’une exposition de vers de terre (E. andrei ou D. rubidus) à un sol contaminé sur leur reproduction

Mode opératoire universel
Type d’essai	Essai de toxicité d’un sol entier, sans renouvellement du milieu (essai en conditions statiques).
Durée de l’essai	≥ 56 jours
Organismes d’essai	E. andrei ou D. rubidus d’élevage en laboratoire, adultes, dotés d’un clitellum; poids humide individuels : 250-600 mg pour E. andrei ou 50-200 mg pour D. rubidus; choisir des vers dont le poids humide est aussi semblable que possible; acclimater les vers pendant au moins 7 jours dans un sol témoin négatif contenant la même nourriture que celle utilisée dans l’essai; 4 vers par répétition (récipient d’essai).
Nombre de répétitions	Pour les essais à concentrations multiples : au moins 5 répétitions par variante expérimentale; chaque répétition emploie quatre vers dans chaque récipient d’essai. Pour les essais à concentration unique, le nombre minimal de répétitions dépend de l’espèce à l’étude et de l’ampleur cible avec effet (v. § 4.2.1 et 5.6.2); chaque répétition emploie quatre vers dans un récipient d’essai.
Nombre de concentrations	Pour les essais à concentrations multiples : ≥7 concentrations, plus le ou les témoins; on en recommande davantage (≥10).
Sol témoin négatif	Selon le plan et les objectifs de l’étude; sol artificiel ou sol prélevé sur le terrain et non contaminé si l’essai porte sur les sols de site; pour les essais portant sur des substances ou des produits chimiques ajoutés à un sol, on recommande d’employer un sol artificiel.
Récipient d’essai	Bocaux de verre propres; 500 ml pour E. andrei ou 250 ml pour D. rubidus; pellicule perforée (p. ex. couvercle perforé ou grillage Nitex), assujetti avec une bande élastique.
Quantité de sol par récipient d’essai	Poids humide identique, équivalant à un volume d’environ 350 ml pour E. andrei ou d’environ 200 ml for D. rubidus.
Humidité des sols d’essai	Pour préparer le sol, hydrater le sol au taux optimal de sa capacité de rétention en eau (CRE) si le sol a été prélevé sur le terrain (v. § 5.3) ou jusqu’à environ 70 % de la CRE, si c’est un sol artificiel (v. § 3.3.2 et 6.2); pendant l’essai, hydrater au besoin.
Température ambiante	20 ± 2 °C, moyenne journalière; 20 ± 3 °C, température instantanée.
Éclairage	Par incandescence, fluorescent ou DEL; intensité : 400-800 lux en un point adjacent à la surface du sol dans le récipient d’essai; photopériode fixe : (p. ex. 16 h de lumière; 8 h d’obscurité ou 12 h de lumière; 12 h d’obscurité).
Alimentation	Magic® Worm Food ou céréales mixtes biologiques; 2 g pour E. andrei ou 1 g pour D. rubidus par récipient d’essai à chaque distribution de nourriture; les jours 0, 14, 28 et 42 uniquement; déposer la nourriture dans une petite dépression au centre du sol de chaque récipient d’essai, humidifier avec de l’eau déionisée et recouvrir d’une mince couche de terre.
Mesures pendant l’essai	Température ambiante dans l’installation d’essai, quotidiennement ou en continu; humidité, pH et conductivité électrique (au besoin) du sol à chaque variante expérimentale ou à chaque concentration : au début et à la fin de l’essai.
Observations pendant l’essai	Le nombre total de vers adultes vivants dans récipient d’essai, aux jours 0 et 28; facultativement, le nombre de vers adultes vivants et morts, sur le sol de chaque récipient d’essai au début de l’essai (t = 1 h) et au jour 28; le nombre de jeunes vers vivants dans chaque récipient d’essai au jour 56; les symptômes pathologiques évidents (p. ex. plaies) ou franches anomalies du comportement (p. ex. léthargie) des vers dans chaque récipient d’essai; présence excessive de moisissures ou de champignons, présence et quantité de nourriture non consommée et « teneur en humidité » apparente du sol, toutes les deux semaines, lors de la distribution de nourriture.
Effet biologique mesuré	Le nombre de vers adultes vivants dans chaque répétition (c’est-à-dire dans chaque récipient d’essai) au jour 28; le nombre de vers jeunes vivants dans chaque répétition au jour 56; mesures facultatives de la biomasse des vers jeunes vivants dans chaque répétition au jour 56.
Paramètres statistiques	Le taux moyen (± ET) de survie des adultes à chaque variante expérimentale, au jour 28; le nombre moyen (± ET) de jeunes vivants dans chaque variante expérimentale, au jour 56; le nombre moyen (± ET) de jeunes vivants par adulte dans le ou les témoins, au jour 56; si l’essai est à concentrations multiples : la CL50 après 28 jours, pour les vers adultes (lorsque les données le permettent); la CIp sur 56 jours pour le nombre de jeunes vivants produits à chaque concentration pendant l’essai.
Validité de l’essai	Essai non valide si : le taux moyen de survie des adultes, après 28 jours, dans le sol témoin négatif est inférieur à 90 %; le taux moyen de reproduction des adultes dans le sol témoin négatif est inférieur à 3 jeunes vivants par adulte.
Essai avec un toxique de référence	Choisir entre un essai avec une concentration témoin positive ou un essai toxicologique de référence à concentrations multiples : Si l’on choisit l’essai avec concentration témoin positive, il doit être effectué parallèlement à chaque essai définitif; utiliser de l’acide borique (H3BO3) ou un produit semblable; préparer et mettre à l’essai au moins 5 répétitions d’une concentration prédéterminée, en utilisant un sol artificiel comme substrat; 4 vers par répétition; suivre les conditions et modes opératoires décrits au § 4.4 et à l’annexe H; déterminer le pourcentage de réduction de la production de jeunes (en tant pourcentage de la réponse dans le groupe témoin) à la fin de l’essai (c’est-à-dire au jour 56). Si l’on choisit l’essai toxicologique de référence à concentrations multiples, il doit être effectué deux fois par an; utiliser de l’acide borique (H3BO3) ou un produit semblable; préparer et mettre à l’essai au moins 5 concentrations plus un témoin négatif, en utilisant un sol artificiel comme substrat; au moins 5 répétitions par concentration et 4 vers par répétition; suivre les conditions et modes opératoires décrits au § 4.4; déterminer la CE50 sur 56 jours pour l’inhibition du nombre de jeunes (avec des limites de confiance à 95 %); exprimer en milligrammes d’acide borique par kilogramme sec; les critères de validité sont les mêmes que ceux de l’essai définitif.
Sol prélevé sur le terrain
Transport et entreposage	Conserver dans un récipient de plastique étanche ou autre matériau approprié et réduire au minimum l’espace libre; les étiqueter ou les coder; transporter à l’obscurité (p. ex. dans une glacière opaque, un seau de plastique ou un autre récipient opaque); ne pas congeler ni surchauffer pendant le transport; conserver à l’obscurité, à 4 ± 2 °C; l’essai devrait débuter dans un délai de deux semaines et il doit débuter dans un délai de six semaines, à moins qu’il ne soit établi que les contaminants du sol sont stables.
Sol témoin négatif	Sol naturel, prélevé sur le terrain, non contaminé ou sol artificiel, pour lequel des essais antérieurs d’une durée de 56 jours, effectués avec l’espèce d’expérience, ont révélé que tous les critères de validité de l’essai pouvaient être régulièrement respectés; analysé pour déterminer, au minimum, les éléments suivants : granulométrie (pourcentage de sable, de limon, d’argile), COT (%), MO (%), pH, conductivité électrique, teneur en humidité (%), CRE et CEC.
Sol de référence	Un ou plusieurs échantillons pour les essais portant sur un sol prélevé sur le terrain; prélevé dans un ou des endroits que l’on présume ne pas être contaminés, mais près du lieu de prélèvement du sol d’essai; les caractéristiques (p. ex. TMO [%], MO [%], granulométrie, texture, pH et conductivité électrique) sont semblables à celles du ou des sols d’essai; analysé conformément à la description concernant le sol témoin négatif naturel.
Caractérisation des sols d’essai	Doit au moins inclure : humidité (%), CRE, pH, conductivité électrique, COT (%), MO (%), granulométrie (pourcentage de sable, de limon et d’argile) et CEC; devrait au moins inclure : azote, phosphore, potassium, ratio C/N, cations et anions majeurs; facultatif : densité apparente, carbone inorganique total, matières volatiles totales, demande biochimique en oxygène, demande chimique en oxygène, potentiel d’oxydoréduction, sels solubles, oxydes métalliques, taux d’adsorption du sodium, contaminants préoccupants (p. ex. métaux, HAP, pesticides) et caractéristiques de la contamination (p .ex. odeur, taches, débris, présence de carburant ou de solvant).
Préparation des sols d’essai	Au besoin, retirer les débris et les organismes macroscopiques indigènes à l’aide d’une pincette; au besoin, passer doucement, au travers d’un tamis au maillage convenable (p. ex. 4-10 mm); homogénéiser; mesurer la teneur en humidité des sols et la CRE; hydrater à l’eau d’essai (ou, au besoin, déshydrater) pour obtenir le taux optimal de la CRE (v. § 5.3); mélanger; diluer avec du sol témoin ou du sol de référence, s’il s’agit d’un essai concentrations multiples; s’assurer de son homogénéité.
Sol enrichi de substance(s) ou de produit(s) chimique(s)
Sol témoin négatif	Sol artificiel ou sol prélevé sur le terrain, non contaminé, pour lequel des essais antérieurs d’une durée de 56 jours, effectués avec l’espèce d’expérience, ont révélé que tous les critères de validité de l’essai pouvaient être régulièrement respectés; analysé pour déterminer, au minimum, les éléments suivants : granulométrie (pourcentage de sable, de limon, d’argile), COT (%), MO (%), pH, conductivité électrique, teneur en humidité (%), CRE et CEC.
Caractérisation de la substance ou du produit chimique	On devrait obtenir au préalable des renseignements sur la concentration des ingrédients actifs et des impuretés, la solubilité dans l’eau, la pression de vapeur, la stabilité, les constantes de dissociation, les coefficients d’adsorption, la toxicité pour l’Homme et les organismes terrestres, ainsi que la biodégradabilité de la substance ou du produit chimique ajouté au sol témoin négatif.
Solvant	Le solvant préférable est l’eau désionisée; si on utilise un solvant organique, l’essai doit comprendre un sol témoin de ce solvant en plus d’un sol témoin négatif.
Préparation de mélanges	Le mode opératoire dépend de la nature de la substance ou des substances à analyser ainsi que du plan d’expérience et des objectifs de l’essai; on peut préparer des mélanges de substances chimiques et de sol par agitation manuelle ou mécanique; la ou les substances d’essai peuvent être ajoutées en quantités mesurées en solution (c’est-à-dire dans l’eau ou dans un solvant organique) ou sous forme solide, à l’état pur ou non; assurer l’homogénéité des mélanges.
Concentration, dans le mélange de sol, de la ou des substances chimiques ajoutées.	Normalement, mesurée au début et à la fin de l’essai, en trois titres au moins : élevé, moyen et faible.

* Les renseignements contenus dans ce tableau ne sont qu’un résumé. Les exigences et recommandations définitives de cette méthode d’essai figurent dans le corps du présent document.

4.2.1 Début de l’essai

Les récipients d’essai utilisés sont des bocaux de verre propres et convenablement étiquetés de 500 ml pour E. andrei et de 250 ml pour D. rubidus (§ 3.2.2).

Tous les sols d’essai, témoins négatifs, de référence et témoins positifs doivent être préparés conformément à la description au § 4.1. Immédiatement après le mélange d’un lot, on doit transvaser, dans chaque récipient d’essai (répétition), un poids humide identique de sol équivalant à un volume de 350 ml environ pour E. andrei ou de 200 ml environ pour D. rubidus^{Note de bas de page 46} (§ 3.2.2). Le volume de sol dans chaque récipient d’essai (répétition) doit être le même. On devrait égaliser la surface du sol ajouté à chaque récipient (mais sans la comprimer) à l’aide d’une cuiller ou d’une spatule ou en tapotant doucement le récipient d’essai contre le dessus de la paillasse ou avec la main.

Pour un essai à concentration unique (p. ex. sur un sol d’essai non dilué, sur un sol d’essai avec une concentration particulière), le nombre minimal de répétitions doit être basé sur l’espèce de ver de terre choisie et l’ampleur cible avec effet. Pour E. andrei, le nombre minimal requis est de 21 pour la détection d’une ampleur d’effet de 40 % ou de 13 pour la détection d’une ampleur d’effet de 50 %. D’autres répétitions sont recommandées (v. § 5.6.2). Pour D. rubidus, le nombre minimal requis est de 13 pour la détection d’une ampleur d’effet de 30 %, de 7 pour la détection d’une ampleur d’effet de 40 % ou de 5 pour la détection d’une ampleur d’effet de 50 %. D’autres répétitions sont recommandées (v. § 5.6.2). Les décisions relatives au nombre minimal de répétitions sont fondées sur le calcul de la puissance, l’objectif étant d’atteindre une puissance de 80 %. Dans le cas d’un sol d’emplacement, les répétitions devraient être constituées des échantillons réitérés prélevés individuellement dans un lieu d’échantillonnage donné (v. § 5.1)^{Note de bas de page 47}.

Pour un essai à concentrations multiples, il faut préparer au moins 5 récipients d’essai (répétition) par sol témoin négatif et au moins 5 récipients d’essai (répétition) par variante expérimentale. Pour tout essai visant à estimer la concentration inhibitrice à tel pourcentage d’effet (CIp) dans un essai définitif à concentrations multiples, on doit préparer au moins 7 concentrations plus une ou des variantes expérimentales témoins; il est toutefois recommandé d’en prévoir un plus grand nombre (au moins 10, plus une ou des variantes expérimentales témoins) pour améliorer la probabilité d’encadrer chaque paramètre^{Note de bas de page 48}. Si un essai préliminaire est effectué avant l’essai définitif, on peut utiliser moins de concentrations dans l’essai définitif, car on disposera de plus de données sur la gamme de concentrations/dilutions avec effet (v. § 4.1).

Il est recommandé d’inclure dans l’essai au moins un récipient d’essai supplémentaire renfermant un sol témoin négatif et un autre renfermant un sol de référence et/ou la plus faible concentration de sol d’essai (s’il s’agit d’un essai à concentrations multiples). Ces répétitions supplémentaires, dont on n’analysera pas les résultats et pour lesquels on n’est pas tenu de signaler ces derniers, sont utiles à l’évaluation préliminaire de la production, acceptable ou non, de jeunes dans ces variantes expérimentales au jour 28 (v. § 4.2.3 et 4.2.5)^{Note de bas de page 49}. Si, au jour 28, la production de jeunes n’y est pas acceptable, on peut choisir de prolonger la durée d’exposition des adultes dans les récipients d’essai utilisés pour l’essai définitif, de 28 à 35 jours (v. § 4.2.5), auquel cas la durée de l’essai serait de 63 jours plutôt que de 56^{Note de bas de page 50}.

Après l’ajout d’une aliquote mesurée du sol d’essai dans chaque récipient d’essai, on devrait recouvrir cette dernière d’une pellicule non perforée (v. § 3.2.2) afin de réduire au minimum la perte d’humidité. On devrait maintenir les récipients d’essai dans les conditions expérimentales de température et d’éclairage pendant la nuit (§ 4.2.2) pour permettre l’équilibration chimique des sols d’essai (p. ex. sol enrichi avec une substance chimique ou sol d’un emplacement dilué avec du sol témoin). Au jour 0 (c’est-à-dire au démarrage de l’essai), on devrait perforer chaque pellicule pour permettre l’aération^{Note de bas de page 51}.

Le jour suivant la préparation du sol (au jour 0 de l’essai), on transfère les organismes d’essai (v. § 2.3.8) dans chaque récipient d’essai. Pour chaque répétition de l’essai, il faut utiliser quatre vers adultes (au clitellum complètement développé), d’une taille acceptable (c’est-à-dire dont le poids humide individuel est de 250 à 600 mg pour E. andrei et de 50 à 200 mg pour D. rubidus). Les adultes utilisés doivent avoir été élevés et acclimatés pendant au moins sept jours, comme il est décrit aux sections 2.3.8 et 2.4. On devrait retirer du récipient d’essai (ou récipients) devant fournir le nombre adéquat d’organismes requis un nombre excédentaire de vers par rapport aux besoins pour l’essai. Les vers choisis pour l’essai devraient être de tailles (c’est-à-dire de poids humide initial) aussi semblables que possible, d’après l’intervalle des poids humide individuels des vers de l’élevage dont ils proviennent. On ne devrait choisir que les vers semblant en bonne santé, dont la couleur est semblable et qui sont actifs lorsqu’on les retire de la litière. Les vers de terre devraient être choisis dans un récipient d’essai, en être retirés à la main (gantée) ou au moyen d’une ou des deux branches émoussées d’une pincette incurvée et on devrait les transférer rapidement dans un plat peu profond ou un plateau propre où on les rince rapidement à l’eau d’essai non contaminée (c’est-à-dire de l’eau désionisée ou distillée). Ensuite, on dépose les vers dans un récipient de transfert (p. ex. un plateau de verre ou d’aluminium mesurant environ 10 × 10 cm) doublé d’essuie-tout humecté d’eau d’essai. On devrait observer une dernière fois les vers de ce récipient pour s’assurer que leur aspect est normal. On devrait se débarrasser de tout ver atypique. Ensuite, on devrait soigneusement choisir les vers, un à la fois, de tailles aussi semblables que possible, tout en s’assurant qu’ils se trouvent dans l’intervalle acceptable de tailles, puis on les dépose individuellement (à la main ou à l’aide des branches émoussées d’une pincette à extrémité incurvée) sur la surface du sol dans chaque récipient d’essai. L’introduction des vers dans les récipients d’essai devrait être décidée au hasard, pour ce qui est des répétitions et des variantes expérimentales.

On dépose les vers à la surface du sol d’essai de chaque récipient d’essai, à raison de quatre vers par récipient. On devrait consigner, pour chaque récipient d’essai, le nombre de vers n’ayant pas pénétré dans sol de chaque bocal une heure après leur introduction^{Note de bas de page 52}. On devrait disposer les récipients d’essai de manière à faciliter les observations et les mesures. Les variantes expérimentales devraient être réparties au hasard dans l’installation d’essai, et il faudrait changer régulièrement l’emplacement des récipients pendant l’essai (p. ex. toutes les deux semaines, au hasard) (EC, 2005b, 2013b, 2014a; ECCC, 2020a). Les dates et heures de préparation des sols témoins et d’essai ainsi que les dates d’ajout des organismes dans les récipients d’essai doivent être consignées et signalées.

Il faut mesurer et consigner les poids humides individuels d’au moins 20 vers au moment de leur introduction dans les récipients d’essai, pour déterminer la variabilité de la taille initiale des vers utilisés dans l’essai. Ces poids peuvent être fondés sur le poids des vers individuels représentant les diverses variantes expérimentales au moment ils sont pesés et transférés dans les récipients d’essai, ou sur celui des vers excédentaires appartenant au groupe choisi pour l’essai. Il faut calculer et signaler (section 7) le poids moyen (± ET) de ces vers.

4.2.2 Conditions expérimentales

• Il s’agit d’un essai de toxicité d’un sol entier d’une durée de 56 jours^{Note de bas de page 53}, durant lequel on ne renouvelle pas le sol des récipients d’essai.
• Le récipient d’essai est un pot de verre de 500 ml (pour E. andrei) ou de 250 ml (pour D. rubidus), et son contenu (c’est-à-dire un volume de 350 ml de sol d’essai pour E. andrei ou un volume de 200 ml de sol d’essai pour D. rubidus) sont couverts (§ 3.2.2).
• Pour un essai à concentration unique, le nombre minimal de répétitions doit être basé sur l’espèce de ver de terre et l’ampleur de l’effet visée (§ 5.6.2). Pour un essai à concentrations multiples, il faut préparer au moins 5 récipients d’essai (répétition) pour chaque concentration d’essai et 5 récipients d’essai (répétition) pour chaque sol témoin.
• Pour un essai à concentrations multiples, il faut préparer au moins 7 concentrations plus le ou les témoins appropriés, et on recommande davantage de concentrations (c’est-à-dire au moins 10 plus les témoins).
• L’essai doit être réalisé à la température journalière moyenne de 20 ± 2 °C. En outre, la température instantanée doit toujours être de 20 ± 3 °C.
• L’éclairage des récipients d’essai doit obéir à une photopériode fixe (p. ex. 16 h de lumière; 8 h d’obscurité ou 12 h de lumière et 12 h d’obscurité) et il devrait être assuré par des lampes à incandescence, fluorescentes ou DEL. La photopériode choisie devrait être la même que celle à laquelle les vers ont été préalablement été acclimatés (v. § 2.3.3 et 2.4.3). L’intensité lumineuse à la surface du sol de chaque récipient d’essai devrait être de 400 à 800 lux et doit être d’au moins 400 lux.
• Dans chaque récipient d’essai, il faut donner aux vers une quantité identique (v. § 4.2.4), aux jours 0, 14, 28 et 42, uniquement.

4.2.3 Critères de validité de l’essai

Pour que les résultats de cette méthode d’essai biologique soient considérés comme valides, il faut respecter chacune des deux conditions suivantes^{Note de bas de page 54} :

1. le taux moyen de survie des vers adultes maintenus dans le sol témoin négatif pendant 28 jours (ou 35 jours) doit être d’au moins 90 %^{Note de bas de page 55},
2. la reproduction des vers adultes dans le sol témoin négatif doit être en moyenne d’au moins 3 jeunes vivants par adulte.

4.2.4 Alimentation des vers

Au cours d’un essai de toxicité, les vers de terre de chaque récipient d’essai doivent recevoir la même nourriture que celle à laquelle ils ont été acclimatés pendant les 7 jours (ou 14 jours) précédant l’essai (§ 2.4.6). La nourriture Magic® Worm Food ou les céréales mixtes biologiques doivent être utilisées pour l’essai de reproduction d’une durée de 56 jours décrit dans le présent document (§ 2.3.6)^{Note de bas de page 56}. On doit donner aux vers de chaque récipient d’essai une quantité mesurée de nourriture à chacune des journées suivantes de l’essai, uniquement : jours 0, 14, 28 et 42. La quantité de nourriture ajoutée à chaque récipient d’essai doit être la même lors d’une distribution de nourriture donnée. Pour la nourriture Magic® Worm Food ou les céréales mixtes biologiques, il est recommandé d’utiliser une portion de 2 g par récipient d’essai d’E. andrei et une portion de 1 g par récipient d’essai de D. rubidus.

Au jour 0 (c’est-à-dire au début de l’essai), avant d’introduire les vers dans les récipients d’essai, on devrait pratiquer une petite dépression au centre de la surface du sol de chaque récipient. On devrait déposer dans cette dépression une quantité appropriée de nourriture, l’hydrater avec une petite quantité d’eau désionisée, puis la recouvrir d’une mince couche de sol environnant pour réduire la croissance de champignons microscopiques. On devrait ensuite introduire les vers adultes, à raison de 4 par récipient (v. § 4.2.1), puis recouvrir les récipients de couvercles perforés (v. § 3.2.2). Au jour 14, on retire la pellicule obturant chaque récipient d’essai et on distribue une autre portion de nourriture (conformément au mode opératoire du jour 0). Au jour 28, après le retrait des vers adultes et le retour du reste du contenu du bocal dans chaque récipient d’essai (§ 4.2.5), on devrait distribuer dans chaque récipient une autre portion de nourriture (pour le développement et la croissance de la progéniture des vers), de la même manière qu’auparavant. Au jour 42, on devrait distribuer une dernière portion de nourriture dans chaque récipient d’essai. Quand on dépose la nourriture dans les récipients d’essai, aux jours 14, 28 et 42, on ne devrait pas toucher à la vieille nourriture dont on constate la présence dans la couche superficielle de sol (puisque les vers nouveau-nés se trouvent souvent dans la nourriture ou autour de cette dernière). On peut utiliser moins de nourriture si l’on observe une quantité importante de nourriture non consommée après la distribution de nourriture précédente; toutefois, tous les récipients d’essai doivent être traités de la même manière (c’est-à-dire que tous les récipients d’essai reçoivent la même quantité de nourriture lors d’une distribution de nourriture donnée)^{Note de bas de page 57}.

4.2.5 Observations et mesures pendant l’essai

Les paramètres biologiques de cet essai sont le nombre de vers adultes vivants au jour 28 et le nombre de descendants produits dans chaque récipient à la fin de l’essai (jour 56). Les mesures de la biomasse (c’est-à-dire la masse humide et/ou sèche) de la descendance sont facultatives (v. note 68 du § 4.2.6). Il faut observer et consigner l’état, l’aspect et le nombre de vers vivants introduits dans chaque récipient d’essai au jour 0. Une heure après, on devrait consigner le nombre de vers à la surface du sol de chaque bocal ou collé contre la paroi interne ou le fond de chaque récipient d’essai (v. § 4.2.1).

À chaque distribution de nourriture (v. § 4.2.4), on devrait retirer la pellicule recouvrant chaque récipient d’essai et consigner le nombre de vers morts ou vivants se trouvant à la surface du sol. Ensuite, on devrait examiner la couche de surface du sol de chaque récipient d’essai pour évaluer la présence et la quantité de tout reste de nourriture et pour décider s’il faut réduire la nourriture fournie (v. § 4.2.4). On devrait alors faire des observations et consigner le nombre de vers aperçus à l’intérieur de chaque récipient d’essai, sur les parois de verre ou le fond (ce qui pourrait être un signe d’une réaction d’évitement du sol qui s’y trouve).

Au jour 28, on devrait retirer les pellicules de tout récipient supplémentaire que l’on utilise pour déterminer si, dans les variantes expérimentales auxquelles on s’intéresse, la production de progéniture est acceptable (v. § 4.2.1) à cette date^{Note de bas de page 58}. On devrait examiner le contenu de ces récipients d’essai supplémentaires pour y déceler la présence de cocons ou de jeunes vers. Si on observe des cocons ou des jeunes dans chacune de ces variantes expérimentales, on devrait retirer la pellicule de chacun des récipients servant à l’essai définitif et on devrait en examiner le contenu (voir l’alinéa suivant). Si on n’observe ni cocon ni jeune ver dans les récipients d’essai supplémentaires représentant chacune de ces variantes, il est recommandé de ne pas perturber les récipients utilisés dans l’essai définitif pendant encore 7 jours avant d’en examiner et d’en retirer les adultes (ESG, 2001, 2002; ESG et Aquaterra Environmental, 2002). Dans ce cas, on devrait remettre le contenu de chaque récipient d’essai supplémentaire (y compris tous les cocons et tous les vers vivants, jeunes et adultes) dans le récipient et le maintenir dans les conditions expérimentales jusqu’à ce qu’on le réexamine.

Ensuite (c’est-à-dire au jour 28 ou, parfois, au jour 35; v. l’alinéa précédent), il faut retirer la pellicule recouvrant chaque récipient d’essai servant à l’essai définitif, tout comme on devrait le faire pour les pellicules recouvrant chaque récipient supplémentaire. On devrait consigner le nombre de vers adultes morts et vivants à la surface du sol et collés contre la paroi intérieure ou le fond de verre de chaque récipient d’essai. Ensuite, on doit transvaser le contenu de chaque récipient d’essai dans un bac de tri ou sur une feuille de plastique et dénombrer les vers adultes, vivants et morts, et consigner les résultats. On devrait toucher doucement les adultes qui semblent morts, à leur extrémité antérieure, avec une tige de verre ou une spatule; par définition, la mort est l’absence de toute réaction. Il faut compter pour morts les adultes manquant à l’appel. On devrait consigner l’aspect (p. ex. tégument normal ou signes d’altération de la couleur ou lésions, suppression du clitellum ou pincement) et le comportement (p. ex. activité normale, enroulement sur soi-même, léthargie) de chaque adulte survivant^{Note de bas de page 59}. Immédiatement après cette évaluation, il faut retourner le sol d’essai dans son bocal avec tout cocon ou tout jeune qui s’y trouve. Il faut replacer la pellicule recouvrant chaque récipient d’essai. Les observations du nombre de jeunes vers nés pendant l’essai, de leur aspect et de leur comportement doivent se faire 28 jours plus tard, à la fin de l’essai (c’est-à-dire au jour 56 ou, parfois, 63).

Il faut mesurer la température de l’air dans le laboratoire d’essais (§ 3.1) quotidiennement (p. ex. au moyen d’un thermomètre à maximum et à minimum) ou en continu (p. ex. au moyen d’un thermographe).

Toutes les deux semaines, on doit examiner la teneur en humidité apparente du contenu d’un ou de plusieurs récipients d’essai (répétition) correspondant à chaque variante expérimentale. ^{Note de bas de page 60} Pour déterminer la perte d’humidité, il faudrait aussi peser les récipients d’essai, et ce, au début de l’essai. On peut ensuite vérifier le poids de chaque récipient d’essai une fois par semaine et ajouter de l’eau d’essai pour compenser la perte de poids (en raison de la perte d’eau) si celle-ci représente plus de 10 % de la teneur en eau initiale (ISO, 1999). Lorsque le nombre de récipients d’essai est élevé, on peut calculer la quantité moyenne d’eau perdue en pesant 10 à 20 % des récipients choisis au hasard au début de l’essai et une fois par semaine par la suite. La quantité d’eau perdue ainsi calculée peut ensuite être ajoutée à tous les récipients d’essai. On devrait humidifier le sol de chaque récipient d’essai par pulvérisation d’eau d’essai, à l’aide d’un dénébulisateur distribuant environ 1 ml d’eau à chaque coup. On peut juger de la teneur en humidité apparente de chaque sol d’essai au moment de la distribution de nourriture dans les récipients d’essai (c’est-à-dire aux jours 0, 14, 28 et 42), et on peut humidifier les sols au besoin.

Au début et à la fin de l’essai, il faut mesurer et consigner le pH et la teneur en humidité du sol d’essai ou de l’horizon pédologique représentant chaque variante expérimentale (y compris le sol témoin négatif et, le cas échéant, le sol de référence). En outre, il est recommandé de mesurer la conductivité électrique au début et à la fin de l’essai dans les cas où l’on prévoit que le sol d’essai aura une forte teneur en sels. Les mesures initiales (au jour 0) devraient se faire sur un échantillon composite composé de sous-échantillons de chaque lot de sol d’essai ou horizon pédologique que l’on utilise pour préparer les répétitions d’une variante expérimentale particulière (v. § 4.2.1)^{Note de bas de page 61}. Les mesures finales (c’est-à-dire au jour 56 ou, parfois, au jour 63) devraient se faire sur des sous-échantillons des répétitions de chaque variante à laquelle les vers ont été exposés, après les observations finales de la répartition au sein du récipient d’essai, du nombre de jeunes vivants, ainsi que de l’aspect et du comportement des vers (v. § 4.2.6).

On devrait mesurer le pH du sol dans une suspension enrichie de CaCl₂ (méthode modifiée de Hendershot et al., 1993; selon les recommandations de Becker-van Slooten et al., 2004)^{Note de bas de page 62}. Pour ces analyses, on introduit 4 g de sol hydraté^{Note de bas de page 63} dans un becher de verre de 30 ml (~ 3 cm de diamètre sur ~ 7 cm de hauteur) avec 20 ml de CaCl₂ 0,01 M^{Note de bas de page 64}. On devrait agiter la suspension par intermittence pendant 30 min (p. ex. une fois à toutes les 6 min). On devrait ensuite la laisser reposer 1 h environ. Ensuite, on plonge une sonde de pH dans le surnageant et on note le pH dès que la lecture du pH-mètre est constante.

On devrait mesurer la teneur en humidité de chaque sol d’essai ou horizon pédologique en en portant un sous-échantillon de 3 à 5 g dans une coupelle tarée d’aluminium. On mesure et consigne le poids humide du sous-échantillon. On devrait porter ensuite chaque sous-échantillon à l’étuve, à 105 °C, jusqu’à l’obtention d’un poids constant. Cela prend habituellement au moins 24 h. On devrait ensuite mesurer et consigner le poids sec de chaque sous-échantillon. On doit calculer la teneur en humidité du sol en pourcentage du poids sec du sol, conformément à l’équation suivante :

${\displaystyle \text{teneur en humidité (\%)}=\frac{\text{poids humide (g)}-\text{poids sec (g)}}{\text{poids sec (g)}}\times 100}$

Il importe de calculer la teneur en humidité par rapport au poids sec et non au poids humide, puisque les résultats de ces calculs servent, avec les calculs de la capacité de rétention en eau (également rapportés au poids sec), à exprimer la teneur en humidité optimale des sols d’essai (v. § 5.3).

Selon la nature de l’essai et le plan de l’étude, on pourrait doser, au début et à la fin de l’essai, la ou les substances ou produits chimiques auxquels on s’intéresse dans les sols. Dans un essai sur un échantillon du sol d’un emplacement prélevé sur le terrain, la ou les substances ou produits dépendront du ou des contaminants auxquels on s’intéresse (v. § 5.5). Dans un essai à concentrations multiples sur un sol enrichi avec une substance chimique, ces mesures devraient porter sur les concentrations fortes, médianes et faibles utilisées dans l’expérience, au moins (v. § 6.3). On devrait prélever des aliquotes pour ces analyses pour chaque sol ou horizon de sol, de la façon décrite ci-dessus à l’égard du pH, de la conductivité électrique et de la teneur en humidité^{Note de bas de page 65}; les analyses devraient se fonder sur des techniques éprouvées et reconnues (p. ex. SPAC, 1992; Carter, 1993; Carter et Gregorich, 2008).

4.2.6 Fin de l’essai

L’essai doit être terminé 28 jours après le retrait des adultes (c’est-à-dire le jour 56 si les adultes ont été retirés au jour 28, et le jour 63 si les adultes ont été retirés au jour 35; v. § 4.2.5). Pour conclure l’essai de toxicité d’un sol, on devrait compter et consigner le nombre de jeunes vers vivants que l’on observe à la surface du sol, dans chaque récipient d’essai ayant servi à l’essai définitif, ou collés contre la paroi ou le fond de verre de chaque récipient. Ensuite, il faut compter et consigner le nombre de jeunes vers vivants qui se trouvent à l’intérieur de chaque récipient d’essai.

Il existe deux approches pour récupérer les vers jeunes du sol à la fin de l’essai : 1) le tri à la main, et 2) l’extraction thermique. Pour le tri à la main, qui est l’option privilégiée pour la récupération des jeunes, tout le contenu du sol dans chaque récipient d’essai doit être soigneusement trié tout en récupérant et en comptant le nombre de vers de terre jeunes vivants. Pour ce mode opératoire, on retire soigneusement le sol du bocal et on le place sur un plateau de tri ou une bâche en plastique. On fouille soigneusement ce sol d’essai à l’aide d’une pincette à bout émoussé ou les outils appropriés, tout en récupérant tous les jeunes vers survivants. Ce processus peut être réitéré deux ou trois fois pour chaque sol utilisé pour les répétitions afin de s’assurer que tous les vers ont été récupérés. En utilisant ce mode opératoire, le nombre de cocons éclos et non éclos dans le sol d’essai peut également être déterminé. Le nombre de cocons dont des jeunes ont éclos ou non, à la fin de l’essai, bien qu’il ne fasse pas partie de l’effet mesuré par l’essai (v. § 4.2.7), pourrait se révéler utile pour certains essais, notamment pour discerner un effet nocif sur le développement (retardé) des vers de terre ou la survie des jeunes au début de leur vie. Pour permettre cette observation (facultative), on devrait consigner le nombre de cocons dont des jeunes ont éclos ou non et que l’on a trouvés dans chaque récipient d’essai^{Note de bas de page 66}.

La deuxième approche pour récupérer les jeunes du sol dans chaque récipient d’essai à la fin de l’essai est un mode opératoire inédit d’extraction thermique, conçu par Stantec et Aquaterra Environmental dans le cadre des études de mise au point associées à la normalisation de la première édition de cette méthode d’essai biologique. Ce mode d’extraction s’est révélé efficace et efficient pour la récupération d’E. andrei, et il est présenté comme une solution de remplacement au tri manuel pour l’utilisation de cette méthode d’essai^{Note de bas de page 67}. Pour l’appliquer, on transfère successivement les bocaux dans un bain d’eau thermostaté (40 à 45 °C), tout en s’assurant que son niveau ne s’élève pas au-dessus de la moitié de la hauteur de sol dans chaque bocal. On laisse le bocal dans l’eau pas plus de 15 minutes. Ensuite, on extrait soigneusement la couche superficielle de 2 cm de sol du bocal et on la dépose dans un bac de tri ou sur une feuille de plastique. On fouille ensuite ce sous-échantillon de sol d’essai à la main, tel qu’il est décrit ci-dessus, tout en récupérant tous les jeunes vers survivants. Les laboratoires qui n’ont pas d’expérience avec la méthode d’extraction thermique décrite ici doivent commencer par valider et documenter l’efficacité de leur système d’extraction thermique (c’est-à-dire recueillir des données qui démontrent que, après l’extraction thermique, il ne reste pas un nombre important d’organismes d’essai dans le sol). Pour ce faire, ils peuvent vérifier s’il reste des organismes dans le sol traité à la chaleur et, par le fait même, si leur technique d’extraction thermique est efficace. La méthode d’extraction thermique est jugée acceptable si le nombre d’organismes d’essai dans le sol (extraits du sol par la méthode de tri manuel après extraction thermique) représente moins de 5 % du nombre total d’organismes. Si l’efficacité de l’extraction thermique n’est pas acceptable, toutes les variantes expérimentales doivent être traitées dans une matière semblable (c.-à-d. en utilisant la méthode de tri manuel après l’extraction thermique). Une fois que le personnel du laboratoire a acquis de l’expérience avec l’extraction thermique et a démontré l’efficacité du système utilisé, le laboratoire devrait continuer de surveiller périodiquement cette efficacité. L’extraction thermique ne convient pas à un essai exigeant la récupération des cocons.

On devrait toucher doucement les vers qui semblent morts à leur extrémité antérieure au moyen d’une tige de verre ou d’une spatule. Par définition, la mort est l’absence de toute réaction. Les vers jeunes morts, s’ils sont observés, sont consignés, mais ils ne doivent pas être inclus dans le compte des jeunes. On devrait consigner, pour chaque récipient d’essai, l’apparence (p. ex. normal ou signes d’altération de la couleur ou lésions) et le comportement (p. ex. activité normale ou léthargie) des vers survivants^{Note de bas de page 68}.

