Évaluation préalable finale des souches

Bacillus amyloliquefaciens 13563-0
Bacillus atrophaeus 18250-7
Bacillus licheniformis American Type Culture Collection (ATCC) 12713
Bacillus subtilis ATCC 6051A (= ATCC 6051a)
Bacillus subtilis ATCC 55405
Bacillus subtilis sous-espèce subtilis ATCC 6051
Bacillus subtilis sous-espèce inaquosorum ATCC 55406
Espèce Bacillus 16970-5
Espèce Bacillus 2 18118-1
Espèce Bacillus 4 18121-4
Espèce Bacillus 7 18129-3

Environnement Canada
Santé Canada
Août 2015

Table des matières

Liste des tableaux

Liste des figures

Sommaire

Conformément à l'alinéa 74b) de la Loi canadienne sur la protection de l'environnement (1999) [LCPE (1999)], la ministre de l'Environnement et la ministre de la Santé ont procédé à une évaluation préalable des souches d’organismes vivants suivantes, qui figurent sur la Liste intérieure :

Bacillus amyloliquefaciens 13563-0
Bacillus atrophaeus 18250-7
Bacillus licheniformis ATCC^{Note de bas de page [1]} 12713
Bacillus subtilis ATCC 6051A (que l'on appelle également Bacillus subtilis ATCC 6051a)
Bacillus subtilis ATCC 55405
Bacillus subtilis sous-espèce subtilis ATCC 6051 (souche type)
Bacillus subtilis sous-espèce inaquosorum ATCC 55406
Espèce Bacillus 16970-5
Espèce Bacillus 2 18118-1
Espèce Bacillus 4 18121-4
Espèce Bacillus 7 18129-3

Aux fins de la présente évaluation, les micro-organismes inscrits à la Liste intérieure énumérés ci-dessus seront collectivement appelés « groupe Bacillus licheniformis/subtilis de la Liste intérieure ». Les termes « complexe Bacillus subtilis » indiqueront des renseignements qui ne sont pas propres à ces souches de la Liste intérieure des substances, mais qui sont liés au groupe plus étendu des espèces comprenant celles de la Liste intérieure.

Conformément au Règlement sur les dénominations maquillées établi en vertu de l’article 113 de la LCPE (1999), Environnement Canada a attribué des noms « maquillés » et des numéros d’accès aux espèces Bacillus 16970-5, Bacillus 2 18118-1, Bacillus 4 18121-4 et Bacillus 7 18129-3 au lieu du nom biologique explicite de ces organismes, lequel est considéré comme confidentiel et ne doit pas être divulgué publiquement.

Les membres du complexe Bacillus subtilis (B. subtilis) global ont la capacité de s'adapter à plusieurs habitats terrestres et aquatiques et d'y prospérer. Ils peuvent être des contaminants présents dans la nourriture et dans le carburant d’aviation ainsi que des membres transitoires de la microflore intestinale. Certains membres du complexe B. subtilis sont utilisés dans la fermentation des aliments. Ils forment des endospores qui assurent leur survie dans des conditions environnementales sous-optimales. De nombreuses variations physiologiques existent dans la nature, ce qui signifie que les membres de ce complexe peuvent s’établir avec succès dans presque tous les environnements. Diverses caractéristiques du groupe Bacillus licheniformis/subtilis (B. licheniformis/subtilis) de la Liste intérieure les rendent convenables pour une utilisation en tant qu'ingrédients actifs dans des produits commerciaux et des produits de consommation.

Certaines souches de B. licheniformis peuvent entraîner un avortement chez les bovins, les porcs et les moutons, ainsi qu'une mammite chez les bovins; toutefois, les répercussions générales de la maladie liée à B. licheniformis chez le bétail sont faibles. Les membres du groupe B. licheniformis/subtilis de la Liste intérieure des substances sont sensibles aux antibiotiques vétérinaires; ainsi, dans le cas d'une infection du bétail, des options de traitement efficaces sont disponibles. Des effets néfastes ont été signalés chez les invertébrés aquatiques et terrestres exposés aux souches de B. subtilis et B. licheniformis. Un rapport a indiqué qu'un isolat de B. licheniformis constituait l'agent responsable du dépérissement de la cime dans le cas de la pistache. Les souches du complexe B. subtilis possèdent des propriétés antimicrobiennes ainsi que des propriétés de promotion de la croissance chez les plantes et les animaux.

On rapporte parfois que certains membres du complexe B. subtilis provoquent des maladies chez les humains vulnérables (les personnes ayant une maladie invalidante ou une immunité compromise, les nourrissons et les personnes âgées), mais rarement chez la population générale. Certains produisent des enzymes extracellulaires et des toxines susceptibles d'entraîner une intoxication alimentaire. Dans les analyses de laboratoire effectuées par des scientifiques de Santé Canada, il a été déterminé que les souches B. licheniformis/subtilis de la Liste intérieure n'ont pas produit ces toxines d’intoxication alimentaire.

La présente évaluation prend en compte les caractéristiques des souches susmentionnées à l'égard des effets sur la santé humaine et l'environnement associés à l'utilisation du produit et des procédés industriels visés par la LCPE (1999), y compris les rejets dans l'environnement par l'entremise de flux de déchets et l'exposition humaine fortuite par l'intermédiaire des milieux naturels. Le gouvernement a lancé une collecte obligatoire de renseignements en application de l'article 71 de la LCPE (1999), dont l’avis a été publié dans la Partie I de la Gazette du Canada le 3 octobre 2009 (Avis donné en vertu de l’article 71) pour mettre à jour les renseignements relatifs aux utilisations actuelles. Les renseignements présentés en réponse à l'Avis indiquaient que les souches du groupe B. licheniformis/subtilis de la Liste intérieure ont été utilisées dans la biodégradation et la biorestauration; dans des produits de nettoyage, de dégraissage et de désodorisation des surfaces et des canalisations; dans la production d’enzymes et de produits chimiques; ainsi que dans le traitement de déchets solides et d’eaux usées.

Compte tenu de tous les éléments de preuve contenus dans la présente évaluation préalable, les souches du groupe B. licheniformis/subtilis présentent un faible risque d'effets nocifs sur les organismes et sur l'intégrité de l'environnement. On conclut que la souche 13563-0 de Bacillus amyloliquefaciens, la souche 18250-7 de Bacillus atrophaeus, la souche ATCC 12713 de Bacillus licheniformis, la souche ATCC 6051A de Bacillus subtilis, la souche ATCC 55405 de Bacillus subtilis, la souche ATCC 6051 de Bacillus subtilis sous-espèce subtilis, la souche ATCC 55406 de Bacillus subtilis sous-espèce inaquosorum, l'espèce Bacillus 16970-5, l'espèce Bacillus 2 18118-1, l'espèce Bacillus 4 18121-4 et l'espèce Bacillus 7 18129-3 ne satisfont pas aux critères énoncés aux alinéas 64a) ou b) de la LCPE (1999), car elles ne pénètrent pas dans l'environnement en une quantité ou concentration, ou dans des conditions de nature à avoir, immédiatement ou à long terme, un effet nocif sur l'environnement ou sur la diversité biologique ou à mettre en danger l'environnement essentiel à la vie.

De plus, à la lumière des renseignements contenus dans la présente évaluation préalable, on conclut que la souche 13563-0 de Bacillus amyloliquefaciens, la souche 18250-7 de Bacillus atrophaeus, la souche ATCC 12713 de Bacillus licheniformis, la souche ATCC 6051A de Bacillus subtilis, la souche ATCC 55405 de Bacillus subtilis, la souche ATCC 6051 de Bacillus subtilis sous-espèce subtilis, la souche ATCC 55406 de Bacillus subtilis sous-espèce inaquosorum, l'espèce Bacillus 16970-5, l'espèce Bacillus 2 18118-1, l'espèce Bacillus 4 18121-4 et l'espèce Bacillus 7 18129-3 ne satisfont pas aux critères énoncés à l'alinéa 64c) de la LCPE (1999), car elles ne pénètrent pas dans l'environnement en une quantité ou concentration ou dans des conditions de nature à constituer un danger au Canada pour la vie ou la santé humaines.

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Introduction

Conformément à l'alinéa 74b) de la Loi canadienne sur la protection de l'environnement (1999), le ministre de l'Environnement et le ministre de la Santé sont tenus de procéder à l'évaluation préalable des organismes vivants inscrits sur la Liste intérieure des substances et commercialisés entre 1984 et 1986, afin de déterminer si lesdits organismes présentent ou sont susceptibles de présenter un risque pour l'environnement ou la santé humaine (d'après les critères énoncés à l'article 64 de la Loi)^{Note de bas de page[2]}. Ces souches ont été ajoutées à la Liste intérieure aux termes du paragraphe 10⁵(1) de la LCPE (1999) parce qu'elles ont été fabriquées ou importées au Canada entre le 1^er janvier 1984 et le 31 décembre 1986, et parce qu'elles ont été introduites ou rejetées dans l'environnement sans égard aux conditions de ladite Loi ou de toute autre loi fédérale ou provinciale.

La présente évaluation tient compte des renseignements sur les risques obtenus dans le domaine public, ainsi que des données de recherche et des commentaires non publiés de chercheurs dans des domaines connexes. Les renseignements liés à l'exposition ont été obtenus du domaine public et des renseignements découlant de l'avis obligatoire relatif à l'article 71 de la LCPE (1999) publié le 3 octobre 2009 dans la Partie I de la Gazette du Canada. De plus amples précisions concernant la méthode d'évaluation des risques utilisée sont accessibles dans le « Cadre d'évaluation scientifique des risques liés aux micro-organismes réglementés en vertu de la Loi canadienne sur la protection de l'environnement (1999) » (Environnement Canada et Santé Canada, 2011).

Dans le présent rapport, les données propres aux souches du groupe Bacillus licheniformis/subtilis de la Liste intérieure sont identifiées comme telles et comportent les données présentées par les proposants, celles de l'ATCC ainsi que les données non pubiées obtenues par des chercheurs d'Environnement Canada^{Note de bas de page[3]} et de Santé Canada^{Note de bas de page[4]}. Lorsqu'aucune donnée spécifique n'était disponible sur les souches, des données de substitution extraites de publications scientifiques ont été utilisées. Lorsque c'était possible, les recherches documentaires ont inclus les synonymes, le nom usuel et le nom périmé de l'organisme. Les organismes de substitution sont identifiés dans chaque cas au niveau taxonomique fourni par la source. Les recherches documentaires ont été effectuées à l'aide de bases de données de publications scientifiques (SCOPUS, Google Scholar, CAB Abstracts), de recherches sur le Web et de termes de recherche clés afin de cerner les dangers pour la santé humaine et l'environnement associés à chacune des souches de la Liste intérieure évaluées dans le présent rapport. Les renseignements recueillis jusqu'en mai 2014 ont été pris en considération pour l'inclus dans le présent rapport.