Les récipients d’essai, quelles que soient les concentrations, devraient être traités au hasard. En effet, le dénombrement peut devenir plus ou moins précis. Après avoir récupéré les jeunes vers de chaque récipient d’essai, on devrait prélever des sous-échantillons de chaque sol d’essai (y compris du sol témoin négatif et, le cas échéant, du sol de référence) pour en déterminer le pH et la teneur en humidité (§ 4.2.5). On devrait également doser à ce moment les autres constituants chimiques (c’est-à-dire les contaminants), à l’aide de sous-échantillons représentatifs de chaque sol d’essai (§ 4.2.5).

4.2.7 Effets mesurés (paramètres) et calculs

Pour chaque essai, il faut calculer le taux de survie des vers dans chaque récipient d’essai exposés à chaque variante expérimentale pendant 28 jours. Il faut calculer et signaler le taux moyen de survie (± ET) de tous les vers adultes exposés à chaque variante expérimentale (y compris le sol témoin négatif et, le cas échéant, le sol de référence) pendant 28 jours^{Note de bas de page 69}.

Le taux de reproduction mesuré par cet essai se fonde sur le nombre de jeunes survivants ayant éclos dans chaque répétition et dans chaque variante expérimentale pendant les 56 jours de l’essai. Une réduction statistiquement sensible de ce nombre est considérée comme le signe d’un effet toxique de la variante sur le succès reproducteur des vers adultes. On doit déterminer et signaler, pour chaque variante, le nombre moyen (± ET) de jeunes survivants dans le sol d’essai au jour 56 ou au jour 63 (y compris les sols de référence et tous les sols témoins [sols témoins négatifs, sols témoins positifs et sols témoins du solvant])^{Note de bas de page 70}. En outre, il faut calculer et signaler le nombre moyen (± ET) de juvéniles survivants engendrés par chaque ver adulte dans le ou les témoins au jour 56 (ou au jour 63, le cas échéant).

Le plus souvent, un plan d’expérience type comporte l’un des deux scénarios suivants :

1. Sol issu de plusieurs stations d’échantillonnage – dans ce cas, on compare les réponses obtenues pour une ou des stations d’échantillonnage à l’étude avec celles obtenues pour la station d’échantillonnage servant d’emplacement de référence^{Note de bas de page 71}, pour d’autres stations d’échantillonnage ou pour le sol témoin (essai à concentration unique). On a souvent recours à des essais d’hypothèse dans les évaluations statistiques, et le résultat habituel de ces essais est que, d’une station à une autre, la réponse est soit « différente », soit « analogue » (§ 5.6.1).
2. Concentrations multiples d’un sol d’essai – dans ce cas, on mélange le sol d’essai avec un sol de référence ou un sol témoin (§ 5.3), ou on l’enrichit d’une substance ou d’un produit chimique à diverses concentrations (§ 6.2). On doit calculer et consigner la CIp après 56 jours (ou 63 jours, le cas échéant) de l’inhibition de la reproduction (si les données le permettent)^{Note de bas de page 72}.

Dans un scénario comportant plusieurs stations d’échantillonnage, il est essentiel de bien comprendre les forces de divers plans d’expérience pour pouvoir appliquer les essais statistiques d’une manière fructueuse. Il faudrait établir clairement les objectifs de l’étude avant la collecte des données et avoir une idée tant de la puissance (capacité de détecter un effet) du plan d’expérience que de la facilité d’interprétation des résultats. En règle générale, on a intérêt à limiter le nombre de comparaisons à faire. À cette fin, on choisit habituellement un plan d’expérience et des essais statistiques comportant des comparaisons entre la ou les stations d’échantillonnage à l’étude et une station d’échantillonnage de référence. La puissance du plan d’expérience se trouvera accrue si on peut supposer l’existence d’un gradient (en d’autres termes, les échantillons sont prélevés dans un ordre séquentiel loin de la source ponctuelle de contaminants; v. P.4 dans EC, 2005b). Il pourrait arriver que les objectifs de l’étude et le plan d’expérience ne reçoivent pas l’attention voulue avant la collecte de données, ce qui amène l’expérimentateur à comparer, en guise de compensation, toutes les stations d’échantillonnage possibles et à maximiser ainsi le nombre de comparaisons. Cette façon de faire est vivement déconseillée, surtout lorsqu’un nombre élevé de stations d’échantillonnage est en cause, car cela peut avoir des effets indésirables sur les taux d’erreur des types I et II; l’interprétation des résultats devient souvent plus difficile; une attention indue pourrait être accordée à des comparaisons particulières après la collecte des données. On trouvera en 5.6 et EC (2005a) des indications détaillées sur les essais d’hypothèse applicables au nombre de descendants vivants à la fin de l’essai.

Dans un essai à concentration unique (v. § 5.3 et 6.2), on compare le taux moyen (± ET) de survie des vers adultes au jour 28 (ou au jour 35, le cas échéant), déterminé pour chaque variante, au taux de survie des vers dans l’échantillon ou les échantillons de sol de référence ou, au besoin, à celui des vers dans le sol témoin négatif. Dans un essai à concentrations multiples (v. § 5.3 et 6.2), on doit calculer et signaler la CL50 après 28 j (ou 35 j, le cas échéant) (y compris les limites de confiance à 95 %) pour la survie des adultes si on possède suffisamment de données à cette fin. Environnement Canada (2005a) donne des conseils sur le calcul des CLp, qu’il faudrait suivre; le § 6.4.1 donne d’autres conseils à cet égard.

Dans un essai à concentration unique (v. § 5.3 et 6.2), on détermine le nombre moyen (± ET) de jeunes survivants dans le sol d’essai à la fin de l’essai (c’est-à-dire aux jours 56 ou 63) et on le compare au nombre correspondant dans l’échantillon ou les échantillons de sol de référence ou, au besoin, dans le sol témoin négatif. Pour un essai à concentrations multiples (v. § 5.3 et 6.2), il faut calculer et signaler (si les données le permettent) la CIp après 56 jours (ou 63 jours, le cas échéant) pour l’inhibition de la reproduction (y compris les limites de confiance à 95 %). Environnement Canada (2005a) donne des conseils et des orientations pour le calcul des CIp, qu’il faudrait suivre; le § 6.4.2 donne d’autres conseils à cet égard. Au début, il faut appliquer des techniques de régression (v. § 6.4.2.1) aux données relatives à des concentrations multiples devant servir au calcul d’une CIp^{Note de bas de page 73}. Si les données devaient ne pas permettre pas à elles seules le calcul de la CIp après 56 jours (ou 63 jours, le cas échéant) de l’inhibition de la reproduction grâce à la régression appropriée, on devrait tenter, à cette fin, l’interpolation linéaire de ces données à l’aide du programme ICPIN (v. § 6.4.2.2)^{Note de bas de page 74}.

Pour avoir une représentation visuelle des données et vérifier si les résultats obtenus sont raisonnables par rapport aux calculs statistiques ultérieurs, il est fortement recommandé de commencer par porter sur un graphique les données brutes (taux de mortalité des adultes et nombre de descendants vivants) en fonction du logarithme des concentrations. Il faut résoudre tout écart important entre la CLp et la CIp déterminées de façon approximative et la CLp et la CIp calculées ultérieurement à l’aide d’un programme informatique. Le diagramme permettrait également de déterminer si on a obtenu une relation logique entre la concentration logarithmique (ou, dans certains cas, la concentration) et l’effet, une caractéristique souhaitable d’un essai valide (EC, 2005a).

4.3 Essai de réaction d’évitement

Cette méthode d’essai biologique emploie des vers de terre (E. andrei ou D. rubidus) et mesure, en tant qu’effet biologique, leur réaction d’évitement lorsqu’exposés à des sols d’essai^{Note de bas de page 75}.

Le tableau 4 présente une liste de contrôle sommaire des conditions et modes opératoires exigés et recommandés pour être appliqués universellement à chaque essai de réaction d’évitement employant des échantillons de sol effectivement ou potentiellement contaminés (y compris les sols de la région boréale et de la taïga). On y trouve également les conditions et modes opératoires recommandés pour un essai utilisant d’autres types de matières ou de substances (p. ex. échantillons de biosolides ou un sol témoin négatif enrichis au laboratoire avec un ou plusieurs produits ou substances chimiques).

Les modes opératoires universels de l’essai de réaction d’évitement sont décrits dans la présente section. Les organismes d’essai sont des vers adultes E. andrei ou de D. rubidus élevés en laboratoire (c’est-à-dire élevés au laboratoire effectuant l’essai ou issus de l’élevage d’un autre laboratoire d’essais de toxicité et acclimatés dans le laboratoire d’essais avant leur utilisation dans un essai; v. section 2).

La durée de l’essai est de 48 heures^{Note de bas de page 76}. Pendant l’essai, on ne nourrit pas les vers et on ne renouvelle pas les sols d’essai (conditions statiques).

Tableau 4. Liste de contrôle des conditions et modes opératoires recommandés et exigés pour les essais visant à mesurer les effets d’une exposition de vers de terre (E. andrei ou D. rubidus) à un sol contaminé sur leur réaction d’évitement

Mode opératoire universel
Type d’essai	Essai de toxicité d’un sol entier, sans renouvellement du milieu (essai en conditions statiques).
Durée de l’essai	48 heures.
Organismes d’essai	E. andrei ou D. rubidus élevés en laboratoire, adultes, dotés d’un clitellum; poids humide individuels : 250-600 mg pour E. andrei ou 50-200 mg pour D. rubidus; choisir des vers dont le poids humide est aussi semblable que possible; acclimater les vers pendant au moins 7 jours dans un sol témoin négatif devant être utilisé dans l’essai; 10 vers par enceinte expérimentale.
Sol témoin négatif	Selon le plan et les objectifs de l’étude; sol artificiel ou sol non contaminé prélevé sur le terrain si l’essai porte sur les sols de site; on recommande d’employer un sol artificiel pour les essais portant sur des sols enrichis avec des produits ou des substances chimiques.
Enceinte expérimentale	Enceinte circulaire à cheminée centrale (diamètre intérieur : ~ 5,4 cm) subdivisée en 6 compartiments sectoriels, reliés entre eux, munie d’un couvercle adapté, de plexiglas ou d’acier inoxydable de qualité; diamètre extérieur : ~ 23 cm; hauteur : ~ 9 cm; orifices de 1,0 cm de diamètre, dans le bas de la paroi de la cheminée (à raison de 2 par compartiment) et des cloisons des compartiments (à raison de 3 par cloison) pour permettre la circulation des vers; modifiée avec un faux fond pour une utilisation avec D. rubidus.
Quantité de sol dans la cheminée centrale	Nulle
Quantité de sol dans chaque compartiment	Poids humide identique, équivalant à un volume d’environ 350 ml pour E. andrei ou d’environ 200 ml for D. rubidus.
Humidité des sols d’essai	Hydrater le sol au taux optimal de sa capacité de rétention en eau (CRE) si le sol a été prélevé sur le terrain (v. § 5.3) ou à environ 70 % de la CRE pour un sol artificiel (v. § 3.3.2 et 6.2).
Nombre de compartiments par enceinte contenant la même variante expérimentale	3 (sol témoin négatif ou sol de référence dans chacun des trois compartiments, alternant avec 3 compartiments renfermant le sol d’essai ou une dilution de ce sol).
Nombre de variantes expérimentales par enceinte	2 variantes expérimentales en alternance dans chaque compartiment contigu; le sol témoin négatif ou le sol de référence, plus un échantillon de sol d’essai ou une concentration de ce sol (p. ex. sol prélevé sur le terrain ou une dilution de ce sol, ou une seule concentration de sol enrichi avec une substance chimique).
Nombre d’enceintes expérimentales (répétition) par sol d’essai ou par concentration	Au moins 2 enceintes expérimentales par sol d’essai ou par concentration pour un essai à concentrations multiples; au moins 5 enceintes expérimentales par sol d’essai ou par concentration pour un essai à concentration unique; au moins une enceinte expérimentale pour les essais de dépistage ou les essais préliminaires.
Nombre de concentrations	Pour un essai à concentrations multiples : ≥ 5 concentrations, plus le ou les témoins; on en recommande davantage (≥ 7)
Température ambiante	20 ± 2 °C, moyenne journalière; 20 ± 3 °C, température instantanée.
Éclairage	Obscurité ininterrompue (les enceintes sont enveloppées de feuilles d’aluminium si elles sont construites de plexiglas transparent ou translucide).
Alimentation	Ne pas nourrir les vers.
Mesures pendant l’essai	Température ambiante dans l’installation d’essai, quotidiennement ou en continu; humidité, pH et conductivité électrique (au besoin) de chaque sol d’essai ou de chaque concentration : au début et à la fin de l’essai.
Observations pendant l’essai	Le compartiment (pour chaque variante expérimentale) dans lequel chaque ver est entré au début de l’essai; le nombre de vers vivants dans chaque compartiment, à la fin de l’essai; le nombre de vers morts dans chaque compartiment, à la fin de l’essai; le nombre de vers vivants ou morts, aperçus sur le sol de chaque compartiment à la fin de l’essai; les symptômes pathologiques évidents (p. ex. plaies) ou franches anomalies du comportement (p. ex. léthargie) chez les survivants, dans chaque compartiment, à la fin de l’essai.
Effet biologique mesuré	Le nombre de vers vivants par enceinte de chaque variante expérimentale (c’est-à-dire le nombre total de vers vivants dans les trois compartiments renfermant le même sol d’essai, pour chacune des deux variantes expérimentales) à la fin de l’essai.
Paramètres statistiques	Le pourcentage de survie de tous les vers dans chaque enceinte expérimentale à la fin de l’essai; lorsqu’il y a plus d’une enceinte expérimentale (répétition), le pourcentage moyen de survie de tous les vers dans chaque enceinte pour chaque sol d’essai ou chaque concentration d’essai à la fin de l’essai. Pour les essais à concentration unique, le nombre moyen (± ET) de vers survivants récupérés du sol d’essai et du sol non contaminé dans chacune des enceintes expérimentales (répétition); le pourcentage de réaction d’évitement, s’il est calculé. Pour les essais à concentrations multiples, le pourcentage de réaction d’évitement par variante expérimentale dans chaque enceinte, à la fin de l’essai; la CE50 (et toute autre CEp) sur 48 h.
Validité de l’essai	Essai non valide si le pourcentage de survie des vers dans une enceinte expérimentale est inférieur à 90 % à la fin de l’essai; lorsqu’il y a plus d’une enceinte expérimentale (répétition) par sol d’essai ou par concentration, essai non valide si le pourcentage moyen de survie des vers par enceinte expérimentale est inférieur à 90 % pour chaque sol d’essai ou chaque concentration.
Essai avec un toxique de référence	Choisir entre un essai avec une concentration témoin positive ou un essai toxicologique de référence à concentrations multiples : Si l’on choisit l’essai avec une concentration témoin positive, il doit être effectué parallèlement à chaque essai définitif; utiliser de l’acide borique (H3BO3) ou un produit semblable; préparer et mettre à l’essai au moins trois enceintes (répétition) d’une concentration prédéterminée plus un témoin négatif, en utilisant un sol artificiel comme substrat; 10 vers par répétition; suivre les conditions et modes opératoires décrits au § 4.4 et à l’annexe H; déterminer le pourcentage de réaction d’évitement à la fin de l’essai (c.-à-d. 48 h). Si l’on choisit l’essai toxicologique de référence à concentrations multiples, il doit être effectué deux fois par an; utiliser de l’acide borique (H3BO3) ou un produit semblable; préparer et mettre à l’essai au moins 5 concentrations plus un témoin négatif, en utilisant un sol artificiel comme substrat; au moins 2 enceintes expérimentales (répétition) par concentration et 10 vers par répétition; suivre les conditions et modes opératoires décrits au § 4.4; déterminer la CE50 sur 48 h pour la réaction d’évitement (avec des limites de confiance à 95 %); exprimer en milligrammes d’acide borique par kilogramme sec; les critères de validité sont les mêmes que ceux de l’essai définitif. Par ailleurs, dans certaines circonstances (c’est-à-dire lorsque l’essai est réalisé peu fréquemment; v. § 4.4), les options d’essai de toxicité de référence avec témoin positif et/ou à concentrations multiples pour l’essai de reproduction sur 56 jours peuvent être appliquées pour satisfaire aux exigences de l’essai de toxicité de référence pour l’essai de réaction d’évitement. Aucun essai de toxicité de référence n’est requis si l’essai de réaction d’évitement n’est utilisé qu’aux fins de dépistage ou d’essai préliminaire.
Sol prélevé sur le terrain
Transport et entreposage	Conserver dans un récipient de plastique étanche ou autre matériau approprié et réduire au minimum l’espace libre; les étiqueter ou les coder; transporter à l’obscurité (p. ex. dans une glacière opaque, un seau de plastique ou un autre récipient opaque); ne pas congeler ni surchauffer pendant le transport; conserver à l’obscurité à 4 ± 2 °C; l’essai devrait débuter dans un délai de deux semaines et il doit débuter dans un délai de six semaines, à moins qu’il ne soit établi que les contaminants du sol sont stables.
Sol témoin négatif	Sol naturel, prélevé sur le terrain, non contaminé ou sol artificiel, pour lequel des essais antérieurs de réaction d’évitement effectués avec l’espèce d’expérience ont révélé que le critère de validité de l’essai pouvait être régulièrement respecté; analysé pour déterminer, au minimum, les éléments suivants : granulométrie (pourcentage de sable, de limon, d’argile), COT (%), MO (%), pH, conductivité, teneur en humidité (%), CRE et CEC.
Sol de référence	Un ou plusieurs échantillons pour les essais portant sur un sol prélevé sur le terrain; idéalement, prélevés dans un ou des endroits que l’on présume ne pas être contaminés, mais près du lieu de prélèvement du sol d’essai; leurs caractéristiques (p. ex. TMO [%], MO [%], granulométrie, texture, pH et conductivité électrique) sont semblables à celles du ou des sols d’essai; analysé conformément à la description concernant le sol témoin négatif naturel.
Caractérisation des sols d’essai	Doit au moins inclure : humidité, CRE, pH, conductivité électrique, COT (%), MO (%), granulométrie (pourcentage de sable, de limon et d’argile) et CEC; devrait au moins inclure : azote, phosphore, potassium, ratio C/N, cations et anions majeurs; facultatif : densité apparente, carbone inorganique total, matières volatiles totales, demande biochimique en oxygène, demande chimique en oxygène, potentiel d’oxydoréduction, sels solubles, oxydes métalliques, taux d’adsorption du sodium, contaminants préoccupants (p. ex. métaux, HAP, pesticides) et caractéristiques de la contamination (p. ex. odeur, taches, débris, présence de carburant ou de solvant).
Préparation des sols d’essai	Au besoin, retirer les débris et les organismes macroscopiques indigènes à l’aide d’une pincette; au besoin, passer doucement, au travers d’un tamis au maillage convenable (p. ex. 4-10 mm); homogénéiser; mesurer la teneur en humidité des sols et la CRE; hydrater à l’eau d’essai (ou, au besoin, déshydrater) pour obtenir le taux optimal de la CRE (v. § 5.3); mélanger; diluer avec du sol témoin négatif ou du sol de référence, s’il s’agit d’un essai est à concentrations multiples; s’assurer de son homogénéité.
Sol enrichi de substance(s) ou de produit(s) chimique(s)
Sol témoin négatif	Sol artificiel ou sol prélevé sur le terrain, non contaminé, pour lequel des essais antérieurs, effectués avec l’espèce d’expérience, ont révélé que tous les critères de validité de l’essai pouvaient être régulièrement respectés; analysé pour déterminer, au minimum, les éléments suivants : granulométrie (pourcentage de sable, de limon, d’argile), COT (%), MO (%), pH, conductivité électrique, teneur en humidité (%), CRE et CEC.
Caractérisation de la substance ou du produit chimique	On devrait obtenir au préalable des renseignements sur la concentration des ingrédients actifs et des impuretés, la solubilité dans l’eau, la pression de vapeur, la stabilité, les constantes de dissociation, les coefficients d’adsorption, la toxicité pour l’Homme et les organismes terrestres, ainsi que la biodégradabilité de la substance ou du produit chimique ajouté au sol négatif.
Solvant	Le solvant préférable est l’eau désionisée; si on utilise un solvant organique, l’essai doit comprendre un sol témoin de ce solvant en plus d’un sol témoin négatif.
Préparation de mélanges	Le mode opératoire dépend de la nature de la substance ou des substances à analyser ainsi que du plan d’expérience et des objectifs de l’essai; on peut préparer des mélanges de substances chimiques et de sol par agitation manuelle ou mécanique; la ou les substances d’essai peuvent être ajoutées en quantités mesurées en solution (c’est-à-dire dans l’eau ou dans un solvant organique) ou sous forme solide, à l’état pur ou non; assurer l’homogénéité des mélanges.
Concentration, dans le mélange de sol, de la ou des substances chimiques ajoutées.	Normalement, mesurée au début et à la fin de l’essai, en trois concentrations au moins : élevée, moyenne et faible.

* Les renseignements contenus dans ce tableau ne sont qu’un résumé. Les exigences et recommandations définitives de cette méthode d’essai figurent dans le corps du présent document.

4.3.1 Début de l’essai

L’essai est effectué à l’aide d’enceintes expérimentales d’évitement spécialement conçues, décrites au § 3.2.3. Pour un essai à concentration unique, il faut au moins 5 répétitions (c’est-à-dire enceintes expérimentales), chacune contenant les deux mêmes variantes expérimentales (c’est-à-dire le sol provenant d’un seul emplacement ou une seule concentration de sol d’essai, plus un sol témoin négatif ou un sol de référence non contaminé) alternant d’un compartiment à l’autre. Dans le cas d’un sol d’un emplacement contaminé, les répétitions devraient idéalement être constituées des échantillons réitérés prélevés individuellement dans une station d’échantillonnage donnée (v. § 5.1). Cependant, le degré de répétition dépend de l’objectif des essais. Si l’objectif de l’essai de réaction d’évitement est de dépister les effets positifs sur les sols afin d’éclairer les décisions relatives à d’autres essais de toxicité (p. ex. l’essai de reproduction d’une durée de 56 jours), on peut utiliser moins de répétitions (p. ex. 1 enceinte expérimentale). Pour un essai à concentrations multiples, il faut au moins deux répétitions (c’est-à-dire deux enceintes expérimentales) par concentration d’essai, chacune contenant les deux mêmes variantes expérimentales (c’est-à-dire une seule concentration d’essai et des aliquotes de sol non contaminé) alternant d’un compartiment à l’autre. Dans un essai à concentrations multiples, l’utilisation de répétitions supplémentaires (c.-à-d. au moins trois enceintes expérimentales) par concentration pourrait fournir une représentation plus précise de la courbe concentration-réponse et, par le fait même, renforcer la confiance à l’égard des résultats d’essai et de leur interprétation. Pour tout essai visant à estimer la CEp dans un essai définitif à concentrations multiples, il faut utiliser au moins cinq concentrations (avec le sol témoin négatif en alternant d’un compartiment à l’autre). On peut utiliser davantage de concentrations d’essai (p. ex. au moins 7) pour élargir l’intervalle des concentrations expérimentales et accroître la probabilité de quantifier l’effet statistique auquel s’intéresse l’essai (v. § 4.3.7). Une autre option pour l’essai à concentrations multiples consiste à réaliser un essai préliminaire pour cibler la gamme souhaitable de concentrations à utiliser pour mesurer les réactions d’évitement à une large gamme de concentrations, utilisant une enceinte expérimentale par concentration, puis à réaliser un essai de moins de concentrations (puisque des renseignements supplémentaires sur la gamme de concentrations/dilutions avec effet seraient disponibles) utilisant trois enceintes par concentration. Cela faciliterait également la sélection des concentrations d’essai lorsque les sols sont hautement contaminés ou lorsqu’on ne connaît pas leur toxicité (p. ex. la CL50).

Tous les sols d’essai, témoins négatifs, de référence et témoins positifs doivent être préparés conformément à la description au § 4.1. Immédiatement après le mélange d’un lot, on doit transvaser, à tous les deux compartiments de chaque enceinte (c’est-à-dire à trois compartiments par enceinte) employé dans l’essai de réaction d’évitement, un poids humide identique de sol témoin négatif (naturel ou artificiel; v. § 3.3) ou de sol de référence (v. § 3.5) équivalant à un volume de 350 ml environ pour E. andrei ou de 200 ml environ pour D. rubidus^{Note de bas de page 77}. Ensuite, on doit transvaser dans les trois autres compartiments de chaque enceinte une quantité pesée de sol d’essai (cette quantité dépend de l’échantillon; elle équivaut à un volume de 200 ml ou 350 ml environ, en fonction de l’espèce d’expérience utilisée) provenant du même lot de matière mélangée. Selon la nature ou l’objectif de l’essai de réaction d’évitement (p. ex. concentration unique avec 5 enceintes par sol d’essai ou par concentration; concentration unique avec moins d’enceintes par sol d’essai ou par concentration pour dépister les sols : ou concentrations multiples avec deux enceintes par sol d’essai ou par concentration), on doit déposer la même matière (c’est-à-dire le sol d’essai du même lot ou emplacement) dans trois compartiments en alternance, dans une ou plusieurs enceintes expérimentales. Le volume de sol dans chaque section de l’enceinte expérimentale doit être le même. On devrait égaliser la surface du sol déposé dans chaque compartiment (sans la comprimer) avec une cuiller pour y répartir également le sol.

La veille de l’essai, après la mise en place, en alternance, du sol non contaminé (c’est-à-dire du sol témoin négatif ou du sol de référence) et du sol d’essai (c’est-à-dire concentration d’essai, effectivement ou potentiellement contaminé, provenant du même lot ou emplacement) dans chacun des trois compartiments de la même enceinte, on devrait couvrir chaque enceinte d’un couvercle (§ 3.2.3) pour réduire au minimum les pertes d’humidité. On devrait garder les enceintes à la température de l’expérience pendant la nuit (§ 4.3.2) pour tendre vers l’équilibre chimique des sols.

Le lendemain (au jour 0), on introduit les 10 organismes d’essai (§ 2.3.8) dans chaque enceinte. On devrait alors prélever d’un élevage (§ 2.3) ou d’un récipient d’acclimatation (§ 2.4) un nombre excédentaire de vers par rapport au nombre de vers dont on a besoin pour l’essai. Dans ce récipient, on devrait choisir des vers adultes (dont le clitellum est entièrement développé) dans l’intervalle acceptable de tailles (c’est-à-dire dont le poids humide individuel est de 250 à 600 mg, dans le cas d’E. andrei, de 50 à 200 mg, dans le cas de D. rubidus), les en retirer à la main (gantée) ou à l’aide d’une ou des branches aux arêtes émoussées d’une pincette à extrémités recourbées et les introduire rapidement dans un plat peu profond ou un plateau propre où on les rince rapidement à l’eau d’essai non contaminée (c’est-à-dire désionisée ou distillée). Les vers choisis devraient être de taille semblable, et on ne devrait retenir que ceux qui semblent en bonne santé, qui présentent une couleur semblable et qui sont actifs lorsqu’on les retire de la litière. Ensuite, on dépose les vers dans un récipient de transfert (p. ex. un plateau de verre ou d’aluminium mesurant environ 10 × 10 cm) doublé d’essuie-tout humecté d’eau d’essai. On devrait observer une dernière fois les vers de ce récipient pour s’assurer que leur aspect est normal. On devrait se débarrasser de tout ver atypique. Le groupe de vers introduits dans chaque enceinte devrait être réparti au hasard pour ce qui est des sols d’essai ou des concentrations. Ensuite, on devrait choisir soigneusement, un à un, des vers d’une taille homogène, tout en s’assurant que celle-ci est acceptable, puis on devrait les transférer, un à la fois, dans la cheminée centrale de chaque enceinte expérimentale (dépourvue de sol). Après que l’on a introduit le premier ver dans la cheminée, on l’observe jusqu’à ce qu’il ait gagné un compartiment renfermant du sol. On introduit ensuite le second ver et on l’observe jusqu’à sa disparition dans un compartiment. On répète l’opération jusqu’à l’introduction des 10 vers par enceinte.

On devrait consigner le compartiment (et la nature de son contenu) dans lequel chaque ver est entré^{Note de bas de page 78}. On devrait se débarrasser de tout ver qui n’entre pas dans un compartiment en moins de 30 minutes et le remplacer par un autre ver pris dans le récipient de transfert^{Note de bas de page 79}. Dès que l’on a introduit un groupe de 10 vers dans une enceinte et que tous les vers ont gagné un compartiment (de sol non contaminé ou de sol d’essai), il faut noter l’heure (t = 0 h) et placer le couvercle sur l’enceinte. Pour les essais menés avec D. rubidus, les enceintes expérimentales peuvent être enveloppées de Parafilm pour empêcher les vers de s’échapper (v. § 3.2.3). Toute enceinte construite de plexiglas transparent ou translucide (v. § 3.2.3) doit être entourée d’une enveloppe opaque (p. ex. une feuille d’aluminium) ou gardée à l’obscurité durant l’essai^{Note de bas de page 80}. Dans le laboratoire, l’emplacement des enceintes expérimentales devrait être décidé par le hasard. Les dates de préparation des sols témoins et des sols d’essai ainsi que les dates d’ajout des organismes dans les enceintes expérimentales doivent être consignées et signalées.

Il faut peser individuellement, pour estimer la variabilité individuelle du poids des vers constituant l’échantillon, au moins 10 vers, au hasard, dans le groupe choisi pour servir dans l’essai. Il faut consigner les poids individuels, puis calculer et signaler le poids moyen (± ET) [Section 7].

4.3.2 Conditions expérimentales

• Il s’agit d’un essai sublétal de 48 h pour déterminer la réaction d’évitement des sols d’essai par des vers de terre adultes, pendant lequel on ne renouvelle pas ces sols et on ne dérange pas les vers pour les laisser choisir entre le sol non contaminé (c’est-à-dire un sol témoin négatif ou sol de référence) et le sol d’essai (p. ex. sol prélevé sur le terrain, dilué ou non, ou encore, concentration unique d’un sol enrichi avec une substance chimique).
• Chaque enceinte expérimentale est constituée d’une cheminée centrale, dépourvue de sol, et de six compartiments sectoriels identiques, reliés entre eux, ce qui permet le déplacement des vers d’un compartiment à l’autre. Un « faux fond » doit être placé dans chaque compartiment si l’essai est effectué avec D. rubidus, afin de réduire le volume de sol utilisé pour cette espèce plus petite. Trois des compartiments de chaque enceinte doivent renfermer du sol non contaminé, provenant du même lot, et les trois autres doivent contenir un seul sol d’essai provenant du même lot ou emplacement. Chaque type de compartiment doit alterner avec l’autre (chaque compartiment renferme un sol différent de celui des compartiments contigus).
• Pour un essai à concentration unique visant à quantifier l’estimation de l’effet, il faut employer au moins 5 enceintes expérimentales constituant autant de répétitions. Chaque enceinte comprend trois compartiments renfermant du sol non contaminé du même lot et trois compartiments renfermant un sol d’essai du même lot ou prélèvement réitéré sur le terrain (le cas échéant). On dispose, en alternance, dans les cinq enceintes, des aliquotes identiques de sol non contaminé et de sol d’essai des deux mêmes lots. Si l’objectif de l’essai de réaction d’évitement à concentration unique est d’analyser un grand nombre de sols pour y déceler des effets positifs potentiels, on peut alors utiliser moins de répétitions (p. ex. une enceinte expérimentale), ce qui serait plus rentable.
• Pour un essai à concentrations multiples, il faut employer au moins 5 concentrations d’essai et on en recommande davantage (au moins 7). Il faut utiliser au moins deux enceintes expérimentales (répétition) pour chaque concentration d’essai. Chaque enceinte doit posséder trois compartiments renfermant du sol non contaminé du même lot et une concentration unique de sol d’essai du même lot. On doit introduire des parties aliquotes identiques de sol non contaminé provenant du même lot dans les compartiments de chaque enceinte en alternance. La concentration de sol d’essai dans les trois compartiments disposés en alternance d’une enceinte donnée doit être identique (provenant du même lot); cependant, les concentrations de sol d’essai diffèrent d’une enceinte à l’autre.
• L’essai doit être réalisé à la température journalière moyenne de 20 ± 2 °C. En outre, la température instantanée doit toujours être de 20 ± 3 °C.
• Les organismes sont maintenus dans une obscurité ininterrompue pendant la durée complète de l’essai.

4.3.3 Critères de validité de l’essai

L’essai de réaction d’évitement est conçu pour détecter les effets sublétaux (ISO, 2008). Par conséquent, pour que les résultats de cette méthode d’essai biologique soient jugés valides, le taux de survie de tous les vers dans chaque enceinte expérimentale doit être d’au moins 90 % à la fin de l’essai. Lorsqu’on utilise plus d’une enceinte dans un essai, le taux moyen de survie de tous les vers par enceinte expérimentale doit être d’au moins 90 % pour chaque sol d’essai ou chaque concentration d’essai à la fin de l’essai.

4.3.4 Alimentation des vers

Durant l’essai, on ne donne pas de nourriture supplémentaire aux vers.

4.3.5 Observations et mesures pendant l’essai

Le paramètre biologique à observer à la fin de cet essai est le nombre de vers vivants se trouvant dans chaque compartiment (v. § 4.3.6). Au début de l’essai, lorsque l’on introduit les organismes dans la cheminée centrale de chaque enceinte, on devrait consigner le compartiment dans lequel entre chaque ver (v. § 4.3.1). Ce genre d’observation n’est pas possible dès que l’essai débute (t = 0). On devrait veiller à ne pas déplacer ni autrement perturber les enceintes pendant l’essai (ou tant que l’on n’a pas inséré les cloisons amovibles, à la fin de l’essai, pour isoler les vers dans chaque compartiment; v.§ 4.3.6)^{Note de bas de page 81}.

Il faut mesurer la température de l’air dans le laboratoire d’essais (§ 3.1) quotidiennement (p. ex. au moyen d’un thermomètre à maximum et à minimum) ou en continu (p. ex. au moyen d’un thermographe).

Il faut mesurer et consigner le pH et la teneur en humidité d’au moins une répétition de chaque sol d’essai (y compris du sol témoin négatif et, le cas échéant, du sol de référence) au début et à la fin de l’essai. En outre, il est recommandé de mesurer la conductivité électrique au début et à la fin de l’essai dans les cas où l’on prévoit que le sol d’essai aura une forte teneur en sels. On devrait effectuer les premières mesures sur des sous-échantillons de chaque lot de sol d’essai servant à la préparation des répétitions d’une variante expérimentale particulière (v. § 4.1). On devrait effectuer les mesures finales (c’est-à-dire à t = 48 h) sur des sous-échantillons de répétitions de chaque variante expérimentale à laquelle les vers ont été exposés, après les observations finales de la répartition des vers, de leur survie, de leur aspect et de leur comportement (v. § 4.3.6). On devrait effectuer des mesures du pH et de la teneur en humidité du sol conformément aux conseils donnés au § 4.2.5.

On pourrait doser dans les sols d’essai la ou les substances ou produits chimiques auxquels on s’intéresse. Dans ce cas, les conseils donnés au § 4.2.5 s’appliquent. Pour de plus amples renseignements, on devrait consulter les § 5.5 et 6.3.

4.3.6 Fin de l’essai

L’essai doit se terminer après 48 heures d’exposition. Pour mettre fin à l’essai de toxicité du sol, on retire le couvercle de chaque enceinte expérimentale, en veillant à ne pas perturber ni déplacer l’appareillage expérimental. Ensuite, on insère rapidement une cloison amovible (v. § 3.2.3, y compris la fig. 2) entre chaque compartiment, pour y confiner les vers. Immédiatement après, il faut dénombrer les vers morts et vivants se trouvant à la surface du sol de chaque compartiment et consigner les résultats. On devrait ensuite doucement vider chaque compartiment avec une cuiller ou une spatule, déposer le contenu dans un plateau de triage ou sur une feuille de plastique, y dénombrer les vers vivants et morts, puis consigner les résultats^{Note de bas de page 82}. On devrait toucher doucement les vers qui semblent morts, à leur extrémité antérieure, avec une tige de verre ou une spatule. Par définition, la mort est l’absence de toute réaction. On se débarrasse des cadavres. On doit compter pour morts les vers manquant à l’appel. On devrait consigner l’aspect (p. ex. normal ou signes d’altération de la couleur ou lésions) et le comportement (p. ex. activité normale ou léthargie) de chaque ver survivant.

Immédiatement après cette évaluation, on devrait prélever des sous-échantillons de chaque sol d’essai (y compris de sol témoin négatif et, le cas échéant, s’il est inclus dans l’essai, de sol de référence pour en déterminer le pH ou la teneur en humidité (§ 4.2.5). On devrait également doser à ce moment les autres constituants chimiques (c’est-à-dire les contaminants), à l’aide de sous-échantillons représentatifs de chaque sol d’essai (§ 4.2.5).

4.3.7 Effets mesurés (paramètres) et calculs

À la fin de chaque essai, il faut consigner le nombre total de vers survivants dans le sol d’essai (c’est-à-dire le sol effectivement ou potentiellement contaminé) et le sol non contaminé (c’est-à-dire le sol témoin négatif ou le sol de référence) de chaque enceinte expérimentale.

Le plus souvent, un plan d’expérience type comporte l’un des trois scénarios suivants :

1. Sol issu de plusieurs stations d’échantillonnage – dans ce cas, on compare les réponses obtenues pour une ou des stations d’échantillonnage à l’étude avec celles obtenues pour la station d’échantillonnage servant d’emplacement de référence^{Note de bas de page 83}, pour d’autres stations d’échantillonnage ou pour le sol témoin (essai à concentration unique). On a souvent recours à des essais d’hypothèse dans les évaluations statistiques, et le résultat habituel de ces essais est que, d’une station à une autre, la réponse est soit « différente », soit « analogue » (§ 5.6.1).
2. Le sol provenant de plusieurs stations d’échantillonnage ou les sols enrichis avec une substance chimique sont analysés (c’est-à-dire comparés à un sol de référence ou témoin dans le cadre d’un essai à concentration unique) pour définir les réactions d’évitement positives en vue de déterminer, et donc de mettre en priorité, une évaluation plus approfondie des effets toxicologiques (c’est-à-dire un essai de reproduction d’une durée de 56 jours).
3. Les concentrations multiples d’un sol d’essai – dans ce cas, on mélange le sol d’essai avec un sol de référence ou un sol témoin (§ 5.3), ou on l’enrichit d’une substance ou d’un produit chimique à diverses concentrations (§ 6.2). On doit calculer et consigner la CE50 sur 48 h pour la réaction d’évitement (si les données le permettent).

Dans un scénario comportant plusieurs stations d’échantillonnage, il est essentiel de bien comprendre les forces de divers plans d’expérience pour pouvoir appliquer les essais statistiques d’une manière fructueuse. Il faudrait établir clairement les objectifs de l’étude avant la collecte des données et avoir une idée tant de la puissance (capacité de détecter un effet) du plan d’expérience que de la facilité d’interprétation des résultats. En règle générale, on a intérêt à limiter le nombre de comparaisons à faire. À cette fin, on choisit habituellement un plan d’expérience et des essais statistiques comportant des comparaisons entre la ou les stations d’échantillonnage à l’étude et une station d’échantillonnage de référence. La puissance du plan d’expérience se trouvera accrue si on peut supposer l’existence d’un gradient (en d’autres termes, les échantillons sont prélevés dans un ordre séquentiel loin de la source ponctuelle de contaminants; v. P.4 dans EC, 2005b et EC, 2012). Il pourrait arriver que les objectifs de l’étude et le plan d’expérience ne reçoivent pas l’attention voulue avant la collecte de données, ce qui amène l’expérimentateur à comparer, en guise de compensation, toutes les stations d’échantillonnage possibles et à maximiser ainsi le nombre de comparaisons. Cette façon de faire est vivement déconseillée, surtout lorsqu’un nombre élevé de stations d’échantillonnage est en cause, car cela peut avoir des effets indésirables sur les taux d’erreur des types I et II; l’interprétation des résultats devient souvent plus difficile; une attention indue pourrait être accordée à des comparaisons particulières après la collecte des données.

Il faut calculer et signaler le taux de survie de tous les vers dans chaque enceinte à la fin de l’essai. Si plus d’un récipient d’essai (répétition) est utilisé dans un essai, il faut calculer et signaler le taux moyen de survie de tous les vers par enceinte pour chaque sol d’essai ou chaque concentration d’essai à la fin de l’essai.

Dans l’essai à concentration unique, il faut calculer et signaler le nombre moyen (± ET) de vers survivants retrouvés dans le sol d’essai et dans le sol non contaminé de chacune des enceintes expérimentales (répétition). On devrait comparer ces valeurs, statistiquement, à l’aide d’un test statistique approprié pour les comparaisons par paire (v. § 5.6). Les résultats montrant un nombre moyen significativement moindre de vers survivants dans le sol d’essai par rapport à ceux du sol non contaminé révèlent une réaction d’évitement du sol d’essai (ou une réaction de préférence pour le sol non contaminé).

Dans l’essai à concentrations multiples, il faut calculer et signaler le taux d’évitement des vers survivants pour chaque concentration. La présence et l’intensité d’une réaction apparente d’évitement de chaque concentration sont déterminées d’après le nombre (moindre) de vers dans le sol d’essai par rapport à une réaction neutre (pas d’évitement, pas de préférence). On définit la réaction neutre comme étant un nombre égal de vers dans le sol d’essai et dans le sol non contaminé (c’est-à-dire le sol témoin négatif ou le sol de référence) à la fin de la période d’exposition. D’après cette définition, le nombre total de vers que l’on détermine se trouver dans un sol d’essai particulier, dans une enceinte expérimentale, est converti en une valeur révélatrice du taux d’évitement, comme suit^{Note de bas de page 84} :

${\displaystyle \text{évitement (\%)}=\frac{{\text{nbre vers}}_{\text{sol non contaminé}}-{\text{nbre vers}}_{\text{sol d’essai}}}{\text{nbre total de vers}}\times 100}$

où :

• nbre vers _{sol non contaminé} est le nombre de vers vivants trouvés dans tous les compartiments de sol non contaminé, à la fin de l’essai;
• nbre vers _{sol d’essai} est le nombre de vers vivants trouvés dans tous les compartiments de sol d’essai, à la fin de l’essai;
• nbre total de vers est le nombre total de vers vivants trouvés dans tous les compartiments, à la fin de l’essai.

Si les données le permettent, on doit estimer et signaler la concentration efficace médiane (CE50, y compris les intervalles de confiance à 95 %) et, si on le souhaite, toute autre concentration efficace (CEp, p. ex. CE20 ou CE25) suscitant une réaction d’évitement (v. § 6.4), d’après le taux de réaction d’évitement déterminé pour chaque concentration expérimentale. Environnement Canada (section 4 dans EC, 2005a) donne des conseils et des orientations pour le calcul de la CEp, qu’il faudrait suivre; le § 6.4.1 donne d’autres conseils à cet égard. Pour avoir une représentation visuelle des données brutes et vérifier si les résultats obtenus sont raisonnables par rapport aux calculs statistiques ultérieurs, il est vivement recommandé de commencer par porter sur un graphique les données (taux de réaction d’évitement) en fonction du logarithme des concentrations. Il faut résoudre tout écart important entre la CEp déterminée de façon approximative et la CEp calculée ultérieurement à l’aide d’un programme informatique. Le diagramme permettrait également de déterminer si on a obtenu une relation logique entre la concentration logarithmique (ou, dans certains cas, la concentration) et l’effet, une caractéristique souhaitable d’un essai valide (EC, 2005a).

On pourrait souhaiter analyser les données montrant le nombre de vers entrant dans chaque compartiment au début de l’essai (v. § 4.3.1 et 4.3.5), pour vérifier le caractère aléatoire de cette réaction. Le test du χ2 (EC, 2005a) convient à cette fin. Un écart significatif dû à la variante expérimentale (c’est-à-dire sol non contaminé par rapport au sol d’essai) révèle une détection et une réaction initiales (c’est-à-dire évitement ou préférence) chez les vers de terre au sol d’essai. Une différence significative entre les compartiments porte à croire en l’absence de mouvements aléatoires des vers dans les compartiments au début de l’essai.

4.4 Essais employant un toxique de référence

On emploie régulièrement un toxique de référence pour évaluer, dans des conditions expérimentales normalisées, la sensibilité relative d’une partie de la population de vers de terre adultes dans un élevage particulier (§ 2.3.9) ou dans un lot particulier de vers acclimatés (c’est-à-dire pour les vers utilisés dans l’essai provenant d’un autre laboratoire; § 2.4.9) d’où on choisira les organismes dont on se servira dans un ou plusieurs essais définitifs (c’est-à-dire essai de production d’une durée de 56 jours ou essai de réaction d’évitement d’une durée de 48 h). Les essais avec un toxique de référence servent également à démontrer la précision et la fiabilité des données obtenues par le laboratoire pour le toxique en question, dans des conditions expérimentales normalisées, ainsi que la compétence technique du personnel du laboratoire qui effectue l’essai (EC, 1995). Il faut effectuer un essai avec un toxique de référence conformément aux conditions et aux modes opératoires décrits ici, sous l’un des deux régimes suivants :

1. un essai avec un toxique de référence à concentrations multiples au moins deux fois par an^{Note de bas de page 85} avec des vers de terre provenant des élevages destinés à l’essai définitif (§ 2.3);
2. l’utilisation d’une concentration témoin positive en même temps que chaque essai définitif en utilisant des vers du même lot que ceux utilisés dans l’essai définitif (§ 2.3.9 et annexe H).

Si l’essai de réaction d’évitement est utilisé uniquement pour le dépistage des sols contaminés ou pour l’essai préliminaire (par opposition à la quantification de l’effet estimé dans un essai définitif), il n’est pas nécessaire de procéder à un essai avec un toxique de référence.

Le laboratoire qui choisit de vérifier la sensibilité de ses élevages par rapport à un toxique de référence dans un essai de toxicité de référence à concentrations multiples devrait réaliser ces essais au moins une fois tous les six mois. Les essais de toxicité de référence peuvent être réalisés simultanément à un essai définitif de toxicité des sols en utilisant des organismes provenant du même élevage (§ 2.3) ou du même lot acclimaté (§ 2.4) que ceux utilisés dans l’essai définitif, si le nombre d’organismes d’essai disponibles le permet.

La présente sous-section traite des conditions et modes opératoires applicables aux essais de toxicité de référence à concentrations multiples exécutés parallèlement à un essai de toxicité d’un sol avec E. andrei ou D. rubidus, de même qu’aux essais visant à déterminer si les élevages de l’espèce qu’on prévoit utiliser dans des essais de toxicité d’un sol sont acceptables et appropriés. Ces conditions et modes opératoires devraient, par ailleurs, être utilisés pour évaluer la précision intralaboratoire lorsqu’un laboratoire s’apprête pour la première fois à appliquer les présentes méthodes d’essai biologique (§ 2.3.1 et 2.3.9).

Pour la première option, qui consiste à effectuer des essais avec un toxique de référence parallèlement à l’essai de reproduction d’une durée de 56 jours, un essai de toxicité de référence doit être réalisé sous la forme d’un essai définitif en conditions statiques à concentrations multiples utilisant une CI50 de 56 jours (ou 63 jours, le cas échéant) pour l’inhibition de la reproduction comme critère d’évaluation (v. § 4.2.7). Les conditions et modes opératoires décrits dans la présente sous-section pour réaliser un essai de reproduction doivent s’appliquer à chacun de ces essais de toxicité de référence. Les conditions et modes opératoires supplémentaires décrits au § 4.2 pour un essai à concentrations multiples sur des échantillons de sol d’essai s’appliquent également à chaque essai de toxicité de référence.

Pour la première option consistant à effectuer des essais avec un toxique de référence parallèlement à l’essai d’évitement, il est fortement recommandé que l’essai de toxicité de référence soit un essai définitif à concentrations multiples, effectué en conditions statiques, utilisant la réaction d’évitement comme effet mesuré pour déterminer une CE50 sur 48 heures (v. § 4.3.7). Les conditions et modes opératoires décrits dans la présente sous-section pour réaliser un essai de réaction d’évitement d’une durée de 48 h doivent s’appliquer à chaque essai de toxicité de référence. Les conditions et modes opératoires supplémentaires décrits au § 4.3 pour un essai de réaction d’évitement à concentrations multiples sur des échantillons de sol d’essai s’appliquent également à chaque essai de toxicité de référence. Les résultats d’un essai de reproduction utilisant un toxique de référence (décrit dans le paragraphe précédent) peuvent également être appliqués pour satisfaire aux exigences de l’essai de toxicité de référence pour l’essai de réaction d’évitement^{Note de bas de page 86}. Les modes opératoires exposés à la section 6, pour la préparation et un essai sur un sol témoin négatif enrichi,s’appliquent également à tous les essais de toxicité de référence et on devrait les consulter pour obtenir de plus amples renseignements. Le guide d’Environnement Canada sur l’emploi d’un sédiment témoin négatif enrichi d’un toxique de référence (EC, 1995) donne des renseignements utiles, qui s’appliquent également à l’exécution d’essais de toxicité de référence employant un sol témoin négatif enrichi d’un toxique de référence.

L’essai de toxicité de référence à concentrations multiples doit être effectué en utilisant les mêmes récipients d’essai ou enceintes expérimentales que ceux utilisés pour les essais définitifs (§ 3.2.2 et 3.2.3), avec le même volume de sol (c’est-à-dire 350 ml environ pour E. andrei et 200 ml environ pour D. rubidus; § 4.1) à la teneur en humidité optimale. Le nombre de récipients d’essai ou d’enceintes expérimentales (répétition) par concentration de toxique de référence et sol témoin négatif doit être conforme à la description pour chaque essai (c’est-à-dire au moins 5 pour l’essai de reproduction, v. § 4.2.1; et au moins 2 pour l’essai de réaction d’évitement, v. § 4.3.1). Le nombre de vers de terre par récipient d’essai doit être de 4 pour l’essai de reproduction décrit au § 4.2.1. Le nombre de vers de terre par enceinte expérimentale doit être de 10 pour l’essai de réaction d’évitement conformément au § 4.3.1.

Les modes opératoires du début et de la fin d’un essai de toxicité à concentrations multiples doivent correspondre à ceux qui sont décrits dans les § 4.2.1 et 4.2.6. Les conditions expérimentales décrites dans le § 4.2.2 doivent s’appliquer. Les organismes d’essai doivent être nourris conformément à la description au § 4.2.4. On doit appliquer les observations et les mesures exposées dans le § 4.2.5.

Les modes opératoires du début et de la fin d’un essai de réaction d’évitement sur 48 h à concentrations multiples doivent correspondre à ceux qui sont décrits dans les § 4.3.1 et 4.3.6. Les conditions expérimentales décrites dans le § 4.3.2 doivent s’appliquer. Les organismes d’essai ne sont pas nourris pendant l’essai, conformément à la description au § 4.3.4. On doit appliquer les observations et les mesures exposées dans le § 4.3.5.

Les critères de validité des essais de toxicité de référence sont les mêmes que ceux décrits pour les essais définitifs (v. § 4.2.3 pour l’essai de reproduction et § 4.3.3 pour l’essai de réaction d’évitement). Les résultats d’un essai de toxicité de référence devraient s’exprimer en milligrammes de substance de référence par kilogramme de sol sec (mg/kg).

Les critères convenant à la sélection du toxique de référence à utiliser conjointement avec un essai de reproduction définitif utilisant des vers de terre sont notamment les suivants (EC, 1995) :

• facilité d’obtention de la substance à l’état pur;
• stabilité ou longue conservabilité à l’étalage;
• possibilité d’être distribué également dans tout le substrat non contaminé;
• bonne courbe concentration-réponse pour l’organisme d’essai;
• stabilité en solution aqueuse et dans le sol;
• danger minime pour l’utilisateur;
• dosage précis facile.

Tout essai de toxicité de référence à concentrations multiples exige au moins six variantes expérimentales (c’est-à-dire un sol témoin négatif et cinq concentrations du toxique de référence). L’acide borique de qualité « réactif » est recommandé comme toxique de référence lorsqu’on effectue des essais de toxicité de sols avec des vers de terre, bien que d’autres substances puissent être utilisées si elles se révèlent convenables^{Note de bas de page 87}. On devrait préparer chaque concentration expérimentale conformément aux conseils des § 4.1 et 6.2, au moyen d’un sol artificiel (§ 3.3.2) comme substrat.

Les essais réguliers de toxicité de référence (p. ex. effectués deux fois par an) employant l’acide borique (ou une autre substance convenable de référence) ajouté à un sol témoin négatif devraient appliquer de façon constante les mêmes conditions expérimentales et modes opératoires décrits dans le présent document. On devrait choisir une série de concentrations expérimentales, d’après les résultats d’essais préliminaires, pour calculer le paramètre requis (c’est-à-dire une CI50 après 56 j pour l’inhibition de la reproduction ou une CE50 après 48 h; v. § 6.4)^{Note de bas de page 88 , Note de bas de page 89}.

La Section de l’évaluation biologique et normalisation d’Environnement et Changement climatique Canada introduit l’utilisation de répétitions témoins positives, dans le cadre de chaque essai définitif, en remplacement des essais courants sur des toxiques de référence à concentrations multiples. Ainsi, la deuxième option d’essai avec un toxique de référence proposée ici consiste à inclure des répétitions d’une concentration unique d’un toxique connu qui suscite une réponse partielle uniforme, servant de témoin positif lors de chaque essai définitif de reproduction et de réaction d’évitement. Il est fortement recommandé que les essais de toxicité de référence effectués soient en rapport avec les essais définitifs réalisés; toutefois, pour les laboratoires qui effectuent fréquemment des essais de reproduction et rarement des tests de réaction d’évitement, les résultats pour la reproduction des concentrations témoin positives sur 56 jours peuvent également être appliqués pour satisfaire aux exigences des essais de toxicité de référence pour ce qui est de l’essai de réaction d’évitement de 48 heures. L’utilisation de témoins positifs consiste à exposer les organismes d’essai à des conditions comparables à celles d’un témoin négatif (même nombre de répétitions, même nombre d’organismes par répétition, mêmes récipients/enceintes et conditions d’essai, etc.), mais ils sont exposés à une concentration unique d’un toxique connu. Cette option pourrait être plus réalisable et plus pratique dans le cas des essais de toxicité à long terme de type « sublétal » et sur le « cycle de vie », notamment l’essai de reproduction de 56 jours mené sur E andrei et D. rubidus, décrit dans la présente méthode d’essai.

S’il est choisi, l’essai de toxicité traditionnel de référence à concentrations multiples doit être effectué deux fois par an. Toutefois, l’autre possibilité consiste à utiliser une concentration témoin positive en même temps que chaque essai définitif effectué. Cette approche pourrait offrir plusieurs avantages : elle est économique (réduction des efforts et des ressources); elle reflète une réponse des organismes sous-échantillonnés du lot (groupe) utilisé pour les essais; et elle peut mesurer les mêmes paramètres dans la même matrice et pendant la même durée que l’essai définitif, surtout pour les essais de toxicité sublétale du sol menés à long terme.

Il faudrait choisir le toxique pour la concentration témoin positive en fonction des mêmes critères de sélection que ceux utilisés pour un essai de toxicité de référence à concentrations multiples et employer de l’acide borique de qualité « réactif » (H₃BO₃). Il faut utiliser une seule concentration connue pour susciter une réponse partielle constante (par rapport aux essais de toxicité de référence traditionnels réalisés avec des concentrations multiples pour saisir une gamme d’effets, allant de l’absence totale de reproduction à l’absence d’effet sur la reproduction). Les répétitions témoins positives doivent être préparées en utilisant les mêmes récipients d’essai/enceintes expérimentales que ceux utilisés pour les essais définitifs (v. § 3.2.2 et 3.2.3), avec le même volume de sol (v. § 4.1) et une teneur en humidité optimale. Le nombre de récipients d’essai ou enceintes expérimentales (répétition) par échantillon témoin positif doit être d’au moins 5 pour l’essai de reproduction et d’au moins 3 pour l’essai de réaction d’évitement. Le nombre de vers par récipient d’essai doit être de 4 pour l’essai de reproduction décrit au § 4.2.1 et de 10 par enceinte expérimentale pour l’essai de réaction d’évitement décrit au § 4.3.1. La concentration témoin positive devrait être préparée conformément aux directives en 4.1 et 6.2 en utilisant un sol artificiel(v. § 3.3.2), et les modes opératoires et conditions d’essai doivent être conformes à ceux utilisés dans l’essai définitif, tel qu’il est décrit aux sections 4.2 et 4.3. Dans le cas de l’option avec témoin positif, le paramètre requis est le pourcentage de réponse. Pour l’essai de reproduction, la réponse moyenne (c’est-à-dire le nombre de jeunes engendrés) dans la concentration témoin positive est soustraite de la moyenne dans le témoin négatif, divisée par la réponse moyenne du témoin négatif et multipliée par 100 pour obtenir un pourcentage de réponse (v. annexe H). Pour l’essai de réaction d’évitement, le pourcentage de réponse est calculé conformément à la description au § 4.3.7.

Si cette méthode est retenue, la réponse des témoins positifs (c’est-à-dire ampleur cible avec effet) doit être définie et doit inclure les limites d’acceptabilité pour chaque paramètre. Les limites d’acceptabilité aux fins de la présente méthode sont synonymes de limites d’avertissement et elles doivent être définies de façon opérationnelle dans chaque laboratoire en prévoyant des limites de variabilité adaptées à l’objectif. Par exemple (v. annexe H), un laboratoire pourrait définir pour son témoin positif que l’acide borique (p. ex. 245 mg H₃BO₃/kg de sol sec) doit produire une inhibition de 72 % de la production des descendants (c’est-à-dire ampleur cible avec effet) qui se situe entre les limites d’avertissement calculées (c’est-à-dire au moins 60 % et pas plus de 84 %), avec un coefficient de variation (CV) de la réponse dans le temps ne dépassant pas 30 %. En conformité avec les résultats actuellement requis pour les essais de toxicité de référence à concentrations multiples, il ne faut pas s’appuyer sur les résultats d’un essai témoin positif pour déterminer l’acceptabilité des résultats des essais correspondants (c’est-à-dire en tant que critères de validité des essais). Il faut plutôt s’en servir pour surveiller la cohérence dans le temps (moyennes similaires parmi les essais de témoins positifs) ainsi que la précision dans le temps (chevauchement des gammes parmi les essais de témoins positifs). Les valeurs aberrantes dans les réponses des organismes d’essai ou la variabilité extrême dans les réponses obtenues lors des essais individuels doivent servir de base pour déclencher des recherches sur les causes potentielles, comme la sensibilité des élevages, la santé des élevages, les conditions du milieu ou de l’installation ainsi que la performance des techniciens. Les données obtenues des témoins négatifs et des témoins positifs, tout comme les données sur la santé des élevages, devraient être surveillées dans le temps (par une analyse des tendances) afin d’indiquer de manière proactive les changements observés dans la réponse des organismes^{Note de bas de page 90}. L’annexe H donne un exemple de la façon de choisir une concentration témoin positive pour l’essai de reproduction et de calculer les limites d’avertissement.

Pour les essais de toxicité de référence à concentrations multiples et les témoins positifs, lorsque suffisamment de données ont été recueillies (EC, 1995, 2005a), on doit porter successivement sur une carte de contrôle tous les paramètres comparables (c’est-à-dire les CE50 ou CI50 pour un toxique de référence particulier calculées à partir des essais de toxicité de référence à concentrations multiples, ou le pourcentage de réduction de la production des juvéniles ou le pourcentage de réaction d’évitement par rapport au témoin pour une concentration unique du toxique de référence mis à l’essai en tant que témoin positif). Pour les essais de toxicité de référence à concentrations multiples, la carte de contrôle devrait porter sur son axe vertical le logarithme de la concentration en fonction de la date ou du numéro de l’essai sur l’axe horizontal. Dans le cas des concentrations témoins positives, sur chacune des cartes de contrôle, il faudrait porter le pourcentage de réduction de la production ou le pourcentage de réaction d’évitement sur l’axe vertical, et la date ou le numéro de l’essai, sur l’axe horizontal (annexe H). On devrait examiner chaque nouveau point de données pour le toxique de référence afin de déterminer s’il se situe à plus ou moins deux écarts types (± 2 ET) des valeurs obtenues dans des essais antérieurs comparables avec le même toxique de référence et le même mode opératoire (EC, 2005b, 2013b, 2014a; ECCC, 2020a; annexe H). Il faut préparer une carte de contrôle séparée et l’actualiser pour chaque mode opératoire différent (p. ex. différents types d’essais, différentes espèces d’organismes d’essai ou différents toxiques de référence) et effet mesuré. On devrait comparer chaque nouveau point de données du toxique de référence aux limites établies du graphique : le résultat du toxique de référence est acceptable s’il se situe dans les limites d’avertissement.

Dans le cas des essais de toxicité de référence à concentrations multiples, le logarithme de la concentration (y compris de la CE50 et CI50) doit servir au calcul de la moyenne et de l’écart type ainsi qu’à l’établissement de tous les graphiques. De la sorte, on continue de se conformer à l’hypothèse selon laquelle chaque CE50 ou CI50 a été estimée à partir de logarithmes de concentrations. On peut établir la carte de contrôle en portant la moyenne et la valeur ± 2 ET en tant que logarithme, ou en les convertissant en valeurs arithmétiques, puis en les portant sur l’échelle logarithmique de concentration. Différentes approches pour établir une carte de contrôle (p. ex. Levey-Jennings, moyenne mobile) sont acceptables. Dans le cas des concentrations témoins positives, on peut établir la carte de contrôle en reportant la moyenne et la valeur ± 2 ET liée au pourcentage de réduction dans la reproduction par rapport au témoin sur une échelle arithmétique.

On devrait recalculer la moyenne des valeurs des effets mesurés connus, ainsi que les limites supérieure et inférieure d’avertissement (± 2 ET) à chaque nouveau résultat que l’on obtient pour le toxique de référence jusqu’à ce que la statistique se stabilise (EC, 1995, 2005b, 2013b, 2014a; ECCC, 2020a; annexe H). Les cartes de contrôle peuvent servir à dégager des tendances au fil du temps. Des exemples de tendances qui pourraient être observées sont notamment les suivantes : une tendance ascendante ou descendante, plusieurs points successifs d’un côté de la moyenne, des changements qui sont observés à différents moments de l’année et des valeurs successives des points de données situées à l’extérieur des limites d’avertissement ± 2 ET. Si un point de donnée particulier tombe à l’extérieur des limites d’avertissement, la sensibilité des organismes d’essai ainsi que l’exécution et la précision de l’essai deviennent suspectes. Comme cela pourrait se produire 5 % du temps, du seul fait du hasard, un point de donnée aberrant n’est pas nécessairement le signe d’une sensibilité anormale de l’élevage ou du lot de vers provenant d’une source de l’extérieur ou gardés au laboratoire ni d’une précision insatisfaisante des données sur la toxicité. Ce serait plutôt un avertissement. On devrait alors effectuer une vérification approfondie de toutes les conditions et de tous les modes opératoires utilisés pour l’élevage, l’entretien ou l’acclimatation et l’essai, ainsi que pour l’efficacité technique. Selon les constatations, on pourrait devoir répéter l’essai de toxicité de référence ou la concentration témoin positive, établir un nouvel élevage, sélectionner des vers d’un autre élevage ou obtenir un nouveau lot d’organismes d’essai d’une source externe avant d’entreprendre d’autres essais de toxicité de sols.

Les résultats qui se situent à l’intérieur des limites d’avertissement ne sont pas nécessairement un signe de constance du laboratoire. Si le laboratoire produisait des résultats historiques extrêmement variables, les limites d’avertissement seraient larges; un nouveau résultat pourrait se situer dans cette zone tout en étant indésirable. Environnement Canada (EC, 1995, 2005b) a proposé comme limites raisonnables un coefficient de variation (CV) ne dépassant pas 30 % et, de préférence, de 20 %, pour la moyenne des valeurs disponibles de log(CE50) ou log(CI50) [v. l’alinéa précédent]. Pour ces méthodes d’essai biologique, le coefficient de variation des moyennes obtenues dans les essais de toxicité de référence ou les témoins positifs effectués à l’aide d’acide borique ne devrait pas dépasser 30 %.

Un résultat d’essai de toxicité de référence ou de témoin positif qui se situe à l’extérieur des limites de contrôle (moyenne ± 3 ET) révèle presque à coup sûr que l’essai est inacceptable et qu’il devrait être repris après un examen attentif de tous ses aspects. Si les paramètres d’essai se situent entre les limites de contrôle et les limites d’avertissement plus de 5 % du temps, cela révélerait une détérioration de la précision. Encore là, l’essai le plus récent devrait être repris après un examen attentif des modes opératoires, des conditions et des calculs.

On peut doser, par les méthodes chimiques appropriées (notamment par spectrophotométrie d’émission atomique [SEA] à plasma à couplage inductif [ICP]pour le dosage du bore), le toxique de référence (y compris les concentrations uniques utilisées comme témoin positif) dans toutes les solutions mères. Pour préparer les concentrations d’essai du toxique de référence dans un sol, on ajoute une quantité mesurée de solution mère au sol témoin négatif^{Note de bas de page 91} et on mélange soigneusement^{Note de bas de page 92}. Après préparation des mélanges du toxique de référence dans le sol, on devrait prélever, au moins, des aliquotes du sol témoin négatif ainsi que des concentrations minimale, médiane et maximale, ou de la concentration unique utilisée pour un témoin positif^{Note de bas de page 93}. Chaque aliquote devrait être soit analysée directement, soit entreposée pour analyse ultérieure (c’est-à-dire à la fin de l’essai) si le ou les résultats de l’essai de toxicité de référence ou du témoin positif fondé sur les concentrations nominales se trouvait à l’extérieur de la limite d’avertissement. Si on conserve des aliquotes de l’échantillon, ce doit être à l’obscurité, à 4 ± 2 °C. Les aliquotes entreposées qui doivent faire l’objet de dosages devraient être analysées promptement, dès la fin de la réalisation de l’essai avec un toxique de référence. On devrait calculer le résultat de l’essai de toxicité de référence ou du témoin positif (c’est-à-dire la CE50 après 48 heures, la CI50 après 56 jours, le pourcentage de réduction de la réponse par rapport au témoin ou le pourcentage de réaction d’évitement) à partir des concentrations mesurées, si elles sont sensiblement différentes (c’est-à-dire d’au moins 20 %) des concentrations nominales et si l’exactitude des analyses chimiques est satisfaisante.

Si on emploie de l’acide borique comme toxique de référence pour un essai de toxicité de référence ou un témoin positif, la méthode d’analyse décrite ci-après (MEEO, 1996) est un exemple de mode opératoire chimique qui peut être utilisé pour confirmer les concentrations nominales. Un sous-échantillon de 1-5 g de sol enrichi avec de l’acide borique est mis à sécher à 105 °C jusqu’à obtention d’un poids constant. On extrait ensuite une aliquote de 1 g à l’aide d’une solution de CaCl₂ 0,01 M en faisant bouillir une suspension de sol dans 50 ml de cette solution d’extraction et en ajoutant une quantité supplémentaire de cette solution pour rajuster le volume final à 50 mL. L’extrait de 50 ml est ensuite filtré à travers un filtre Whatman^MD no 4, puis dilué jusqu’à obtention d’un volume final de 100 mL. Un échantillon témoin est préparé de la même manière. On analyse ensuite le filtrat par la méthode SEA/ICP afin de doser le bore élémentaire. On calcule ensuite la concentration d’acide borique (H₃BO₃) dans le sol à l’aide de l’équation suivante :

${\displaystyle \text{acide borique }\left(\frac{\text{mg}}{\text{kg de poids sec}}\right)=\frac{\frac{\text{µg B}}{\text{mL}}\text{(measurée)}\times \text{volume final (mL)}\times \frac{{\text{PM}}_{\text{acide borique}}}{{\text{PM}}_{\text{bore}}}}{1000\times \text{poids de l’échantillon (mg poids sec)}}\times {10}^6}$

Dans la plupart des cas, la limite de détection de l’acide borique dans le sol serait de 1 mg/kg de sol sec (Stephenson, 2003b).

Section 5 : Modes opératoires particuliers pour l’essai de toxicité d’un sol prélevé sur le terrain ou d’une matière particulaire semblable

La présente section renferme des instructions précises pour la préparation et l’essai d’échantillons de sol (d’un site) prélevés sur le terrain ou d’une matière particulaire semblable. Ces instructions s’ajoutent aux modes opératoires exposés dans la section 4.

Des instructions détaillées sur le prélèvement, la manipulation, le transport, l’entreposage et la préparation d’échantillons de sol sont fournies dans le Guide d’échantillonnage et de préparation de sol contaminéaux fins d’essais biologiques d’Environnement Canada (EC, 2012). Ce document décrit les modes opératoires généraux applicables aux préparatifs entourant l’échantillonnage, dont les suivants : établissement des objectifs de l’étude; délimitation de la zone d’étude; collecte de données documentaires; levés de l’emplacement, levés pédologiques et classification écologique du sol; choix des stratégies et des lieux d’échantillonnage; détermination du nombre et de la taille des échantillons à prélever; établissement de procédures adéquates d’assurance et de contrôle de la qualité (AQ/CQ); facteurs à prendre en considération en matière d’environnement, de santé et de sécurité; conception de plans d’échantillonnage. Des indications y sont également fournies quant au prélèvement du sol, notamment le choix des échantillonneurs, le prélèvement d’échantillons par horizon ou en fonction de la profondeur, la manipulation des échantillons in situ, le choix des récipients à échantillon et le transport des échantillons. On trouve aussi dans EC (2012) les modes opératoires que doit suivre le personnel lors de la réception, de la préparation (séchage, humectation, tamisage, broyage, homogénéisation, reconstitution, caractérisation) et de l’entreposage d’échantillons de sol destinés à des essais biologiques. On y indique également la marche à suivre et les points à examiner en fonction de la nature des contaminants (comme des composés volatils ou instables), des exigences des essais biologiques et des objectifs de l’étude. Des conseils sont fournis sur l’échantillonnage, la manipulation, le transport, l’entreposage et la préparation d’échantillons de sol provenant d’écozones de la forêt boréale, de la taïga et de la toundra, de même que de sols organiques et de sols prélevés dans des milieux humides. On devrait consulter EC (2012) et suivre les indications qui y sont fournies (en plus de celles que renferme le présent document) lorsqu’on prélève sur le terrain des échantillons de sol et qu’on les prépare en vue d’essais toxicologiques avec des vers de terre, conformément aux présentes méthodes.

5.1 Prélèvements des échantillons

EC (2012) fournit de nombreux conseils sur le plan de prélèvement d’échantillons sur le terrain et les techniques convenables à cette fin. Ces conseils partent du principe selon lequel on dispose de données sur la caractérisation des propriétés chimiques et pédologiques du lieu à l’étude. Les études de la toxicité des sols effectuées sur le terrain à l’aide d’essais biologiques employant des vers de terre ou d’autres organismes convenables, inféodés aux sols (p. ex. EC, 2005b, 2013b, 2014a; ECCC 2020a) font souvent partie d’examens plus vastes englobant l’évaluation et l’assainissement de lieux contaminés (Stephenson et al., 2008; EC, 2012). Ces examens pourraient comprendre une batterie d’essais de toxicité visant à évaluer la toxicité du sol en utilisant plus d’un type d’essai et plus d’une espèce d’expérience parallèlement à des essais sur la bioaccumulation des contaminants, des analyses chimiques, des relevés biochimiques des organismes de l’épifaune ou de l’endofaune et, peut-être, le recueil de données géologiques et hydrographiques. Cette approche intégrée peut fournir de l’information plus exacte sur le risque associé à la contamination du sol aux fins de l’évaluation du risque écologique et de la gestion des lieux contaminés (EC, 2012). On peut améliorer la corrélation statistique dans ces examens et comprimer les coûts si on prélève les échantillons conjointement pour tous ces essais, analyses et acquisitions de données.

Les échantillons de sol à utiliser dans l’une ou l’autre des deux méthodes d’essai biologique décrites dans le présent document (section 4) pourraient être prélevés à un rythme trimestriel, semestriel ou annuel, dans un certain nombre de lieux effectivement ou potentiellement contaminés, pour les besoins de la surveillance et de l’assurance du respect des règlements. On pourrait également prélever des échantillons de sols en une ou plusieurs occasions pendant des études sur le terrain d’emplacements pour y définir la qualité des sols à l’échelle spatiale (c’est-à-dire horizontale ou verticale) ou temporelle. Les essais biologiques (de toxicité) servent de plus en plus à tous les niveaux de l’évaluation du risque. Selon les objectifs précis de cette évaluation et l’état d’un lieu contaminé, on peut utiliser les données toxicologiques propres à l’emplacement pour combler différents besoins, dont les suivants :

• repérer, au moyen d’une analyse préalable du sol, les zones hautement toxiques ou présentant une toxicité sublétale;
• identifier un sol d’emplacement (par suite de la détermination de la concentration du ou des contaminants de ce sol) ayant un impact toxique;
• évaluer les effets toxiques létaux ou sublétaux d’un sol contaminé;
• cerner les caractéristiques du sol qui modifient la biodisponibilité;
• établir (en partie) des normes ou des objectifs d’assainissement propres à l’emplacement;
• évaluer l’efficacité des techniques de biorestauration ou d’assainissement de l’emplacement;
• surveiller à long terme un lieu assaini (EC, 2012).

EC (2012) renferme d’autres conseils concernant l’application des essais biologiques dans l’évaluation des lieux contaminés, de même que de nombreuses indications sur la définition des objectifs des études et sur l’établissement d’un plan d’expérience intégrant des essais biologiques dans l’évaluation et la gestion d’un lieu contaminé.

Un plan d’expérience précise les méthodes et stratégies d’échantillonnage ainsi que la marche à suivre pour satisfaire à tous les objectifs de qualité des données (OQD). Il renferme notamment les renseignements suivants : OQD; définition de la zone d’étude; collecte de données documentaires; choix et emplacement des lieux d’échantillonnage; choix des stratégies d’échantillonnage; procédures d’AQ/CQ; points à considérer en matière d’environnement, de santé et de sécurité. La stratégie d’échantillonnage (c’est-à-dire le processus par lequel on détermine le type d’échantillons à prélever, le lieu du prélèvement et la méthode de prélèvement) repose avant tout sur les objectifs de l’étude et, accessoirement, sur les caractéristiques de l’emplacement (pour plus de détails, v. EC [2012]).

Dans un site, le nombre de lieux où l’on fait des prélèvements et le nombre d’échantillons réitérés par lieu sont propres à chaque étude. Le nombre d’échantillons à prélever dépend des objectifs de l’étude, des OQD, du degré souhaité de certitude et de facteurs propres à l’emplacement. En outre, le nombre d’échantillons réitérés à prélever est fonction du plan d’expérience applicable aux essais biologiques et, dans la plupart des cas, d’un compromis entre les contraintes logistiques et budgétaires (p. ex. temps et coûts) ainsi que les considérations pratiques. On peut recueillir divers types d’échantillons (ponctuels, composites et en vrac), selon les objectifs de l’étude.

Dans le cas des essais biologiques, on prélève habituellement des échantillons de sol perturbé – dans ce type d’échantillonnage, les particules du sol se dissocient pendant le prélèvement. Cependant, lorsqu’on prélève des échantillons de sol intact (c’est-à-dire des carottes), les particules de sol et la structure des pores demeurent inchangées. La marche à suivre pour le prélèvement d’échantillons de sol intact aux fins d’essais biologiques est décrite dans EC (2012). Il convient toutefois de préciser que les indications fournies ici s’appliquent principalement au prélèvement d’échantillons de sol perturbé.

EC (2012) décrit les modes opératoires propres à la collecte, à la manipulation et à la préparation des échantillons de sol contaminé par des composés volatils ou instables, de même que les modifications applicables à la collecte, au transport, à l’entreposage et à la préparation de ces échantillons et aux analyses de leurs contaminants. Il faudrait se conformer à ces modes opératoires afin de réduire au minimum la perte de ces contaminants, que ce soit pendant l’échantillonnage et la manipulation des sols sur le terrain, le transport des échantillons au laboratoire d’essais toxicologiques ou la période précédant les essais (c’est-à-dire pendant l’entreposage, la manipulation ou la préparation des échantillons). Les questions connexes aux procédures d’AQ/CQ sont également abordées dans EC (2012).