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Décisions d'autorités compétentes sur le plan national et international

Échelle nationale

Les membres du groupe B. licheniformis/subtilis de la Liste intérieure sont reconnus comme des micro-organismes du groupe de risque 1 par l'Agence de la santé publique du Canada (ASPC) et par l'Agence canadienne d'inspection des aliments (ACIA).

L'utilisation des souches de B. subtilis a été approuvée au Canada pour la production d'enzymes utilisées dans les aliments. Les extraits de fermentation provenant des souches de B. subtilis sont acceptés en tant qu'ingrédient dans les aliments en vertu du Règlement sur les aliments du bétail, tant qu'ils sont exempts d'activité antimicrobienne et qu'ils ne constituent pas des sources de cellules microbiennes. Pour le moment, les souches de B. licheniformis/subtilisinscrites à la Liste intérieure ne sont pas approuvées sur le marché canadien en vertu de la Loi. Le Bureau de l'innocuité des engrais de l'ACIA a mené une évaluation exhaustive de l'innocuité de B. subtilis et a exempté toutes les souches des exigences complètes en matière de données sur la sécurité (ACIA, 2014). Les souches isolées du milieu naturel doivent être identifiées et différenciées jusqu'au niveau de la souche.

L'Agence de réglementation de la lutte antiparasitaire de Santé Canada a approuvé plusieurs autres souches du complexe B. subtilis aux fins d'utilisation comme agents de lutte biologique, notamment la souche FZB24 de B. subtilis var. amyloliquefaciens (2011) [Agence de réglementation de la lutte antiparasitaire de Santé Canada, 2012], la souche MBI 600 de B. subtilis (2005) [Agence de réglementation de la lutte antiparasitaire de Santé Canada, 2007a; Agence de réglementation de la lutte antiparasitaire de Santé Canada, 2007c], la souche QST 713 de B. subtilis (2006) [Agence de réglementation de la lutte antiparasitaire de Santé Canada, 2007b] et la souche GB03 de B. subtilis (2011) [Agence de réglementation de la lutte antiparasitaire de Santé Canada, 2013]. L'évaluation de chaque agent microbien et préparation commerciale de lutte antiparasitaire a permis de déterminer qu'aucun ne présentait de risque inacceptable pour la santé humaine ou l'environnement.

Échelle internationale

L'Environmental Protection Agency des États-Unis (USEPA) a évalué plusieurs souches de B. subtilis et de B. licheniformis utilisées dans la production d'enzymes. Cette agence a conclu qu'aucun risque déraisonnable pour la santé humaine ou l'environnement n'était associé à l'utilisation de ces souches pour la production d'enzymes, d'antibiotiques ou d'autres produits chimiques spéciaux. Selon la Food and Drug Administration des États-Unis (USFDA), les enzymes produites par la souche B. subtilis sont généralement reconnues comme inoffensives aux fins d'utilisation dans les aliments. L'Environmental Protection Agency des États-Unis a approuvé beaucoup des mêmes agents de lutte biologique homologués par l'Agence de réglementation de la lutte antiparasitaire de Santé Canada. Outre les souches approuvées aux fins d'utilisation en tant que biofongicides au Canada, l'Environmental Protection Agency des États-Unis a approuvé la souche D747 de B. amyloliquefaciens (USEPA, 2011) et la souche SB3086 de B. licheniformis (USEPA, 2001).

En Australie, des souches modifiées de B. amyloliquefaciens, B. licheniformis et B. subtilis ont été approuvées aux fins d'utilisation dans la production d'enzymes (ANZ, 2012a; ANZ, 2012b; ANZ, 2013). La souche PB6 de B. subtilis a été employée chez la volaille pour réduire les isolats de clostridies (C. difficile et C. perfringens) [ANZ, 2011]. D'autres souches font actuellement l'objet d'un examen pour la lutte biologique.

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1. Évaluation du danger

1.1 Caractérisation des souches inscrites à la Liste intérieure faisant l'objet d'une évaluation

1.1.1 Taxonomie, identification et historique de la souche

Désignation taxonomique

Règne : Bactéries
Embranchement : Firmicutes
Classe : Bacilli
Ordre : Bacillales
Famille : Bacillaceae
Genre : Bacillus
Espèce : Bacillus amyloliquefaciens13563-0
Bacillus atrophaeus 18250-7
Bacillus licheniformis ATCC 12713
Bacillus subtilis ATCC 6051A
Bacillus subtilis ATCC 55405
Bacillus subtilis sous-espèce subtilis ATCC 6051 (= souche type)
Bacillus subtilis sous-espèce inaquosorum ATCC 55406
Espèce Bacillus 16970-5
Espèce Bacillus 2 18118-1
Espèce Bacillus 4 18121-4
Espèce Bacillus 7 18129-3

Onze souches du complexe « Bacillus subtilis » inscrites à la Liste intérieure font l'objet de la présente évaluation. Elles seront évaluées collectivement en tant que « souches du groupe Bacillus licheniformis/subtilis inscrites à la Liste intérieure » dans le présent rapport. Le terme « complexe Bacillus subtilis » et le regroupement de ces espèces sont appuyés par les ouvrages scientifiques et incluent les souches inscrites à la Liste intérieure(Sorokulova et al., 2008; De Jonghe et al., 2010). Ces termes seront utilisés lorsque les données de substitution seront abordées. Comme nous l'avons mentionné précédemment, les noms de plusieurs souches du groupe B. licheniformis/subtilis inscrites à la Liste intérieure ont été maquillés au niveau du genre à la demande des proposants, conformément au Règlement sur les dénominations maquillées de la LCPE (1999) et ne peuvent pas être divulgués.

Les synonymes des espèces du groupe B. licheniformis/subtilis inscrit à la Liste intérieure des substances ont été obtenus à partir de la « List of Prokaryotic Names with Standing in the Nomenclature » (Euzéby, 2013), du « NCBI taxonomy browser » (Benson et al., 2009; Sayers et al., 2009) et du « Catalogue of Life » (Shimura et al., 2013) sauf indication contraire (tableau 1-1).

**Tableau 1-1. Synonymes des micro-organismes dans le complexe B. subtilis**
Nomenclature actuelle	Synonymes
B. amyloliquefaciens sous-espèce amyloliquefaciens^{Note de bas de page 1[a]} sous-espèce plantaruma	Bacillus amyloliquifaciens^{Note de bas de page 1[b]} Bacillus subtilis var. amyloliquefaciens^{Note de bas de page 1[c]} Bacillus velezensis^{Note de bas de page 1[d]}
B. atrophaeus	Bacillus subtilis var. niger Bacillus globigii Bacillus niger
B. licheniformis	Denitrobacillus licheniformis Clostridium licheniforme
B. subtilis sous-espèce inaquosorum^{Note de bas de page 1[e]} sous-espèce spizizenii sous-espèce subtilis sous-espèce virginiana^{Note de bas de page 1[f]}	Vibrio subtilis Bacillus globigii Bacillus uniflagellatus Bacillus natto

Notes de bas de page a

(Borris et al., 2011)

Retour à la référence de la note de bas de pagea

Notes de bas de page b

(Priest et al., 1987)

Retour à la référence de la note de bas de pageb

Notes de bas de page .1

(Agence de réglementation de la lutte antiparasitaire de Santé Canada, 2012)

Retour à la référence de la note de bas de page.1

Notes de bas de page .3

Synonyme hétérotypique ultérieur de B. amyloliquefaciens (Wang et al., 2008)

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Notes de bas de page .5

Certaines souches ont été reclassées à partir de B. licheniformis (Rooney et al., 2009)

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Notes de bas de page f

(Zhao et al., 2011)

Retour à la référence de la note de bas de pagef

1.1.1.1 Identification phénotypique et profil biochimique

L'espèce Bacillus est une bactérie Gram positif dont la coloration est variable, avec certaines espèces qui se colorent clairement comme des Gram positif dans les jeunes cultures uniquement. Les cellules sont en forme de bâtonnet avec des extrémités rondes ou carrées dont la taille varie de 0,5 × 1,2 à 2,5 × 10 μm, elles peuvent se présenter individuellement ou en chaîne, et la stabilité des chaînes détermine la forme de la colonie, qui peut varier d'une souche à l'autre (Logan et De Vos, 2009; Rooney et al., 2009) (Logan et De Vos, 2009)(Logan et De Vos, 2009). Alors que la plupart des espèces du genre sont aérobies, certaines sont anaérobies facultatives ou strictes (Logan et De Vos, 2009; Murray et al., 1995). Les espèces du genre Bacillus peuvent former des spores qui peuvent être cylindriques, ovales, rondes ou réniformes, placées en position centrale, terminale ou subterminale, mais aucune ne gonfle le sporange (Murray et al., 1995).

Les membres du complexe B. subtilis peuvent être différenciés des anthropopathogènes et zoopathogènes connus du groupe B. cereus (B. anthracis, B. cereus et le parasite d'insecte B. thuringiensis) par des moyens morphologiques et biochimiques. Le diamètre des cellules des membres du complexe B. subtilis est inférieur à 1 μm alors que le diamètre des cellules des membres du groupe B. cereus est supérieur à 1 μm (Logan et De Vos, 2009). Les profils biochimiques peuvent être utilisés pour différencier les membres du complexe B. subtilis et ceux du groupe B. cereus; les caractéristiques distinctives figurent au tableau 1-2 (Santini et al., 1995).