Pour les besoins de certaines opérations de surveillance ou à des fins réglementaires, on devrait prélever des échantillons réitérés de sol (c’est-à-dire des échantillons réitérés de terrain ou des échantillons séparés provenant de différents échantillons ponctuels ou en vrac, prélevés sur le même emplacement) dans chaque lieu d’échantillonnage, y compris dans un ou plusieurs lieux de référence. Ces échantillons réitérés^{Note de bas de page 94} fournissent des renseignements sur la variation de la toxicité ou de la biodisponibilité des contaminants du lieu à l’étude et permettent d’établir des comparaisons statistiques sur la toxicité du sol de plus d’un emplacement (EC, 2005a). On peut mesurer la toxicité, pour des vers de terre, de chacun de ces « vrais échantillons réitérés » de sol en tant querépétition de laboratoire individuelle (un seul récipient d’essai ou enceinte expérimentale par échantillon réitéré) ou répétitions multiples de laboratoire (plus d’un récipient d’essai ou enceinte expérimentale par échantillon réitéré; v. § 5.6.1). ECCC n’a pas formulé de recommandation sur le nombre minimal d’échantillons réitérés, fondé sur des considérations statistiques. On peut fixer le nombre d’échantillons réitérés sur le terrain dans le cadre du plan d’expérience et des objectifs de qualité des données (EC, 2012). La pratique habituelle des laboratoires consiste à préparer des répétitions de laboratoire, et les directives sur le nombre minimal de répétitions décrites ici sont bien étayées par le calcul de la puissance. À certaines autres fins (p. ex. études de dépistage préliminaires ou études approfondies de la répartition spatiale de la toxicité), le plan de l’étude pourrait englober un seul échantillon réitéré (c’est-à-dire un prélèvement réitéré sur le terrain) de chaque emplacement, y compris les sols de référence et/ou les sols témoins. Si l’objectif consiste à déterminer et donc à classer par ordre de priorité les sols ou les emplacements qui nécessitent une évaluation de la toxicité plus poussée, les répétitions en laboratoire peuvent ne pas être nécessaires; toutefois, si l’objectif consiste à quantifier les effets dans ces échantillons réitérés uniques prélevés sur le terrain (v. § 4.2.7 et 4.3.7), ils doivent être homogénéisés et répartis entre un certain nombre de récipients d’essai ou d’enceintes expérimentales (répétitions) (c’est-à-dire répétitions de laboratoire), en fonction de l’espèce utilisée, du type d’essai effectué et de l’ampleur ciblée avec effet (v. § 4.2.1, 4.3.1 et 5.6.2)^{Note de bas de page 95}. Cette approche empêche toute détermination de la toxicité moyenne dans une station donnée d’échantillonnage et empêche tout à fait toute conclusion selon laquelle la station diffère de la station témoin ou de la station de référence ou de tout autre endroit. Cependant, elle permet la comparaison statistique de la toxicité de cet échantillon particulier à celle de l’échantillon de référence ou de l’échantillon témoin ou d’un ou de plusieurs échantillons d’autres endroits. Il importe de réaliser que l’on ne doit extrapoler aucune conclusion sur les différences issues de l’essai d’échantillons uniques prélevés sur le terrain, sans réitération sur le terrain, pour formuler une ou des conclusions sur les stations d’échantillonnage.

Quels que soient les objectifs de l’étude, on devrait échantillonner un ou des sols de référence (qu’on présume non contaminés) parallèlement à chaque échantillonnage de sol d’emplacement (v. § 3.5)^{Note de bas de page 96}. On devrait chercher pour le prélèvement d’un sol de référence des emplacements où les propriétés géochimiques du sol sont semblables à celles du sol de site. Voici certaines des plus importantes propriétés physicochimiques que l’on devrait faire correspondre pour ces deux types de sols : granulométrie, teneur en COT, TMO, pH et conductivité électrique. De plus, on pourrait faire correspondre d’autres propriétés, comme la CEC, le carbone inorganique total, le potentiel d’oxydoréduction et la CRE (EC, 2012). Il pourrait ne pas être justifié de faire correspondre la teneur en COT (%) ou la teneur en matière organique (%) dans les cas où la pollution (p. ex. dans les boues résiduaires ou industrielles ou due à ces boues) explique la teneur élevée en carbone organique dans les sols d’essai. Des études préliminaires visant à évaluer la toxicité et les propriétés géochimiques du sol dans la ou les régions auxquelles on s’intéresse et dans des emplacements proches permettent de choisir les emplacements appropriés des stations de prélèvement du sol de référence. On trouvera dans EC (2012) d’autres conseils sur l’échantillonnage d’un sol de référence aux fins d’essais biologiques, de même que les modes opératoires à suivre lorsqu’on ne peut trouver un tel sol.

On pourrait prélever des échantillons de boues urbaines ou industrielles (p. ex. boues d’épuration, stériles déshydratés ou biosolides d’un clarificateur industriel ou d’un étang de décantation) pour l’évaluation de leur(s) effet(s) toxique(s) sur les vers de terre, ainsi que pour des analyses géochimiques et le dosage des contaminants. On pourrait également prélever d’autres déchets particulaires dont on envisage l’épandage pour en faire l’évaluation toxicologique et physicochimique. EC (2012) renferme des indications sur les points précis à considérer en vue de l’échantillonnage d’amas de déchets.

Un plan d’échantillonnage constitue un élément essentiel du plan d’expérience. On y décrit les modes opératoires détaillés à suivre pour prélever, manipuler et préparer les échantillons in situ (au besoin) et pour les emballer, les étiqueter, les entreposer (le cas échéant) et les transporter. Avant l’échantillonnage, il est important d’avoir en main une description complète du sol à échantillonner. De plus, les sols devraient être décrits en détail à l’échelle du site à l’étude. Au Canada, les sols sont classés selon le Système canadien de classification des sols (SCCS). Ceux échantillonnés aux fins d’essais biologiques devraient être classés au moins jusqu’à l’échelle du sous-groupe du SCCS, conformément aux indications fournies dans EC (2012). On trouvera à l’annexe E d’EC (2012) des informations détaillées sur le SCCS et sur les éléments fondamentaux de l’identification taxonomique des sols.

Les modes de prélèvement d’échantillons (ponctuels, en vrac ou composites) dépendent des objectifs de l’étude et de la nature du sol (ou autre matière particulaire semblable) à échantillonner. Pour le prélèvement d’échantillons de sol, on utilise fréquemment des pelles, des tarières ou des carottiers (de préférence en acier inoxydable). Les pelles et les truelles sont les outils le plus couramment utilisés pour prélever d’importants volumes de sol; toutefois, il faut s’assurer que l’échantillon est représentatif et exempt de biais (p. ex. les prélèvements doivent se faire à la même profondeur ou dans le même horizon). Les carottiers, emporte-pièce, cadres de coupe et échantillonneurs cylindriques sont des instruments plus précis, mais ils conviennent moins à l’extraction d’importants volumes de sol. Pour prélever des échantillons à une profondeur précise, il serait plus efficace et moins exigeant en main-d’œuvre d’utiliser une tarière. Les dispositifs d’échantillonnage les plus courants et les modes opératoires qu’il faudrait suivre pour échantillonner un sol sont décrits dans EC (2012).

Au Canada, la plupart des sols des écozones forestières ou non agricoles sont fortement stratifiés en horizons pédologiques. La structure et la chimie de ces horizons peuvent varier grandement et influer différemment sur la biodisponibilité et la toxicité des contaminants pour la pédofaune. La couche supérieure (horizon A) est celle qui est le plus souvent échantillonnée aux fins d’essais biologiques. Elle renferme le plus de matière organique et c’est là que se déroule la plus grande partie de l’activité biologique des sols minéraux. Selon les objectifs de l’étude, on peut aussi prélever des échantillons de litière (horizon L), de matières fulviques/humiques (horizons F et H) (p. ex. un terrain boisé) ou de matière organique superficielle (horizon O) des sols minéraux (p. ex. dans la toundra), le cas échéant. Pourraient également être échantillonnés l’horizon subsuperficiel B et (quoique moins fréquemment) l’horizon C. Dans la mesure du possible, les sols échantillonnés dans les écozones de la région boréale et de la taïga pour évaluer leurs effets sur les vers (décrits dans le présent document) doivent être prélevés par horizon pédologique distinct. Il est recommandé d’échantillonner en fonction de la profondeur les sols dont les horizons pédologiques sont indistincts (p. ex. dont les horizons superficiels ont été mélangés ou perturbés par des activités anthropiques). Avant d’échantillonner un sol par horizon, la classification du profil pédologique de l’emplacement doit d’abord avoir été établie, comme il est indiqué plus haut et dans EC (2012). Lorsqu’on échantillonne un sol par horizon, il faudrait éviter toute dilution de la contamination, en particulier lorsque celle-ci ne s’étend verticalement que dans une partie d’un horizon. Dans un tel cas, l’horizon peut être échantillonné jusqu’à une certaine profondeur seulement ou faire l’objet de deux échantillonnages à deux profondeurs différentes (EC, 2012).

EC (2012) renferme d’autres indications détaillées sur le prélèvement d’échantillons aux fins d’essais toxicologiques. Avant le prélèvement, il faut d’abord délimiter le lieu d’échantillonnage. La surface de l’endroit où chaque échantillon doit être prélevé devrait être débarrassée de tout débris, brindilles, feuilles, pierres, chaume et litière (sauf si l’échantillonnage de l’horizon L est prévu dans le plan de l’étude). Si l’endroit se trouve dans un endroit herbeux ou occupé par d’autres végétaux herbacés, on devrait raser cette végétation et l’enlever avant de prélever l’échantillon. L’arrachage devrait être fait de manière à entraîner le moins possible de particules de sol avec les racines. On devrait arracher les chevelus racinaires denses (p. ex. de graminées) puis les secouer vigoureusement pour en détacher les particules de sol. Les échantillons de sol à prélever pour l’évaluation de la toxicité et des propriétés chimiques devraient provenir d’une ou de plusieurs profondeurs qui représentent l’horizon ou les horizons auxquels on s’intéresse (p. ex. l’horizon superficiel ou un ou plusieurs horizons plus profonds du sol ou du sous-sol si on s’intéresse à l’historique du dépôt des contaminants). Lorsque les sols présentent des horizons distincts (p. ex. sols forestiers non perturbés), on doit les échantillonner par horizon après avoir creusé une fosse (EC, 2012).

Le volume minimal (ou la masse minimale) de sol nécessaire à un essai est fonction des objectifs de l’étude, des conditions de l’emplacement et du type d’essai à exécuter. Il varie selon le plan d’expérience (p. ex. essai à concentration unique ou à concentrations multiples), les caractéristiques physiques du sol (p. ex. masse volumique apparente, teneur en humidité, quantité de débris dans le sol), la nature des analyses chimiques à exécuter et la distribution des contaminants dans le sol (p. ex. distribution verticale). On devrait calculer, avant d’entreprendre le programme d’échantillonnage, le volume nécessaire de sol par échantillon. Ce calcul devrait tenir compte de la quantité de sol nécessaire à la préparation d’échantillons subdivisés en laboratoire pour les essais de toxicité du sol ainsi que des échantillons nécessaires à la caractérisation granulométrique, au dosage du COT (%), au dosage de la matière organique (%), à la détermination de la teneur en humidité et à des analyses chimiques particulières. On trouvera dans EC (2012) des recommandations quant au volume de sol à prélever pour des types précis d’essais biologiques. Pour les essais décrits dans le présent document, on a normalement besoin de 5 à 7 L de sol par échantillon, bien que ce volume dépende des objectifs et du plan de l’étude (p. ex. essai à concentration unique ou à concentrations multiples) ainsi de la nature des analyses chimiques à effectuer et, peut-être, de la nature du sol (p. ex. nécessité d’éliminer l’excès d’eau et/ou les débris au laboratoire, ce qui risque de réduire le volume de l’échantillon). Pour obtenir le volume nécessaire, il faut souvent combiner des sous-échantillons prélevés par le dispositif d’échantillonnage. On devrait suivre les conseils donnés dans EC (2012) pour le regroupement de sous-échantillons sur le terrain. On devrait utiliser dans tous les emplacements échantillonnés sur le terrain la même méthode de prélèvement. Les échantillons de chaque horizon doivent être transférés et entreposés dans des récipients distincts, sauf si le profil pédologique a été perturbé par suite de mesures d’assainissement de l’emplacement.

On peut commencer à préparer les échantillons in situ, avant leur expédition au laboratoire d’essais. Cette préparation peut inclure l’enlèvement à la main des débris ou des organismes, le séchage à l’air, le tamisage et l’homogénéisation des échantillons. Toutes ces procédures sont décrites en détail dans EC (2012).

5.2 Étiquetage, transport, entreposage et analyse des échantillons

Les récipients de transport et d’entreposage des échantillons de sol ou d’une autre matière particulaire prélevés sur le terrain doivent être faits d’un matériau inerte non toxique. Le choix du récipient dépend du volume et de ses éventuelles utilisations finales, de même que du type et de la nature de la contamination du sol. Les récipients doivent être propres et refermables hermétiquement, et ils devraient être faciles à manipuler et suffisamment résistants pour supporter le poids de l’échantillon (EC, 2012). On utilise couramment des sacs de plastique épais (p. ex. 0,1016 mm ou 4 mils) pour le transport et l’entreposage des échantillons. Si on utilise des sacs de plastique, il est recommandé de placer chacun d’eux dans un second récipient propre, opaque (p. ex. une glacière ou un seau de plastique muni d’un couvercle) pour prévenir les déchirures, soutenir la masse de l’échantillon et le maintenir à l’obscurité pendant son transport (ASTM, 2012). Les contenants ou doublures en plastique ne devraient pas être utilisés s’il y a des risques que le plastique altère les caractéristiques du sol (p. ex. risques de lixiviation de composants de la matière plastique dans le sol), que les contaminants soient adsorbés sur le plastique, ou qu’ils entraînent sa détérioration. L’annexe H d’EC (2012) renferme une liste des récipients recommandés pour le transport et l’entreposage des échantillons de sol.

Après avoir déposé l’échantillon dans le récipient, on devrait réduire au minimum l’espace libre (p. ex. en expulsant l’air du sac de plastique partiellement rempli en pressant sur le sac, puis en le fermant avec du ruban adhésif). Immédiatement après le remplissage, il faut sceller, étiqueter ou coder chaque récipient. L’étiquetage et les enregistrements connexes doivent comprendre au moins un code ou une description identifiant le type d’échantillon (p. ex. ponctuel, en vrac, composite), la date et l’heure du prélèvement, l’emplacement d’échantillonnage et son emplacement exact, l’état de l’échantillon, son numéro d’identification (y compris le numéro de réitération, le cas échéant) et le volume de l’échantillon. Le nom et la signature ou les initiales de la ou des personnes ayant effectué le prélèvement devraient aussi être inclus. Les préleveurs de sol devraient également tenir des dossiers décrivant dans le détail ce qui suit :

• la nature, l’apparence et le volume de chaque échantillon;
• le mode opératoire et l’appareillage utilisés pour le prélèvement;
• tout mode opératoire utilisé pour obtenir des échantillons composites ou des sous-échantillons d’échantillons en vrac ou ponctuels prélevés sur le terrain;
• le nombre d’échantillons réitérés prélevés dans chaque station d’échantillonnage;
• l’heure du prélèvement;
• les types et le nombre de récipients utilisés pour le transport des échantillons;
• toute mesure effectuée sur le terrain (p. ex. température, pH, humidité du sol, densité apparente), sur les lieux du prélèvement;
• la caractérisation des horizons pédologiques;
• tout essai réalisé in situ (p. ex. sac de litière, exposition de vers de terre, bandes appâtées);
• les modes opératoires du refroidissement et du transport des échantillons et les conditions dans lesquelles ces opérations ont eu lieu;
• les observations des conditions existant dans l’environnement, au moment du prélèvement (p. ex. pluie);
• les observations de la faune du sol et de la végétation sur les lieux du prélèvement et tout prélèvement de spécimens;
• la durée et les conditions d’entreposage des échantillons avant leur arrivée au laboratoire;
• des renseignements sur le mode de transport des échantillons.

Le tableau 10 d’EC (2012) renferme d’autres recommandations quant aux observations et mesures effectuées in situ.

Les échantillons de sol ne devraient pas être conservés au froid, ni geler ou surchauffer pendant le transport ou l’entreposage. Au besoin, on devrait utiliser des blocs ou sachets réfrigérants, de la glace ordinaire ou d’autres moyens assurant la réfrigération des échantillons (p. ex. 7 ± 3 °C) durant le transport. Il est recommandé de les conserver à l’obscurité (c’est-à-dire de les garder dans des récipients de transfert opaques tels que des glacières ou des seaux de plastiques munis d’un couvercle) pendant le transport, particulièrement s’ils peuvent renfermer des HAP ou d’autres substances ou produits chimiques susceptibles de photoactivation ou, par ailleurs, risquant d’être altérés par une exposition à la lumière du jour. La documentation appropriée doit accompagner tous les envois d’échantillons, notamment le formulaire de chaîne de conservation et tout document réglementaire connexe au transport de matières contaminées (v. EC, 2012 pour d’autres indications sur le transport des échantillons).

Il faut consigner la date de réception de l’échantillon au laboratoire ainsi que sa température à la réception. La température et la teneur en humidité des échantillons à l’arrivée au laboratoire doivent également être mesurées et notées. On devrait aussi examiner chaque échantillon de sol d’essai ou d’horizon pédologique prélevé séparément sur le terrain et consigner une description qualitative des éléments suivants : couleur; texture; indications sommaires sur la teneur en humidité; présence d’eau surnageante; d’invertébrés indigènes, de champignons ou de matière végétale; toute odeur forte (EC, 2012). Les échantillons qu’on prévoit entreposer pour un usage ultérieur doivent être conservés dans des conditions permettant de maintenir les caractéristiques et la qualité du sol pour son utilisation prévue (EC, 2012). Si le sol renferme des contaminants volatils ou si on s’intéresse particulièrement à ces derniers, on devrait purger tout l’air se trouvant dans l’espace libre du récipient avec un gaz inerte tel que l’azote, avant de fermer hermétiquement ce récipient. Il ne faudrait pas que les échantillons gèlent, même partiellement, pendant le transport ou l’entreposage (à moins d’avoir déjà été congelés au moment du prélèvement), et on ne doit pas les laisser se déshydrater. Si, cependant, un ou plusieurs échantillons sont saturés d’eau excédentaire à leur arrivée au laboratoire (p. ex. ils ont été prélevés pendant une grosse pluie), on peut les déposer sur une feuille de plastique, pendant une courte période (p. ex. une ou plusieurs heures) pour laisser s’évaporer l’eau excédentaire ou lui permettre d’être drainée. Ensuite, on devrait remettre l’échantillon dans son récipient de transport ou le transvaser dans un récipient plus hermétique, en vue de l’entreposage. Il est recommandé d’entreposer les échantillons à l’obscurité, à 4 ± 2 °C^{Note de bas de page 97}. Il faut appliquer ces conditions d’entreposage dans les cas où des HAP ou d’autres contaminants sensibles à la lumière seraient présents ou si on sait que les échantillons renferment des substances volatiles instables auxquelles on s’intéresse.

On recommande de soumettre à l’essai les échantillons de sol ou de matière particulaire semblable le plus tôt possible après le prélèvement. On devrait entreprendre l’essai ou les essais de toxicité dans les deux semaines suivant le prélèvement et, de préférence, dans la semaine qui suit. L’essai doit débuter dans les six semaines, à moins que l’on sache que les contaminants du sol sont altérés ou ont un certain âge et sont, par conséquent, considérés comme stables. D’autres points à prendre en considération concernant l’entreposage d’échantillons de sol contaminé sont mentionnés dans EC (2012), et on devrait se conformer aux indications fournies dans ce document.

Au laboratoire, on devrait mélanger à fond chaque échantillon de sol prélevé sur le terrain ou horizon pédologique distinct (§ 5.3) et y prélever des sous-échantillons représentatifs pour la caractérisation physicochimique. Chaque échantillon (y compris tous les échantillons de sol témoin négatif et de sol de référence) doit être caractérisé par l’analyse, sur des sous-échantillons, des caractéristiques suivantes au moins :

• la répartition granulométrique (% de sables, de limons et d’argiles);
• la teneur en COT (%)^{Note de bas de page 98};
• la teneur en matière organique (%)^{Note de bas de page 98};
• pH
• la conductivité électrique;
• la teneur en humidité;
• la capacité de rétention en eau;
• la capacité d’échange cationique.

En outre, on devrait analyser :

• les anions et cations majeurs (Na⁺, K⁺, Mg²⁺, Ca²⁺, Al³⁺, S^2-, Cl^-);
• l’azote total, nitrate (NO₃^-), nitrite (NO₂^-) et ammonium (NH₄⁺);
• le phosphore phytodisponible ou total;
• le potassium phytodisponible ou total;
• le rapport C/N.

On pourrait également analyser :

• la densité apparente;
• le carbone inorganique total;
• les matières volatiles totales;
• la demande biochimique d’oxygène;
• la demande chimique d’oxygène;
• le potentiel d’oxydoréduction;
• les sels solubles;
• les oxydes métalliques (fer, manganèse);
• le rapport d’adsorption du sodium;
• les contaminants et/ou cocontaminants préoccupants;
• les caractéristiques de la contamination (p. ex. odeur, taches, débris, présence de carburant ou de solvant).

Sauf indication contraire, les analyses physicochimiques et toxicologiques identiques devraient être effectuées sur des sous-échantillons représentatifs de chaque échantillon réitéré de sol prélevé sur le terrain ou horizon pédologique (y compris de sol de référence) pour une étude particulière de la qualité du sol, ainsi que sur un ou plusieurs sous-échantillons de sol témoin négatif.

5.3 Préparation de l’échantillon en vue de l’essai

Il ne faut pas tamiser par voie hydraulique le sol prélevé sur le terrain ou les déchets particulaires semblables, ce qui entraînerait les contaminants présents dans l’eau interstitielle ou lâchement fixés par sorption à la matière particulaire. On devrait normalement débarrasser l’échantillon des gros graviers ou des grosses pierres, des débris, des invertébrés indigènes ou de la matière végétale macroscopique, à l’aide de pincettes ou à la main (gantée). Si un échantillon renferme beaucoup de débris grossiers indésirables (p. ex. matière végétale, copeaux de bois, verre, plastique, gros graviers) ou de gros invertébrés macroscopiques, on peut l’en débarrasser en faisant passer doucement le sol au travers d’un tamis à mailles larges (p. ex. de 4 à 10 mm de côté; EC, 2012). On pourrait aussi procéder à un tamisage par voie sèche afin de s’assurer que la structure de l’échantillon (agrégation, matière organique ou distribution de l’argile) se prête aux essais. Il ne faudrait pas tamiser au laboratoire les échantillons qui l’ont déjà été sur le terrain ou qui présentent une texture grumeleuse optimale pour les essais (p. ex. grumeaux de 3-5 mm). Les échantillons constitués de sol subsuperficiel argileux humide sont très cohésifs et, souvent, on ne peut les tamiser ou les homogénéiser directement. Ces échantillons devraient d’abord être fractionnés à la main, puis séchés avant leur tamisage et leur homogénéisation, conformément aux indications données dans EC (2012). En règle générale, on devrait éviter de broyer les échantillons de sol, mais le broyage pourrait être nécessaire dans certains cas (p. ex. sols argileux) ou si on souhaite une plus grande homogénéité que celle obtenue par tamisage. Tout comme dans le cas des méthodes d’échantillonnage et d’entreposage, il faudrait documenter adéquatement les méthodes de préparation du sol (c’est-à-dire prétraitement)) et, obligatoirement, les consigner.

Il faudra peut-être reconstituer les composants de l’échantillon avant l’essai si, pendant la préparation du sol, l’eau que celui-ci contenait s’est décantée ou si des portions (p. ex. chaume, racines ou autre matière organique) qu’on a enlevées de l’échantillon doivent être mises à l’essai avec le sol (EC, 2012). Les horizons pédologiques prélevés comme composants distincts de l’échantillon de sol doivent être mis à l’essai séparément, c’est-à-dire en tant qu’échantillons individuels. Si on a confirmé la présence de contaminants préoccupants dans un seul horizon pédologique (p. ex. l’horizon organique supérieur) à partir d’analyses antérieures ou d’essais de toxicité, il faut alors, selon les objectifs de l’étude, déterminer si l’essai toxicologique portera sur cet horizon seulement ou sur les horizons additionnels provenant du lieu d’échantillonnage.

Sauf si les objectifs particuliers de l’étude ou de la recherche en décident autrement, on devrait homogénéiser, au laboratoire, avant de l’utiliser, chaque échantillon ou horizon de matière d’essai perturbé, prélevé sur le terrain (ASTM, 2012; ISO, 2012)^{Note de bas de page 99}. Tout liquide séparé de l’échantillon pendant son transport ou son entreposage doit, si possible, être réincorporé dans l’échantillon. Le mélange peut modifier la concentration et la biodisponibilité des contaminants dans le sol, et l’homogénéisation de l’échantillon pourrait ne pas être souhaitable dans tous les cas ni à toutes les fins. Pour homogénéiser l’échantillon, on transfère une quantité (calculée au préalable) de sol d’essai ou de référence dans un récipient rigide propre (p. ex. un gros bol en acier inoxydable ou en plastique) ou, pour de plus grandes quantités de sol, sur des toiles en plastique propres étalées sur une surface plate. On devrait mélanger l’échantillon à la main (gantée) ou au moyen d’un outil fait d’un matériau non toxique, tel qu’une cuiller d’acier inoxydable ou par des moyens mécaniques (p. ex. un mélangeur à main domestique à batteurs tournant à faible vitesse ou un fouet à œufs à fil) jusqu’à obtention d’une texture et d’une couleur homogènes. Un certain nombre de méthodes d’homogénéisation d’échantillons de sol (p. ex. pliage, mélange, mise en cône) sont décrites en détail dans EC (2012). Pendant le mélange, on devrait réduire au minimum l’impact de l’opération sur la structure du sol et veiller à ce que le mélange ne détruise pas entièrement la structure du sol. On devrait s’arrêter dès que la texture et la couleur de l’échantillon semblent homogènes.

Pour chaque échantillon ou horizon pédologique à étudier, les conditions de mélange, y compris sa durée et sa température, doivent être aussi semblables que possible et signalées. Si on s’interroge sur l’efficacité du mélange de l’échantillon, on devrait prélever des sous-échantillons du sol après mélange et les analyser séparément pour déterminer l’homogénéité de la granulométrie, celle de la ou des substances auxquelles on s’intéresse, etc.

Comme il est mentionné dans le § 3.6, on peutsoumettre à un essai à concentration unique (habituellement à la concentration de 100 %) un ou plusieurs échantillons ou horizons de sol prélevés sur le terrain ou en évaluer la toxicité dans un essai à concentrations multiples, en vertu duquel on prépare une série de concentrations (dilutions) par mélange de quantités mesurées de sol dans un sol témoin négatif ou dans un sol de référence. Dans le § 6.2, on trouve des conseils sur des séries de dilutions qui pourraient s’avérer utiles, de même que des conseils sur la préparation de mélanges qui pourraient s’appliquer également à un essai à concentrations multiples portant sur un ou plusieurs échantillons de sol prélevés sur le terrain. Pour obtenir des conseils supplémentaires sur le choix des concentrations d’essai, prière de consulter le § 4.1. Dans chaque cas, l’essai doit comprendre une variante expérimentale constituée uniquement de sol témoin négatif (v. § 3.3).

Comme il est indiqué en 4.1 pour les sols échantillonnés par horizon, chaque horizon doit être mis à l’essai séparément dans des essais définitifs individuels. Pour un essai à concentrations multiples, il faudrait mélanger chaque horizon de sol d’essai avec l’horizon correspondant du sol témoin négatif ou du sol de référence aux concentrations expérimentales prévues (0 %, 6,25 %, 12,5 %, 25 %, etc.). Dans certains cas, il pourrait être impossible de prélever les mêmes horizons de sol témoin négatif et de sol d’essai. Par exemple, lorsque l’emplacement a fait l’objet de mesures d’assainissement préliminaires et que les horizons naturels ont été perturbés ou mélangés. On peut alors utiliser pour l’essai un sol mixte, c’est-à-dire une quantité de sol d’essai et une autre de l’horizon disponible (il peut y en avoir plus d’un) du sol témoin négatif aux concentrations voulues. Les objectifs de l’essai doivent tenir compte du profil pédologique du sol de référence et de l’emplacement ou de la mobilité des contaminants du sol d’essai, le but étant de faire correspondre si possible les horizons équivalents du sol de référence et du sol contaminé.

La structure du sol est un important facteur de la survie et de la reproduction des vers de terre, et la teneur en humidité influe beaucoup sur elle. Un mode opératoire qualitatif, dit officieusement « essai d’expression de la teneur en humidité », peut être utile pour déterminer si l’échantillon de sol se trouve à une humidité optimale. Il pourrait se révéler utile pour ajuster la teneur en humidité de chaque échantillon de sol à un pourcentage particulier de sa capacité de rétention en eau (v. les alinéas qui suivent) en vue d’un essai de toxicité. Pour effectuer cet essai, on prélève un petit sous-échantillon représentatif du sol (p. ex. une pincée), au hasard, à la main gantée et on le comprime légèrement entre le pouce et l’index. Si le sol exprime un peu d’eau, c’est que son humidité est acceptable. Si, toutefois, aucune eau n’apparaît, le sol est probablement trop sec. Si, au contraire, le sous-échantillon exprime une quantité notable d’eau, c’est qu’il est probablement trop humide. Au fur et à mesure de l’essai, il faudrait peser les récipients d’essai pour déterminer la perte d’eau (v. § 4.2.5).

L’humidité d’un échantillon donné de sol prélevé sur le terrain devrait être normalisée pendant sa préparation par détermination de sa capacité de rétention en eau, puis hydratation à une humidité optimale fondée sur un pourcentage de cette capacité. Il faut déterminer ce taux optimal pour chaque échantillon de sol prélevé sur le terrain avant la préparation de l’échantillon et le début de l’essai. À cette fin, on doit déterminer la teneur en humidité de chaque échantillon homogénéisé (c’est-à-dire de chaque échantillon de sol d’essai, y compris le sol témoin négatif) [§ 4.1, 4.2.1 et 4.3.1]. Ensuite, il faut déterminer la capacité de rétention de chaque échantillon, en employant un mode opératoire normalisé reconnu (v. les trois alinéas qui suivent). On devrait hydrater (ou déshydrater, le cas échéant) ensuite un sous-échantillon de chaque échantillon de sol jusqu’à ce que l’on obtienne une consistance homogène, friable, avec des fragments d’environ 3 à 5 mm de diamètre^{Note de bas de page 100}. La teneur en humidité, la CRE et le pourcentage optimal de la CRE de chaque horizon pédologique doivent être déterminés séparément. On peut s’attendre à ce que les horizons pédologiques présentant une TMO plus élevée aient une CRE également plus élevée que les horizons minéraux, de sorte qu’il faudra une plus grande quantité d’eau pour obtenir une texture humide et grumeleuse. D’après la teneur en humidité initiale et la capacité de rétention en eau de l’échantillon ainsi que la quantité d’eau ajoutée pour obtenir la consistance recherchée du sol, on peut calculer et exprimer la teneur en humidité optimale de l’échantillon en pourcentage de la capacité de rétention en eau de chaque sol^{Note de bas de page 101}. Une fois ce taux visé (ou optimal) déterminé, on peut normaliser la teneur en humidité de chaque échantillon de sol d’essai (y compris du sol témoin négatif) au taux choisi (propre à l’échantillon). On devrait ajouter de l’eau d’essai (c’est-à-dire désionisée ou distillée^{Note de bas de page 102}) à chaque échantillon dont la teneur en humidité est inférieure au taux optimal prédéterminé de sa capacité de rétention en eau jusqu’à l’obtention de ce taux^{Note de bas de page 103} (Aquaterra Environmental, 1998). Si un échantillon est trop humide, on devrait l’étendre en couche mince sur une feuille propre de plastique (p. ex. un sac neuf à ordures ou un pare-vapeur, de plastique) ou sur un plateau d’un matériau propre, non réactif (p. ex. d’acier inoxydable ou de plastique) et le laisser sécher par évaporation à la température ambiante (~ 20 °C)^{Note de bas de page 104}; la réhydratation au taux optimal prédéterminé de sa capacité de rétention en eau pourrait être nécessaire. Une fois la teneur en humidité de l’échantillon ajustée au pourcentage souhaité de sa capacité de rétention en eau, cette teneur doit être déterminée, et sa valeur ainsi que le pourcentage de la capacité de rétention en eau doivent être consignés.

La capacité de rétention en eau (et son pourcentage optimal pour les essais biologiques) d’un sol particulier est généralement propre au type de sol ou à l’horizon et c’est, au bout du compte, le résultat de l’interaction de nombreuses variables liées à la structure du sol (p. ex. micro- et macroagrégation, porosité, densité apparente, texture, teneur en matière organique). Un certain nombre de méthodes peuvent servir à déterminer la capacité de rétention en eau; cependant, la plupart exigent que les mesures se fassent sur un échantillon intact (p. ex. une carotte de sol) dont les caractéristiques (agrégations structurales, porosité, densité apparente, texture et teneur en matière organique) sont préservées pendant le prélèvement. L’USEPA (1989) a décrit une méthode convenant aux essais de toxicité et utilisant des matières non consolidées (telles que des échantillons de sols prélevés sur le terrain, ayant été séchés, tamisés et homogénéisés ou des échantillons de sol préparés au laboratoire à partir de leurs constituants)^{Note de bas de page 105}. Nous exposons ci-après cette méthode.

Pour cette méthode, on dépose environ 130 g (poids humide)^{Note de bas de page 106} d’échantillon dans un plat d’aluminium ou dans une boîte de Petri (15 × 1 cm) et on le fait sécher à 105 °C jusqu’à l’obtention d’un poids constant (ce qui prend habituellement au moins 24 heures). On refroidit le sol dans un dessiccateur pendant au moins 20 min. On introduit ensuite 100 g du sol séché à l’étuve dans un becher de verre de 250 ml avec 100 ml d’eau distillée ou désionisée. On mélange à fond la suspension résultante avec une tige de verre. On place dans un entonnoir de verre (grand diamètre intérieur : 100 mm; hauteur de la tige : 95 mm) un papier filtre plié (de 185 mm de diamètre à porosité grossière Fisherbrand P8, papier filtre crêpé pour analyse qualitative; n^o de cat. 09-790-12G). La bordure du papier filtre plié devrait arriver au ras du rebord de l’entonnoir. À l’aide d’une pipette, verser lentement 9 ml d’eau distillée ou désionisée sur le papier filtre, de façon à en mouiller toute la surface. On pèse ensuite l’entonnoir et le papier filtre hydraté. Pour obtenir la masse initiale de l’entonnoir plus le papier filtre hydraté plus le sol séché (v. I dans l’équation 1 ci-après), on ajoute la masse du sol séché (100 g) à la masse de l’entonnoir et du papier filtre mouillé.

On insère ensuite la tige de l’entonnoir dans un erlenmeyer de 500 ml et on verse lentement la suspension aqueuse de sol dans le papier filtre hydraté maintenu dans l’entonnoir^{Note de bas de page 107}. Par rinçage, on entraîne tout le sol restant dans le becher et sur la tige de verre dans l’entonnoir, pour s’assurer de recevoir sur le filtre la totalité des matières solides, mais en usant du minimum d’eau nécessaire. Ensuite, on couvre bien l’entonnoir avec une feuille d’aluminium et on laisse le liquide s’écouler pendant 3 h à la température ambiante. Après ces trois heures, on pèse l’entonnoir, le papier filtre hydraté et le sol humide, c’est-à-dire la masse finale totale de l’entonnoir, du papier filtre hydraté et du sol (humide) [v. F de l’équation 1 ci-après].

On calcule ensuite la capacité de rétention en eau du sous-échantillon de sol dans l’entonnoir, en pourcentage du poids sec de sol, à l’aide de l’équation suivante :

${\displaystyle \text{CRE}=\frac{\text{F }- \text{I}}{\text{S}}\times 100\text{ [Équation 1]}}$

où :

• CRE = capacité de rétention en eau (%)
• F = poids final de l’ensemble l’entonnoir, du papier filtre hydraté et du sol humide
• I = poids initial de l’ensemble entonnoir, du papier filtre hydraté et du sol sec
• S = 100 g (poids sec de sol)

On devrait déterminer la CRE de chaque échantillon de sol d’essai en triple, au moyen de trois sous-échantillons.

Le pourcentage d’eau (P_E) ajouté à l’échantillon de sol prélevé sur le terrain afin d’obtenir le degré souhaité d’hydratation (c’est-à-dire le pourcentage optimal de la CRE) peut se calculer comme suit^{Note de bas de page 108} :

P_E = [CRE × (P_CRE / 100)] − TH  [Équation 2]

où :

• P_E = le pourcentage d’eau à ajouter au sol (%)
• CRE = la capacité de rétention en eau (%)
• P_CRE =  le pourcentage recherché de la CRE (%)
• TH = la teneur en humidité initiale du sol.

Le volume d’eau (c’est-à-dire V_E) que l’on devrait ajouter à un échantillon de sol prélevé sur le terrain pour obtenir le degré souhaité d’hydratation (c’est-à-dire le pourcentage optimal de la capacité de rétention en eau de l’échantillon) peut se calculer comme suit (v. note 108) :

 V_E = (P_E × M)/100    [Équation 3]

où :

• V_E = le volume d’eau à ajouter au sol (mL)
• P_E = le pourcentage d’eau à ajouter au sol (%)
• P = le poids total de sol (poids sec)^{Note de bas de page 109} de sol nécessaire à l’essai.

On trouvera dans EC (2012) la description de divers modes opératoires applicables aux échantillons de sol qui ne peuvent pas être soumis aux essais dans l’état dans lequel ils ont été prélevés et qu’il faut conditionner pour satisfaire aux objectifs de l’étude ou aux OQD. Ces modes opératoires incluent les suivants : lavage, vieillissement/météorisation, ajustement du pH, amendement, ajustement de la fertilité du sol, réduction du nombre de microorganismes indigènes (EC, 2012). En règle générale, les échantillons de sol prélevés sur le terrain ne doivent faire l’objet d’aucun ajustement ou conditionnement, sauf pour les essais de toxicité effectués pour les besoins de la recherche et visant à déterminer l’effet d’un conditionnement particulier sur la toxicité de l’échantillon. Les horizons pédologiques très organiques (p. ex. horizons LFH) pourraient toutefois exiger au moins un cycle de gel-dégel pour que les invertébrés indigènes puissent en être retirés avant les essais (v. § 5.6.6 de EC, 2012)^{Note de bas de page 110}. Les études visant à examiner l’effet d’une manipulation du sol (p. ex. ajustement du pH) sur la toxicité de l’échantillon devraient prévoir la réalisation de deux essais en parallèle, en vertu desquels on ajuste le pH d’une ou de plusieurs séries de variantes expérimentales, tandis que l’on n’ajuste pas le pH d’une ou de plusieurs séries en plusieurs exemplaires de variantes expérimentales. Tout conditionnement doit être consigné en détail.

Immédiatement après l’hydratation de l’échantillon (ou sa déshydratation) et son mélange, on doit prélever des sous-échantillons de la matière d’essai, dont on a besoin pour l’essai de toxicité et pour les analyses physicochimiques et on doit les déposer dans des récipients d’essai/enceintes expérimentales étiquetés (v. § 4.2.1 et 4.3.1) ainsi que dans les récipients étiquetés nécessaires à l’entreposage de sous-échantillons en vue d’analyses physicochimiques ultérieures. Toute fraction subsistant de l’échantillon homogénéisé dont on pourrait avoir besoin pour les essais supplémentaires de toxicité employant des vers de terre ou d’autres organismes (p. ex. conformément à EC 2005b, 2013b, 2014a; ECCC, 2020a) devrait alors également être transvasée dans des récipients étiquetés. Tous les sous-échantillons à conserver devraient être gardés dans des récipients étanches renfermant un espace libre le plus petit possible, à l’obscurité à 4 ± 2 ̊C (§ 5.2) jusqu’au moment de l’essai. Ces conditions d’entreposage sont obligatoires pour les sous-échantillons destinés à des analyses physicochimiques. Immédiatement avant l’analyse ou l’utilisation dans un essai de toxicité, il faut amener à la température de la pièce et remélanger à fond chaque sous-échantillon pour en assurer l’homogénéité.

5.4 Éléments particuliers à prendre en considération dans la collecte, la manipulation et la préparation de sol de diverses écozones du Canada

Des indications précises sur l’échantillonnage, la manipulation, le transport, l’entreposage et la préparation de sol de diverses écozones du Canada sont fournies dans EC (2012).

Environnement Canada a publié diverses méthodes (EC, 2005b, 2014a) permettant d’évaluer des sols dont le pH est neutre ou presque neutre et dont la TMO peut varier de 3 % à 12 % environ. Ces deux propriétés sont généralement caractéristiques des horizons Ah des sols agricoles du Canada, de même que des sols des écorégions de forêts de feuillus mixtes du sud-est du pays (p. ex. écozone des prairies et écozone des plaines à forêts mixtes). De nombreux autres types de sols répandus au Canada ont des propriétés qui ne sont pas considérées comme typiques dans les méthodes normalisées qu’Environnement Canada a déjà publiées, et ces sols exigent des procédures spéciales d’échantillonnage, de manipulation, de transport, d’entreposage et de préparation. Il s’agit notamment des sols de la forêt boréale, des sols minces/pierreux, des sols organiques, des sols cryosoliques et des sols des milieux humides, qui se prêtent tous aux essais décrits dans la présente édition révisée de la méthode d’essai biologique avec des acariens. Étant donné que ces types de sols couvrent la plus grande partie de la masse terrestre du Canada et que certaines activités anthropiques (p. ex. exploitation minière, foresterie, production pétrolière et gazière) se déroulant dans ces écozones ont donné lieu ou peuvent donner lieu à la contamination des terres, on trouve dans EC (2012) des conseils précis sur leur prélèvement, leur manipulation, leur transport, leur entreposage et leur préparation. On trouve aussi dans ce document des indications sur la variation des sols de chacun des écosystèmes décrits, de même que les éléments à prendre en considération quant au choix des espèces expérimentales convenant aux essais sur ces sols (EC, 2012).

5.5 Observations et mesures pendant l’essai

On devrait, au moment de la préparation de l’essai, rédiger une description qualitative de chaque matière d’essai, prélevée sur le terrain. Cela pourrait comprendre des observations de la couleur de l’échantillon, de sa texture et de son homogénéité ainsi que des observations sur la présence de végétaux ou d’invertébrés macroscopiques. On devrait consigner tout changement d’apparence de la matière observée pendant l’essai ou à sa fin. On peut également utiliser des photographies pour tenir des registres de l’apparence des sols.

Dans les § 4.2.5 et 4.3.5, on trouve des conseils et les exigences propres à chaque essai pour les observations et les mesures à faire pendant l’essai ou à la fin. Ces observations et mesures s’appliquent et doivent être faites lorsque l’on effectue n’importe quel essai de toxicité d’un sol décrit dans le présent document, en employant un ou plusieurs échantillons de sol (d’un site) prélevé sur le terrain.

Selon les objectifs et le plan d’expérience de l’essai, on peut préparer des récipients d’essai supplémentaires au début de l’essai de reproduction (§ 4.2.1) pour surveiller les propriétés chimiques du sol. Ces enceintes seraient l’objet d’un échantillonnage destructif pendant l’essai et à la fin de ce dernier. On pourrait ajouter ou non des organismes d’essai dans ces récipients supplémentaires, selon les objectifs de l’étude. On peut doser les substances chimiques se trouvant dans le sol de ces récipients, en prélevant des parties aliquotes du sol pour les analyses appropriées (v. § 5.2).

5.6 Effets mesurés (paramètres) et calculs

Le thème commun de l’interprétation des résultats des essais ayant porté sur un ou plusieurs échantillons de sol prélevés sur le terrain est une comparaison des effets biologiques exercés par le ou les sols (d’un ou de plusieurs sites) aux effets constatés dans un sol de référence. L’échantillon de référence devrait servir à des comparaisons chaque fois que c’est possible ou convenable, parce que cela permet une évaluation locale, de la toxicité, propre à l’emplacement (EC, 2005b, 2013b, 2014a; ECCC 2020a). Parfois, le sol de référence pourrait ne pas convenir à la comparaison en raison de sa toxicité ou de caractéristiques physicochimiques atypiques. En pareil cas, il faudrait comparer les sols d’essai avec le sol témoin négatif. Les résultats que donnera ce dernier aideront à distinguer l’effet des contaminants des autres effets causés par les propriétés physicochimiques du sol telles que la distribution granulométrique, la teneur en COT (%) et la teneur en matière organique (%). Indépendamment de l’emploi du sol de référence ou du sol témoin négatif pour les comparaisons statistiques, il faut utiliser les résultats donnés par le sol témoin négatif pour juger de la validité et de l’acceptabilité de l’essai (v. § 4.2.3 et 4.3.3).

Les paramètres biologiques des deux méthodes d’essai décrites dans le présent document sont la survie des adultes après 28 jours (ou 35 jours, le cas échéant) (une mesure quantique), si les données le permettent, le succès de la reproduction (une mesure quantitative) pour l’essai de reproduction après 56 jours (ou 63 jours, le cas échéant), ainsi que la réaction d’évitement (une mesure quantique) à la fin de l’essai de réaction d’évitement après 48 heures. Ces deux mesures étant de nature différente, il faut recourir à des approches statistiques différentes également, et celles-ci sont affinées pour refléter les objectifs de l’essai et le schéma expérimental. La présente sous-section renferme des conseils d’ordre statistique pour les essais à concentration unique (c’est-à-dire sur des échantillons de sol provenant de plusieurs lieux d’échantillonnage et mis à l’essai à la concentration maximale seulement). Le schéma le plus simple consiste à comparer le lieu d’échantillonnage à l’étude avec un lieu d’échantillonnage de référence, tandis qu’un schéma plus complexe pourrait comporter la comparaison de plusieurs lieux d’échantillonnage à l’étude, soit entre eux, soit avec un lieu d’échantillonnage de référence. La présente sous-section ne renferme que des indications générales relatives à l’analyse des paramètres liés à la mortalité, au succès de la reproduction et à la réaction d’évitement, étant donné qu’on peut trouver ailleurs de plus amples détails (EC, 2005a). Les méthodes standard d’analyse statistique constituent généralement tout ce dont on a besoin pour analyser les résultats. On devrait consulter la section 3 dans EC (2005a) pour obtenir des conseils sur la comparaison des résultats d’essais à concentration unique découlant des échantillons prélevés en plusieurs stations, à l’aide de tests paramétriques et non paramétriques. Comme toujours, on devrait chercher à obtenir a priori les conseils d’un statisticien qui connaît la toxicologie pour décider du plan d’expérience et de l’analyse des données de l’essai.

Si on effectue un essai à concentrations multiples sur un ou plusieurs échantillons de sol prélevés sur le terrain et dilués avec du sol témoin négatif ou du sol de référence non contaminé, on devrait suivre les conseils de la section 6 (y compris du § 6.2, pour la réalisation de recherches de la gamme de concentrations à utiliser, et du § 6.4 pour le calcul de la valeur de l’effet mesuré). On devrait consulter la section 9 d’EC (2005a) pour la comparaison de telles estimations ponctuelles de la toxicité dans le cas d’échantillons multiples de sol prélevés sur le terrain.

5.6.1 Variations des plans d’expérience et de l’analyse

On trouvera dans EC (2005a) des indications détaillées sur l’analyse statistique des données quantiques recueillies dans le cadre de divers plans d’expérience comportant plusieurs lieux d’échantillonnage. Le choix de l’essai statistique se fonde sur plusieurs considérations, notamment :

• le type de comparaison à établir (p. ex. une série complète de comparaisons par paires entre tous les lieux d’échantillonnage ou une comparaison de la réponse obtenue pour chaque lieu et pour le lieu de référence seulement);
• l’existence prévue d’un gradient chimique ou d’un gradient dans la réponse biologique^{Note de bas de page 111};
• le nombre et le type de répétitions (de laboratoire ou prélevées sur le terrain).

Environnement Canada a également fourni des données statistiques détaillées sur l’analyse des mesures quantitatives (EC, 2005a)^{Note de bas de page 112}, que l’on peut appliquer facilement aux données sur la reproduction des vers de terre (c’est-à-dire le nombre de jeunes vivants à la fin de l’essai) dans un scénario comportant plusieurs lieux d’échantillonnage. Si on doit comparer les résultats obtenus pour la seule station d’échantillonnage à l’étude avec ceux obtenus pour une station d’échantillonnage de référence, un essai t^{Note de bas de page 113} convient habituellement à l’analyse statistique (v. § 3.2 dans EC, 2005a). Lorsque plus d’une station d’échantillonnage (variante expérimentale) est à l’étude et que l’expérimentateur souhaite comparer de nombreuses stations d’échantillonnage entre elles ou avec la station d’échantillonnage de référence, il peut avoir recours à des ANOVA et à plusieurs essais de comparaisons (et équivalents non paramétriques) (v. § 3.3 dans EC, 2005a). Le choix de l’essai se fonde sur les trois éléments décrits ci-dessus pour les essais quantiques, de même que sur la satisfaction des hypothèses de normalité et d’homoscédasticité.

Une étude très préliminaire pourrait ne disposer que d’un seul échantillon de sol d’essai (c’est-à-dire de sol de site effectivement ou potentiellement contaminé) et d’un échantillon de sol de référence en exemplaire unique. Un simple examen des résultats pourrait inspirer la conception d’études plus approfondies. En principe, on pourrait faire une évaluation préliminaire avec les échantillons prélevés en de nombreuses stations, mais non réitérés ni subdivisés au laboratoire. L’objectif pourrait être de déterminer un nombre réduit de stations d’échantillonnage méritant une étude plus approfondie ou plus détaillée. Dans ce cas, les occasions d’analyse statistique seraient limitées (EC, 2005a).

Une étude plus habituelle des sols comporterait le prélèvement d’échantillons réitérés en plusieurs endroits, par les mêmes méthodes puis leur comparaison avec des échantillons subdivisés d’un seul sol de référence et/ou sol témoin négatif. Plusieurs pistes s’offrent à l’analyse, selon le type et la qualité des données. Dans les études portant sur plusieurs lieux, le type de répétitions (prélevés sur le terrain ou de laboratoire) influerait sur l’interprétation des résultats. Si des échantillons réitérés prélevés sur le terrain et des récipients d’essai/enceintes expérimentales (répétitions de laboratoire) ont été mis à l’essai, on devrait consulter un statisticien pour connaître les choix d’analyse. Si l’essai n’a porté que sur des échantillons subdivisés de laboratoire (répétitions) et qu’aucun échantillon réitéré de terrain n’a été étudié, il est alors difficile de tirer des conclusions statistiquement robustes au sujet des différences dues au lieu d’échantillonnage (v. § 5.1). Les répétitions de laboratoire ne révéleraient, entre les échantillons, que des différences supérieures à la variabilité de base des modes opératoires intralaboratoire pour la préparation et l’exécution de l’essai. La variabilité des échantillons due au lieu ne serait pas véritablement évaluée par l’analyse statistique, mais elle contribuerait à toute différence dans les résultats de l’essai associée au lieu du prélèvement.

Si on voulait comparer les résultats de l’essai des échantillons réitérés de chaque lieu d’échantillonnage aux résultats donnés par le sol de référence, divers essais sont recommandés, selon que les échantillons présentent un gradient d’effet ou non et que le nombre de répétitions est égal ou inégal (v. section 3 dans EC, 2005a).

Dans une étude portant sur de nombreux endroits, on pourrait vouloir savoir quels sont les échantillons provenant de divers endroits ayant présenté des résultats différant statistiquement des résultats des autres échantillons et quels sont les échantillons différant de l’échantillon ou des échantillons de référence et/ou de l’échantillon ou des échantillons témoins négatifs. Cette situation pourrait comporter le prélèvement d’échantillons dans un certain nombre d’endroits à des distances de plus en plus grandes par rapport à la source ponctuelle de contamination, auquel cas on pourrait vouloir connaître quels sont les lieux d’échantillonnage ayant fourni des échantillons présentant une toxicité significativement supérieure à celle des autres et, ainsi, quels emplacements méritent particulièrement d’être dépollués. Il faudrait suivre les conseils fournis dans les § 3.1, 3.3 et 7.5 d’EC (2005a), où l’on trouve par ailleurs d’autres détails, des essais de rechange et des essais non paramétriques.

5.6.2 Calcul de la puissance

Un facteur important dont il faut tenir compte dans l’analyse des résultats des essais de toxicité de sols est la possibilité de faux positifs (c’est-à-dire de qualifier de contaminé un lieu non contaminé : erreur de type I) ou de faux négatifs (c’est-à-dire de qualifier de non contaminé un lieu contaminé : erreur de type II). Les scientifiques sont habituellement prudents dans le choix du niveau de signification pour la tolérance des résultats faux positifs (erreur de type I) et ils le fixent habituellement à p = 0,05 ou 0,01. Le plus souvent, lorsqu’ils se conforment à un plan d’expérience précis, ils ne tiennent pas compte du lien entre puissance, variation et amplitude de l’effet et omettent de préciser la valeur de l’erreur de type II (ß). Plusieurs facteurs influent sur la puissance statistique, notamment :

• la variabilité des échantillons réitérés représentant la même variante expérimentale;
• á (c’est-à-dire la probabilité de commettre une erreur de type I);
• l’ampleur de l’effet (c’est-à-dire l’ampleur de l’effet véritable que l’essai cherche à déterminer);
• n (c’est-à-dire le nombre d’échantillons ou de répétitions utilisées dans l’essai et, dans certains cas, leur affectation^{Note de bas de page 114}).

Les guides d’Environnement Canada sur les méthodes statistiques applicables aux essais d’écotoxicité (EC, 2005a) renferment de plus amples renseignements et conseils sur les erreurs des types I et II.

Dans les domaines scientifiques fondés sur la recherche, l’analyse de puissance est particulièrement utile au moment de l’établissement du plan d’expérience préliminaire (Hoenig et Heisey, 2001; Lenth, 2007; Newman, 2008). Ainsi, on exécute un essai exploratoire afin de déterminer l’écart type approximatif (variation) et de diagnostiquer les problèmes qui risquent de surgir dans l’exécution de l’essai en général. D’autres facteurs du calcul de la puissance, comme l’ampleur de l’effet et le nombre de répétitions, peuvent ensuite être envisagés en regard de l’écart type en vue d’optimiser le plan d’expérience définitif (p. ex. le nombre de répétitions nécessaires pour détecter un effet d’une certaine ampleur).

Dans la mise au point de méthodes d’essai normalisées, le calcul de la puissance a pour objectif premier l’optimisation du plan d’expérience ou du moins l’estimation de la puissance du plan en cours^{Note de bas de page 115}. Toutefois, il faudrait généralement prendre en considération un ensemble de données nettement plus étoffé qu’une seule estimation de la variation et de l’ampleur de l’effet. Par exemple, les spécialistes des méthodes d’essai pourraient recueillir un certain nombre d’estimations de la variation auprès de différents laboratoires et à partir de différents scénarios de contamination (Thursby et al., 1997; Van der Hoeven, 1998; Denton et al., 2011, 2019). Les essais normalisés sont souvent employés aux fins de surveillance ou d’application de programmes réglementaires, lesquels peuvent préciser l’ampleur de l’effet (p. ex. 25 %) à détecter (MEA, 2007).

Les données des essais de performance au Laboratoire de toxicologie des sols d’ECCC ont servi à estimer la puissance permettant de détecter une réduction du nombre de jeunes ayant survécu dans le cadre de l’essai de reproduction des vers de terre de 56 jours. On n’a effectué aucun calcul de la puissance pour les essais de réaction d’évitement. Pour E. andrei, on se sert des données du plan d’expérience révisé pour calculer la puissance, avec cinq répétitions et quatre adultes par répétition. Vingt-quatre essais ont permis d’estimer la variabilité, des essais effectués avec un sol artificiel (n = 11) et trois sols prélevés de terrain (n = 4 ou 5 par type de sol; total n = 13). Le coefficient de variation (CV) était raisonnablement constant au cours de ces essais^{Note de bas de page 116} et l’écart-type a été rétrocalculé à partir du CV afin de calculer la puissance. Pour D. rubidus, on se sert des données du plan d’expérience pour calculer la puissance, avec cinq répétitions et quatre adultes par répétition (c’est-à-dire le plan d’expérience actuel). Quatre-vingt-onze essais ont permis d’estimer la variabilité, des essais effectués avec un sol artificiel (n = 42) et huit sols de terrain (n = 1 à 11 par type de sol; total n = 49). Le CV était raisonnablement constant au cours des essais où le nombre moyen de jeunes était compris entre 12 et 50 par répétition, et le CV diminuait dans les essais où le nombre moyen de jeunes par répétition était supérieur à 50. On a supposé que le CV était constant au cours de ces essais^{Note de bas de page 117}; l’écart-type a été rétrocalculé à partir du CV afin de calculer la puissance. Pour E. andrei et D. rubidus, les estimations de la variabilité n’étaient disponibles que pour les récipients d’essai (répétitions de laboratoire) et non parmi les échantillons réitérés (échantillons réitérés de terrain). On a utilisé des ampleurs d’effet d’une réduction de 30 % (pour D. rudibus uniquement), 40 % et 50 % du nombre de jeunes ayant survécu. Un essai t à une face a été utilisé, avec α = 0,05. Une variance égale a été présumée et estimée en utilisant l’estimation groupée de l’écart type dans le sol témoin et le sol d’essai. On effectue tous les calculs de la puissance dans Power And Precision v4.1.0, puis on les vérifie par recoupement avec G*Power v3.1.9.7 (L. Van der Vliet et C. Martinko, Environnement et Changement climatique Canada, communication personnelle, 2021).

Pour déterminer le nombre minimal de répétitions requis pour un essai à concentration unique, le chercheur doit déterminer et indiquer l’ampleur cible avec effet avant de commencer un essai. L’ampleur cible avec effet doit être indiquée. Le respect de cette exigence relève de la responsabilité du chercheur, et la décision doit se faire au cas par cas. Il s’agit d’une approche différente et nouvelle pour ECCC, car dans d’autres méthodes d’essai, l’ampleur cible avec effet n’a pas été définie.

On effectue un calcul de la puissance pour les deux espèces d’expérience en utilisant les 50e (modéré) et 85e (élevé) centiles de la variabilité^{Note de bas de page 118} afin d’établir des exigences et des recommandations sur le nombre de répétitions, respectivement, pour différentes ampleurs d’effet^{Note de bas de page 119}. Pour E. andrei, le calcul de la puissance a montré que, pour détecter de manière fiable un effet de 40 % (puissance d’au moins 80 %) compte tenu des conditions énumérées, il faut utiliser au moins 21 répétitions; par ailleurs, pour détecter de manière fiable un effet de 50 %, il faut utiliser au moins 13 répétitions, et 24 répétitions sont recommandées. Le calcul de la puissance a montré que l’on ne peut détecter de manière fiable une ampleur d’effet de 30 % en utilisant un nombre raisonnable de répétitions pour E. andrei^{Note de bas de page 120}. Pour D. rubidus, le calcul de la puissance a montré que pour détecter de manière fiable un effet de 30 % (puissance d’au moins 80 %) compte tenu des conditions énumérées, il faut utiliser au moins 13 répétitions, et 28 répétitions sont recommandées; pour détecter de manière fiable un effet de 40 %, il faut utiliser au moins 7 répétitions, et 15 répétitions sont recommandées; enfin, pour détecter de manière fiable un effet de 50 %, il faut utiliser au moins 5 répétitions, et 9 répétitions sont recommandées. Les évaluateurs des risques des emplacements contaminés ou les gestionnaires de l’assainissement des emplacements pourraient réaliser d’importantes économies s’ils évaluaient d’abord un emplacement à l’aide d’essais de dépistage des vers de terre moins coûteux et plus rapides en vue de déterminer et de classer par ordre de priorité les principales zones contaminées, de manière à y effectuer d’autres essais définitifs de reproduction d’une durée de 56 jours (p. ex. pour confirmer le succès de l’assainissement et/ou l’amélioration de la qualité du sol). L’essai de réaction d’évitement des vers de terre d’une durée de 48 heures s’est révélé être un outil de dépistage très efficace et pertinent pour déterminer les sols potentiellement sublétaux toxiques afin de réduire le nombre de sols d’emplacement qui nécessiteraient une évaluation de toxicité plus approfondie (c’est-à-dire un essai de reproduction de 56 jours) (Hind-Rinke et al., 2005; EC, 2012).

Les exigences et recommandations ci-dessus concernant le nombre de répétitions utilisées pour un essai de reproduction d’une durée de 56 jours sont propres à l’espèce, car les deux espèces d’expérience ont des propriétés de variabilité différentes (p. ex. on a observé que E. andrei était environ 2 fois plus variable que D. rubidus; v. note 118), ce qui a un impact sur la puissance. Cependant, les espèces d’expérience ne devraient pas nécessairement être choisies en fonction de la puissance. Le choix entre les espèces d’expérience pourrait être déterminé par des données propres à l’emplacement, notamment le type de sol, le pH et les espèces résidentes. La sensibilité ou la tolérance connue d’une espèce aux contaminants présents sur un emplacement peut également être utilisée pour choisir les espèces d’expérience. Par exemple, le même échantillon de sol pourrait provoquer une diminution de 50 % de la reproduction chez E. andrei, mais n’avoir aucun effet important sur D. rubidus, et cette information appuierait l’utilisation d’E. andrei dans les essais. Il est important de reconnaître que l’importance statistique et l’importance biologiquepeuvent ne pas toujours concorder.

Section 6 : Modes opératoires particuliers de l’essai sur un sol enrichi avec une substance chimique

Dans la présente section, on trouvera des conseils et des instructions pour la préparation et l’essai d’un sol témoin négatif enrichi, à des fins expérimentales, avec un ou plusieurs produits ou substances chimiques. Ces conseils et instructions s’appliquent aux deux méthodes d’essai biologique décrites dans la section 4. Les conseils donnés dans EC (1995) pour enrichir un sédiment témoin négatif d’une ou de plusieurs substances chimiques et effectuer des essais de toxicité avec des mélanges de substances et de sédiment valent encore ici, pour un sol enrichi avec une substance chimique. On pourrait devoir évaluer et normaliser davantage les modes opératoires de la préparation de sols enrichis avec une substance chimique, exposés ci-après (§ 6.2) avant d’appliquer les essais de toxicité de sols employant des vers de terre ou d’autres organismes terricoles appropriés pour évaluer les mélanges particuliers de sol et de substance(s) à des fins réglementaires.

On peut examiner expérimentalement la ou les causes de la toxicité d’un sol ainsi que les effets toxiques interactifs de substance(s) ou de produit(s) chimique(s) en association avec un sol par ailleurs non contaminé, en enrichissant un sol témoin négatif (§ 3.3) de ces substances. Cet enrichissement pourrait concerner une ou plusieurs substances ou produits chimiques. Parmi les autres options des essais de toxicité employant des vers de terre ainsi que les modes opératoires décrits dans le présent document, mentionnons l’enrichissement d’un sol de référence (§ 3.5) ou d’un sol d’essai (§ 3.6) d’une ou de plusieurs substances ou produits chimiques. Les échantillons d’horizons pédologiques prélevés séparément doivent être traités comme des échantillons distincts (§ 4.1 et 5.3). Il faut aussi les caractériser et les préparer (c.-à-d. les hydrater et les enrichir) séparément avant de les soumettre à un essai (§ 6.2). Les essais de toxicité employant un sol enrichi avec une gamme de concentrations de substances ou de produits chimiques à l’étude peuvent servir à déterminer des paramètres statistiques fondés sur des concentrations seuils causant des effets sublétaux particuliers (v. § 6.4.1 et 6.4.2).

Dans le § 6.2, on décrit le mode opératoire de la préparation de mélanges d’essai d’un sol enrichi avec une substance chimique. Dans le § 6.3, on décrit le mode opératoire des observations et des mesures à faire pendant l’essai de toxicité et à sa fin, tandis que, dans le § 6.4 (et § 4.2.7 et 4.3.7), on expose le mode opératoire de l’estimation de l’effet mesuré par des essais à concentrations multiples. Ces modes opératoires s’appliquent également aux mélanges de concentrations multiples de sols d’essai prélevés sur le terrain (y compris de matières résiduaires sous forme particulaire telles que les boues ou d’autres déblais de dragage destinés à l’épandage) dans un sol témoin négatif ou dans un sol de référence et à effectuer des essais à concentrations multiples ainsi qu’à déterminer les paramètres statistiques de ces mélanges (v. la section 5 et, particulièrement, le § 5.6). On effectue aussi, en s’inspirant du mode opératoire et des conseils en matière de statistique décrits dans la présente section, des essais à concentrations multiples employant un sol témoin positif (§ 3.4) ou un ou plusieurs toxiques de référence ajoutés à un sol témoin négatif (§ 4.4). En outre, on peut déterminer l’influence des caractéristiques physicochimiques d’un sol témoin négatif naturel ou artificiel sur la toxicité chimique, grâce à des essais de toxicité employant un sol enrichi selon le mode opératoire et les conseils en matière de statistique exposés dans la présente section.

6.1 Propriétés, étiquetage et entreposage des échantillons

On devrait se renseigner sur les propriétés des substances ou produits chimiques que l’on doit ajouter, à des fins expérimentales, au sol témoin négatif^{Note de bas de page 121}. On devrait également obtenir, relativement à chaque substance ou produit chimique (p. ex. pesticides ou d’autres préparations du commerce), des renseignements sur leur concentration des impuretés et des ingrédients (actifs ou majeurs), la solubilité dans l’eau, la pression de vapeur, la stabilité chimique, les constantes de dissociation, les coefficients d’adsorption, la toxicité pour l’Homme et les organismes terrestres ainsi que la biodégradabilité. Lorsque la solubilité dans l’eau est douteuse ou problématique, on devrait obtenir et signaler des modes opératoires acceptables, éprouvés, pour la préparation de solutions aqueuses de la ou des substances. En l’absence de mode opératoire acceptable pour solubiliser la ou les substances d’essai dans l’eau, on devrait effectuer des essais préliminaires de leur solubilisation dans l’eau d’essai ou dans un solvant non aqueux et en confirmer les résultats par des analyses. On devrait également obtenir et consigner d’autres renseignements utiles tels que la formule mise au point, la nature et le pourcentage d’impuretés importantes, la présence et la quantité d’additifs et le coefficient de partage entre le n-octanol et l’eau. On devrait obtenir et examiner toute fiche signalétique pertinente.

Les substances à soumettre à l’essai devraient être au moins de qualité « réactif », à moins que l’on ne demande un essai sur une préparation du commerce ou une substance de qualité technique. Les récipients des substances doivent être scellés et codés ou étiquetés à leur réception. S’il y a lieu, on devrait indiquer sur l’étiquette ou consigner sur une fiche séparée, consacrée à l’échantillon, les renseignements exigés (nom de la substance, fournisseur, date de réception, responsable des essais, etc.). Les conditions d’entreposage (p. ex. température, protection contre la lumière) sont souvent commandées par la nature de la substance.

6.2 Préparation des mélanges d’essai

La veille de l’essai de toxicité (c’est-à-dire au jour − 1), on devrait préparer, introduire dans les récipients d’essai/enceintes expérimentales et les y laisser pendant la nuit les mélanges de substance(s) ou de produit(s) chimique(s) ajouté(s) au sol témoin négatif, avant d’introduire, le lendemain (c’est-à-dire au jour 0), les organismes d’essai (v. § 4.1, 4.2.1 et 4.3.1). Dans le cas de certaines substances ou certains produits chimiques (p. ex. ceux qui sont très volatiles, qui se dégradent facilement ou qui pourraient être métabolisés), l’ajout d’organismes d’essai peut être effectué immédiatement après la préparation du sol d’essai. Pour d’autres substances d’essai (p. ex. les substances peu solubles), une période prolongée de contact avec le sol (c’est-à-dire jusqu’à plusieurs semaines avec un mélange périodique) peut être nécessaire avant que l’équilibre soit atteint. Les dates de préparation du sol d’essai et d’ajout d’organismes d’essai doivent être consignées et signalées. On devrait préparer chaque lot de sol d’essai représentant une variante expérimentale (concentration) particulière en une quantité suffisante pour permettre la préparation de toutes les répétitions de cette variante (concentration) (v. § 4.2.1, 4.3.1 et 5.6.2), de même que toute répétition ou quantité supplémentaire dont on a besoin pour l’une ou l’autre des analyses physicochimiques (§ 6.3) ou d’autres essais de toxicité du sol à l’aide de vers de terre ou d’autres organismes terricoles (p. ex. les essais effectués conformément aux méthodes exposées dans EC 2005b, 2013b, 2014a; ou ECCC, 2020a).

On recommande l’emploi d’un sol artificiel (§ 3.3.2) pour la préparation de chaque mélange d’essai, puisque cette matière offre une approche constante, normalisée, permettant la comparaison des résultats relatifs à d’autres substances ou produits chimiques éprouvés selon une méthode semblable, dans le même laboratoire ou ailleurs (p. ex. selon l’USEPA, 1989; l’ISO, 2008, 2012; l’ASTM, 2012; ou l’OECD, 2016]). Si on se sert d’un sol artificiel, on devrait suivre le mode de préparation décrit en 3.3.2. On devrait préparer (en fonction du poids sec des constituants; v. § 3.3.2) la quantité nécessaire de sol artificiel pour l’essai ou les essais, l’hydrater à environ 20 % d’humidité (ce qui correspond à environ 28 % de la capacité de rétention en eau du sol), au besoin en ajuster le pH dans l’intervalle de 6,0 à 7,5^{Note de bas de page 122}, la laisser mûrir au moins 3 jours et l’entreposer jusqu’à ce qu’on en ait besoin (v. § 3.3.2). L’humidité finale (y compris celle qui est attribuable à l’ajout d’une quantité mesurée de substance ou de produit chimique à l’étude, dissoute dans l’eau d’essai avec ou sans solvant organique) de tout sol enrichi avec une substance chimique et préparé à l’aide d’un sol artificiel devrait être d’environ 70 % de la capacité de rétention en eau du mélange final (§ 3.3.2), à chaque variante (concentration), ou à celle qui produit la texture de sol optimale pour l’essai (c’est-à-dire une consistance grumeleuse homogène avec des grumeaux d’environ 3 à 5 mm de diamètre; v. § 5.3)^{Note de bas de page 123}. L’humidité finale de chaque mélange (variante) utilisé dans un essai devrait être aussi semblable que possible.

On peut choisir d’utiliser un sol témoin naturel (§ 3.3.1) plutôt qu’un sol témoin artificiel (§ 3.3.2) comme sol témoin négatif à enrichir d’une ou de plusieurs substances ou produits chimiques ainsi que dans les répétitions correspondantes de sol témoin à inclure dans l’essai. Le mode opératoire décrit dans le présent document à l’égard du sol artificiel s’applique également au sol naturel, si on en utilise, si ce n’est que la teneur en humidité finale de chaque lot de sol enrichi avec une substance chimique (y compris les lots témoins) préparée à l’aide de sol prélevé sur le terrain devrait être ajustée au pourcentage optimal de sa capacité de rétention en eau (en hydratant ou en déshydratant l’échantillon, le cas échéant), conformément aux conseils exposés dans le § 5.3. S’il s’agit d’un sol naturel, le volume de sol dans chaque récipient d’essai ou compartiment d’une enceinte utilisée pour l’essai de réaction d’évitement pourrait également être différent en raison des écarts dans la masse volumique apparente de chacun des sols susceptibles d’être utilisés.

Le mode opératoire servant à l’enrichissement expérimental du sol dépend des objectifs de l’étude et de la nature de la substance d’essai à mélanger au sol témoin négatif ou à un autre sol. Souvent, on prépare un mélange de substance et de sol en apprêtant une solution mère de la ou des substances ou produits chimiques à l’étude, puis en en mélangeant une ou plusieurs mesures dans de l’eau d’hydratation, qui est ensuite ajoutée à un sol témoin négatif, artificiel ou naturel (§ 3.3)^{Note de bas de page 124}. Le solvant que l’on préfère pour la préparation des solutions mères est l’eau d’essai (c’est-à-dire désionisée ou distillée); on devrait éviter d’utiliser d’autres solvants que de l’eau d’essai à 100 %, sauf nécessité absolue. Si les substances ou produits chimiques ne se dissolvent pas facilement dans l’eau d’essai, on peut utiliser un peu de solvant organique convenable, miscible dans l’eau, peu toxique (p. ex. acétone, méthanol ou éthanol) pour aider à disperser ces substances dans l’eau (OECD, 2016). On ne devrait pas utiliser de surfactifs.

S’il l’on emploie un solvant organique, il faut effectuer l’essai à l’aide d’une série de récipients d’essai ou compartiments d’une enceinte utilisée pour l’essai de réaction d’évitement ne contenant que du sol témoin négatif (c’est-à-dire 100 % de sol non contaminé, artificiel ou naturel, ne renfermant pas de solvant ni de substance d’essai), de même qu’une série d’enceintes renfermant uniquement du sol témoin du solvant (ASTM, 2012; ISO, 2012; USEPA, 2012; OECD, 2016). À cette fin, il faut préparer un lot du sol témoin du solvant renfermant la concentration d’agent solubilisant présent dans la plus forte concentration, dans le sol, de substance(s) ou de produit(s) chimique(s) à l’étude. Il faut utiliser du solvant du même lot que celui qui a servi à préparer la solution mère des substances d’essai. On devrait utiliser les solvants avec modération, puisqu’ils pourraient contribuer à la toxicité du sol d’essai préparé. La concentration maximale de solvant dans le sol ne devrait pas agir sur la réaction d’évitement ou la reproduction des vers de terre pendant l’essai. Si on ne connaît pas cette concentration, on devrait effectuer un essai préliminaire avec solvant uniquement, à diverses concentrations, dans le sol témoin négatif, pour déterminer la concentration-seuil efficace du solvant que l’on envisage d’utiliser dans l’essai définitif.

Pour les essais comportant la préparation de concentrations de substance ajoutée à un sol artificiel, dans lesquelles la substance est insoluble dans l’eau, mais soluble dans un solvant organique, on devrait dissoudre la quantité de substance d’essai nécessaire à la préparation du volume nécessaire d’une concentration à l’étude particulière dans un peu de solvant organique convenable (p. ex. de l’acétone). On devrait ensuite pulvériser ou mélanger ce mélange de substance dans un solvant sur ou dans un peu de la quantité finale de sable quartzeux fin dont on a besoin pour la préparation de chaque concentration à l’essai comprenant une quantité mesurée d’un mélange particulier de substance dans un solvant ajouté au sol artificiel (v. § 3.3.2). On élimine ensuite le solvant par évaporation, en plaçant le récipient dans une hotte, pendant au moins une heure, jusqu’à ce qu’on ne puisse plus déceler d’odeur résiduelle du solvant. Une fois le solvant évaporé, on combine soigneusement le mélange de substance et de sable avec la quantité restante du sable préhumidifié et des autres ingrédients nécessaires pour préparer le sol artificiel (v. 3.3.2). On peut ensuite ajouter la quantité d’eau d’essai nécessaire pour obtenir une humidité finale d’environ 70 % de la capacité maximale de rétention en eau de ce sol artificiel, puis on mélange le tout avec le mélange de sol, de sable et de tourbe. On peut alors ajouter aux récipients d’essai/enceintes expérimentales le sol enrichi d’une substance (OECD, 2016).

Pour les essais dans lesquels le sol naturel est enrichi avec une substance chimique insoluble dans l’eau, on peut avoir recours au mode opératoire suivant (R. Kuperman, US Army Edgewood Chemical Biological Center, communication personnelle, 2004). Après dissolution de la substance dans un solvant (comme l’acétone), on verse cette solution sur une couche de sol de 2,5 cm d’épaisseur à l’aide d’une pipette afin d’obtenir la concentration voulue de chaque substance chimique dans le sol; il faut s’assurer que le volume ajouté n’excède jamais 15 % (ratio volume/poids) du poids sec du sol. Ce même volume de solution (substance-solvant) à des concentrations différentes est ajouté à chaque variante expérimentale; il doit correspondre au volume dont on a besoin pour dissoudre la substance chimique à la concentration d’essai la plus élevée. On laisse le solvant se volatiliser (pendant au moins 18 h, généralement) sous une hotte dépourvue d’éclairage afin d’empêcher la photolyse. Chaque échantillon de sol enrichi est mélangé jusqu’à ce qu’il soit homogène (p. ex. chaque échantillon est transféré dans un récipient en polyéthylène haute densité à revêtement fluorocarbone, puis mélangé pendant 18 h dans un agitateur rotatif tridimensionnel). D’autres méthodes de dissipation du solvant peuvent être utilisées selon la nature de la substance d’essai ou du solvant.

Il faut préparer l’échantillon de sol témoin du solvant à inclure dans l’essai d’après le même mode opératoire, mais sans addition de la substance d’essai. En outre, ce sol doit renfermer une concentration de solvant aussi élevée que celle qui se trouve dans n’importe laquelle des concentrations de sol enrichi avec une substance chimique que l’on utilise dans un essai.

Si la substance d’essai à ajouter au sol artificiel est insoluble dans l’eau et dans tout solvant organique convenable (non toxique), on devrait en préparer un mélange constitué de 10 g de sable quartzeux industriel, fin, broyé et de la quantité de la substance nécessaire pour obtenir la concentration d’essai voulue dans le sol. On devrait alors mélanger à fond ce mélange avec les autres constituants du sol artificiel préalablement humidifié. On ajoute ensuite, en mélangeant, la quantité d’eau désionisée nécessaire pour obtenir une humidité finale d’environ 70 % de la capacité maximale de rétention en eau. On peut ensuite déposer dans les récipients d’essai/enceintes expérimentales le mélange résultant de sol enrichi avec la substance chimique (OECD, 2016).