**Tableau 1-2. Caractéristiques biochimiques des espèces du groupe B. cereus par rapport aux espèces du complexe B. subtilis**
Espèces Bacillus^{Note de bas de page Tableau 1-2[a]}	D-xylose	Mannose	Inositol	Mannitol	ONPG^{Note de bas de page Tableau 1-2[b]}
B. anthracis	-^{Note de bas de page Tableau 1-2[c]}	-	-	-	-
B. cereus	-	-	-	-	-
B. thuringiensis	-^{Note de bas de page Tableau 1-2[d]}	-e^{Note de bas de page Tableau 1-2[e]}	N.D.^{Note de bas de page Tableau 1-2[f]}	-^[d]	N.D.
B. amyloliquefaciens	N.D.^{Note de bas de page Tableau 1-2[g]}	+^{Note de bas de page Tableau 1-2[h]}	N.D.	+^[g]	N.D.
B. atrophaeus	+^[h]	+^[h]	N.D.	+^[h]	N.D.
B. licheniformis	+^{Note de bas de page Tableau 1-2[i]}	+	+	+	+
B. subtilis	+^{Note de bas de page Tableau 1-2[j]}	+	+	+	+

Notes de bas de page a.1

(Santini et al., 1995)

Retour à la référence de la note de bas de pagea.1

Notes de bas de page b.1

o-nitrophényl-β-D-galactopyranoside

Retour à la référence de la note de bas de pageb.1

Notes de bas de page c

-, inférieur(e) ou égal(e) à 19 % des réactions positives

Retour à la référence de la note de bas de pagec

Notes de bas de page d

(Fakruddin et al., 2012)

Retour à la référence de la note de bas de paged

Notes de bas de page e

(Swiecicka et al., 2002)

Retour à la référence de la note de bas de pagee

Notes de bas de page f.1

N.D., non disponible

Retour à la référence de la note de bas de pagef.1

Notes de bas de page g

(Borriss et al., 2011)

Retour à la référence de la note de bas de pageg

Notes de bas de page h

(Nakamura, 1989)

Retour à la référence de la note de bas de pageh

Notes de bas de page i

+, supérieur(e) ou égal(e) à 81 % des réactions positives

Retour à la référence de la note de bas de pagei

Notes de bas de page j

20 à 80 % des réactions positives

Retour à la référence de la note de bas de pagej

1.1.1.2 Identification moléculaire

Le genre Bacillus est vaste, avec 11 sous-groupes phylogéniques et plus de 140 espèces (Logan et De Vos, 2009). Grâce à l'analyse des séquences du gène de l'ARNr 16S, le complexe B. subtilis peut être différencié du groupe B. cereus en raison de la présence d'un site de restriction Hinfl entre les régions V4 et V5 chez le complexe B. subtilis (Jeyaram et al., 2011). La figure 1-1 illustre les liens phylogénétiques entre les espèces du genre Bacillus et des genres étroitement apparentés d'après l'alignement des séquences du gène de l'ARN ribosomique 16S produites par les scientifiques de Santé Canada et d'après les séquences pbliées dans la littérature scientifique. Cette figure montre clairement que les espèces du complexe B. subtilis se regroupent à l'écart des pathogènes connus du genre Bacillus, en particulier ceux du groupe B. cereus.

L'identité des souches du groupe B. licheniformis/subtilis de la Liste intérieure a été vérifiée de façon indépendante par les scientifiques de Santé Canada. La morphologie des colonies (annexe 1) était conforme aux descriptions figurant dans les ouvrages scientifiques. Par exemple, l'espèce B. atrophaeus, contrairement à d'autres membres du groupe, produit un pigment noir lorsque sa croissance se fait sur un milieu contenant de la tyrosine ou d'autres sources d'azote organique (Logan et De Vos, 2009; Rooney et al., 2009). La capacité de la souche 18250-7 de B. atrophaeus à produire des pigments noirs a été confirmée.

Dans les laboratoires de Santé Canada, l'identification de la plupart des souches du groupe B. licheniformis/subtilis de la Liste intérieure, y compris les souches dont le genre a été maquillé, a été confirmée par l'analyse de la séquence du gène de l'ARN ribosomique 16S; l'analyse des esters méthyliques d'acide gras (EMAG) et la teneur cellulaire totale de certains acides gras (annexes 2 à 4). Il est difficile de distinguer la souche B. subtilis des espèces étroitement apparentées du genre Bacillus, en particulier l'espèce B. amyloliquefaciens (Ash et al., 1991; Logan et De Vos, 2009); toutefois, l'espèce B. amyloliquefaciens présente une différence caractéristique dans la séquence du gène de l'ARN ribosomique 16S : l'absence de deux sites de restriction RsaI dans la région V3 qui la différencie de l'espèce B. subtilis (Jeyaram et al., 2011). L'absence de ces sites Rsa I est caractéristique de l'espèce B. amyloliquefaciens et a été observée dans la séquence du gène de l'ARN ribosomique de la souche ATCC 55405 de B. subtilis. D'autres méthodes utilisées ont également montré que la souche ATCC 55405 de B. subtilis ressemble davantage à la souche B. amyloliquefaciens qu'à la souche B. subtilis, ce qui laisse supposer qu'elle puisse être identifiée incorrectement. Le site de restriction Cfol, entre les régions V4 et V5, peut être utilisé pour différencier l'espèce B. subtilis de l'espèce B. licheniformis (Jeyaram et al., 2011).

Figure 1-1 : Liens phylogéniques de l'espèce Bacillaceae d'après l'alignement de la région codante de la séquence génétique de l'acide ribonucléique (ARN) ribosomique 16S

Figure 1-1 (Voir la longue description plus bas)

Description longue de la figure 1-1

Figure 1-1 : Liens phylogéniques de l'espèce Bacillaceae d'après l'alignement de la région codante de la séquence génétique de l'ARN ribosomique 16S

Arbre phylogénétique réalisé par la Direction générale de la santé environnementale et de la sécurité des consommateurs de Santé Canada, d'après les séquences génétiques de l'ARN ribosomique 16S accessibles au public et les séquences génétiques de l'ARN ribosomique 16S des souches du groupe B. licheniformis/subtilis générées à l'interne. Les relations phylogénétiques de l'espèce Bacillus sont basées sur l'alignement de séquences génétiques complètes de l'ARN ribosomique 16S. Les séquences des souches de type représentatif ont été obtenues à partir du projet de la Ribosomal Database (RDP version 11, rdp.cme.msu.edu/) à l'exception des organismes de la LIS dont les séquences ont été générées à l'interne par le Bureau de la science et de la recherche en santé environnementale de Santé Canada. Plusieurs alignements ont été effectués à l'aide du programme MUSCLE v3.7 et corrigés pour les régions mal alignées à l'aide du programme GBLOCKS. La phylogénie a été générée à l'aide du logiciel PhyML 3.0 en utilisant le modèle de substitution HKY85 et la prise en charge des branches a été calculée à l'aide d'un test du rapport des vraisemblances approximatif du type Shimodaira-Hasegawa (Anisimova et al., 2006). Ce projet est disponible à l'adresse www.phylogeny.fr/ (Depreeper et al., 2008).

B. subtilis sous-espèce inaquosorum et B. licheniformis ont tous les deux des propriétés qui les distinguent d'autres membres du complexe B. subtilis, notamment une halotolérance plus faible, une croissance anaérobie et une production de composés toxiques dans certaines souches (Salkinoja-Salonen et al., 1999). La souche B. subtilis sous-espèce inaquosorum se distingue de l'espèce B. licheniformis, d'autres sous-espèces de B. subtilis et d'autres membres du complexe B. subtilis, par la production d'un nouveau lipopéptide de type surfactine, mis en évidence par un ion majeur supplémentaire (masse m/z 1 120,8) dans le profil de spectrométrie de masse à temps de vol par désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI-TOF), ainsi que par des différences dans la teneur cellulaire totale des acides gras (Rooney et al., 2009) [annexe 4]. Le séquençage génomique récent de la souche de B. subtilis sous-espèce inaquosorum corrobore son statut taxonomique en tant que sous-espèce indépendante de B. subtilis (Yi et al., 2014). Pour les besoins du présent rapport, l'information liée à la souche ATCC 55406 de B. subtilis sous-espèce inaquosorum sera regroupée avec l'information portant sur les souches de B. subtilis inscrites à la Liste intérieure.

1.1.1.3 Historique de la souche

Les sites d'isolement de la plupart des membres du groupe B. licheniformis/subtilis de la Liste intérieure sont inconnus. Certains membres ont été isolés du sol (souche ATCC 55405 de B. subtilis, souche ATCC 55406 de B. subtilis sous-espèce inaquosorum et espèce Bacillus 16970-5) et des milieux industriels (espèce Bacillus 2 181181-1). Diverses souches du groupe B. licheniformis/subtilis de la Liste intérieure qui figurent dans l'American Type Culture Collection (ATCC) sont également connues sous d'autres désignations de souches dans les souchothèques du monde entier (Tableau 1-3 ). La souche type (souche ATCC 6051 de B. subtilis sous-espèce subtilis) a été déposée dans de nombreuses souchothèques et elle est connue sous le nom de souche Marburg (Tableau 1-4).

**Tableau 1-3. Souchothèques comportant des souches du groupe B. licheniformis subtilis de la *Liste intérieure* et autres désignations connues de ces souches reconnues**
Souche	Souchothèque	Autre désignation de la souche
B. licheniformis ATCC 12713	Agricultural Research Service Database Culture Collection/NRRL Collection	NRRL B-1001
B. licheniformis ATCC 12713	Laboratoire régional des Prairies	PRL B479
B. subtilis ATCC 6051A	Sans objet	P31K6
B. subtilis ATCC 55405	Sans objet	300
B. subtilis sous-espèce inaquosorum ATCC 55406	National Collection of Industrial, Food and Marine Bacteria	NCMIB 14014

**Tableau 1-4. Souchothèques principales comportant la souche Marburg (souche type ATCC 6051 de *B. subtilis*sous-espèce *subtilis*) et autres désignations connues**
Souchothèque	Autre désignation de la souche
Agricultural Research Service Database Culture Collection/NRRL Collection	NRRL B-4219, NRS 1315, NRS 744
American Type Culture Collection	ATCC 6051-U
Collection française des Bactéries Phytopathogenes et Collection de l'Institut Pasteur (France)	CFBP 4228, CIP 52.65
Deutsche Sammlung von Mikroogansimen und Zellkulturen (Allemagne)	DSM 10, IMET 10758
Institute for Fermentation, Osaka (collection transférée auNBRC) (Japon)	IFO 12210, IFO 13719, IFO 16412
Japan Collection of Micro-organisms (Japon)	JCM 1465, IAM 12118
National Collection(Royaume-Uni)	NCFB 1769, NCIB 3610, NCTC 3610
Netherlands Culture Collection of Bacteria	NCCB 32009, NCCB 53016, NCCB 70064

1.1.2 Propriétés biologiques et écologiques

1.1.2.1 Présence naturelle

Les membres du complexe B. subtilis peuvent s'adapter à de nombreux environnements et y prospérer. En général, les espèces de Bacillus ont été isolées de divers habitats, notamment des milieux terrestres (sol et végétation) [Logan et De Vos, 2009; Murray et al., 1995; Thatoi et al., 2013) et des milieux aquatiques (Rajarajan et al., 2013; Shakir et al., 2012; Shields et al., 2013; Smitha et Bhat, 2012). Des espèces de Bacillus ont également été isolées d'animaux, en tant que partie transitoire de la flore intestinale humaine (Kramer et Gilbert, 1989; Turnbull et Kramer, 1985), en tant que contaminants d'aliments crus et transformés (Fangio et al., 2010; Hosoi et al., 2000; Inatsu et al., 2006; Kramer et Gilbert, 1989; Ray et al., 2000; Turnbull et al., 2001) de même que de carburant d'aviation (Rauch et al., 2006). La grande variété d'environnements exploités par le genre Bacillus reflète la grande variation physiologique observée parmi les espèces de ce genre (Murray et al., 1995).

La densité cellulaire naturelle des souches viables de B. licheniformis, B. amyloliquefaciens et B. subtilis dans l'air intérieur ainsi que dans la poussière des écoles, des garderies (Tableau 1-5 ) et des bâtiments agricoles (étable à vaches et porcherie) (Tableau 1-6 ) a été mesurée (Andersson et al., 1999).

**Tableau 1-5. Densité cellulaire naturelle des souches viables de B. *amyloliquefaciens,* *B. licheniformis* et *B. subtilis* dans les écoles et les garderies**
Organisme	Air intérieur (UFC/m³)	Dépôt de poussière (UFC/g)
B. amyloliquefaciens	Aucune donnée	10-10²
B. licheniformis	10²	10³
B. subtilis	Aucune donnée	Aucune donnée

**Tableau 1-6. Densité cellulaire naturelle des souches viables de *B. amyloliquefaciens,* *B. licheniformis* et *B. subtilis* dans les établissements agricoles (étables [vaches] et porcheries)**
Organisme	Air intérieur (UFC/m³)	Dépôt de poussière (UFC/g)
B. amyloliquefaciens	Aucune donnée	Aucune donnée
B. licheniformis	10⁴-10⁷	10⁴-10⁶
B. subtilis	10⁴-10⁷	10⁴-10⁶

1.1.2.2 Survie et persistance dans des environnement

Les espèces du genre Bacillus forment des spores qui leur permettent de survivre dans des conditions hostiles et leur donnent un avantage concurrentiel par rapport aux espèces qui ne forment pas de spores (Grossman et Losick, 1988; Kramer et Gilbert, 1989). Les spores résistent mieux à la chaleur, aux produits chimiques, aux radiations et au dessèchement que les cellules végétatives (Brown, 2000; Logan, 2012). La physiologie des spores de Bacillus thuringiensis est semblable à celles des spores du complexe B. subtilis; elles constituent donc un substitut adéquat. Les spores de B. thuringiensispersistent en grandes quantités dans le sol pendant au moins 13 ans (Hendriksen et Hansen, 2002; Hendriksen et Carstensen, 2013). Néanmoins, de manière générale, les populations microbiennes introduites dans le sol diminuent progressivement, indépendamment de leur source originale, en raison de l'hostilité des conditions biotiques et abiotiques dans le sol (Van Veen et al., 1997). Les facteurs biotiques incluent la prédation et l'antagonisme; les facteurs abiotiques, le pH, la température et l'humidité inhospitaliers, ainsi que la rareté des éléments nutritifs (Van Veen et al., 1997). Il est peu probable que de grandes quantités de cellules végétatives persistent dans l'eau ou le sol, et ce, en raison de la concurrence exercée par les autres microorganismes (Leung et al., 1995). La colonisation de plantes et la formation de biofilms peuvent également accroître la résistance de la bactérie aux conditions défavorables (Sella et al., 2012).

Dans la littérature scientifique, trois études ont été trouvées sur la persistance du complexe B. subtilis dans les sols. L'une d'elles portait sur la persistance à long terme des souches ATCC 6051 de B. subtilis et ATCC 13933 de B. subtilis dans le sol agricole (Xiang et al., 2010). L'ARN extrait des souches ATCC 6051 de B. subtiliset ATCC 13933 de B. subtilis pouvait être amplifié de microcosmes de laboratoire pendant 8 et 127 jours respectivement, après une inoculation avec des suspensions de cultures de cellules contenant entre 10⁸ et 10¹⁰ UFC/mL (Xiang et al., 2010). L'utilisation combinée du polymorphisme de longueur de fragments amplifiés pour mettre au point des marqueurs d'ADN spécifiques des souches étudiées et l'emploi de la PCR quantitative en temps réel ont permis de suivre quantitativement le devenir des souches ATCC 6051 de B. subtilis et ATCC 13933 de B. subtilis du sol et d'en estimer la concentration (figure 1-2 ).

Figure 1-2. Persistance des souches ATCC 6051 de Bacillus subtilis et ATCC 13933 de Bacillus subtilis dans le sol, selon les analyses de PCR quantitative de l'ADN pouvant être extrait du sol

Figure 1-2 (Voir la longue description plus bas)

Description longue de la figure 1-2

Figure 1-2 : Persistance des souches ATCC 6051 de Bacillus subtilis et ATCC 13933 de Bacillus subtilis dans le sol, selon les analyses de la PCR quantitative de l'ADN du sol extractible

Xiang, S., Cook, M., Saucier, S., Gillespie, P., Socha, R., Scroggins, R., et Beaudette, L.A. (2010). Élaboration de marqueurs fonctionnels propres aux souches calculés à partir du polymorphisme de longueur de fragments amplifiés en vue d'évaluer la persistance de dix souches bactériennes dans les microcosmes du sol. Appl. Environ. Microbiol. vol. 76, p. 7126-7135.
Entre 10⁸ et 10¹⁰ UFC/mL de B. subtilis 6051 ont été inoculés dans le sol et pourraient être détectés jusqu'à 8 jours après l'inoculation.
Entre 10⁸ et 10¹⁰ UFC/mL de B. subtilis 13933 ont été inoculés dans le sol et pourraient être détectés jusqu'à 127 jours après l'inoculation.

Les limites de détection très différentes de ces deux souches compliquent la comparaison de leur persistance. La sporulation des cellules végétatives et la récupération moins efficace de l'ADN des spores peuvent avoir joué un rôle dans la diminution observée. La récupération de l'ADN des spores dépend du type de spore, de la concentration des spores et de l'environnement.

Dans une autre étude, une souche de B. subtilis a été inoculée dans les sols et un déclin rapide de la population a été observé avant qu'elle se stabilise (van Elsas et al., 1986). La population est restée faible et principalement sous forme de spores pendant une période de 120 jours

La troisième étude portait sur la persistance dans le sol des souches 13563-0 de B. amyloliquefaciens, ATCC 12713 de B. licheniformis, ATCC 6051A de B. subtilis, ATCC 55405 de B. subtilis et ATCC 55406 de B. subtilis sous-espèce inaquosorum (Providenti et al. 2009). Selon les auteurs, avec un inoculum de cellules végétatives de 1 × 10⁶ UFC/g de sol, la concentration détectable des bactéries diminuerait probablement à 1 × 10² UFC/g de sol ou moins en un à six mois

Selon ces trois études, la concentration des espèces de Bacillus faisant l'objet de la présente évaluation devrait diminuer de façon importante avec le temps, mais persisterait probablement à une faible concentration sous forme de spores.

1.1.2.3 Paramètres de croissance

Les plages de températures de croissance et de pH varient entre les membres du complexe B. subtilis et peuvent varier entre les souches (Tableau 1-7) [Logan et De Vos, 2009; Rooney et al., 2009].

Tableau 1 - 7 : Plages de température de croissance et de pH des membresdu complexe *B. subtilis*
Espèce	Plage de température de croissance (°C)	Température de croissance optimale (°C)	Plage de pH^{Note de bas de page Tableau 1-7[a]}
B. amyloliquefaciens	15-50	30-40	5,5-8,5^{Note de bas de page Tableau 1-7[b]}
B. atrophaeus	5-55	28-30	5,3-5,7^{Note de bas de page Tableau 1-7[c]}
B. licheniformis	15-55	30-40	5,7-6,8^[b]
B. subtilis sous-espèce subtilis	5-55	28-30	5,5-8,5^[b]
B. subtilis sous-espèce inaquorsorum	15-55^{Note de bas de page Tableau 1-7[d]}	28-30^[d]	5,5-5,7^[d]

Notes de bas de page a.2

pH dans un bouillon Voges-Proskauer

Retour à la référence de la note de bas de pagea.2

Notes de bas de page b.2

(Logan et De Vos, 2009)

Retour à la référence de la note de bas de pageb.2

Notes de bas de page c.1

(Nakamura, 1989)

Retour à la référence de la note de bas de pagec.1

Notes de bas de page d.1

(Rooney et al., 2009)

Retour à la référence de la note de bas de paged.1

Les espèces B. licheniformis et B. subtilissous-espèce inaquosorum sont anaérobies facultatives et certaines souches de B. subtilis ont une croissance restreinte dans des conditions anaérobies (Logan et De Vos, 2009). La capacité de croissance dans des conditions aérobies et anaérobies contribue au succès de ces espèces Bacillusdans la colonisation d'une variété de niches. Chez les souris BALB/c inoculées par voie orale avec de fortes concentrations de spores de B. subtilis, la quantité de B. subtilis (spores et cellules végétatives) extraite des matières fécales était supérieure à la concentration d'inoculation initiale (Hoa et al., 2001). Cette augmentation semble indiquer que les spores peuvent résister et germer dans le tube digestif des souris malgré l'anaérobiose (Hoa et al., 2001).

1.1.2.4 Lutte biologique et promotion de la croissance^{Note de bas de page[5]}

Lutte biologique

Les souches du complexe B. subtilis ont des caractéristiques faisant d'elles des agents de lutte biologique efficaces. En tant que bactérie endophyte, l'espèce B. licheniformis colonise les mêmes sites que certains pathogènes des plantes et peut mieux convenir que les bactéries présentes dans la rhizosphère pour supplanter ou antagoniser les pathogènes des plantes (Mekete et al., 2009). Chez la souche ATCC 14580 de B. licheniformis, l'activité de la chitinase et de la chitobiase peut être utile contre les pathogènes fongiques (ATCC, 2012e).Les membres du complexe B. subtilis sont capables de produire des antibiotiques et des enzymes chitinolytiques extracellulaires pouvant inhiber les pathogènes fongiques des plantes (Cordero-Ramírez et al., 2013; Hameeda et al., 2006; Jamalizadeh et al., 2008; Pérez-García et al. 2011; Toledo et al. 2011). Les bactériocines sont des peptides antagonistes pouvant tuer ou inhiber la croissance d'autres bactéries (He et al., 2006; Tagg et al., 1976). Les bactériocines produites par les souches de B. licheniformis présentent une vaste gamme d'activités antagonistes contre diverses bactéries Gram positif et divers agents pathogènes fongiques, mais elles ne sont pas efficaces contre les Gram négatif (He et al., 2006). Des composés antimicrobiens, tels que des bactériocines, produits par les membres du complexe B. subtilis pourraient avoir une incidence sur les populations microbiennes dans les habitats tels que le sol, et sur les microbiomes des plantes, des animaux et des humains. Récemment, il a été démontré que l'espèce B. atrophaeus CAB-1 présentait une activité antifongique, ce qui fait d'elle un agent de lutte biologique potentiel (Zhang et al., 2013).