Si la substance d’essai à ajouter au sol naturel est insoluble dans l’eau et dans tout solvant organique convenable (non toxique), on devrait en ajouter par mélange à sec. Le mode opératoire suivant peut être utilisé (Ritchie et al., 2017; EC, 2014b). On mélange le sol naturel et la quantité de la substance d’essai nécessaire pour obtenir la concentration souhaitée dans le sol. Ce mélange est d’abord combiné à l’aide d’un batteur électrique, puis mélangé pendant plusieurs heures (p. ex. 16 h), à l’aide d’un agitateur mécanique ou d’un batteur (p. ex. mélangeur rotatif) jusqu’à homogénéité. Le sol enrichi peut être mélangé avec de l’eau d’essai (p. ex. jusqu’à 50 % de sa teneur en humidité optimale), avant de l’additionner d’une substance. Chaque concentration peut être mélangée à sec indépendamment. On peut aussi préparer un mélange de la substance d’essai et d’une portion de sol non contaminé à la concentration à l’étude la plus élevée, dans un volume suffisant pour répondre aux exigences d’un essai, en diluant le sol enrichi avec du sol non contaminé, après l’enrichissement initial et le mélange. Ces mélanges peuvent être préparés plusieurs heures ou jours avant le début de l’essai pour permettre l’équilibrage chimique. L’efficacité des méthodes de mélange à sec devrait être évaluée par l’analyse chimique d’aliquotes de sol.

Habituellement, on calcule, on mesure et on exprime les concentrations de substance ou de produit chimique dans le sol en milligrammes de substance d’essai par kilogramme sec de sol ou en microgrammes par gramme sec (μg/g) [OCDE, 1984, 2016; ISO, 1993]. De même, les paramètres d’évaluation sont reportés au poids sec de sol (§ 6.4).

Pour chaque variante faisant partie d’un essai, il faut normaliser les conditions de mélange, y compris le rapport solution/sol, la durée du mélange et du repos et la température de mélange et de repos. La durée de mélange d’un sol enrichi devrait pouvoir assurer l’homogénéisation chimique, ce qui peut prendre plusieurs minutes ou jusqu’à 24 heures. Pendant le mélange, on devrait maintenir la température basse pour réduire au minimum l’activité microbienne et la modification des caractéristiques physicochimiques du mélange. L’analyse de sous-échantillons du mélange est conseillée pour déterminer le degré de mélange et d’homogénéité réalisé.

Pour certaines études, il pourrait être nécessaire de ne préparer qu’une seule concentration d’un mélange particulier de sol témoin négatif (ou d’un autre sol) et de substance(s) ou de produit(s) chimique(s) ou un mélange d’une seule concentration de sol contaminé ou de déchet particulaire dans un sol témoin négatif ou un autre sol. Par exemple, on pourrait réaliser un essai à concentration unique pour déterminer si une concentration particulière de substance ou de produit chimique dans un sol non contaminé est toxique pour les organismes d’essai. Une telle application pourrait servir à la recherche ou à des fins réglementaires (p. ex. « essai limite »).

On devrait recourir à un essai à concentrations multiples, en vertu duquel on ajoute une gamme de concentrations de substance à un sol témoin négatif (ou à un autre sol) dans des conditions normalisées, pour déterminer l’effet ou les effets que l’on souhaite mesurer (c’est-à-dire la CL50, la CE50, la CIp; v. § 6.4) des mélanges de substance et de sol. Un essai à concentrations multiples employant un sol témoin négatif additionné d’un déchet particulaire donné pourrait également convenir. Il faut préparer, pour chaque essai à concentrations multiples, au moins 5 concentrations plus le ou les témoins afin d’estimer la CE50 de 48 h (et toute autre CEp) provoquant une réaction d’évitement (v. § 4.3.1 et 4.3.2); on en recommande même davantage (c’est-à-dire au moins 7 concentrations plus les témoins). Pour un essai de reproduction à concentrations multiples d’une durée de 56 jours, il faut préparer au moins 7 concentrations plus le ou les témoins appropriés), et on en recommande davantage (c’est-à-dire au moins 10 plus les témoins) [v. § 4.2.1 et 4.2.2]. Lorsque l’on choisit les concentrations d’essai, on peut utiliser une suite géométrique appropriée de dilutions, chaque concentration successive de la substance ou du produit dans le sol étant au moins la moitié de celle qui la précède dans la suite (p. ex. 10, 5, 2,5, 1,25, 0,63 mg/kg). On peut également choisir les concentrations dans d’autres suites logarithmiques appropriées de dilution (v. annexe G); on peut également les choisir après avoir effectué un essai préliminaire de toxicité visant à cerner la gamme de concentrations à utiliser. Le lecteur est prié de consulter le § 4.1 pour obtenir des conseils supplémentaires sur la sélection des concentrations d’essai.

Pour choisir une gamme convenable de concentrations, il peut valoir la peine d’effectuer un essai préliminaire couvrant une gamme plus large de concentrations. On pourrait réduire ou supprimer complètement, pour ce genre d’essai, le nombre de répétitions par variante expérimentale (v. § 4.2.1 et 4.3.1). Selon l’écart prévu ou révélé (par des études antérieures ayant employé la même substance ou une substance semblable) entre les récipients d’essai de la même variante expérimentale, on pourrait également réduire le nombre de répétitions dans les travaux de recherche et les essais biologiques (bioessais) de dépistage à des fins non réglementaires.

En fonction des objectifs de l’essai, il pourrait être souhaitable de déterminer l’effet des caractéristiques du substrat (p. ex. sa granulométrie ou sa teneur en matière organique) sur la toxicité des mélanges de substance et de sol. Par exemple, on pourrait mesurer l’influence de la granulométrie du sol sur la toxicité chimique en effectuant des essais parallèles à concentrations multiples employant une série de mélanges constitués de la ou des substances ou produits chimiques à l’étude dans différentes fractions granulométriques (c’est-à-dire des classes granulométriques tamisées) ou dans différents types de sol témoin négatif naturel ou artificiel (§ 3.3). De même, on pourrait examiner le degré dans lequel la teneur en carbone organique total (%) ou la teneur en matière organique (%) du sol peut modifier la toxicité chimique, en effectuant des essais parallèles à concentrations multiples employant différents mélanges de substances et de sol préparés avec une série de sols témoins négatifs enrichis en matière organique. On devrait inclure dans l’essai, en tant que témoin séparé, chaque fraction granulométrique ou chaque préparation de sol témoin négatif naturel ou artificiel utilisé dans la préparation de ces mélanges.

Selon les objectifs et le plan de l’étude, on pourrait effectuer certains essais de toxicité d’un sol employant des vers de terre avec des échantillons de sol témoin négatif ou de sol de référence auxquels on applique, en surface, une ou des substances ou produits chimiques, plutôt que de les y mélanger. On peut appliquer ces traitements de surface sur le terrain ou en laboratoire. Les modes opératoires de l’application de substance(s) comprennent l’emploi d’un pulvérisateur à trajet balisé et étalonné pour assurer la distribution uniforme de la substance sur une surface donnée. On peut doser la ou les substances ou produits chimiques dans le sol, grâce à la profondeur de pénétration, à la superficie ou à la largeur de la surface couverte en une passe, au calibre de la ou des buses, à la pression et à la vitesse de déplacement du pulvérisateur (Stephenson, G.L., Aquaterra Environmental, communication personnelle, 2001). L’OCDE (OCDE, 2016) donne quelques conseils sur les substances à appliquer à la surface du sol en préparation d’essais pour en mesurer l’effet sur la reproduction des vers de terre.

6.3 Observations et mesures pendant l’essai

Lorsque l’on met l’essai sur pied, on devrait faire la description qualitative de chaque mélange de sol enrichi avec une substance chimique. Cela pourrait englober des observations de la couleur, de la texture et de l’homogénéité apparente (visuelle) de chaque mélange. On devrait consigner toute modification de l’aspect du mélange pendant l’essai ou à la fin de ce dernier.

Dans les § 4.2.5 et 4.3.5, on trouve des conseils et des exigences particulières sur les essais, relativement aux observations et aux mesures à faire au début et à la fin de l’essai et pendant ce dernier. Ces observations et mesures s’appliquent et doivent être effectuées pendant la réalisation de n’importe lequel des essais de toxicité d’un sol décrits dans le présent document et pour lesquels on utilise un échantillon ou plus de sol enrichi avec une substance chimique. Dans le cas de sols échantillonnés par horizon, les mesures doivent porter sur chaque horizon.

Selon les objectifs de l’essai et son plan d’expérience, on pourrait préparer des récipients d’essai supplémentaires au jour − 1 de l’essai de reproduction (v. § 4.2.1) pour surveiller les caractéristiques chimiques du sol. Ces récipients supplémentaires feraient l’objet d’un prélèvement destructif pendant l’essai (c’est-à-dire au jour 0 et, dans certains cas, en d’autres jours, à mesure que l’essai se déroule) ou à la fin de l’essai. Ces récipients de surveillance seraient installés le jour 0 si l’essai est démarré (c’est-à-dire si des organismes sont ajoutés aux récipients d’essai) immédiatement après la préparation du sol d’essai en raison de préoccupations concernant la volatilisation, la dégradation ou le métabolisme des contaminants ou des substances dans les sols d’essai (v. § 6.1). On pourrait ajouter ou non des organismes d’essai dans ces récipients supplémentaires, selon les objectifs de l’étude. On pourrait mesurer les concentrations chimiques dans le sol de ces récipients d’essai après avoir prélevé des parties aliquotes de sol pour les analyses appropriées, au début de l’essai et à mesure qu’il se déroule et/ou à la fin de ce dernier, selon la nature du toxique et les objectifs de l’essai.

Il faut mesurer la qualité (y compris le pH et la teneur en humidité) de chaque mélange de sol d’essai enrichi (y compris du sol témoin négatif) et consigner les résultats au début et à la fin de l’essai, comme il est décrit dans les § 4.2.5 et 4.3.5. Si les capacités d’analyse le permettent, il est recommandé d’analyser la ou les solutions mères en même temps qu’un ou plusieurs sous-échantillons de chaque mélange de sol enrichi, pour déterminer les concentrations chimiques et évaluer la qualité de l’enrichissement. Ces sous-échantillons et solutions devraient être conservés, entreposés et analysés conformément à des modes opératoires appropriés et validés.

À moins d’avoir de bonnes raisons de croire que les dosages ne sont pas exacts, on devrait calculer les résultats toxicologiques de chaque essai dans lequel on mesure des concentrations dans chaque mélange de sol enrichi faisant partie de l’essai et les exprimer en fonction de ces valeurs mesurées. Il faudrait au moins prélever des parties aliquotes des échantillons aux concentrations forte, médiane et faible, au début et à la fin de l’essai^{Note de bas de page 125}; auquel cas, les valeurs calculées des effets mesurés (§ 6.4) se fonderaient sur des valeurs nominales. On devrait comparer tout résultat de ce dosage de la ou des substances ou produits chimiques à l’étude aux concentrations nominales, signaler tout écart qu’il présente et par rapport aux concentrations nominales et en discuter. Si on utilise les concentrations nominales pour exprimer les résultats toxicologiques, il faut l’expliciter dans le rapport particulier de l’essai (v. § 7.1.6).

6.4 Effets mesurés (paramètres ultimes) et calculs

Les essais à concentrations multiples employant des mélanges de sols enrichis se caractérisent par des paramètres statistiques propres à chaque essai (v. § 4.2.7 et 4.3.7). On trouve des conseils sur le calcul d’une CL50 (§ 4.2.7) ou d’une CE50 (§ 4.3.7) dans le § 6.4.1 ci-après, tandis que, pour le calcul d’une CIp (d’après les données révélant une inhibition de la fonction de reproduction; v. § 4.2.7), il faut aller au § 6.4.2. Dans le § 5.6, on donne des conseils sur le calcul et la comparaison de ces paramètres révélés par des essais à concentration unique utilisant des échantillons de sol prélevés sur le terrain. Ils s’appliquent également aux essais à concentration unique effectués sur des mélanges de sol enrichi. Pour plus de renseignements sur ces statistiques et d’autres statistiques paramétriques (ou non paramétriques) appropriées, à appliquer aux effets mesurés, on devrait consulter le rapport d’Environnement Canada sur les statistiques permettant la détermination des effets toxiques mesurés (EC, 2005a).

Dans tout essai qui comprend un sol témoin du solvant (v. § 6.2), il faut examiner les résultats obtenus pour les vers de terre maintenus dans ce sol et dans le sol témoin négatif afin de déterminer s’ils sont respectivement conformes aux critères de validité de l’essai (v. § 4.2.3 et 4.3.3). Si ces critères ne sont pas satisfaits pour l’un ou l’autre témoin, on doit considérer que les résultats de l’essai sont non valides. S’ils sont satisfaits dans les deux cas, les résultats du sol témoin du solvant devraient être utilisés dans l’analyse statistique^{Note de bas de page 126}. Toutefois, s’ils sont satisfaits dans les deux cas, mais que le taux de survie ou de reproduction diffère grandement entre les deux témoins, cela pourrait indiquer l’existence d’une interférence possible du solvant, et on devrait alors procéder à une évaluation supplémentaire pour en mesurer l’incidence sur l’interprétation de l’essai. On trouvera dans USEPA (2008) des indications sur ce que pourrait inclure une telle évaluation : 1) degré de pertinence de la réponse dans le sol témoin du solvant (à savoir le pourcentage de changement par rapport à la réponse dans le sol témoin); 2) degré de signification statistique connexe à la différence entre les deux témoins (c’est-à-dire écart hautement ou très peu significatif); 3) ampleur de l’interférence; 4) examen de toute autre cause potentielle de l’interférence observée dans le sol témoin du solvant; 5) incidence de cette interférence possible sur l’incertitude de l’estimation du risque.

6.4.1 CL50 ou CE50

Lorsque l’on effectue un essai à concentrations multiples avec des mélanges de sol enrichi (§ 6.2), il faut utiliser les données quantiques sur la mortalité pour une période donnée d’exposition pour calculer (si les données le permettent) la concentration létale médiane (CL50) appropriée ainsi que ses limites de confiance à 95 %. Dans un essai de reproduction visant à mesurer l’exposition à de multiples concentrations de sol enrichi, il faut calculer et signaler la CL50 après 28 j chez les adultes (de première génération) si les données le permettent^{Note de bas de page 127} (v. § 4.2.7). Pour estimer la CL50, on combine les données sur la mortalité à la période spécifiée d’exposition correspondant à toutes les répétitions de chaque concentration.

Dans un essai de réaction d’évitement à multiples concentrations employant des vers de terre, il faut calculer la concentration efficace médiane (CE50 de 48 h) (ainsi que ses limites de confiance à 95 %) à la fin de l’essai, si les données le permettent. Ce calcul se fonde sur le pourcentage de réactions d’évitement à chaque concentration (§ 4.3.7).

Environnement Canada (2005a) a donné des conseils sur le choix des méthodes d’analyse statistique à appliquer aux données quantiques (la CL50 ou la CE50), que l’on devrait consulter lorsque l’on choisit le test statistique à appliquer à de telles données pour les essais de toxicité employant des vers de terre (section 4 dans EC, 2005a).

L’optimisation du calcul de la CL50 ou de la CE50 et de ses intervalles de confiance à 95 % est basée sur les effets partiels observés (EC, 2005a). En bref, les régressions probit et/ou logit sont les régressions de prédilection si deux effets partiels sont observés; on privilégie la méthode de Spearman-Kärber si un seul effet partiel est observé; on utilise la méthode binomiale si aucun effet partiel n’est observé, et comme méthode générale « par défaut » (EC, 2005a).

Quels que soient les calculs utilisés, il est fortement recommandé de vérifier toute CL50 calculée par des moyens informatiques en examinant le graphique, aux échelles log-probit, des taux de mortalité ou réaction d’évitement à une période donnée d’exposition aux diverses concentrations (EC, 2005a). Il faut résoudre tout écart important entre la CL50 ou CE50 estimée au moyen de ce graphique et la CL50 ou CE50 calculée par des moyens informatiques. Pour cette vérification, il est recommandé d’utiliser un graphique tracé à la main (EC, 2005a).

6.4.2 CIp

Quand on réalise un essai de reproduction à concentrations multiples pour mesurer les effets d’une exposition des vers de terre des mélanges de sol enrichi (ou à des mélanges de sol prélevé sur le terrain; v. § 5.3), il faut utiliser les données quantitatives représentant l’inhibition de la reproduction pour calculer la CIp (v. § 4.2.7 et § 6.2). La CIp est une estimation quantitative de la concentration causant un pourcentage spécifié de réduction du nombre moyen de jeunes engendrés par les vers adultes pendant l’essai.

On calcule cette concentration à un pourcentage spécifié d’inhibition (p. ex. la CI25 et/ou la CI20, qui représentent une inhibition ou réduction de 25 et de 20 %, respectivement). La valeur p du pourcentage est choisie par le chercheur, et c’est le plus souvent 25 % ou 20 %. Il faut accompagner toute CIp calculée et signalée de ses limites de confiance à 95 %.

Dans les analyses de la performance reproductrice, on se sert du nombre de jeunes survivants engendrés dans chaque enceinte (répétition) pour calculer le nombre moyen de jeunes survivants engendrés dans chaque variante expérimentale (à chaque concentration), relativement au nombre moyen engendré dans les répétitions des témoins négatifs. On attribue la valeur nulle (0) au nombre de jeunes dans une enceinte, si les vers adultes qui s’y trouvaient sont morts avant de se reproduire. Si l’un ou l’autre des vers adultes meurt pendant l’essai, après s’être reproduit, le nombre de jeunes engendrés continue de devoir être utilisé dans les analyses. Si, dans une enceinte, aucun jeune ne survit, la contribution du récipient d’essai au calcul du nombre moyen de survivants, dans cette variante (concentration), est nulle. Si, à une concentration donnée, aucun jeune ne survit dans aucune des enceintes, cette concentration continue d’être incluse dans l’analyse, avec une valeur moyenne nulle de jeunes.

Comme nous l’avons mentionné dans le § 4.2.7, il faut calculer une CIp pour le nombre moyen de vers survivants engendrés dans une variante expérimentale donnée et les signaler (si les données le permettent) à la fin d’un essai de reproduction à concentrations multiples avec E. andrei ou D. rubidus. Il faut faire ces calculs en employant les analyses de régression linéaires ou non linéaires appropriées (v. le § 6.4.2.1 suivant). Si, cependant, les analyses de régression ne permettent pas de calculer une CIp significative pour le nombre moyen de jeunes vivants engendrés, on devrait appliquer aux données correspondantes les analyses au moyen du programme ICPIN décrites au § 6.4.2.2. Il faut déclarer tout mode opératoire appliqué aux données, les détails concernant toute transformation des données ainsi que la méthode statistique utilisée pour le calcul de la CIp.

6.4.2.1 Emploi de la régression

À la fin d’un essai définitif à concentrations multiples d’une durée de 56 jours (ou, dans certains cas, de 63 jours) employant E. andrei ou D. rubidus, il faut calculer une CIp (y compris sa limite respective de confiance à 95 %) pour le nombre moyen de jeunes vers survivants engendrés dans chaque variante expérimentale, à l’aide de méthodes de régression, à condition que les hypothèses ci-dessous soient satisfaites. Un certain nombre de modèles permettent d’évaluer par régression les données sur la reproduction (essais statistiques quantitatifs). Les modèles proposés pour l’application consistent en un modèle linéaire et en les quatre modèles suivants de régression non linéaire : exponentiel, de Gompertz, logistique, hormétique (ou hormético-logistique, c’est-à-dire logistique ajusté à l’hormèse^{Note de bas de page 128}) (v. § 6.5.8 dans EC, 2005a). Pour que les méthodes de régression puissent être utilisées, les données doivent satisfaire aux hypothèses de normalité et d’homoscédasticité. Nous conseillons fortement le lecteur de consulter EC (2005a) pour obtenir des conseils supplémentaires sur l’application générale de la régression linéaire et non linéaire à l’analyse des données toxicologiques quantitatives^{Note de bas de page 129}.

Dans la figure 4, on expose le processus général de l’analyse statistique et du choix du modèle de régression qui convient le mieux (linéaire ou non linéaire) aux données toxicologiques quantitatives. La sélection débute par l’examen du nuage de points ou du graphique linéaire correspondant aux données expérimentales, pour déterminer l’allure de la courbe concentration-réponse. On compare ensuite l’allure de la courbe aux modèles disponibles, en retenant, pour examen approfondi, un ou plusieurs modèles appropriés, les mieux conformes aux données (v. fig. O.1, annexe O dans EC, 2005a), pour la représentation des cinq modèles potentiels).

Une fois le ou les modèles appropriés retenus en vue de l’examen approfondi, on évalue les hypothèses relatives à la normalité et à l’homoscédasticité des résidus.

Figure 4 Processus général de l’analyse statistique et de la sélection du modèle convenant le mieux aux données quantitatives sur la toxicité (adapté et modifié d’après Stephenson et al., 2000b)

Si, pour un ou plusieurs des modèles examinés, la régression satisfait les hypothèses, on examine les données (et la régression) pour y trouver des valeurs aberrantes. Si on en trouve, on devrait examiner la possibilité d’erreur humaine dans le procès-verbal de l’essai et les conditions expérimentales. S’il se trouve une ou plusieurs valeurs aberrantes, on devrait effectuer l’analyse avec et sans ces valeurs et comparer les résultats des analyses pour examiner l’effet des valeurs aberrantes sur la régression. Ensuite, on doit décider s’il faudrait soustraire la ou les valeurs aberrantes à l’analyse finale. Pour cette décision, on devrait prendre en considération la variabilité biologique naturelle et les éventuelles causes biologiques de l’anomalie apparente. Dans le § 10.2 de EC (2005a), on trouve des conseils supplémentaires sur la présence de valeurs aberrantes et d’observations inhabituelles.

Si aucune valeur aberrante n’est présente ou si on n’en soustrait aucune à l’analyse finale, le modèle qui présente la plus petite moyenne des carrés des erreurs résiduelles est retenu comme modèle optimal^{Note de bas de page 130}. On conseille aussi de consulter un statisticien qui connaît bien la façon de traiter les données aberrantes.

On devrait évaluer la normalité à l’aide du test de Shapiro-Wilk, décrit dans EC (2005a). Pendant la régression, on peut également utiliser un graphique de probabilité normale des résidus, mais cela n’est pas conseillé comme test autonome de la normalité, puisque l’évaluation de la normalité ou non d’une distribution relève de la subjectivité de l’utilisateur. Si la distribution des données n’obéit pas à la loi normale, on devrait essayer un autre modèle, consulter un statisticien pour obtenir un avis supplémentaire sur le modèle à retenir ou effectuer la méthode d’analyse moins souhaitable qu’est l’interpolation linéaire (à l’aide du programme ICPIN; v. § 6.4.2.2).

On devrait évaluer l’homoscédasticité des résidus à l’aide du test de Levene, décrit dans EC (2005a) et par la comparaison des graphiques des résidus aux valeurs réelles et prévues (estimées). Le test de Levene donne une indication nette de l’homogénéité (p. ex. comme dans la fig. O.2A de l’annexe O dans EC, 2005a) ou non des données. Si (d’après le test de Levene) les données sont hétéroscédastiques (c’est-à-dire non homogènes), il faudrait examiner les graphiques des résidus. Si la variance subit une modification importante et si les graphiques des résidus épousent nettement la forme d’un éventail ou d’un fuseau (cf. la fig. O.2B, annexe O dans EC, 2005a), il faudrait répéter l’analyse des données au moyen d’une régression pondérée. Pour pondérer les données, on divise habituellement par l’inverse de la variance, mais d’autres méthodes sont possibles. Avant de retenir la régression pondérée, on compare l’erreur-type de la CIp à celle que l’on obtient par régression non pondérée. Si la différence entre les deux erreurs-types excède 10 %^{Note de bas de page 131}, on retient comme choix optimal la régression pondérée. Cependant, si l’écart est inférieur à 10 %, on devrait consulter un statisticien sur l’application de modèles supplémentaires, compte tenu des données expérimentales. On pourrait également analyser de nouveau les données en utilisant la méthode d’analyse moins souhaitable qu’est l’interpolation linéaire (au moyen du programme ICPIN, v. § 6.4.2.2). On effectue cette comparaison entre la régression pondérée et la non pondérée, pour chacun des modèles retenus, pendant que l’on s’engage dans la sélection finale du modèle (c’est-à-dire du meilleur modèle et de la meilleure régression). Certaines formes non divergentes du nuage de points pourraient révéler un modèle inadapté ou erroné (cf. fig. O.2C, annexe O dans EC, 2005a), et, de nouveau, il est conseillé d’obtenir l’avis d’un statisticien sur l’application de modèles supplémentaires.

Les paramètres estimés par régression doivent être encadrés par les concentrations utilisées dans l’essai; l’extrapolation des paramètres au-delà de la concentration d’essai maximale ne constitue pas une pratique acceptable (EC, 2005a).

6.4.2.2 Interpolation linéaire au moyen du programme ICPIN

Si les régressions des données relatives aux effets mesurés (v. § 6.4.2.1) n’aboutissent pas à une CIp acceptable pour l’inhibition de la reproduction (c’est-à-dire si les hypothèses de normalité et d’homoscédasticité ne peuvent être satisfaites), on devrait appliquer l’interpolation linéaire au moyen du programme informatique dit ICPIN. Ce programme (Norberg-King, 1993; USEPA, 1995, 2002) est libre de droits, et il fait partie de la plupart des logiciels employés en écotoxicologie, y compris TOXSTAT (1996) et CETIS. Les instructions d’origine du programme ICPIN dues à l’USEPA sont claires et facilitent l’emploi du programme (Norberg-King, 1993)^{Note de bas de page 132}. Une version antérieure du programme s’appelait BOOTSTRP.

L’analyse par le programme ICPIN n’exige pas des nombres égaux de répétitions aux différentes concentrations. On estime la CIp par lissage des données, au besoin, puis par utilisation des deux données encadrant la CIp choisie (USEPA, 1995, annexe L; USEPA, 2002, annexe M). Pour calculer la CIp, des concentrations d’essai doivent lui être inférieure et supérieure; ces deux concentrations devraient agir assez près de la valeur choisie de p, de préférence à moins de 20 % de distance. Le programme n’emploie pas l’échelle logarithmique des concentrations, de sorte que ses utilisateurs doivent saisir les concentrations sous forme de logarithmes. Certains progiciels du commerce possèdent, comme option générale, la transformation logarithmique, mais on devrait s’assurer que les chiffres ainsi calculés sont effectivement retenus lorsque l’on applique le programme ICPIN. Ce dernier estime les limites de confiance par une technique particulière dite « bootstrap », parce que les méthodes usuelles ne sont pas valides. Cette technique effectue de nombreux rééchantillonnages dans les mesures originelles. On doit spécifier le nombre de rééchantillonnages, qui peut varier de 80 à 1 000. Nous en recommandons au moins 400, et 1 000 seraient avantageux^{Note de bas de page 133}.

Si de multiples concentrations élevées et contiguës n’ont permis la survie d’aucun jeune, seule la concentration minimale de cette série devrait être utilisée dans l’analyse (c’est-à-dire la concentration la plus rapprochée de la médiane de la série de concentrations utilisées dans l’essai). Normalement, l’ajout de concentrations supplémentaires ne procure aucun avantage particulier, parce que ces concentrations n’offrent rien à l’analyse (c’est-à-dire que les données ne consistent qu’en un effectif nul de la progéniture).

Outre la détermination et le signalement de CIp calculées par des moyens informatiques relativement à la reproduction à la fin de l’essai, on devrait tracer le graphique du taux de réduction du nombre de jeunes engendrés qui sont vivants en fonction du logarithme des concentrations, pour vérifier les estimations mathématiques et procurer une estimation visuelle de la nature des données (EC, 2005a).

Si le programme ICPIN est appliqué à des données révélant un effet hormétique, un lissage inhérent des données pourrait modifier la valeur correspondant au témoin et décaler l’estimation de la CIp. En conséquence, avant d’appliquer l’analyse statistique, on devrait arbitrairement remplacer par la valeur témoin les valeurs hormétiques correspondant aux faibles concentrations. Cette façon de procéder est considérée comme un expédient provisoire, tant qu’une meilleure approche ne sera pas mise au point (v. Option 4, § 10.3.3 d’EC, 2005a).

La correction est appliquée à toute concentration d’essai dont l’effet moyen correspondant (c’est-à-dire la moyenne géométrique des moyennes des répétitions) est supérieur (« meilleur ») à la moyenne du témoin. Pour appliquer cette correction, on remplace l’effectif moyen de la progéniture observé dans les répétitions correspondant à la concentration ou aux concentrations hormétiques par la moyenne des répétitions du témoin. La moyenne géométrique de cette ou de ces concentrations sera alors identique à celle du témoin.

Section 7 : Rapports à produire

Dans le rapport sur chaque essai, il faut préciser si on s’est écarté des exigences énoncées dans les sections 2 à 6 et, le cas échéant, fournir des détails sur ces écarts. Le lecteur doit pouvoir juger si, grâce aux conditions et aux modes opératoires s’appliquant avant et pendant l’essai, les résultats sont valides et acceptables pour l’usage qu’il entend en faire.

Dans le § 7.1, nous énumérons les points (renseignements) à intégrer dans le rapport sur chaque essai et, dans le § 7.2, les renseignements soit à intégrer dans le rapport, soit à communiquer séparément dans un rapport général, soit à archiver pour au moins cinq années. Certains programmes de surveillance, les protocoles connexes d’essai ou des règlements pourraient exiger de faire figurer dans le rapport sur l’essai certains des renseignements particuliers que l’on énumère dans le § 7.2 (p. ex. des détails sur les matières étudiées ou sur les modes opératoires et les conditions explicites ayant coïncidé avec le prélèvement des échantillons, leur manipulation, leur transport ou leur entreposage) ou de les reléguer à l’archivage.

À l’égard de certains modes opératoires et conditions communs à une série d’essais courants (p. ex. des essais de toxicité réguliers ou des essais de contrôle de la conformité aux règlements) et correspondant aux exigences énoncées dans le présent document, on peut renvoyer à un rapport général ou joindre ce dernier. Dans ce rapport, on expose dans ses grandes lignes la pratique ordinairement suivie en laboratoire.

On doit archiver, au laboratoire, pour au moins cinq ans, les détails se rapportant aux modes opératoires, aux conditions et aux constatations de l’essai, qui ne sont pas reproduits dans le rapport sur l’essai ni dans le rapport général, de sorte que l’on peut fournir l’information convenable si l’essai doit faire l’objet d’une vérification (audit) (§ 7.2).

7.1 Exigences minimales pour le rapport sur l’essai

Voici la liste des renseignements à intégrer dans chaque rapport.

7.1.1 Substance ou matière d’essai

• une description succincte du type d’échantillon (p. ex. boue d’épuration, sol de référence ou sol contaminé, prélevé sur le terrain, sol témoin négatif) ou le code attribué à l’échantillon par le personnel du laboratoire;
• des renseignements sur l’étiquetage ou le codage de chaque échantillon;
• une courte description des méthodes d’échantillonnage, d’entreposage et de préparation (c’est-à-dire de prétraitement) du sol;
• des renseignements sur les horizons pédologiques, tels qu’ils ont été prélevés (nombre, profondeur relative de chacun) en tant que sol d’essai, sol de référence et sol témoin négatif, le cas échéant;
• le type de sol témoin négatif (naturel ou artificiel) et, le cas échéant, sol de référence;
• la date du prélèvement de chaque échantillon; la date et l’heure de sa réception au laboratoire;
• la température et la teneur en humidité de l’échantillon dès sa réception au laboratoire d’essai.

7.1.2 Organismes d’essai

• l’espèce et l’origine des géniteurs et des organismes d’essai;
• le poids humide (moyenne ± écart-type) des organismes au début de l’essai;
• tout aspect, comportement ou traitement inhabituel des organismes avant leur emploi dans l’essai.

7.1.3 Installations expérimentales

• les nom et adresse du laboratoire;
• le nom de la personne ou des personnes exécutant l’essai (ou chacun de ses éléments) et vérification des résultats.

7.1.4 Méthode d’essai

• la désignation de la méthode d’essai biologique utilisée (c’est-à-dire conformément au présent document);
• le plan d’expérience et la description du mode opératoire, s’il comporte des manipulations spéciales (p. ex. manipulation du sol, préparation de mélanges de sol enrichi; préparation et emploi de solvant et, dans ce cas, du témoin du solvant) ou modification(s) de la méthode normalisée décrite dans le présent document;
• une courte description de la fréquence et de la nature de toutes les observations et mesures effectuées pendant l’essai;
• le titre et la désignation des programmes et des méthodes de calcul des paramètres statistiques.

7.1.5 Conditions expérimentales et modes opératoires

• le plan et la description de tout écart par rapport aux conditions et aux modes opératoires exposés dans le présent document ou de toute exclusion de ces conditions et modes opératoires;
• le nombre d’échantillons discrets par variante expérimentale; ampleur cible avec effet dans des essais de reproduction à concentration unique (le cas échéant); le nombre d’enceintes expérimentales (répétitions) par variante expérimentale; le nombre et la description de chaque variable expérimentale, y compris le ou les témoins; les concentrations d’essai (s’il y a lieu);
• le volume ou la masse de sol dans chaque récipient d’essai ou compartiment servant à l’essai de réaction d’évitement;
• le nombre d’organismes par récipient d’essai/enceinte expérimentale et par variante expérimentale;
• les dates et heures de préparation des sols d’essai et des sols témoins, au début (c’est-à-dire les organismes ajoutés aux sols d’essai et témoins) et à la fin de l’essai;
• le régime alimentaire et la ration, dans le cas de l’essai de reproduction;
• l’indication de l’évaluation de la teneur en humidité du sol pendant l’essai de reproduction;
• la date du retrait des adultes des récipients d’essai, dans l’essai de reproduction;
• à l’égard de chaque échantillon de sol, toutes les mesures de la granulométrie, de la teneur en humidité, de la capacité de rétention en eau, du pH, du carbone organique total, de la teneur en matière organique, de la capacité d’échange cationique et de la conductivité électrique;
• à l’égard de chaque échantillon composé de sous-échantillons prélevés en même temps dans toutes les répétitions de chaque variante expérimentale, toutes les mesures de la température (température ambiante et du sol), du pH, de la teneur en humidité et de la capacité de rétention en eau.

7.1.6 Résultats

• d’un essai de reproduction : le taux moyen (± ET) de survie des vers adultes dans chaque variante expérimentale au jour 28 (ou au jour 35, le cas échéant); le nombre moyen (± ET) de jeunes survivants dans chaque variante expérimentale au jour 56 (ou au jour 63, le cas échéant); le nombre moyen (± ET) de juvéniles survivants engendrés par chaque ver adulte dans le ou les témoins au jour 56 (ou au jour 63, le cas échéant).
• d’un essai de réaction d’évitement : le taux de survie de tous les vers dans chaque enceinte à la fin de l’essai ou le taux moyen de survie des vers par enceinte si plus d’une enceinte expérimentale (répétition) est utilisée pour chaque sol d’essai ou chaque concentration d’essai; le nombre moyen (± ET) de vers survivants dans les répétitions de chaque variante expérimentale représentant du sol non contaminé et du sol d’essai, à 48 h dans les essais à concentration unique; le taux d’évitement pour chaque variante expérimentale pour les essais à concentrations multiples, ainsi que pour les essais à concentration unique, s’il est calculé;
• toute CIp (y compris ses limites de confiance à 95 %) que l’on a déterminée pour les données relatives à la réussite de la reproduction (c’est-à-dire le nombre de jeunes vers survivants, dans chaque variante expérimentale, à la fin de l’essai); les détails concernant toute transformation des données et l’indication des méthodes statistiques quantitatives utilisées ou des modes opératoires appliqués aux données;
• toute CL50 ou CE50 (y compris leurs limites de confiance à 95 % et, si on l’a calculée, la pente) que l’on a déterminée; toute CLp ou CEp (p. ex. la CL25 ou la CE25) que l’on a calculée;
• à l’égard d’un essai à concentrations multiples employant un sol enrichi avec une substance chimique, l’indication selon laquelle les résultats se fondent sur des concentrations nominales ou mesurées d’une ou de substances ou de produits chimiques; toutes les valeurs des concentrations mesurées et degré d’écart par rapport à la valeur nominale;
• toute détermination de la CI50 après 56 jours (ou 63 jours, le cas échéant) pour l’inhibition de la reproduction ou de la CE50 après 48 h pour la réaction d’évitement (et ses limites de confiance à 95 %) dans des essais à concentrations multiples; ou le pourcentage de réduction dans la production de jeunes par rapport au témoin ou le pourcentage d’évitement pour les essais avec témoins positifs effectués au moyen du toxique de référence, conjointement avec l’essai définitif de toxicité du sol; la moyenne géométrique (± 2 ET) calculée pour le même type d’essai, toxique de référence et la même espèce, dans le laboratoire, à la faveur d’essais antérieurs fondés sur les modes opératoires et les conditions des essais avec un toxique de référence décrits dans le présent document;
• toute anomalie dans le déroulement de l’essai, tout problème observé et toute mesure corrective prise.

7.2 Exigences supplémentaires

Ce paragraphe fournit une liste des renseignements qu’il faut soit faire figurer dans le rapport sur l’essai ou le rapport général, soit archiver pour au moins cinq années. Les renseignements déposés doivent inclure ce qui suit, le cas échéant :

• l’enregistrement de la chaîne de conservation des échantillons prélevés sur le terrain et des autres échantillons analysés dans un dessein de surveillance ou d’application des règlements;
• copie du dossier d’acquisition de l’échantillon ou des échantillons;
• les résultats d’analyses chimiques de l’échantillon ou des échantillons ne figurant pas dans le rapport sur l’essai;
• les notes d’observations et de mesures en laboratoire enregistrées pendant l’essai;
• les notes de laboratoire et les cartes de contrôle portant sur les essais de toxicité de référence;
• des renseignements sur l’étalonnage de l’équipement et des appareils.

Le personnel de laboratoire effectuant les essais doit signer ou parafer l’original des feuilles de données.

7.2.1 Substance ou matière d’essai

• le nom des préleveurs et/ou des fournisseurs de l’échantillon;
• l’enregistrement des fiches d’inscription de l’échantillon;
• l’apparence (p. ex. odeur, couleur) et l’état (p. ex. conservation à l’obscurité, dans un récipient scellé) de l’échantillon à sa réception et pendant l’entreposage;
• tout autre renseignement obtenu pour les échantillons prélevés sur le terrain (p. ex. les renseignements fournis ou conservés pendant le prélèvement des échantillons) ou les échantillons de substances chimiques (impuretés, additifs, formules structurales, etc.).

7.2.2 Organismes d’essai

• les renseignements et méthodes utilisés pour la confirmation taxonomique des espèces expérimentales;
• les antécédents et l’âge des reproducteurs pour tout élevage ayant fourni des organismes;
• la description des conditions et des modes opératoires d’élevage pour tous les élevages de laboratoire, y compris la température, l’éclairage, le type et la quantité de substrat ainsi que les détails sur son renouvellement périodique, les méthodes et enregistrement d’hydratation du substrat; les mesures et enregistrements de la qualité du substrat, la densité de chargement des vers, les enregistrements des conditions d’élevage, les indices de santé et de performance; tout mode opératoire et toute condition d’acclimatation (p. ex. substrat et température), y compris le taux de changement;
• l’historique de tout lot d’organismes obtenus de l’extérieur, y compris les particularités concernant la ou les périodes d’entretien ou d’acclimatation avant leur emploi dans l’essai, le type et la quantité de substrat et les détails sur son renouvellement périodique, les méthodes et enregistrements d’hydratation du substrat; les mesures et enregistrements de la qualité du substrat, la densité de chargement des vers, les enregistrements des conditions d’élevage, les indices de santé et de performance; tout mode opératoire et toute condition d’acclimatation (p. ex. substrat, régime alimentaire et température), y compris le taux de changement;
• les modes opératoires des dénombrements, de la manipulation, du tri et du transfert des animaux; ceux qui ont servi à déterminer leur mortalité, leur état, leur aspect et leur comportement;
• l’origine et la composition de la nourriture, les méthodes utilisées pour la préparation et la conservation des aliments, les méthodes d’alimentation, la fréquence des repas et les rations données.

7.2.3 Installations et appareillage expérimentaux

• tous les résultats des essais initiaux avec le sol témoin négatif et le toxique de référence, entrepris par le laboratoire jusqu’alors inexpérimenté dans la réalisation des méthodes d’essai biologique décrites dans le présent document, préalablement à la communication de tout résultat d’essais définitifs (v. § 3.2.1);
• la description des systèmes d’éclairage et de la régulation de la température, dans le laboratoire d’essais;
• la description des récipients d’essai/enceintes utilisées pour l’essai de réaction d’évitement et des pellicules les recouvrant;
• la description des modes opératoires du nettoyage ou du rinçage de l’appareillage expérimental.

7.2.4 Sol témoin négatif ou sol de référence

• les modes opératoires de la préparation (dans le cas du sol artificiel) ou du prétraitement (dans le cas du sol naturel) du sol témoin négatif;
• la source du sol naturel; l’historique des utilisations et les dossiers d’analyse des pesticides ou d’autres contaminants;
• la formulation du sol artificiel, y compris les sources de ses constituants ainsi que les conditions et modes opératoires de son hydratation et de l’ajustement de son pH;
• les conditions et la durée d’entreposage avant emploi.

7.2.5 Méthode d’essai

• les modes opératoires utilisés pour le mélange ou les autres manipulations des sols d’essai, avant leur emploi; le délai entre la préparation et l’essai;
• le mode opératoire utilisé dans la préparation des solutions mères et/ou filles (d’essai) de substances chimiques; la description et la ou les concentrations de tout solvant utilisé;
• les détails concernant l’échantillonnage de parties aliquotes, leur préparation et leur entreposage avant l’analyse physicochimique ainsi que tout renseignement disponible concernant les méthodes d’analyse utilisées (avec leur désignation);
• l’utilisation et la description des essais préliminaires.

7.2.6 Conditions expérimentales et modes opératoires

• la photopériode et les mesures de l’intensité de l’éclairage à la surface du sol dans les récipients d’essai;
• le mode opératoire de l’introduction des organismes dans les récipients d’essai par variante expérimentale;
• l’aspect de chaque échantillon (ou de chaque mélange d’échantillons) dans les récipients d’essai par variante expérimentale; son évolution observée pendant l’essai;
• l’enregistrement de chaque ajout d’eau d’essai à la surface du sol de chaque récipient d’essai pendant l’essai de reproduction, pour en accroître la teneur en humidité;
• les données sur la croissance des moisissures ou des champignons, ainsi que sur la présence et la quantité estimée de tout aliment non consommé;
• la description des modes opératoires utilisés pour l’extraction et le dénombrement des vers de terre à la fin de l’essai; l’enregistrement de la durée et des températures atteintes pendant l’extraction thermique, si elle a été utilisée;
• les modes opératoires utilisés pour évaluer et valider l’efficacité de la méthode d’extraction thermique et données démontrant l’établissement et la surveillance continue de l’efficacité de l’extraction thermique;
• toute autre mesure physicochimique (p. ex. les analyses d’aliquotes du même lot pour déterminer l’homogénéité, la concentration de contaminant[s], les cations et les anions, l’azote, les nitrates, les nitrites, l’ammoniac, le phosphore, le potassium, le ratio C/N, la masse volumique apparente, les matières volatiles totales, la demande biochimique d’oxygène, la demande chimique d’oxygène, le carbone inorganique total, le potentiel d’oxydoréduction, les sels solubles, les oxydes métalliques, le rapport d’adsorption du sodium, les cocontaminants préoccupants, les caractéristiques de la contamination) effectuée avant et pendant l’essai sur la matière d’essai (y compris le sol témoin négatif et le sol de référence) ainsi que sur le contenu des récipients d’essai/enceintes, notamment les analyses du sol entier et de l’eau de porosité;
• toute autre observation ou analyse effectuée sur la matière d’essai (y compris sur des échantillons de sol témoin négatif ou de sol de référence); p. ex. les données qualitatives et/ou quantitatives concernant la faune macroscopique indigène ou les détritus, ou encore, les résultats des analyses géochimiques;
• tout dosage de la ou des solutions mères de toxiques de référence et, le cas échéant, les concentrations d’essai.

7.2.7 Résultats

• les résultats d’essais préliminaires;
• dans l’essai de reproduction : le nombre de vers adultes survivants dans chaque récipient d’essai, au jour 28 (ou 35, le cas échéant); le nombre de jeunes survivants dans chaque récipient d’essai, au jour 56 (ou 63, le cas échéant); pour les besoins des régressions, les renseignements sur la taille des échantillons (p. ex. le nombre de répétitions dans chaque variante expérimentale), l’estimation des paramètres et de leur variance, tout tableau d’analyse de variance produit, les graphiques des valeurs ajustées et observées de tout modèle utilisé et les résultats obtenus grâce au programme statistique (p. ex. SYSTAT);
• dans l’essai de réaction d’évitement : le nombre total de vers survivants dans le sol non contaminé et dans le sol d’essai, dans chaque enceinte, à 48 h;
• une carte de contrôle montrant les résultats les plus récents et les antécédents des essais de toxicité de référence ou des concentrations témoins positives au moyen du toxique de référence; un CV pour les données antérieures moyennes obtenues grâce aux essais de toxicité de référence ou concentrations témoins positives effectués avec le toxique de référence;
• la présentation graphique des données.

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Annexe A : Méthodes d’essai biologique et guides à l’appui publiés par l’Unité de l’élaboration et de l’application des méthodes d’Environnement et Changement climatique Canada^a

Titre de la méthode ou du guide	No de publication	Date de publication	Date des modifications applicables
A. — Méthodes génériques (universelles)
Essai de létalité aiguë sur la truite arc-en-ciel	SPE 1/RM/9	Juillet 1990	Mai 1996 et mai 2007
Essai de létalité aiguë sur Daphnia spp.	SPE 1/RM/11	Juillet 1990	Mai 1996
Essai de reproduction et de survie du cladocère Ceriodaphnia dubia	SPE 1/RM/21 2e édition	Février 2007	–
Essai de croissance et de survie sur des larves de tête-de-boule	SPE 1/RM/22 2e édition	Février 2011	–
Essai de toxicité sur la bactérie luminescente	SPE 1/RM/24	Novembre 1992	–
Essai d’inhibition de la croissance d’une algue d’eau douce	SPE 1/RM/25 2e édition	Mars 2007	–
Essai de toxicité aiguë de sédiments chez des amphipodes marins ou estuariens	SPE 1/RM/26	Décembre 1992	Octobre 1998
Essai sur la fécondation chez les échinides (oursins globuleux et oursins plats)	SPE 1/RM/27 2e édition	Février 2011	–
Essais toxicologiques sur des salmonidés (truite arc-en-ciel) aux premiers stades de leur cycle biologique	SPE 1/RM/28 2e édition	Juillet 1998	–
Essai de survie et de croissance des larves dulcicoles de chironomes (Chironomus tentans ou Chironomus riparius) dans les sédiments	SPE 1/RM/32	Décembre 1997	–
Essai de survie, de croissance et de reproduction de l’amphipode dulcicole Hyalella azteca dans les sédiments et l’eau	SPE 1/RM/33 3e édition	Septembre 2017	–
Essai de mesure de l’inhibition de la croissance de la plante macroscopique dulcicole Lemna minor	SPE 1/RM/37 2e édition	Janvier 2007
Essai de survie et de croissance des vers polychètes spionides (Polydora cornuta) dans les sédiments	SPE 1/RM/41	Décembre 2001	–
Essais pour déterminer la réaction d’évitement ou la reproduction des vers de terre (Eisenia andrei ou Dendrodrilus rubidus) exposés à des contaminants dans le sol	DGST 1/RM/43 2e édition	Août 2022	–
Essai de mesure de la levée et de la croissance de plantes terrestres exposées à des contaminants dans le sol	SPE 1/RM/45	Février 2005	Juin 2007
Essai de mesure de la survie et de la reproduction de collemboles exposés à des contaminants dans le sol	SPE 1/RM/47 2e édition	Février 2014	–
Essai de croissance de plantes terrestres indigènes de la région boréale exposées à un sol contaminé	SPE 1/RM/56	Août 2013	–
Essai de mesure de la reproduction des acariens oribates exposés à des contaminants dans le sol	DGST 1/RM/61	Septembre 2020	–
B. — Méthodes de référenceb
Méthode de référence pour la détermination de la létalité aiguë d’effluents chez la truite arc-en-ciel	SPE 1/RM/13 2e édition	Décembre 2000	Mai 2007 et février 2016
Méthode de référence pour la détermination de la létalité aiguë d’effluents chez Daphnia magna	SPE 1/RM/14 2e édition	Décembre 2000	Février 2016
Méthode de référence pour la détermination de la létalité aiguë d’un sédiment pour des amphipodes marins ou estuariens	SPE 1/RM/35	Décembre 1998	–
Méthode de référence servant à déterminer la toxicité des sédiments à l’aide d’une bactérie luminescente dans un essai en phase solide	SPE 1/RM/42	Avril 2002	–
Méthode de référence pour mesurer la toxicité des sédiments contaminés chez les embryons et les larves des échinides (oursins globuleux ou oursins plats)	SPE 1/RM/58	Juillet 2014	–
Méthode de référence pour la détermination de la létalité aiguë chez le copépode Acartia tonsa	DGST 1/RM/60	Juin 2019	–
C. — Documents d’orientation et guides
Document d’orientation sur le contrôle de la précision des essais de toxicité au moyen de produits toxiques de référence	SPE 1/RM/12	Août 1990	–
Document d’orientation sur le prélèvement et la préparation de sédiments en vue de leur caractérisation physicochimique et d’essais biologiques	SPE 1/RM/29	Décembre 1994	–
Document d’orientation sur la mesure de la précision des essais de toxicité sur sédiment de contrôle dopé avec un produit toxique de référence	SPE 1/RM/30	Septembre 1995	–
Guide des essais écotoxicologiques employant une seule espèce et de l’interprétation de leurs résultats	SPE 1/RM/34	Décembre 1999	–
Guide des essais de pathogénicité et de toxicité de nouvelles substances microbiennes pour les organismes aquatiques et terrestres	SPE 1/RM/44 2e édition	Décembre 2016	–
Document d’orientation sur les méthodes statistiques applicables aux essais d’écotoxicité	SPE 1/RM/46	Mars 2005	Juin 2007
Procédure de stabilisation du pH pendant un essai de létalité aiguë d’un effluent d’eau usée chez la truite arc-en-ciel	SPE 1/RM/50	Mars 2008	–
Guide d’échantillonnage et de préparation de sol contaminé aux fins d’essais biologiques	SPE 1/RM/53	Février 2012	–
Procédure de stabilisation du pH pendant un essai de létalité aiguë des effluents des fabriques de pâtes et papiers chez la truite arc-en-ciel	DGST 1/RM/59	Mars 2018	–
Procédure recommandée pour l’importation d’organismes destinés à des essais de toxicité sublétale	–	Septembre 1999	–
Procédure révisée pour l’ajustement de la salinité d’échantillons d’effluents soumis à un essai de toxicité sublétale en milieu marin conduit dans le cadre des programmes d’étude de suivi des effets sur l’environnement (ESEE)	–	Décembre 2001	–
Renseignements de base et conseils supplémentaires pour l’étude de la létalité aiguë d’un effluent d’eau usée pour la truite arc-en-ciel	–	Mars 2008	–
Conseils supplémentaires pour l’étude de la létalité aiguë des effluents des fabriques de pâtes et papiers due à l’ammoniac	–	Mars 2018	–

Annexe B : Composition du Groupe intergouvernemental sur l’écotoxicité (en septembre 2021)

Administration fédérale, Environnement et Changement climatique Canada

Suzanne Agius
Section des programmes de protection marine
Gatineau (Québec)

Adrienne Bartlett
Division de la recherche sur les contaminants aquatiques
Burlington (Ontario)

Rene Beaulieu
Laboratoire des essais environnementaux des Prairies et du Nord
Edmonton (Alberta)

Christian Blaise (émérite)
Centre St. Laurent
Montréal (Québec)

Patrick Boyd
Section de l’évaluation biologique et normalisation
Ottawa (Ontario)

Lorraine Brown
Laboratoire des essais environnementaux du Pacifique et du Yukon
North Vancouver (Colombie-Britannique)

Joy Bruno
Laboratoire des essais environnementaux du Pacifique et du Yukon
North Vancouver (Colombie-Britannique)

Julia Brydon
Section des programmes de protection marine
Gatineau (Québec)

Craig Buday
Laboratoire des essais environnementaux du Pacifique et du Yukon
North Vancouver (Colombie-Britannique)

Melanie Camplin
Laboratoire des essais environnementaux des Prairies et du Nord
Edmonton (Alberta)

Marshneil Chandra
Laboratoire des essais environnementaux des Prairies et du Nord
Edmonton (Alberta)

Ajith Dias Samarajeewa
Section de l’évaluation biologique et normalisation
Ottawa (Ontario)

Heather Dillon
Laboratoire des essais environnementaux des Prairies et du Nord
Edmonton (Alberta)

Ken Doe (chercheur émérite)
Laboratoire des essais environnementaux de l’Atlantique
Moncton (Nouveau-Brunswick)

Tamzin El-Fityani
Bureau national des recommandations et des normes
Ottawa (Ontario)

Richard Frank
Division de la recherche sur les contaminants aquatiques
Burlington (Ontario)

François Gagné
Recherche sur les écosystèmes fluviaux
Montréal (Québec)

Patricia Gillis
Division de la recherche sur la protection des écosystèmes aquatiques
Burlington (Ontario)

Christina Heise
Laboratoire des essais environnementaux des Prairies et du Nord
Edmonton (Alberta)

Natasha Hostal
Laboratoire des essais environnementaux des Prairies et du Nord
Edmonton (Alberta)

Paula Jackman
Laboratoire des essais environnementaux de l’Atlantique
Moncton (Nouveau-Brunswick)

Stephanie Kvas
Section de l’évaluation biologique et normalisation
Ottawa (Ontario)

Christopher Le
Laboratoire des essais environnementaux du Pacifique et du Yukon
North Vancouver (Colombie-Britannique)

Heather Lemieux
Section de l’évaluation biologique et normalisation
Ottawa (Ontario)

Michelle Linssen-Sauvé
Laboratoire des essais environnementaux du Pacifique et du Yukon
North Vancouver (Colombie-Britannique)

Carolyn Martinko
Section de l’évaluation biologique et normalisation
Ottawa (Ontario)

Danielle Milani
Direction de la recherche sur les conséquences pour les écosystèmes aquatiques
Burlington (Ontario)

Rachel Miliano
Laboratoire des essais environnementaux du Pacifique et du Yukon
North Vancouver (Colombie-Britannique)

Joanne Parrott
Division de la recherche sur la protection des écosystèmes aquatiques
Burlington (Ontario)

Linda Porebski
Section des programmes de protection marine
Gatineau (Québec)

Juliska Princz
Section de l’évaluation biologique et normalisation
Ottawa (Ontario)

Rick Scroggins
Section de l’évaluation biologique et normalisation
Ottawa (Ontario)

David Taillefer
Protection du milieu marin
Gatineau (Québec)

Sylvain Trottier
Laboratoire des essais environnementaux du Québec
Montréal (Québec)

Graham van Aggelen
Laboratoire des essais environnementaux du Pacifique et du Yukon
North Vancouver (Colombie-Britannique)

Leana Van der Vliet
Section de l’évaluation biologique et normalisation
Ottawa (Ontario)

Jessica Velicogna
Section de l’évaluation biologique et normalisation
Ottawa (Ontario)

Brian Walker
Laboratoire des essais environnementaux du Québec
Montréal (Québec)

Peter Wells (chercheur émérite)
Service de la conservation de l’environnement
Dartmouth (Nouvelle-Écosse)

Administration fédérale, Ressources naturelles Canada

Philippa Huntsman-Mapila
Programme Gestion du risque lié aux écosystèmes
Laboratoire des mines et des sciences minérales
CANMET, RNCan
Ottawa (Ontario)

Morgan King
Programme Gestion du risque lié aux écosystèmes
Laboratoire des mines et des sciences minérales
CANMET, RNCan
Ottawa (Ontario)

Carrie Rickwood
Programme Gestion du risque lié aux écosystèmes
Laboratoire des mines et des sciences minérales
CANMET, RNCan
Ottawa (Ontario)

Provinces

Lisa Kennedy (coprésidente)
Ministère de l’Environnement, de la Protection de la nature et des Parcs de l’Ontario
Etobicoke (Ontario)

Jennifer Koene-Fenton
Ministère de l’Environnement, de la Protection de la nature et des Parcs de l’Ontario
Etobicoke (Ontario)

Jasen Nelson
Ministère de l’Environnement et de la stratégie sur les changements climatiques, province de la Colombie-Britannique
Victoria (Colombie-Britannique)

Heather Osachoff
Ministère de l’Environnement et de la stratégie sur les changements climatiques, province de la Colombie-Britannique
Victoria (Colombie-Britannique)

David Poirier (chercheur émérite)
Ministère de l’Environnement, de la Protection de la nature et des Parcs de l’Ontario
Etobicoke (Ontario)

Éloïse Veilleux
Centre d’expertise en analyse environnementale du Québec
Ste-Foy (Québec)

Trudy Watson-Leung (coprésidente)
Ministère de l’Environnement, de la Protection de la nature et des Parcs de l’Ontario
Etobicoke (Ontario)

Annexe C :  Environnement et Changement climatique Canada, région de la capitale nationale (RCN) et laboratoires d’essai environnemental régionaux

Laboratoire de toxicologie des sols
River Road S et T Branch Laboratories
335, chemin River
Ottawa (Ontario)
K1A 0H3

Laboratoire des essais environnementaux de l’Atlantique
Immeuble des sciences de l’environnement
443, avenue Université, Université de Moncton
Moncton (Nouveau-Brunswick)
E1A 3E9

Laboratoire des essais environnementaux du Pacifique et du Yukon
Centre des sciences environnementales du Pacifique
2645, route Dollarton
North Vancouver (Colombie-Britannique)
V7H 1B1

Laboratoire des essais environnementaux du Québec
105, rue McGill
Montréal (Québec)
H2Y 2E7

Laboratoire des essais environnementaux des Prairies et du Nord
Northern Forestry Building
5320, 122 St NW
Edmonton (Alberta)
T6H 3S5

Pour obtenir les coordonnées actuelles des personnes-ressources du laboratoire régional, veuillez communiquer avec :

Unité de l’élaboration et de l’application des méthodes
Direction générale de la science et de la technologie
Environnement et Changement climatique Canada
335, chemin River
Ottawa (Ontario)
K1A 0H3
Courriel : methods@ec.gc.ca

Annexe D : Composition du Groupe consultatif scientifique (GCS) pour la première édition du document de méthode d’essai

Membres du Groupe consultatif scientifique

M. Christian Bastien
Centre d’expertise en analyse
environnementale du Québec
Ministère de l’Environnement
2700, rue Einstein
Sainte-Foy (Québec) G1P 3W8
Tél. : 418-643-8225
Téléc. :  418-643-9023
Courriel :  christian.bastien@menv.gouv.qc.ca

Dr Clive Edwards
Ohio State University
Department of Entomology
1735 Neil Avenue
Columbus, Ohio
USA 43210
Tél. : 614-292-3786
Téléc. :  614-688-4222
Courriel :  edwards.9@osu.edu

Dr Roman G. Kuperman
U.S. Army Edgewood Chemical Biological Center
AMSSB-RRT-TE E5641 DR KUPERMAN
5183 Blackhawk Road
Aberdeen Proving Ground, Maryland
USA 21010-5424
Tél. :  410-436-4697
Téléc. : 410-436-4846
Courriel :  roman.kuperman@us.army.mil

Dr Roman P. Lanno
Ohio State University
Department of Entomology
1735 Neil Avenue
Columbus, Ohio
USA 43210
Tél. : 614-292-4943
Téléc. : 614-292-2180
Courriel :  lanno.1@osu.edu

Dr Frank Riepert
Biologische Bundesantalt fur Land- und
Forstwirtschaft (BBA)
Königin-Luise-Str. 19
D-14195
Berlin, Allemagne
Tél. : 0049 30 8304 2406
Téléc. : 0049 30 8304 2403
Courriel f.riepert@bba.de

Dr Jöerg Römbke
ECT Oekotoxikologie GmbH –
Boettgerstrasse 2-14
65439 Flörsheim am Main
Allemagne
Tél. : 49 6145 95640
Téléc. : 49 6145 95649 9
Courriel : j-roembke@ect.de

Dr Geoffrey Sunahara
Conseil national de recherches du Canada
Institut de recherche en biotechnologie

6100, avenue Royalmount
Montréal (Québec) H4P 2R2
Tél. : 514-496-8030
Téléc. : 514-496-6265
Courriel : geoffrey.sunahara@nrc.ca

M. Graham van Aggelen
Environnement Canada
Centre des sciences environnementales du Pacifique
2645, autoroute Dollarton
North Vancouver (Colombie-Britannique) V7H 1B1
Tél. : 604-924-2513
Téléc. : (604-924-2555
Courriel :  graham.vanaggelen@ec.gc.ca

Dr Kees van Gestel
Institute of Ecological Science
Vrije Universiteit Amsterdam
De Boelelaan 1087
1081 HV Amsterdam
Pays-Bas
Tél. : 31 20 444-7079/7004
Téléc. :  31 20 444-7123
Courriel : kees.van.gestel@vu.nl

Dr Suzanne Visser
Département des sciences biologiques
Université de Calgary
2500, University Drive NW
Calgary (Alberta) T2N 1N4
Tél. : 403-220-6375
Téléc. : 403-289-9311
Courriel : svisser@acs.ucalgary.ca

Autorité scientifique

M. Rick Scroggins
Environnement Canada
Division des méthodes biologiques
Centre de technologie environnementale
335, chemin River
Ottawa (Ontario) K1A 0H3
Tél. : 613-990-8569
Téléc. : 613-990-0173
Courriel :  rick.scroggins@ec.gc.ca

Consultants

Dr Don McLeay
McLeay Environmental Ltd.
2999, chemin Spring Bay
Victoria (Colombie-Britannique) V8N 5S4
Tél. : 250-472-2608
Téléc. : 250-472-2609
Courriel :  dmcleay@telus.net

Dre Gladys Stephenson
Aquaterra Environmental Consulting Inc.
RR1, Site 5936
Orton (Ontario) L0N 1N0
Tél. : 519-836-6050
Téléc. : 519-836-2493
Courriel : gstephenson@stantec.com

Annexe E : Variantes de modes opératoires des essais visant à mesurer les effets d’un sol contaminé sur la survie et la reproduction de vers de terre (Eisenia andrei et Dendrodrilus rubidus), décrites dans les méthodes internationales

Les documents de base ci-dessous sont énumérés dans l’ordre chronologique, sous le sigle de l’organisme dont ils émanent plutôt que sous le nom de l’auteur.

EC, 2004b — la première édition de la méthode d’essai biologique d’Environnement Canada pour mesurer la toxicité des sols à l’aide d’un essai mesurant les effets sur la reproduction et la croissance d’Eisenia andrei ou E. fetida, publiée en 2004, SPE 1/RM/43 (Ottawa, Canada).

ECCC, 2022 — la méthode d’essai décrite dans le présent document pour mesurer la toxicité des sols à l’aide d’un essai mesurant les effets sur la reproduction d’Eisenia andrei ou Dendrodrilus rubidus, SPE 1/RM/43, deuxième édition (Ottawa, Canada).

ISO, 2012 — le guide normalisé pour l’évaluation des effets des produits chimiques sur la reproduction du ver de terre Eisenia fetida ou E. fetida andrei, publié en 2012 par l’Organisation internationale de normalisation (Genève, Suisse).

OECD, 2016 — la ligne directrice normalisée pour évaluer les effets des produits chimiques sur la reproduction du ver de terre Eisenia fetida ou E. fetida andrei, publiée en 2016 par l’Organisation de coopération et de développement économiques (Paris, France).

Paramètre	EC, 2004b	ECCC, 2022	ISO, 2012	OECD, 2016
Type d’essai	Essai de toxicité d’un sol entier en conditions statiques (c’est-à-dire sans renouvellement)	Essai de toxicité d’un sol entier en conditions statiques (c’est-à-dire sans renouvellement)	Essai de toxicité d’un sol entier en conditions statiques (c’est-à-dire sans renouvellement)	Essai de toxicité d’un sol entier en conditions statiques (c’est-à-dire sans renouvellement)
Type de sol	Sol prélevé sur le terrain ou enrichi avec une substance chimique	Sol prélevé sur le terrain ou enrichi avec une substance chimique	Sol prélevé sur le terrain ou enrichi avec une substance chimique	Sol enrichi avec une substance chimique uniquement
Durée de l’essai	56 ou 63 jours	56 jours (63 jours, dans certains cas)	56 jours	56 jours
Organismes d’essai	E. andrei ou E. fetida d’élevage en laboratoire, adultes, dotés d’un clitellum; poids humide : 250-600 mg 2 vers de terre adultes par récipient d’essai Acclimaté au sol témoin négatif et aux conditions d’essai pendant au moins 7 jours	E. andrei ou D. rubidus d’élevage en laboratoire, adultes, dotés d’un clitellum; poids humide : 250-600 mg pour E. andrei ou 50-200 mg pour D. rubidus 4 vers de terre adultes par récipient d’essai Acclimaté au sol témoin négatif et aux conditions d’essai pendant au moins 7 jours	E. andrei ou E. fetida d’élevage en laboratoire, âgés de 2 à 12 mois; organismes synchrones dès la sortie du cocon; dotés d’un clitellum; poids humide : 250-600 mg pour E. andrei 10 vers de terre adultes par récipient d’essai; chaque groupe de 10 vers adultes est pesé avant d’être placé dans le récipient; l’écart de biomasse moyenne entre les récipients devrait être d’au moins 100 mg Acclimaté au sol témoin négatif et au régime alimentaire entre 1 et 7 jours	E. andrei ou E. fetida d’élevage en laboratoire, âgés de 2 à 12 mois; structure des âges homogène; organismes synchrones dès la sortie du cocon; dotés d’un clitellum; poids humide : 250-600 mg pour E. andrei; l’âge des vers ne diffère pas de plus de 4 semaines 10 vers de terre adultes par récipient d’essai; chaque groupe de 10 vers adultes est pesé avant d’être placé dans le récipient Acclimaté au sol témoin négatif et au régime alimentaire pendant au moins 1 jour
Sol témoin négatif	Inclusion comme variante expérimentale avec chaque essai de toxicité Sol artificiel naturel non contaminé, prélevé sur le terrain ou formulé, pour lequel des essais antérieurs, effectués avec l’espèce d’expérience, ont démontré que la validité de l’essai pouvait être régulièrement respectée Tous les horizons pédologiques sont testés séparément (ni mélange ni superposition)	Inclusion comme variante expérimentale avec chaque essai de toxicité Sol artificiel naturel non contaminé, prélevé sur le terrain ou formulé, pour lequel des essais antérieurs, effectués avec l’espèce d’expérience, ont démontré que la validité de l’essai pouvait être régulièrement respectée Tous les horizons pédologiques sont testés séparément (ni mélange ni superposition)	Inclusion comme variante expérimentale avec chaque essai de toxicité Sol artificiel naturel non contaminé, prélevé sur le terrain ou formulé, pour lequel des essais antérieurs, effectués avec l’espèce d’expérience, ont démontré que la validité de l’essai pouvait être régulièrement respectée	Inclusion comme variante expérimentale avec chaque essai de toxicité Sol artificiel Le sol naturel peut être utilisé dans des essais supplémentaires (c’est-à-dire pour des essais de niveau supérieur)
Nombre de répétitions	10 répétitions par témoin et variante expérimentale	5 répétitions par témoin et variante expérimentale dans un essai à concentrations multiples Pour les essais à concentration unique, en fonction de l’ampleur cible avec effet (v. § 5.6.2) : entre 13 et 21 répétitions, au moins, par témoin et variante expérimentale pour E. andrei; entre 5 et 13 répétitions, au moins, par témoin et variante expérimentale pour D. rubidus	4 répétitions par témoin et variante expérimentale pour la CSEO ou CMEO et concentrations mixtes (CSEO/CMEO et CEx) 2 répétitions pour les variantes expérimentales et 6 répétitions pour les témoins pour CEx	4 répétitions par témoin et variante expérimentale pour la CSEO ou CMEO et concentrations mixtes (CSEO/CMEO et CEx) 2 répétitions pour les variantes expérimentales et 6 répétitions pour les témoins pour CEx 8 répétitions pour l’essai limite
Nombre de variantes expérimentales	Concentration unique Au moins 1, plus le sol témoin négatif Concentrations multiples Au moins 7, plus le sol témoin négatif	Concentration unique Au moins 1, plus le sol témoin négatif Concentrations multiples Au moins 7, plus le sol témoin négatif	Concentration unique Au moins 1, plus le sol témoin négatif Concentrations multiples Au moins 5, plus le sol témoin négatif pour la CSEO et les concentrations mixtes; au moins 12 pour la CEx.	Essai limite 1 000 mg/kg, plus le sol témoin négatif Concentrations multiples Au moins 5, plus le sol témoin négatif pour la CSEO; suffisamment pour produire au moins 4 réponses moyennes différentes statistiquement significatives pour la CEx; 8, plus le témoin négatif pour les concentrations mixtes
Récipient d’essai	Bocal de verre Mason à large ouverture de 500 ml recouvert d’un couvercle perforé translucide ou transparent	Pour E. andrei : bocal de verre Mason à large ouverture de 500 ml recouvert d’un couvercle perforé Pour D. rubidus : bocal de verre Mason à large ouverture de 250 ml recouvert d’un grillage Nitex de 50 μm maintenu par un anneau métallique à vis; un couvercle métallique est placé sur le grillage	1-2 L avec une surface transversale d’environ 200 cm2; recouverte pour permettre les échanges gazeux et le passage de la lumière	1-2 L avec une section transversale de ~200 cm2; matériau inerte; couvert pour permettre les échanges gazeux et le passage de la lumière
Quantité de sol dans chaque enceinte expérimentale	Poids humide identique équivalant à un volume de 350 ml de sol à une teneur en humidité optimale	Poids humide identique équivalant à un volume de 350 ml de sol pour E. andrei, et de 200 ml de sol pour D. rubidus, à une teneur en humidité optimale	500 g de poids sec 5 à 6 cm de profondeur	500 g de poids sec 5 à 6 cm de profondeur
Humidité	Hydrater jusqu’à la teneur en humidité optimale Maintenir la teneur en humidité par l’observation et le test de compression	Hydrater jusqu’à la teneur en humidité optimale Maintenir la teneur en humidité par la pesée, l’observation et le test de compression	Hydrater à 40-60 % ou plus de la CRE Maintenir la teneur en humidité en pesant périodiquement les récipients (différence de moins de 10 % à la fin de l’essai).	Hydratation à 40-60 % de la CRE Maintenir la teneur en humidité en pesant périodiquement les récipients (différence de moins de 10 % à la fin de l’essai).
Température	Moyenne journalière : 20 ± 2 °C; température instantanée : 20 ± 3 °C	Moyenne journalière : 20 ± 2 °C; température instantanée : 20 ± 3 °C	Moyenne journalière : 20 ± 2 °C	Moyenne journalière : 20 ± 2 °C
Éclairage	Incandescent ou fluorescent avec une intensité de 400 à 800 lux; photopériode fixe de 16 h ou 12 h	Incandescent, fluorescent ou à DEL avec une intensité de 6,96 à 11,92 µmol/(m2 ∙ s); photopériode fixe de 16 h ou 12 h	Incandescent ou fluorescent avec une intensité de 400 à 800 lux; photopériode fixe de 16 h ou 12 h	Incandescent ou fluorescent avec une intensité de 400 à 800 lux; photopériode fixe de 16 h ou 8 h
Alimentation	Une demi-cuiller à café environ de bouillie d’avoine refroidie aux jours 0, 14, 28 et 42. La nourriture est placée dans une dépression sous la surface du sol d’essai	Pour E. andrei : environ 2 g ou 1 g (s’il reste une grande quantité de nourriture non consommée) de flocons d’avoine, de nourriture MWF ou de céréales mixtes biologiques par récipient d’essai, aux jours 0, 14, 28 et 42 Pour D. rubidus : environ 1 g de nourriture MWF ou de céréales mixtes biologiques par récipient d’essai, aux jours 0, 14, 28 et 42 La nourriture est placée dans une dépression sous la surface du sol d’essai	5 g d’aliments finement broyés séchés à l’air (p. ex. flocons d’avoine, purée de pommes de terre en poudre, fumier de vache ou de cheval) par récipient d’essai, le jour 1, puis une fois par semaine, et le jour 28 après le retrait des adultes Le régime alimentaire n’a pas d’incidence pas la croissance et la production de cocons La nourriture est placée sur la surface et humidifiée avec de l’eau potable (5-6 ml par récipient); réduire la distribution de nourriture en cas de faible consommation Les jeunes sont nourris une fois (jour 28) avec 5 g de nourriture mélangée délicatement au substrat	5 g d’aliments finement broyés séchés à l’air (p. ex. flocons d’avoine, purée de pommes de terre en poudre, fumier de vache ou de cheval) par récipient d’essai, le jour 1, et une fois par semaine, ainsi qu’au jour 28 après le retrait des adultes Le régime alimentaire n’a pas d’incidence pas la croissance et la production de cocons La nourriture est placée sur la surface et humidifiée avec de l’eau potable (5-6 ml par récipient); réduire la distribution de nourriture en cas de faible consommation Les jeunes sont nourris une fois (jour 28) avec 5 g de nourriture mélangée délicatement au substrat
Mesures et observations pendant l’essai	Température quotidienne dans un incubateur à environnement contrôlé pH et humidité au début et à la fin de l’essai Présence d’aliments non consommés et teneur en humidité qualitative à chaque distribution de nourriture Intensité lumineuse au moins une fois pendant l’essai	Température quotidienne dans un incubateur à environnement contrôlé pH et humidité au début et à la fin de l’essai Poids hebdomadaires des récipients d’essai Présence d’aliments non consommés et teneur en humidité qualitative à chaque distribution de nourriture Intensité lumineuse au moins une fois pendant l’essai	pH et humidité au début et à la fin de l’essai Présence d’aliments non consommés	pH et humidité au début et à la fin de l’essai Présence d’aliments non consommés
Dénombrement des jeunes	Extraction thermique (bain-marie à 40-45 °C pendant 15 minutes) Tri à la main	Tri à la main Extraction thermique (bain-marie à 40-45 °C pendant 15 minutes) proposée comme autre solution	Extraction par la chaleur (bain-marie à 50-60 °C pendant 20 minutes); l’efficacité de la méthode est contrôlée Tamisage (deux tamis de 0,5 mm) Trié à la main deux fois	Extraction par la chaleur (bain-marie à 50-60 °C pendant 20 minutes); l’efficacité de la méthode est contrôlée Tamisage (deux tamis de 0,5 mm) Trié à la main deux fois
Validité de l’essai dans les groupes témoins	La survie doit être d’au moins 90 % au jour 28 ou au jour 35 Reproduction d’au moins 3 jeunes vivants par adulte à la fin de l’essai Le poids sec moyen des jeunes vivants est d’au moins 0,2 mg	La survie doit être d’au moins 90 % au jour 28 Reproduction d’au moins 3 jeunes vivants par adulte à la fin de l’essai (56 jours)	Le taux de survie doit être d’au moins 90 % Reproduction d’au moins 30 jeunes vivants par répétition CV de reproduction ne dépassant pas 30 %	Le taux de survie doit être d’au moins 90 % Reproduction d’au moins 30 jeunes vivants par répétition CV de reproduction ne dépassant pas 30 %
Effet biologique mesuré	Nombre d’adultes vivants et de cocons (facultatif) dans chaque récipient d’essai au jour 28 ou 35, avec observation de la santé des adultes Poids humide des organismes sélectionnés (sous-ensemble de 20 vers) le jour de l’ajout de l’organisme et le jour du retrait de l’adulte (jour 28 ou 35) Nombre de jeunes vivants et de cocons (facultatif) dans chaque récipient d’essai au jour 56 ou 63 Poids sec individuel des jeunes après 56 ou 63 jours	Nombre d’adultes vivants et de cocons (facultatif) dans chaque récipient d’essai au jour 28, avec observation de la santé des adultes Poids humide des organismes sélectionnés (sous-ensemble de 20 vers) le jour de l’ajout de l’organisme et le jour du retrait de l’adulte (jour 28) Nombre de jeunes vivants et de cocons (facultatif) dans chaque récipient d’essai au jour 56	Nombre d’adultes vivants ainsi que leur masse au jour 28 Nombre de jeunes vivants et de cocons au jour 56	Nombre d’adultes vivants ainsi que leur masse au jour 28 Nombre de jeunes vivants et de cocons au jour 56
Paramètres statistiques	Concentration unique : Pourcentage moyen de survie (± ET) des adultes dans chaque variante expérimentale, au jour 28 ou 35 Nombre moyen (± ET) de jeunes vivants dans chaque variante expérimentale au jour 56 ou 63 Poids sec moyen (± ET) des jeunes vivants dans chaque variante expérimentale au jour 56 ou 63. Concentrations multiples : Pourcentage moyen de survie (± ET) des adultes dans chaque variante expérimentale, au jour 28 ou 35 Nombre moyen (± ET) de jeunes vivants dans chaque variante expérimentale au jour 56 ou 63 CL50 sur 28 ou 35 jours et limites de confiance à 95 % pour la survie des adultes, si les données le permettent CIp de 56 ou 63 jours et limites de confiance à 95 % pour le nombre de jeunes vivants et poids sec moyen des jeunes	Concentration unique : Pourcentage moyen de survie (± ET) des adultes dans chaque variante expérimentale, au jour 28 ou 35 Nombre moyen (± ET) de jeunes vivants dans chaque variante expérimentale au jour 56 ou 63 Concentrations multiples : Pourcentage moyen de survie (± ET) des adultes dans chaque variante expérimentale, au jour 28 ou 35 Nombre moyen (± ET) de jeunes vivants dans chaque variante expérimentale au jour 56 ou 63 CL50 sur 28 ou 35 jours et limites de confiance à 95 % pour la survie des adultes, si les données le permettent CIp de 56 ou 63 jours et limites de confiance à 95 % pour le nombre de jeunes vivants	Concentration unique : Pourcentage moyen de survie (± ET) des adultes dans chaque variante expérimentale, au jour 28 Pourcentage moyen de perte/augmentation de la biomassea (± ET) des adultes dans chaque variante expérimentale au jour 28 Nombre moyen (± ET) de jeunes vivants dans chaque variante expérimentale au jour 56 ANOVA Concentrations multiples : Pourcentage moyen de survie (± ET) des adultes dans chaque variante expérimentale, au jour 28 Pourcentage moyen de perte/augmentation de la biomasse1 (± ET) des adultes dans chaque variante expérimentale, au jour 28 Nombre moyen (± ET) de jeunes vivants dans chaque variante expérimentale au jour 56 CEx pour la réduction du nombre de jeunes vivants CSEO/CMEO pour la létalité ou l’altération de la masse des adultes, ou la réduction de la reproduction	Essai limite : CSEO pour la reproduction Concentrations multiples : Nombre moyen (± ET) de jeunes vivants dans chaque variante expérimentale au jour 56 CL50 sur 28 et limites de confiance à 95 % pour la survie des adultes CEx ou CSEO/CMEO pour la réduction du nombre de jeunes vivants

^a Le poids humide initial de chaque groupe de 10 vers placés dans chaque récipient d’essai est mesuré et utilisé pour déterminer le changement dans le poids des adultes au jour 28.