L'utilisation de souches de B. amyloliquefaciens et de B. subtilis a été approuvée aux fins d'utilisation en tant qu'agents de lutte biologique contre les maladies fongiques chez les plantes terrestres au Canada depuis 2011 et 2005, respectivement (Agence de réglementation de la lutte antiparasitaire de Santé Canada, 2007a; Agence de réglementation de la lutte antiparasitaire de Santé Canada, 2007b; Agence de réglementation de la lutte antiparasitaire de Santé Canada, 2007c; Agence de réglementation de la lutte antiparasitaire de Santé Canada, 2012; Agence de réglementation de la lutte antiparasitaire de Santé Canada, 2013; Agence de réglementation de la lutte antiparasitaire de Santé Canada, 2014). L'utilisation de souches de B. amyloliquefaciens, B. licheniformis et B. subtilis a été approuvée aux fins d'utilisation en tant qu'agents de lutte biologique contre les maladies fongiques chez les plantes terrestres aux États-Unis depuis 2000, 2007 et 1992, respectivement (Mendelsohn et Vaituzis, 1999; USEPA, 2001; USEPA, 2006; USEPA, 2010; USEPA, 2011; USEPA, 2012; USEPA, 2013b).

Promotion de la croissance

Les membres du complexe B. subtilis peuvent favoriser la croissance des plantes en fixant l'azote, en produisant des engrais biologiques et des phytohormones, en renforçant la nodulation des racines, en contrôlant les agents pathogènes des plantes et par leurs interactions avec d'autres bactéries et champignons symbiotiques. Ces fonctions peuvent être liées à la colonisation de plantes et à la formation de biofilms (Beauregard et al., 2013; Chung et al., 2010; Weng et al., 2012). Les espèces B. licheniformis, B. amyloliquefaciens et B. subtilis ont été isolées des tissus intérieurs de plantes saines et pourraient jouer un rôle dans la promotion de la croissance et la protection des végétaux (Logan, 2012). Les espèces B. amyloliquefaciens, B. atrophaeus et B. licheniformis ont été décrites dans la rhizosphère de mangroves où elles solubilisent le phosphate, augmentant ainsi la disponibilité des éléments nutritifs pour les plantes (Thatoi et al., 2013).

Les espèces B. licheniformis et B. subtilisproduisent un certain nombre d'enzymes (p. ex. protéases, lipases et amylases) pouvant être incorporées aux aliments pour animaux en vue d'aider à la digestion des protéines (Ahmadnia Motlagh et al., 2012; Link et Kovác, 2006). L'espèce B. licheniformis offre une protection contre les pathogènes en aquaculture et peut servir de solution de rechange au traitement antibiotique prophylactique, (Vinoj et al., 2013); elle a aussi été utilisée comme probiotique pour la prise de poids ou la résistance aux pathogènes chez les truites arc-en-ciel (Merrifield et al., 2010a; Merrifield et al., 2010b), les porcs (Link et Kovác, 2006) et les poulets (Rahimi et Kahsksefidi, 2006). Des études ont montré que l'utilisation de certaines souches du complexe B. subtiliscomme probiotiques chez les animaux et l'ajout de leurs enzymes aux aliments peuvent augmenter la prise de poids et améliorer la santé chez les animaux. D'autres études ont porté sur le potentiel de stimulation immunitaire des souches probiotiques pour renforcer la résistance des animaux aux pathogènes (Huang et al., 2013; Vinoj et al., 2013).

1.1.2.5 Transfert génque

L'espèce B. subtilis est naturellement compétente pour la transformation, un phénomène propre au stade de croissance et qui dépend des éléments nutritifs disponibles (Dubnau et Losick, 2006; Veening et al., 2008). L'échange génétique par ce mécanisme semble être biaisé en faveur des espèces étroitement apparentées, puisque la fréquence de transformation diminue de façon exponentielle avec la divergence de la séquence de l'ADN (Majewski et Cohan, 1998; Roberts et Cohan, 1993; Zawadzki et al., 1995). Cette caractéristique devrait limiter la probabilité que l'espèce B. subtilis acquière des caractères de pathogénicité des espèces éloignées.

L'espèce B. subtilis a également été impliquée dans le transfert conjugatif des plasmides; toutefois, une bonne partie des bactéries semblable à l'espèce B. subtilisne contiennent pas d'ADN plasmidique endogène (Kreft et Hughes, 1982; Meijer, 1995; Meijer et al., 1998; Tanaka et al., 1977). Des éléments transposables et des prophages ont été déclarés dans le génome de la souche ATCC 14580 de B. licheniformis (souche type) [Lapidus et al., 2002], y compris neuf copies identiques des 1 285 séquences d'insertion de paires de base IS3Bli1 et des séquences des prophages NZP1 et NZP3 (Rey et al., 2004). Les séquences des prophages n'ont pas été caractérisées. L'espèce B. subtilis peut également transférer des transposons et des intégrons (Auchtung et al., 2005; Celli et Trieu-Cuot, 1998; Kimura et al., 2011; Koehler et Thorne, 1987; Marra et Scott, 1999; Meijer et al., 1998), en particulier ceux qui s'inscrivent dans la catégorie des éléments intégratifs et conjugatifs, tels que l'élément ICEBs1 (Auchtung et al., 2005), qui peut être transféré de l'espèce B. subtilisà d'autres espèces Bacillus ou Listeria lorsque l'hôte subit une détresse cellulaire ou en présence d'une forte concentration de cellules n'ayant pas suffisamment d'éléments ICEBs1. Les éléments intégratifs et conjugatifs codent les protéines requises pour le transfert conjugatif, la résistance aux antibiotiques et le métabolisme d'autres sources de carbone (Auchtung et al., 2005).

Les éléments génétiques mobiles de certaines souches du complexe B. subtilis sont repris dans l'annexe 5. Les gènes associés à la virulence dans les souches du complexe B. subtilis sont repris dans l'annexe 6. On ne sait pas si les souches inscrites à la Liste intérieure portent des gènes conférant des facteurs de virulence ou une résistance aux antimicrobiens sur les éléments mobiles. Compte tenu de leur capacité de transmission horizontale de gènes, elles pourraient, en théorie, acquérir ces gênes, mais ce potentiel n'est pas plus important pour les souches inscrites à la Liste intérieure que pour les souches naturellement présentes dans l'environnement, d'après ce qui a été déclaré dans les ouvrages scientifiques actuels.

1.1.2.6 Caractéristiques pathogéniques et toxigènes

Spores

La capacité à former des spores fait partie intégrante de l'étiologie de l'intoxication alimentaire découlant de l'espèce Bacillus, qui a été associée à certaines souches de B. licheniformis et de B. subtilis. Les spores de Bacillus survivent à la désinfection, à la radioexposition et à la cuisson (Baril et al., 2012; Logan, 2012). Toutes les souches inscrites à la Liste intérieure faisant l'objet d'une évaluation sont en mesure de former des spores. Les spores du complexe B. subtilisrésistent fortement à la chaleur, avec des températures comprises entre 94,9 °C et 97,7 °C dans le cas de l'espèce B. licheniformis et entre 10³,2 °C et 10⁸,0 °C pour B. subtilis, des températures requises pour inactiver 90 % des spores dans un délai de dix minutes (André et al., 2013). Dans des conditions favorables, lorsque les aliments sont maintenus à des températures comprises entre 10 °C et 50 °C par exemple, les spores peuvent germer et proliférer (Baril et al., 2012; Brown, 2000), ce qui permet l'accumulation de concentrations cellulaires suffisantes pour provoquer une maladie d'origine alimentaire.

Déterminants de l'infectiosité

Pour qu'une bactérie soit un agent pathogène efficace, elle doit être pouvoir adhérer aux surfaces cellulaires de l'hôte, d'envahir ses tissus et d'éliminer ses défenses. Dans une étude, certains isolats des espèces B. licheniformis et B. subtilis étaient parfois capables d'adhérer aux cellules ou de les envahir (lignées cellulaires Hep-2 et Caco-2), tandis que d'autres n'en étaient pas capables (Rowan et al., 2001).

Une forte activité hémolytique (ainsi qu'une activité lécithinase) peut révéler la présence de phospholipases cytotoxiques qui peuvent faciliter l'invasion et qui sont associées à la virulence (Rowan et al., 2001; Sorokulova et al., 2008). Les isolats de B. amyloliquefaciens, B. licheniformis et B. subtilisprésentent des degrés variables d'hémolyse. Une étude a révélé une activité bêta-hémolytique chez l'espèce B. amyloliquefaciens, aucune activité hémolytique chez B. licheniformis et chez l'espèce B. subtilis, l'activité hémolytique variait selon l'isolat : alpha-hémolytique, bêta-hémolytique ou aucune activité hémolytique (Cordero-Ramírez et al., 2013). Toutefois, une analyse effectuée par les scientifiques de Santé Canada relativement aux souches du groupe B. licheniformis/subtilis de la Liste intérieure n'a indiqué aucune activité hémolytique forte chez ces souches (annexe 7).

L'activité de la catalase permet aux micro-organismes de se protéger contre l'oxygène réactif produit par les cellules immunitaires, ce qui les rend plus efficaces comme pathogènes. L'activité de la catalase a été évaluée pour les souches du groupe B. licheniformis/subtilis de la Liste intérieure par les scientifiques de Santé Canada; toutes les souches étaient positives au test de la catalase (annexe 8).

Métabolites secondaires

Les membres du complexe B. subtilis produisent également une variété de métabolites secondaires. La surfactine (B. subtilis) et la lichénysine (B. licheniformis) sont des lipopeptides amphiphiliques (Li et al., 2010). Il s'agit de deux surfactants puissants qui possèdent des propriétés antimicrobiennes et hémolytiques. Bien que seulement deux acides aminés les distinguent, l'activité hémolytique de la lichensyne est bien plus élevée que celle de la surfactine (15 µmol/L et 200 µmol/L, respectivement, pour une hémolyse complète) [Li et al., 2010].

L'amylosine a été détectée pour la première fois chez l'espèce B. amyloliquefaciens (Logan, 2012; Mikkola et al., 2007). Il s'agit d'un ionophore qui forme les canaux K+ et Na+ dans les membranes cellulaires de l'hôte, entraînant alors des réactions toxiques, notamment la mort de la cellule, avec une lyse importante dans les lignées cellulaires exposées et une inhibition de la mobilité dans les essais sur les spermatozoïdes de porcs (Mikkola et al., 2007).

Toxines

Les études montrent que les souches de B. subtilis, B. licheniformis et B. amyloliquefaciens produisent des toxines instables et stables à la chaleur (annexe 9) [Beattie et Williams, 1999; De Jonghe et al., 2010; Mikkola et al., 2007; Nieminen et al., 2007]. Parmi les toxines produites, certaines sont semblables à la toxine émétique (céréulide) de B. cereus (Salkinoja-Salonen et al., 1999; Taylor et al., 2005); elles comportent également une entérotoxine hémolytique BL (Hbl) (Lindsay et al., 2000; Rowan et al., 2001) et une entérotoxine non hémolytique (Nhe). Un composant cytotoxique non émétique stable à la chaleur a également été signalé chez certaines souches de B. subtilis et de B. amyloliquefaciens (De Jonghe et al., 2010). Certains isolats de B. licheniformis produisent aussi une toxine non protéique thermostable, qui endommage l'intégrité de la membrane cellulaire, appauvrit la cellule en adénosine triphosphate (ATP) et possède une activité bêta-hémolytique (Salkinoja-Salonen et al., 1999).