Annexe F : Sols témoins négatifs, naturels et artificiels, utilisés pour l’élaboration des méthodes et l’établissement des critères de validité des essais

Dans chaque essai de toxicité d’un sol, il faut inclure parmi les variantes expérimentales un échantillon de sol témoin négatif. À cette fin, il faut choisir un sol essentiellement exempt de tout contaminant qui pourrait diminuer les performances des organismes en expérience (v. § 3.3). Avant d’appliquer l’une ou l’autre des méthodes expérimentales décrites dans le présent document en tant qu’essai normalisé à effectuer conformément aux exigences d’Environnement et Changement climatique Canada, il a d’abord fallu évaluer les performances des organismes d’essai dans divers types de sols témoins négatifs, représentatifs d’un ensemble de sols non contaminés, trouvés au Canada. Cinq types de sols témoins négatifs ont servi à élaborer les méthodes d’essai biologique décrites dans la première édition de ce document sur les méthodes d’essai et à évaluer de façon plus poussée la robustesse de chaque méthode expérimentale au moyen d’échantillons de sols qui variaient considérablement par leurs caractéristiques physicochimiques. Ces sols ont également servi à établir des critères raisonnables de validité des résultats des essais, fondés sur les performances des groupes témoins. Les cinq sols éprouvés comprennent un sol artificiel (v. § 3.3.2) et quatre sols naturels (v. § 3.3.1) [Aquaterra Environmental, 1998; Stephenson et al., 1999a, 1999b, 2000a; Aquaterra Environmental et ESG, 2000; ESG, 2001, 2002; ESG et Aquaterra Environmental, 2002; Stantec et Aquaterra Environmental, 2004]. Le sol artificiel a été préparé en laboratoire à partir d’ingrédients naturels. Les quatre sols naturels comprenaient deux sols agricoles du sud de l’Ontario, un sol de prairie de l’Alberta et un sol forestier du nord de l’Ontario. Les caractéristiques physicochimiques des cinq sols sont présentées dans le tableau de synthèse H-1.

Le sol artificiel (SA) utilisé dans cette série d’études d’évaluation des performances avec divers types de sols était le sol recommandé dans le présent document (v. § 3.3.2). Il est constitué de 70 % de sable siliceux, de 20 % d’argile kaolinique, de 10 % de tourbe à sphaignes et de carbonate de calcium (10 à 30 g dans 1 kg de tourbe). On l’a préparé par mélange poussé des ingrédients secs, puis hydratation graduelle avec de l’eau désionisée, homogénéisation jusqu’à l’obtention d’une couleur, d’une texture et d’un degré de mouillage visiblement uniformes. Le sol artificiel est très semblable à celui qu’ont décrit l’OCDE (OECD, 2016) et ISO (2012).

Les quatre sols naturels employés comme témoins négatifs pendant l’élaboration des méthodes et l’établissement des critères de validité des essais exposés dans le présent document (v. § 4.2.3 et 4.3.3) ne sont pas représentatifs de tous les types de sols du Canada. Cependant, ils varient énormément par leurs caractéristiques physicochimiques et ils comprennent des sols agricoles de textures diverses ainsi qu’un sol forestier (v. tableau F-1). Les sols proviennent de régions n’ayant été soumises à aucune application directe de pesticides au cours des dernières années. On les a prélevés à la pelle ordinaire ou rétro, selon le lieu et la quantité à obtenir. La profondeur d’échantillonnage dépendait de la nature du sol et de l’emplacement lui-même.

L’échantillon de loam argileux, classé chernozem noir orthique de Delacour, a été prélevé en mai 1995, dans une réserve routière située à l’est de Calgary. On a fait sécher à l’air le sol sous la plaque de gazon jusqu’à une teneur en humidité d’environ 10 à 20 %, on l’a ensuite tamisé (mailles de 4 ou 9 mm), recueilli dans des seaux de plastique de 20 L, puis expédié à l’Université de Guelph (Guelph, Ont.) où on l’a conservé au froid (4 °C) jusqu’au moment de l’employer. On a déterminé que le sol était presque exempt de tout contaminant (Komex International, 1995). Les caractéristiques physicochimiques du sol montrent qu’il s’agit d’un loam argileux de granulométrie moyenne à fine, à teneur en matière organique et d’une capacité d’échange cationique forte par rapport à celles des autres sols non contaminés utilisés pendant l’élaboration de la première édition de ces méthodes d’essai biologique et l’établissement des critères de validité de l’essai (v. tableau F-1).

Tableau F-1 Caractéristiques physicochimiques des sols témoins négatifs artificiels et naturels employés pour l’élaboration des méthodes^a

Paramètre	Sol artificiel	Loam argileux	Loam sableux	Loam limoneux	Sol forestier	Méthode d’analyse
Sources	préparé à partir de ses constituants	prélevé sur le terrain en Alberta	prélevé sur le terrain en Ontario	prélevé sur le terrain en Ontario	prélevé sur le terrain en Ontario	—
Texture du sol	Loam sableux fin	Loam argileux	Loam sableux fin	Loam limoneux	Loam	selon Hausenbuiller (1985); fondée sur la répartition granulométrique
Sable (%)	77,3	26,6	60,8	36,6	48,6	granulométrie : méthode gravimétrique
Limon (%)	7,8	43,3	27,8	50,1	36,9	granulométrie : méthode gravimétrique
Argile (%)	14,9	30,1	11,4	13,3	14,5	granulométrie : méthode gravimétrique
Graviers (%)	—b	—	0	0	0	granulométrie : méthode gravimétrique
Sables très grossiers (%)	—	—	1,5	1,2	0,6	granulométrie : méthode gravimétrique
Sables grossiers (%)	—	—	3,2	2,3	2,2	granulométrie : méthode gravimétrique
Sables moyens (%)	—	—	10,1	5,4	9	granulométrie : méthode gravimétrique
Sables fins (%)	—	—	25,9	13,4	20,4	granulométrie : méthode gravimétrique
Sables très fins (%)	—	—	20,2	14,3	16,4	granulométrie : méthode gravimétrique
Capacité de rétention en eau (%)	71,5	80,3	44	56,5	75,6	analyse gravimétriquec
pH (unités)	6	5,9	7,3	7,4	4,2	méthode au CaCl2 0,01 Md
Conductivité électrique (mS/cm)	0,3	1,52	0,092	0,373	0,39	méthode sur extrait de pâte saturée
Densité apparente (g/cm3)	0,98	0,83	—	—	0,51	méthode de la motte
Carbone total (%)	4,46	6,83	1,88	2,57	11,9	four Leco
Carbone inorganique (%)	—	—	0,18	0,58	< 0,05	four Leco
Carbone organique (%)	—	—	1,7	1,99	11,9	four Leco
Matière organique (%)	9	12,8	2,9	3,5	19,9	oxydation au bichromate
Capacité d’échange cationique (cmol/kg)	18,5	34,5	16,1	21,9	20	méthode au chlorure de baryum
Azote (N) total (%)	0,05	0,59	0,115	0,166	0,74	méthode de Kjeldahl
N ammoniacal (NH4) (mg/kg)	—	—	0,53	10,25	260	méthode de Kjeldahl
N nitrique (NO3) (mg/kg)	—	—	6,94	5,44	2,26	méthode de Kjeldahl
N nitreux (NO2) (mg/kg)	—	—	0,94	< 0,1	< 0,1	méthode de Kjeldahl
Phosphore (mg/kg)	23	12	6	10	35	minéralisation dans les acides nitrique et perchlorique
Potassium (mg/kg)	22	748	61	75	250	extraction à l’acétate d’ammonium et colorimétrie
Magnésium (mg/kg)	149	553	261	256	192	extraction à l’acétate d’ammonium et colorimétrie
Calcium (mg/kg)	1848	5127	1846	4380	963	extraction à l’acétate d’ammonium et colorimétrie
Chlorures (mg/kg)	—	—	69	42	113	extraction à l’eau et colorimétrie
Sodium (mg/kg)	67	57	33	19	38	extraction à l’acétate d’ammonium et colorimétrie

En juin 1999, on a prélevé un gros (~ 3 000 L) échantillon de loam sableux sur les fermes Beauchamp, à Eramosa (Ont.), dans un champ qui avait été régulièrement cultivé, mais sans être soumis à des traitements pesticides. On a fait sécher ce sol à l’air et on l’a tamisé (mailles de 2 ou 5 mm), recueilli dans des seaux de plastique de 20 L, puis conservé au froid (4 °C) jusqu’au moment de l’utiliser. On en a dosé les contaminants organiques et minéraux communs et on en a établi les caractéristiques physicochimiques afin déterminer s’il ne possédait pas des caractéristiques inhabituelles (p. ex. forte conductivité électrique ou concentrations anormales d’éléments nutritifs). On a constaté que l’échantillon était presque exempt de contaminants et d’anomalies. Ce sol est un loam sableux fin, possédant une teneur modérée en matière organique et une capacité d’échange cationique moyenne par rapport aux autres sols non contaminés employés dans ces études (v. tableau F-1).

En juin 1999, on a prélevé l’échantillon de loam limoneux à la station de recherches d’Elora de l’Université de Guelph, dans le canton de Nichol, en Ontario. Le sol de surface avait été enlevé, plusieurs années auparavant, au moment de la construction du centre de recherches, et on l’avait entassé à côté d’un champ. Le sol prélevé pour les études de mise au point de méthodes provient de l’intérieur du tas (on ne voulait pas prélever de sol qui aurait été accidentellement contaminé par la dérive de pesticides ou d’engrais pulvérisés depuis le champ contigu). On a fait sécher ce sol à l’air et on l’a tamisé (mailles de 2 ou 5 mm), recueilli dans des seaux de plastique de 20 L, puis conservé au froid (4 °C) jusqu’au moment de l’utiliser. L’analyse a révélé qu’il était exempt de contaminants minéraux et organiques ainsi que d’anomalies. Les caractéristiques physicochimiques mesurées de ce loam limoneux révèlent qu’il possède une teneur en matière organique et une capacité d’échange cationique moyennes par rapport aux quatre autres sols englobés dans les études d’élaboration de méthodes pour la première édition de ce document sur les méthodes d’essai biologique (v. tableau F-1).

En juin 2001, on a prélevé un échantillon de 400 L de sol forestier, classé dans les podzols humo-ferriques orthiques, dans une forêt du Bouclier canadien, à Sudbury (Ontario). On a doucement enlevé la litière de feuilles au râteau et, au moyen d’un transplantoir, on a enlevé une tranche de sol de 5 à 10 cm d’épaisseur. On a recueilli ce sol, sans le tamiser, dans des seaux de 20 L, doublés de plastique à l’intérieur, puis on l’a envoyé à ESG International Inc., à Guelph. On l’a fait sécher à l’air pendant 48 heures, jusqu’à pas moins d’environ 10 % d’humidité, on l’a homogénéisé puis tamisé (mailles de 6 mm). Après le tamisage, on a complètement homogénéisé l’échantillon et on l’a entreposé dans les mêmes seaux de plastique de 20 L jusqu’au moment de l’emploi. On l’a entreposé à la température ambiante (20 °C) jusqu’au moment de l’emploi. Les caractéristiques physicochimiques du sol forestier montrent que c’est un loam à capacité d’échange cationique modérée, possédant les pourcentages maximaux de carbone organique total (11,9 %) et de matière organique (19,9 %) parmi les cinq sols utilisés dans les études de mise au point des méthodes pour la première édition de ce document sur les méthodes d’essai biologique (v. tableau F-1).

Pour cette deuxième édition du document sur les méthodes d’essai, les performances de D. rubidus ont été évaluées dans différents types de sols témoins négatifs représentatifs d’un ensemble de sols non contaminés prélevés dans les écozones de la forêt boréale et de la taïga au Canada. Neuf sols témoins négatifs ont servi à élaborer les méthodes d’essai biologique décrites dans le présent document aux fins d’utilisation avec D. rubidus et à évaluer de façon plus poussée la robustesse des méthodes expérimentales au moyen d’échantillons de sols qui variaient considérablement par leurs caractéristiques physicochimiques. Ces sols ont également servi à établir des critères raisonnables de validité des essais, fondés sur les performances des groupes témoins dans le cadre de l’essai de reproduction de 56 jours employant D. rubidus. Les neuf sols éprouvés comprennent un sol artificiel (v. § 3.3.2) et huit sols naturels avec divers horizons pédologiques (v. § 3.3.1) (EC, 2010; ECCC, 2020b). Les sols naturels étaient constitués d’un sol agricole et de 7 sols naturels provenant des écozones de la forêt boréale et de la taïga. Les caractéristiques physicochimiques de ces sols sont présentées dans le tableau de synthèse F-2.

Le sol artificiel utilisé dans cette série d’études d’évaluation des performances avec divers types de sols était le même sol formulé que le sol recommandé dans le présent document (v. § 3.3.2), et le même que celui utilisé pour E. andrei dans la première édition de ce document sur les méthodes d’essai, décrit plus tôt dans cette section. Il est constitué de 70 % de sable siliceux, de 20 % d’argile kaolinique, de 10 % de tourbe à sphaignes et de carbonate de calcium (10 à 30 g CaCO₃ dans 1 kg de tourbe). On l’a préparé par mélange poussé des ingrédients secs, puis hydratation graduelle avec de l’eau désionisée, homogénéisation jusqu’à l’obtention d’une couleur, d’une texture et d’un degré de mouillage visiblement uniformes. Le sol artificiel est très semblable à celui qu’a décrit ISO (2012) et l’OCDE (OECD, 2016).

Tableau F-2 Caractéristiques physicochimiques des sols témoins négatifs artificiels et naturels et horizons pédologiques de la forêt boréale employés pour l’élaboration des méthodes^a

Type de sol :			Sol artificiel	LUFA	Podzol NFLD01	Podzol NB
Source :			Préparé en laboratoire	sol standard d’Europe	Terre-Neuve	Nouveau-Brunswick
Classification :			S.O.	S.O.	Podzol humo-ferrique gleyifié	Podzol humo-ferrique gleyifié
Horizon :			S.O.	S.O.	Bf	A	B
Paramètre	Unités	Méthode d’analyse	vide
Texture du solb	vide	S.O.c	–	SL	–	LAS	LS
Sable	%	granulométrie (bougie filtrante)	72	77	72	79	62
Limon	%		20	17	20	1	28
Argile	%		8	6,5	8	20	10
Capacité de rétention en eau	%	EC (2005b)	41,9	47,9	41,9	67,6	80,6
Teneur optimale en humidité	%		55,0	57,5	55,0	65	65
pH	unités	méthode du ratio sol/eau de 1:1	4,2	5,6	4,2	4,7	4,6
Conductivité électrique	mS/cm	méthode sur extrait de pâte saturée	–	1,6	–	0,23	0,06
Carbone organique	%	four Leco	–	–	–	41,1	3,7
Matière organique	%	perte au feu	4,6	3	4,6	77,1	10,9
Capacité d’échange cationique	Cmol+/kg	méthode au chlorure de baryum	–	< 10	–	–	–
Azote total	%	méthode de Kjeldahl	–	1640	–	1,72	0,23
NH3	mg/kg	extraction au KCl 2N	15	< 20	15	783	19
NO3-N	mg/kg		<10	36	<10	3	9
NO2-N	mg/kg		<1	< 1	< 1	–	–
Phosphore (total)	%	vide	0,04	0,03	0,04	–	–
Phosphore	mg/kg	extraction au NaHCO3	4	230d	4	99	18
Potassium	mg/kg	extraction à l’acétate d’ammonium et colorimétrie	20	360	20	917	1030
Magnésium	mg/kg		20	590	20	784	6560
Calcium	mg/kg		< 100	1400	< 100	4190	608
Sodium	mg/kg		10	< 50	10	128	< 100
Rapport C/N	vide	vide	–	–	–	23,9	16
Rapport d’adsorption du sodium	vide	méthode sur extrait de pâte saturée	–	0,25	–	1,8	1,2

Tableau F-2 Caractéristiques physicochimiques des sols témoins négatifs artificiels et naturels et horizons pédologiques de la forêt boréale employés pour l’élaboration des méthodes (suite)

Type de sol :			Podzol ON			Chernozem AB02
Source :			Ontario			Alberta
Classification :			Podzol humo-ferrique gleyifié			Tchernoziome régosolique gris foncé
Horizon :			Ahe	Of/Oh	Of/Oh	Ah	Ck
Paramètre	Unités	Méthode d’analyse	vide
Texture du solb	vide	S.O.c	SL	SL	SL	LS	LS
Sable	%	granulométrie (bougie filtrante)	82	88	86	51	71
Limon	%		12	6	6	43	24
Argile	%		6	6	8	6	6
Capacité de rétention en eau	%	EC (2005b)	41,0	181,9	40,9	68,3	51,4
Teneur optimale en humidité	%		65,0	52,5	47,5	55,0	47,5
pH	unités	méthode du ratio sol/eau de 1:1	4,6	4,6	5,8	7,1	7,7
Conductivité électrique	mS/cm	méthode sur extrait de pâte saturée	–	–	–	0,34	0,2
Carbone organique	%	four Leco	32,1	1,6	1,0	6,3	1,5
Matière organique	%	perte au feu	58,1	2,1	2,2	9,5	2,6
Capacité d’échange cationique	Cmol+/kg	méthode au chlorure de baryum	26	9	12	25	16
Azote total	%	méthode de Kjeldahl	0,96	0,06	0,05	0,43	0,09
NH3	mg/kg	extraction au KCl 2N	128	4	2	2	1
NO3-N	mg/kg		< 1	< 1	< 1	15	1
NO2-N	mg/kg		< 1	< 1	< 1	< 1	< 1
Phosphore (total)	%	vide	–	–	–	–	–
Phosphore	mg/kg	extraction au NaHCO3	16	2	< 2	17	8
Potassium	mg/kg	extraction à l’acétate d’ammonium, analyse colorimétrique	143	23	16	430	203
Magnésium	mg/kg		151	31	40	431	235
Calcium	mg/kg		765	184	191	3380	2400
Sodium	mg/kg		57	35	21	–	12
Rapport C/N	vide	vide	33,4	26	20,6	14,6	16,2
Rapport d’adsorption du sodium	vide	méthode sur extrait de pâte saturée	2,0	2,8	2,4	1,2	1,2

Tableau F-2 Caractéristiques physicochimiques des sols témoins négatifs artificiels et naturels et horizons pédologiques de la forêt boréale employés pour l’élaboration des méthodes (suite)

Type de sol :			Luvisol SK01	Brunisol SK02		SK09
Source :			Saskatchewan	Saskatchewan		Saskatchewan
Classification :			Luvisol gris foncé	Brunisol eutrique orthique		Brunisol dystrique éluvié
Horizon :			Bt	FH	AB	LFH/Ae
ParametParamètreer	Unités	Méthode d’analyse	vide
Texture du solb	vide	S.O.c	L	LS	SL	SL
Sable	%	granulométrie (bougie filtrante)	35	89	82	77
Limon	%		55	7	12	17
Argile	%		10	6	4	6
Capacité de rétention en eau	%	EC (2005b)	42,1	174,1	39,5	–
Teneur optimale en humidité	%		42,5	55,0	45,0	–
pH	unités	méthode du ratio sol/eau de 1:1	6,6	6,9	6,8	4,2
Conductivité électrique	mS/cm	méthode sur extrait de pâte saturée	–	–	–	–
Carbone organique	%	four Leco	1,0	11,4	1,0	8,1
Matière organique	%	perte au feu	2,0	15,8	1,8	9,6
Capacité d’échange cationique	Cmol+/kg	méthode au chlorure de baryum	11	22	6	< 1
Azote total	%	méthode de Kjeldahl	0,07	0,65	0,05	0,14
NH3	mg/kg	extraction au KCl 2N	5	23	6	55
NO3-N	mg/kg		3	86	< 1	< 10
NO2-N	mg/kg		< 1	< 1	< 1	< 1
Phosphore (total)	%	vide	0,06	0,05	0,02	0,04
Phosphore	mg/kg	extraction au NaHCO3	9	24	16	20
Potassium	mg/kg	extraction à l’acétate d’ammonium et colorimétrie	170	200	83	70
Magnésium	mg/kg		198	785	196	20
Calcium	mg/kg		1780	2860	795	< 100
Sodium	mg/kg		67	64	50	20
Rapport C/N	vide	vide	0,3	4	0,6	–
Rapport d’adsorption du sodium	vide	méthode sur extrait de pâte saturée	0,2	0,4	0,1	–

Le sol agricole était un sable loameux (LUFA 2.2) provenant d’Hanhofen, dans la région de Rheinland P-falz en Allemagne, échantillonné à GroBer Stret, Nr.585 en 2017. Le sol n’a pas fait l’objet d’épandage de pesticides, d’engrais biocides ou de fumier organique pendant au moins 5 ans avant la collecte. Le sol a été échantillonné à une profondeur de 0 à 20 cm, et tamisé à l’aide d’un tamis à mailles de 2 mm. Le lot de sol spécifique a été acheté en 2017 et expédié à Environnement et Changement climatique Canada (Ottawa, Ontario), où il a été entreposé à environ 23 °C jusqu’à son emploi. Les caractéristiques physicochimiques du sol sont présentées au tableau F-2.

Le sol provenant de Terre-Neuve (podzol NL) a été classé comme étant un podzol humo-ferrique gleyifié, formé sur un till glaciaire non calcaire pierreux, de loameux à sableux (EcoDynamics Consulting Ltd., 2011a). Les sapins baumiers (Abies balsamea) et des épinettes noires (Picea mariana) dispersées dominaient le couvert forestier de l’emplacement. Le sous-étage était formé de kalmias à feuilles étroites (Kalmia angustifolia), de gaulthéries hispides (Gaultheria hispidula), d’arbres en régénération et de cornouillers du Canada (Cornus canadense); on y trouvait aussi, en moins grands nombres, des dryoptères spinuleuses (Dryopteris spinulosa), des osmondes cannelle (Osmunda cinnamomea), des maïanthèmes du Canada (Maianthemum canadense) et des clintonies boréales (Clintonia borealis). La surface du sol était couverte principalement de mousses hypnacées [p. ex. hypne de Schreber (Pleurozium schreberi), hypne éclatante (Hyloconium splendens), hypne plumeuse (Ptilium crista-castrensis)]. Avant l’échantillonnage, on a enlevé les débris ligneux et la couche de feuilles mortes. Les échantillons des horizons organiques sous-jacents F et H ont été prélevés ensemble, puis on a échantillonné séparément les horizons Ahe (à une profondeur de 3 cm), Ae (à une profondeur de 25 cm) et Bf. Seul l’horizon Bf a été utilisé dans l’établissement des critères de validité des essais pour D. rubidus (v. tableau F-2).

Le sol du Nouveau-Brunswick (podzol NB) a été classé comme un podzol humo-ferrique gleyifié mal drainé, développé dans un till basal ou de dépôt non calcaire, à texture moyenne à modérément fine (EcoDynamics Consulting Inc., 2008). La strate principale était constituée d’une forêt mixte composée de hêtres (Fagus grandifolia), d’érables rouges (Acer rubrum), de bouleaux jaunes (Betula alleghaniensis) et d’érables à sucre (Acer saccharum); on y trouve aussi des sapins baumiers (Abies balsamea), avec un sous-étage de noisetiers (Corylus cornuta) et d’érables et de sapins baumiers en régénération (EcoDynamics Consulting Inc, 2008). La litière de la forêt (horizon L) a été retirée, et les horizons sous-jacents FH et Ahe-Aegj ont été prélevés séparément et placés dans des seaux de 25 litres. L’horizon Bf sous-jacent a ensuite été prélevé; cependant, étant donné la variation et la nature ondulée des limites de l’horizon pédologique, le prélèvement de certaines matières BCgj était inévitable. Les horizons A et B ont été utilisés dans l’établissement des critères de validité des essais pour D. rubidus (v. tableau F-2).

Le sol provenant de l’Ontario (podzol ON) a été classé comme étant un podzol humo-ferrique gleyifié, formé à même un dépôt fluvio-lacustre non calcaire (EcoDynamics Consulting Ltd., 2011b). L’emplacement portait une forêt mixte à prédominance de conifères. La strate supérieure du couvert forestier englobait principalement des pins rouges (Pinus resinosa) et des pins blancs (Pinus strobus) entremêlés d’érables à sucre (Acer saccharum) épars; la strate inférieure était composée d’un mélange de bouleaux à papier (Betula papyrifera), de thuyas occidentaux (Thuja occidentalis), d’épinettes noires (Picea mariana), d’épinettes blanches (Picea glauca), d’érables rouges (Acer rubrum) et de pruches du Canada (Tsuga canadensis). Des espèces en régénération dominaient le sous-étage constitué d’aulnes rugueux (Alnus incana), de noisetiers à bec (Corylus cornuta), de dircas des marais (Dirca palustris), de viornes cassinoïdes (Viburnum cassinoides), d’airelles fausses-myrtilles (Vaccinium myrtilloides) et de linnées boréales (Linnaea borealis). Sur la surface du sol, on trouvait surtout des quatre-temps (Cornus canadensis) et des coptides du Groenland (Coptis trifolia). Trois horizons ont été échantillonnés après l’enlèvement de la litière forestière : Ahe (à une profondeur de 2 cm), Ae (à une profondeur de 7 cm) et Bf (à une profondeur de 20 cm). Seul l’horizon Ahe a été utilisé dans l’établissement des critères de validité des essais pour D. rubidus (v. tableau F-2).

Le sol de l’Alberta (chernozem AB02) a été prélevé sur une terrasse fluviatile de plaine inondable, et a été qualifié de tchernoziome régosolique gris foncé modérément à bien drainé (EcoDynamics Consulting Inc., 2007). La texture de l’horizon Ah riche en matières organiques a été classée comme un loam limoneux, avec une texture de sable très fin/loameux allant d’un sable très fin à un loam très sableux en fonction de la profondeur. La végétation dominante était constituée de brome inerme (Bromus inermis Leyss.), entrecoupé de petites quantités de rose (Rosa sp.), de gaillet boréal (Galium boreale L.) et d’épilobe (Epilobium angustifolium L.). Les zones boisées proches des pentes de la vallée fluviale étaient composées d’un étage supérieur de trembles, avec des épinettes blanches éparses. Deux horizons ont été prélevés : l’horizon Ah jusqu’à une profondeur de 11 cm, et l’horizon Ckgj jusqu’à une profondeur d’environ 25-30 cm; il n’y avait pas d’horizon B défini. Les deux horizons ont été utilisés dans l’établissement des critères de validité des essais pour D. rubidus (v. tableau F-2).

Trois sols ont été échantillonnés en Saskatchewan. Le premier (luvisol SK01) a été classé comme étant un luvisol gris foncé modérément à bien drainé, formé sur des matériaux glaciolacustres exempts de roches, de loameux à argileux (EcoDynamics Consulting Ltd., 2007). Le couvert forestier comportait un mélange d’épinettes blanches (Picea glauca) et de peupliers faux-trembles (Populus tremuloides), un sous-étage constitué de drageons de peupliers, de même que de rosiers (Rosaspp.), de saules (Salix spp.), de quatre-temps (Cornus canadensis) et de linnées boréales (Linnaea borealis). Trois horizons ont été échantillonnés : couches LFH (à une profondeur de 10 cm), Ahe (à une profondeur de 10 cm) et Bt (à une profondeur de 19 cm), mais seul l’horizon Bt a été utilisé pour établir les critères de validité des essais pour D. rubidus (v. tableau F-2).

Le deuxième sol provenant de la Saskatchewan (brunisol SK02) a été classé comme étant un brunisol eutrique orthique à drainage rapide, formé sur des matériaux glaciolacustres sableux exempts de roches (EcoDynamics Consulting Ltd., 2007). Le couvert forestier était composé de peuplements purs de pins gris (Pinus banksiana), tandis que des peupliers faux-trembles (Populus tremuloides), des aulnes crispés (Alnus crispa), des raisins d’ours (Arctostaphylos uva-ursi) et des cladonies (Cladina spp.) dominaient le sous-étage. Après l’enlèvement de la couche de feuilles mortes, les couches FH ont été échantillonnées à une profondeur d’environ 6 cm; les horizons Ah et Bm ont été échantillonnés ensemble (à une profondeur de 25-30 cm), étant donné que l’horizon Ah était discontinu et mince (2 cm). Les deux horizons ont été utilisés dans l’établissement des critères de validité des essais pour D. rubidus (v. tableau F-2).

Le troisième sol prélevé en Saskatchewan (brunisol SK09) a été classé comme un profil de brunisol dystrique éluvié bien drainé, reposant sur des matériaux glaciolacustres sableux stratifiés, qui repose à son tour sur un till glaciaire sableux érodé (EcoDynamics Consulting Inc., 2011c). L’étage supérieur de la végétation était composée principalement d’un mélange d’épinette noire (Picea mariana), de pin gris (Pinusbanksiana) et de bouleau blanc (Betulapapyrifera), avec un sous-étage dominé par des cladonies (principalement Cladinamitis) et des hypnes (principalement Pleuroziumschreberi), ainsi qu’un mélange d’arbustes comprenant le thé du Labrador (Ledum groenlandicum), la tourbière à canneberges (Vacciniumvitis-idaeus), les bleuets (Vacciniummyrtilloides), l’airelle des marécages (Vacciniumuliginosum) et la camarine noire (Empetrumnigrum). Avant l’échantillonnage, on a enlevé les débris ligneux et la couche de feuilles mortes. Les échantillons des horizons organiques sous-jacents F et H ont été prélevés, puis on a prélevé les horizons minéraux sous-jacents A et B jusqu’à une profondeur d’environ 10 cm.

Annexe G : Séries logarithmiques de concentrations convenant aux essais de toxicité

Adapté de Rocchini et al. (1982).

Colonne (nombre de concentrations entre 10,0 et 1,00 ou entre 1,00 et 0,10)^a

1	2	3	4	5	6	7
10,0	10,0	10,0	10,0	10,0	10,0	10,0
3,2	4,6	5,6	6,3	6,8	7,2	7,5
1,00	2,2	3,2	4,0	4,6	5,2	5,6
0,32	1,00	1,8	2,5	3,2	3,7	4,2
0,10	0,46	1,00	1,6	2,2	2,7	3,2
-	0,22	0,56	1,00	1,5	1,9	2,4
-	0,10	0,32	0,63	1,00	1,4	1,8
-	-	0,18	0,40	0,68	1,00	1,3
-	-	0,10	0,25	0,46	0,72	1,00
-	-	-	0,16	0,32	0,52	0,75
-	-	-	0,10	0,22	0,37	0,56
-	-	-	-	0,15	0,27	0,42
-	-	-	-	0,10	0,19	0,32
-	-	-	-	-	0,14	0,24
-	-	-	-	-	0,10	0,18
-	-	-	-	-	-	0,13
-	-	-	-	-	-	0,10

Annexe H : Détermination d’une concentration témoin positive et définition des limites de contrôle – Exemple fonctionnel

1. Utiliser au moins 5 essais valides (c’est-à-dire les critères de validité des essais doivent être satisfaits) à concentrations multiples dans un type de sol (p. ex. sol témoin négatif ou sol artificiel), avec le même toxique de référence. Dans cet exemple, les essais de reproduction d’une durée de 56 jours ont été effectués sur un sol non contaminé prélevé sur le terrain (c’est-à-dire un sol témoin négatif) en utilisant de l’acide borique comme toxique de référence.
2. Pour chaque essai, compiler le nombre total moyen de jeunes produits par variante expérimentale (tableau H-1).
3. Pour chaque essai, calculer et compiler le pourcentage de réduction de la production de jeunes par rapport à la réponse dans le groupe témoin (tableau H-2) à l’aide de la formule suivante :

   ${\displaystyle \%\mathit{\text{Réduction}}=\left(\frac{\text{(}\mathit{\text{Réponse dans le témoin}}-\mathit{\text{Réaction au traitement}}\text{)}}{\mathit{\text{Réponse dans le témoin}}}\right)\times 100}$

4. Calculer le pourcentage moyen de réduction de la production de jeunes pour chaque variante expérimentale (tableau H-2). Facultatif : tracer les données.
5. Choisir une concentration pour laquelle les données ont tendance à être moins variables (c’est-à-dire la plage des données couvre environ 20 %), mais qui présente tout de même un effet partiel (c’est-à-dire réduction de 30 à 70 %; voir les cellules ombrées du tableau H-2).
6. Calculer l’écart type (ET) et deux écarts types (2 ET) de la réduction moyenne en pourcentage pour la concentration d’essai choisie (tableau H-2).
7. Calculer le pourcentage moyen de réduction ±2 ET pour la concentration d’essai choisie (tableau H-2) et comparer ces valeurs aux pourcentages de réduction minimum et maximum observés dans le cadre de cette variante expérimentale pour s’assurer que les limites d’avertissement proposées (c’est-à-dire le pourcentage moyen de réduction ±2 ET) tiennent compte des données liées à la réponse. Utiliser le pourcentage moyen de réduction à cette variante expérimentale pour définir l’ampleur cible avec effet.
8. Dans cet exemple, 245 mg de H₃BO₃ par kilogramme de sol sec a entraîné une réduction moyenne de 72 % de la production de jeunes (c’est-à-dire l’ampleur cible avec effet avec des limites d’avertissement proposées d’au moins 60 % et ne dépassant pas 84 %. D’après ces résultats, il s’agit de la concentration d’essai d’acide borique qu’un laboratoire pourrait choisir et utiliser en même temps que chaque essai définitif pour la variante expérimentale avec témoin positif.
9. Pour les essais où le témoin positif est inclus dans le cadre de l’essai définitif de reproduction, le pourcentage de réduction de la production de jeunes (c’est-à-dire l’effet) est comparé aux limites d’avertissement établies. Cette opération est effectuée et documentée selon les mêmes modes opératoires que ceux utilisés pour comparer les essais de toxicité de référence à concentrations multiples dans les cartes de contrôle avec toxique de référence (v. § 4.4). Si le pourcentage de réduction de la production de jeunes dans un sol témoin positif avec un essai définitif se situe à l’intérieur des limites d’avertissement établies (c’est-à-dire le pourcentage moyen de réduction ±2 ET), le témoin positif est acceptable. Si la réponse est en dehors de ces limites, il faut examiner le déroulement de l’essai et la sensibilité de la population d’essai (c’est-à-dire les élevages de laboratoire) ou du groupe d’organismes d’essai utilisés dans l’essai (c’est-à-dire le lot d’organismes d’essai obtenu de l’extérieur) (v. § 4.4). Cet examen peut consister, par exemple, à déterminer si la concentration témoin positive a été préparée correctement, à vérifier les calculs de l’essai, à confirmer analytiquement la concentration témoin positive, à examiner les données sur les témoins négatifs, à examiner les données sur la santé de l’élevage, à vérifier les compétences du technicien ou à contrôler la qualité en fonction de l’âge du sol (p. ex. s’il a été conservé trop longtemps dans des seaux). Outre l’établissement de cartes de contrôle sur les témoins positifs, un laboratoire devrait surveiller la variabilité de la réponse des témoins positifs dans le temps en calculant le coefficient de variation (CV) de la réponse et en l’évaluant par rapport à une limite d’acceptabilité prédéfinie (p. ex. le laboratoire définit un CV ne dépassant pas 30 % comme acceptable). Dans cet exemple, le CV est de 8,2 % pour six points de données (tableau H-2).

Tableau H-1 Nombre moyen de jeunes de D. rubidus produits lors de l’exposition à l’acide borique dans un sol non contaminé prélevé sur le terrain

Essai no	Concentration d’acide borique (mg/kg)
	0	84	120	171	245	350
1	29,0	13,4	34,4	20,2	6,6	1,5
2	41,0	42,5	49,7	29,7	10,6	0,2
3	56,0	58,2	56,1	35,4	17,1	3,2
4	62,0	63,7	58,8	31,0	18,2	1,2
5	34,0	31,6	28,6	21,4	7,1	1,5
6	25,0	23,5	17,2	20,0	9,3	0,0

Tableau H.2 Pourcentage de réduction de la production de jeunes de D. rubidus, par rapport à la réponse dans le groupe témoin, lors de l’exposition à l’acide borique dans un sol non contaminé prélevé sur le terrain

Essai no	Concentration d’acide borique (mg/kg)
	0	84	120	171	245	350
1	0	53,8	-18,6	30,3	77,2	94,8
2	0	-3,7	-21,2	27,6	74,2	99,5
3	0	-3,9	-0,2	36,8	69,5	94,3
4	0	-2,7	5,2	50,0	70,6	98,1
5	0	7,1	15,9	37,1	79,1	95,6
6	0	6,0	31,2	20,0	62,8	100,0
Moyenne	-	9,4	2,1	33,6	72,2	97,1
ETa	-	-	-	-	5,9	-
2 ET	-	-	-	-	11,8	-
Moyenne + 2 ET	-	-	-	-	84,0	-
Moyenne – 2 ET	-	-	-	-	60,4	-
% CV	-	-	-	-	8,2	-

^a Écart type