Les gènes du complexe de toxines Hbl et des toxines diarrhéiques BceT ont été décelés dans des isolats cliniques et alimentaires de B. licheniformis et B. subtilis (Rowan et al., 2001). Il semble que le milieu de croissance influe sur la production de toxines; en effet, davantage de souches produisent la toxine Hbl lorsqu'elles sont cultivées dans du lait maternisé pour nourrisson plutôt que dans du bouillon d'infusion cœur-cervelle. La production de toxines n'est pas liée à la source de l'isolat (clinique ou environnementale) [Beattie et Williams, 1999; Madslien et al., 2012].

Dans les essais effectués dans les laboratoires de Santé Canada, des souches ont été cultivées dans un bouillon d'infusion cerveau-cœur. Trois différentes trousses d'essais commerciales ont été utilisées : toutes les souches ont été testées pour contrôler la sous-unité HblC de l'entérotoxine Hbl à l'aide d'une trousse RPLA commerciale (Oxoid) et six souches ont été testées pour contrôler la sous-unité NheA de l'entérotoxine Nhe à l'aide de l'essai ELISA (trousse TECRA). La trousse Duopath Cereus (Millipore) a également été utilisée pour détecter la production d'entérotoxines Nhe et Hbl dans les souches inscrites à la Liste intérieure des substances. Aucune des souches inscrites à la Liste intérieure des substances n'a produit ces toxines.

Dans les essais effectués dans les laboratoires de Santé Canada, des souches ont été cultivées dans un bouillon d'infusion cœur-cervelle. Trois trousses d'essai commerciales ont été utilisées : la trousse RPLA (Oxoid) a servi à vérifier la présence de la sous-unité HblC de l'entérotoxine Hbl; la trousse TECRA a permis de faire une ELISA avec six souches^{Note de bas de page[6]} et de vérifier si elles possédaient la sous-unité NheA de l'entérotoxine Nhe; la trousse Duopath Cereus (Millipore) a servi à vérifier la production des entérotoxines Nhe et Hbl par les souches inscrites à la Liste intérieure. Aucune des souches inscrites à la Liste intérieure ne produisait ces toxines.

Les surnageants de culture acelluaires de certains isolats cliniques et alimentaires des espèces B. licheniformis et B. subtilis associés à une intoxication alimentaire présentaient une activité cytotoxique influant sur les lignées cellulaires épithéliales humaines Caco-2 et HEp-2 (Rowan et al., 2001). Le milieu de croissance a eu une incidence sur le potentiel cytotoxique, et le traitement thermique ou la trypsinisation du surnageant de culture a permis de réduire voire d'éliminer l'activité cytotoxique, indiquant que cette activité était due à la fraction protéinique (Rowan et al., 2001). Dans une autre étude, des isolats de B. licheniformis et B. subtilis associés à une intoxication alimentaire causée par des aliments achetés de marchands ambulants se sont révélés cytotoxiques pour les cellules McCoy (Mosupye et al., 2002). En outre, alors que la cytotoxicité des isolats de B. cereus disparaissait après un traitement thermique, certains isolats de B. licheniformis et B. subtilis conservaient leur cytotoxicité (Mosupye et al., 2002). Une souche de B. licheniformis isolée du lait cru et qui était associée à une intoxication alimentaire était également cytotoxique pour les cellules McCoy (Lindsay et al., 2000).

Dans les essais réalisés par les scientifiques de Santé Canada, la cytotoxicité des souches du groupe B. licheniformis/subtilis inscrites à la Liste intérieure a été évaluée dans deux lignées cellulaires, J774A.1 (cellules de macrophages) et HT29 (cellules épithéliales du colôn humain), cultivées avec et sans gentamicine. Les souches n'ont pas révélé d'activité cytotoxique forte envers l'une ou l'autre des lignées cellulaires (annexe 10).

1.1.2.7 Profil de sensibilité aux antibiotiques

L'information figurant dans les ouvrages scientifiques sur la sensibilité aux antibiotiques des espèces B. amyloliquefaciens et B. atrophaeus est insuffisante, vraisemblablement parce que ces dernières n'ont pas été impliquées dans des infections.

Des profils de sensibilité aux antibiotiques variables ont été signalés dans des rapports de cas d'infection ayant un lien avec les espèces B. licheniformis et B. subtilis (Tableau 1-8 ). La sensibilité de B. licheniformis aux bêta-lactamines ampicilline, piperacilline et ticarcilline dépend de l'isolat (Banerjee et al., 1988; Castagnola et al., 1997). Certains isolats possèdent une bêta-lactamase inductible qui pourrait être responsable de cette sensibilité variable (Filée et al., 2002; Zhu et al., 1992). De même, la souche ATCC 12713 de B. licheniformis résiste à l'érythromycine, tandis que la souche type ATCC 14580 y est sensible; des variations dans la séquence du gène de la bacitracine synthase pourraient déterminer la résistance à l'érythromicine (Ishihara et al., 2002). Un cas d'endocardite provoquée par B. subtilis a été traité efficacement avec de la céfazoline(Tuazon et al., 1979), mais une étude ultérieure a révélé que les isolats étaient résistants à cet antibiotique (Banerjee et al., 1988).

**Tableau 1-8. Sensibilité de *B. licheniformis* et *B. subtilis* aux antibiotiques selon les ouvrages scientifiques**
Antibiotique	B. licheniformis	B. subtilis	Référence
Amikacine	S^{Note de bas de page Tableau 1-8[a]}	S	(Banerjee et al., 1988; Sorokulova et al., 2008)
Aminoglucoside	S	N.D.^{Note de bas de page Tableau 1-8[b]}	(Ozkocaman et al., 2006)
Amoxicilline	I^{Note de bas de page Tableau 1-8[c]}	I	(Sorokulova et al., 2008)
Acide clavulanique avec amoxicilline	S	N.D.	(Lépine et al., 2009)
Ampicilline	V^{Note de bas de page Tableau 1-8[d]}	S	(Banerjee et al., 1988; Sorokulova et al., 2008)
Azlocilline	S	S	(Banerjee et al., 1988)
Bactrim	S	S	(Sorokulova et al., 2008)
Carbapénème	S	N.D.	(Ozkocaman et al., 2006)
Carbenicilline	S	S	(Sorokulova et al., 2008)
Ceftazimide	R^{Note de bas de page Tableau 1-8[e]}	R	(Banerjee et al., 1988)
Céfamandole	I	S	(Sorokulova et al., 2008)
Céfatoline	S	N.D.	(Lépine et al., 2009)
Céfazoline	S	V	(Banerjee et al., 1988; Sorokulova et al., 2008)
Céfépime	S	N.D.	(Ozkocaman et al., 2006)
Céfotaxime	R	I	(Sorokulova et al., 2008)
Céfoxitine	R	I	(Sorokulova et al., 2008)
Ceftriaxone	R	I	(Sorokulova et al., 2008)
Céfalotine	S	S	(Sorokulova et al., 2008)
Chloramphénicol	R	V	(Banerjee et al., 1988; Sorokulova et al., 2008)
Ciprofloxacine	S	S	(Castagnola et al., 1997; Sorokulova et al., 2008)
Clindamycine	R	S	(Banerjee et al., 1988; Sorokulova et al., 2008)
Cotrimoxazole	S	N.D.	(Castagnola et al., 1997)
Doxycycline	S	N.D.	(Lépine et al., 2009)
Enrofloxacine	S	S	(Sorokulova et al., 2008)
Érythromycine	V	S	(Ishihara et al., 2002; Sorokulova et al., 2008)
Gentamicine	S	S	(Banerjee et al., 1988; Sorokulova et al., 2008)
Imipénème	S	S	(Banerjee et al., 1988; Sorokulova et al., 2008)
Kanamycine	S	S	(Sorokulova et al., 2008)
Linézolide	S	S	(Sorokulova et al., 2008)
Méropénème	S	N.D.	(Mochiduki et al., 2007)
Méticilline	R	I	(Sorokulova et al., 2008)
Mezlocilline	I	S	(Sorokulova et al., 2008)
Nafcilline	S	N.D.	(Blue et al., 1995)
Néomycine	S	S	(Sorokulova et al., 2008)
Nétilmicine	S	N.D.	(Castagnola et al., 1997)
Nitrofurantoïne	S	S	(Sorokulova et al., 2008)
Norfloxacine	S	S	(Banerjee et al., 1988; Sorokulova et al., 2008)
Ofloaxcine	S	N.D.	(Lépine et al., 2009)
Oxacilline	R	R	(Castagnola et al., 1997; Sorokulova et al., 2008)
Pénicilline	R	R	(Banerjee et al., 1988)
Piperacilline	V	S	(Banerjee et al., 1988)
Quinupristine + dalfopristine	N.D.	N.D.	(Sorokulova et al., 2008)
Rifampicine	S	S	(Sorokulova et al., 2008)
Streptomycine	S	S	(Sorokulova et al., 2008)
Telcoplanine	S	N.D.	(Castagnola et al., 1997)
Tétracycline	S	S	(Sorokulova et al., 2008)
Ticarcilline	V	S	(Banerjee et al., 1988)
Tobramycine	S	S	(Castagnola et al., 1997; Sorokulova et al., 2008)
Triméthoprime	S	S	(Sorokulova et al., 2008)
Vancomycine	S	S	(Banerjee et al., 1988; Sorokulova et al., 2008)

Notes de bas de page a.3

S : Sensible, comprend également les traitements efficaces avec lesquels aucun autre antibiotique n'a été utilisé.

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Notes de bas de page b.3

N.D. : Non disponible

Retour à la référence de la note de bas de pageb.3

Notes de bas de page c.2

I : Intermédiaire

Retour à la référence de la note de bas de pagec.2

Notes de bas de page d.2

V : Variable (différentes sources ont donné lieu à des résultats différents en matière de résistance)

Retour à la référence de la note de bas de paged.2

Notes de bas de page e.1

R : Résistant

Retour à la référence de la note de bas de pagee.1

Les scientifiques de Santé Canada ont vérifié la résistance des cellules végétatives des souches du groupe B. licheniformis/subtilis inscrites à la Liste intérieure à un certain nombre de familles d'antibiotiques^{Note de bas de page[7]} (Tableau 1-9 à Tableau 1-13). Les catégories interprétatives (sensible, intermédiaire, résistant ou non sensible) correspondent à des classifications établies d'après la réaction in vitro d'un organisme à un agent antimicrobien présent en une concentration correspondant aux concentrations atteintes dans le sang ou les tissus avec les doses habituellement prescrites de cet antimicrobien (CLSI, 2010). Dans la mesure du possible, la concentration minimale inhibitrice a été déterminée, mais pour certains des antibiotiques testés, aucun critère interprétatif n'a pu être déterminé.

Tableau 1-9. Concentrations minimales inhibitrices (CMI) pour la souche 13563-0 de *B. amyloliquefaciens*
Antibiotique	Sensible^{Note de bas de page Tableau 1-9[a]}	Intermédiaire^[a]	Résistant^[a]	CMI en μg/mL (interprétation)
Acide nalixidique	N.D.	N.D.	N.D.	10,2 ± 8,4
Amoxicilline	N.D.^{Note de bas de page Tableau 1-9[b]}	N.D.	N.D.	0,37 ± 0
Céfotaxime	inférieur(e) à 8	16-32	supérieur(e) ou égal(e) à 64	21,3 ± 8 (I^{Note de bas de page Tableau 1-9[c]})
Ciprofloxacine	inférieur(e) à 1	2	supérieur(e) ou égal(e) à 4	0,37 ± 0 (S^{Note de bas de page Tableau 1-9[d]})
Doxycycline	N.D.	N.D.	N.D.	0,37 ± 0
Érythromycine	inférieur(e) à 0,5	1-4	supérieur(e) ou égal(e) à 8 ( supérieur(e) ou égal(e) à 4^{Note de bas de page Tableau 1-9[e]})	0,37 ± 0 (S)
Gentamicine	inférieur(e) à 4	8	supérieur(e) ou égal(e) à 16 ( supérieur(e) ou égal(e) à 4^[e])	0,52 ± 0,21 (S)
Méropénème	N.D.	N.D.	N.D.	0,37 ± 0
Triméthoprime	inférieur(e) à 2	N.D.	supérieur(e) ou égal(e) à 4	supérieur(e) à 24 (R^{Note de bas de page Tableau 1-9[f]})
Vancomycine	inférieur(e) ou égal(e) à 4	N.D.	N.D. ( supérieur(e) ou égal(e) à 4^[e])	0,45 ± 0,17 (S)

Notes de bas de page a.4

Critères d'interprétation (CMI en μg/mL; CLSI, 2010)

Retour à la référence de la note de bas de pagea.4

Notes de bas de page b.4

N.D. : Non disponible

Retour à la référence de la note de bas de pageb.4

Notes de bas de page c.3

I : Sensibilité intermédiaire

Retour à la référence de la note de bas de pagec.3

Notes de bas de page d.3

S : Sensible

Retour à la référence de la note de bas de paged.3

Notes de bas de page e.2

Critères d'interprétation (CMI μg/mL; EFSA, 2008)

Retour à la référence de la note de bas de pagee.2

Notes de bas de page f.2

R : Résistant

Retour à la référence de la note de bas de pagef.2

**Tableau 1-10. Concentrations minimales inhibitrices (CMI) pour la souche 18250-7 de B. atrophaeus**
Antibiotique	Sensible^{Note de bas de page Tableau 1-10[a]}	Intermédiaire^[a]	Résistant^[a]	CMI en μg/mL (interprétation)
Acide nalixidique	N.D.	N.D.	N.D.	3 ± 0
Amoxicilline	N.D.^{Note de bas de page Tableau 1-10[b]}	N.D.	N.D.	0,75 ± 0
Céfotaxime	inférieur(e) à 8	16-32	supérieur(e) ou égal(e) à 64	1,5 ± 0 (S^{Note de bas de page Tableau 1-10[c]})
Ciprofloxacine	inférieur(e) à 1	2	supérieur(e) ou égal(e) à 4	0,37 ± 0 (S)
Doxycycline	N.D.	N.D.	N.D.	0,37 ± 0
Érythromycine	inférieur(e) à 0,5	1-4	supérieur(e) ou égal(e) à 8 ( supérieur(e) ou égal(e) à 4^{Note de bas de page Tableau 1-10[d]})	0,37 ± 0 (S)
Gentamicine	inférieur(e) à 4	8	supérieur(e) ou égal(e) à 16 ( supérieur(e) ou égal(e) à 4^[d])	0,37 ± 0 (S)
Méropénème	N.D.	N.D.	N.D.	0,37 ± 0
Triméthoprime	inférieur(e) à 2	N.D.	supérieur(e) ou égal(e) à 4	supérieur(e) à 24 ± 0 (R^{Note de bas de page Tableau 1-10[e]})
Vancomycine	inférieur(e) ou égal(e) à 4	N.D.	N.D. ( supérieur(e) ou égal(e) à 4^[d])	0,75 ± 0 (S)

Notes de bas de page a.5

Critères d'interprétation (CMI en μg/mL; CLSI, 2010)

Retour à la référence de la note de bas de pagea.5

Notes de bas de page b.5

N.D. : Non disponible

Retour à la référence de la note de bas de pageb.5

Notes de bas de page c.4

S : Sensible

Retour à la référence de la note de bas de pagec.4

Notes de bas de page d.4

Critères d'interprétation (CMI μg/mL;EFSA, 2008)

Retour à la référence de la note de bas de paged.4

Notes de bas de page e.3

R : Résistant

Retour à la référence de la note de bas de pagee.3

La souche ATCC 12713 de B. licheniformis semblait résister à de nombreux antibiotiques (pour la plupart desquels des critères d'interprétation étaient disponibles; tableau 1-11). Ce résultat était inattendu, étant donné que les ouvrages sur l'espèce indiquent une sensibilité à diverses catégories d'antibiotiques (tableau 1-8). La résistance à la vancomycine était particulièrement inattendue (CLSI, 2010). Pour cette raison, les résultats des tests ont été réexaminés. La concentration minimale inhibitrice a été strictement interprétée comme la concentration la plus basse ayant complètement inhibé la croissance du micro-organisme (CLSI, 2010); toutefois, pour certains antibiotiques, la grande majorité des bactéries a été éliminée à des concentrations bien plus faibles, avec une petite quantité de bactéries résiduelles qui persistaient même sur plusieurs incréments de concentrations plus élevées. L'examen par microscopie a révélé que ces bactéries résiduelles se présentaient sous la forme d'agrégats, comportement unique de cette souche en milieu liquide. Cette formation d'agrégats peut protéger les cellules internes du contact avec les antibiotiques. Lorsque les résultats des essais étaient réinterprétés avec un seuil de l'activité de bioréduction de 95 %, les concentrations minimales inhibitrices étaient davantage conformes aux valeurs attendues pour cette espèce. Cela a été confirmé pour la vancomycine à l'aide de bandelettes diagnostiques, qui ont montré que les concentrations minimales inhibitrices étaient faibles (1,1 ± 1,0; n = 6). Il a été conclu que la résistance apparente élevée était un artéfact de l'essai sur la CMI en milieu liquide.

**Tableau 1-11. Concentrations inhibitrices minimales (CMI) de la souche ATCC 12713 de B. licheniformis**
Antibiotique	S^{Note de bas de pageTableau1-11[a]}	I^{Note de bas de page Tableau 1-11[b]}	R^{Note de bas de page Tableau 1-11[c]}	CMI en μg/mL (interprétation)	Activité de bioréduction de 95 % (interprétation)
Acide nalixidique	N.D.	N.D.	N.D.	supérieur(e) à 24	supérieur(e) à 24
Amikacine	inférieur(e) ou égal(e) à 16	32	supérieur(e) ou égal(e) à 64	supérieur(e) à 24 (non sensible^{Note de bas de page Tableau 1-11[d]})	supérieur(e) à 24 (non sensible)
Amoxicilline	N.D.^{Note de bas de page Tableau 1-11[e]}	N.D.	N.D.	supérieur(e) à 24	supérieur(e) à 24
Ampicilline	inférieur(e) ou égal(e) à 0,25	N.D.	supérieur(e) ou égal(e) à 0,5	0,37 ± 0 (I^{Note de bas de page Tableau 1-11[f]})	0,37 ± 0
Céfotaxime	inférieur(e) à 8	16-32	supérieur(e) ou égal(e) à 64	12 (I)	6,0 ± 0 (S)
Ceftazidime	inférieur(e) à 8	16	supérieur(e) ou égal(e) à 32	supérieur(e) à 24 (R^{Note de bas de page Tableau 1-11[g]})	supérieur(e) à 24 (R)
Chloramphénicol	inférieur(e) ou égal(e) à 8	16	supérieur(e) ou égal(e) à 32 ( supérieur(e) ou égal(e) à 8^{Note de bas de page Tableau 1-11[h]})	12 (I)	12 ± 0 (I)
Ciprofloxacine	inférieur(e) à 1	2	supérieur(e) ou égal(e) à 4	18 ± 9 (R)	0,37 ± 0 (S)
Doxycycline	N.D.	N.D.	N.D.	24	0,56 ± 0,19
Érythromycine	0,5	1-4	supérieur(e) ou égal(e) à 8 ( supérieur(e) ou égal(e) à 4^[f])	supérieur(e) à 24 (R)	supérieur(e) à 24 (R)
Gentamicine	4	8	supérieur(e) ou égal(e) à 16 ( supérieur(e) ou égal(e) à 4^[f])	18 ± 9 (R)	2,53 ± 1,54 (S)
Méropénème	N.D.	N.D.	N.D.	24	0,37 ± 0
Pénicilline	inférieur(e) ou égal(e) à 0,12	N.D.	supérieur(e) ou égal(e) à 0,25	0,75 ± 0 (R)	0,75 ± 0 (R)
Rifampine	inférieur(e) ou égal(e) à 1	2	supérieur(e) ou égal(e) à 4	0,5 ± 0,2 (S)	0,37 ± 0 (R)
Tétracycline	inférieur(e) ou égal(e) à 4	8	supérieur(e) ou égal(e) à 16 ( supérieur(e) ou égal(e) à 8^[f])	3 ± 0 (S)	3,0 ± 0 (S)
Triméthoprime	inférieur(e) à 2	N.D.	supérieur(e) ou égal(e) à 4	supérieur(e) à 24 (R)	0,37 ± 0 (S)
Vancomycine	inférieur(e) ou égal(e) à 4	N.D.	N.D. ( supérieur(e) ou égal(e) à 4^[f])	18 ± 9 (non sensible)	0,61 ± 0,37 (S)

Notes de bas de page a.6

Critères d'interprétation (CMI en μg/mL; CLSI, 2010) S : Sensible

Retour à la référence de la note de bas de pagea.6

Notes de bas de page b.6

Critères d'interprétation (CMI en μg/mL; CLSI, 2010) I : Intermédiaire

Retour à la référence de la note de bas de pageb.6

Notes de bas de page c.5

Critères d'interprétation (CMI en μg/mL; CLSI, 2010) R : Résistant

Retour à la référence de la note de bas de pagec.5

Notes de bas de page d.5

S : Sensible

Retour à la référence de la note de bas de paged.5

Notes de bas de page e.4

N.D. : Non disponible

Retour à la référence de la note de bas de pagee.4

Notes de bas de page f.3

I : Sensibilité intermédiaire

Retour à la référence de la note de bas de pagef.3

Notes de bas de page g.1

R : Résistant

Retour à la référence de la note de bas de pageg.1

Notes de bas de page h.1

Critères d'interprétation (CMI μg/mL; EFSA, 2008)

Retour à la référence de la note de bas de pageh.1

Notes de bas de page i.1

Confirmée à l'aide de bâtonnets diagnostiques (1,1 ± 1,0 µg/mL, n = 6)

Retour à la référence de la note de bas de pagei.1

**Tableau 1-12. Concentrations inhibitrices minimales (CMI, μg/mL) des souches de *B. subtilis*inscrites à la Liste intérieure des substances**
Antibiotique	S^{Note de bas de page Tableau 1-12[a]}	I^{Note de bas de page Tableau1-12[b]}	R^{Note de bas de page Tableau 1-12[c]}	B. subtilis sous-espèce subtilis ATCC 6051	B. subtilis ATCC 6051A	B. subtilis ATCC 55405	B. subtilis sous-espèce inaquosorum ATCC 55406
Acide nalixidique	N.D.	N.D.	N.D.	supérieur(e) à 24	8 ± 3,5	8 ± 3	9,6 ± 3,3
Amoxicilline	N.D.^{Note de bas de page Tableau 1-12[d]}	N.D.	N.D.	0,4	12,2 ± 13,6	4,3 ± 9,6	0,6 ± 0,5
Ampicilline	inférieur(e) ou égal(e) à 0,25	N.D.	supérieur(e) ou égal(e) à 0,5	supérieur(e) à 24 (R^{Note de bas de page Tableau 1-12[e]})	supérieur(e) à 24 (R)	supérieur(e) à 24 (R)	Aucune donnée
Aztréonam	N.D.	N.D.	N.D.	supérieur(e) à 24	supérieur(e) à 24	supérieur(e) à 24	Aucune donnée
Céfotaxime	inférieur(e) ou égal(e) à 8	16-32	supérieur(e) ou égal(e) à 64	6,1 ± 4,7 (S^{Note de bas de page Tableau 1-12[f]})	5 ± 1,7 (S)	1,3 ± 1,3 (S)	supérieur(e) à 24
Ciprofloxacine	inférieur(e) ou égal(e) à 1	2	supérieur(e) ou égal(e) à 4	Aucune donnée	Aucune donnée	Aucune donnée	supérieur(e) à 24 (R)
Doxycycline	N.D.	N.D.	N.D.	0,4	0,4	0,4	8,4 ± 3,3
Érythromycine	inférieur(e) à 0,5	1-4	supérieur(e) ou égal(e) à 8 ( supérieur(e) ou égal(e) à 4^{Note de bas de page Tableau 1-12[g]})	0,4 (S)	0,4 (S)	0,4 (S)	0,4 (S)
Gentamicine	inférieur(e) à 4	8	supérieur(e) ou égal(e) à 16 ( supérieur(e) ou égal(e) à 4^[g])	0,6 ± 0,2 (S)	0,6 ± 0,2 (S)	0,4 (S)	0,4 (S)
Méropénème	N.D.	N.D.	N.D.	Aucune donnée	Aucune donnée	Aucune donnée	1,2 ± 1,1
Triméthoprime	inférieur(e) à 2	N.D.	supérieur(e) ou égal(e) à 4	supérieur(e) à 24 (R)	supérieur(e) à 24 (R)	supérieur(e) à 24 (R)	supérieur(e) à 24 (R)
Vancomycine	inférieur(e) ou égal(e) à 4	N.D.	N.D. ( supérieur(e) ou égal(e) à 4^[g])	0,9 ± 0,7 (S)	0,4 (S)	0,4 (S)	0,37 (S)

Notes de bas de page a.7

Critères d'interprétation (CMI en μg/mL; CLSI, 2010) S : Sensible

Retour à la référence de la note de bas de pagea.7

Notes de bas de page b.7

Critères d'interprétation (CMI en μg/mL; CLSI, 2010) I : Intermédiaire

Retour à la référence de la note de bas de pageb.7

Notes de bas de page c.6

Critères d'interprétation (CMI en μg/mL; CLSI, 2010) R : Résistant

Retour à la référence de la note de bas de pagec.6

Notes de bas de page d.6

N.D. : Non disponible

Retour à la référence de la note de bas de paged.6

Notes de bas de page e.5

R : Résistant

Retour à la référence de la note de bas de pagee.5

Notes de bas de page f.4

S : Sensible

Retour à la référence de la note de bas de pagef.4

Notes de bas de page g.2

Critères d'interprétation (CMI μg/mL;EFSA, 2008)

Retour à la référence de la note de bas de pageg.2

**Tableau 1-13. Concentrations inhibitrices minimales (CMI, μg/mL) de l'espèce *Bacillus* maquillée inscrite à la Liste intérieure des substances**
Antibiotique	S^{Note de bas de page Tableau 1-13[a]}	I^{Note de bas de page Tableau1-13[b]}	R^{Note de bas de page Tableau 1-13[c]}	Espèce Bacillus 2 18118-1	Espèce Bacillus 4 18121-4	Espèce Bacillus 16970-5	Espèce Bacillus 7 18129-3
Acide nalixidique	N.D.	N.D.	N.D.	8 ± 3	12	9,0 ± 3,3	supérieur(e) à 24
Amoxicilline	N.D.^{Note de bas de page Tableau 1-13[d]}	N.D.	N.D.	Variable	0,37	0,9 ± 0,6	0,4
Ampicilline	inférieur(e) ou égal(e) à 0,25	N.D.	supérieur(e) ou égal(e) à 0,5	Aucune donnée	Aucune donnée	supérieur(e) à 24 (R^{Note de bas de page Tableau 1-13[e]})	supérieur(e) à 24 (R)
Aztréonam	N.D.	N.D.	N.D.	supérieur(e) à 24	Aucune donnée	supérieur(e) à 24	supérieur(e) à 24
Céfotaxime	inférieur(e) à 8	16-32	supérieur(e) ou égal(e) à 64	1,6 ± 0,7 (S^{Note de bas de page Tableau 1-13[f]})	3 (S)	11 ± 2,4 (I^{Note de bas de page Tableau 1-13[g]})	6,1 ± 4,7 (S)
Ciprofloxacine	inférieur(e) ou égal(e) à 1	2	supérieur(e) ou égal(e) à 4	Aucune donnée	0,37 (S)	Aucune donnée	Aucune donnée
Doxycycline	N.D.	N.D.	N.D.	0,8 ± 0,4	0,37	0,4	0,4
Érythromycine	inférieur(e) à 0,5	1-4	supérieur(e) ou égal(e) à 8 ( supérieur(e) ou égal(e) à 4^{Note de bas de page Tableau 1-13[h]})	0,37 (S)	0,37 (S)	0,4 (S)	0,4 (S)
Gentamicine	inférieur(e) à 4	8	supérieur(e) ou égal(e) à 16 ( supérieur(e) ou égal(e) à 4^[h])	1,2 ± 0,5 (S)	1,5 (S)	0,5 ± 0,2 (S)	0,6 ± 0,2 (S)
Méropénème	N.D.	N.D.	N.D.	Aucune donnée	0,37	Aucune donnée	Aucune donnée
Triméthoprime	inférieur(e) à 2	N.D.	supérieur(e) ou égal(e) à 4	supérieur(e) à 24 (R)	0,37 (S)	24 ± 23 (R)	supérieur(e) à 24 (R)
Vancomycine	inférieur(e) ou égal(e) à 4	N.D.	N.D. ( supérieur(e) ou égal(e) à 4^[h])	0,37 (S)	0,75 (S)	0,4 (S)	0,9 ± 0,7 (S)

Notes de bas de page a.8

Critères d'interprétation (CMI en μg/mL; CLSI, 2010) S : Sensible

Retour à la référence de la note de bas de pagea.8

Notes de bas de page b.8

Critères d'interprétation (CMI en μg/mL; CLSI, 2010) I : Intermédiaire

Retour à la référence de la note de bas de pageb.8

Notes de bas de page c.7

Critères d'interprétation (CMI en μg/mL; CLSI, 2010) R : Résistant

Retour à la référence de la note de bas de pagec.7

Notes de bas de page d.7

N.D. : Non disponible

Retour à la référence de la note de bas de paged.7

Notes de bas de page e.6

R : Résistant

Retour à la référence de la note de bas de pagee.6

Notes de bas de page f.5

S : Sensible

Retour à la référence de la note de bas de pagef.5

Notes de bas de page g.3

I : Sensibilité intermédiaire

Retour à la référence de la note de bas de pageg.3

Notes de bas de page h.2

Critères d'interprétation (CMI μg/mL; EFSA,2008)

Retour à la référence de la note de bas de pageh.2

1.1.3 Effets

1.1.3.1 Environnement

B. amyloliquefaciens

L'espèce B. amyloliquefaciens est largement répandue dans la nature dans une variété d'habitats. Certaines souches ont été utilisées dans des écosystèmes agricoles en tant que pesticides biologiques destinés à lutter contre les champignons phytopathogènes (Agence de réglementation de la lutte antiparasitaire de Santé Canada, 2012; USEPA, 2011; USEPA, 2012); d'autres ont été utilisées dans des habitats aquatiques pour traiter et adoucir l'eau (Advanced Water Technologies, 2012). Malgré sa présence naturelle dans une variété d'environnements et ses antécédents d'utilisation dans les écosystèmes, une recherche exhaustive dans les ouvrages scientifiques de nombreuses sources n'a pas permis de trouver de rapports sur des infections ou des preuves d'effets nocifs sur les vertébrés, les invertébrés et les plantes aquatiques ou terrestres.

Des études sur les effets des souches FZB24 et D747 de B. amyloliquefaciens sur une variété d'espèces environnementales ont été présentées à l'appui de leur homologation en tant que biofongicides destinés à être utilisés sur les plantes terrestres (annexe 11, Tableau A-51 et Tableau A-52 ). En résumé, aucune pathogénicité ou toxicité importante n'a été observée chez les vertébrés terrestres (rats CD et Sprague Dawley, Colin de Virginie [caille]), les vertébrés aquatiques (truite arc-en-ciel), les invertébrés terrestres (abeilles domestiques adultes et larves, lombric) ni les invertébrés aquatiques (Daphnia magna) aux concentrations testées. Même si les études sur les plantes aquatiques ou terrestres n'ont pas été déclarées dans le cadre de l'homologation des pesticides, les pesticides contenant ces souches sont délibérément appliqués aux plantes terrestres pour lutter contre les phytopathogènes fongiques et bactériens, et aucun effet nocif sur les plantes traitées n'a été signalé dans la littérature scientifique.

Des essais sur l'exposition des souris ont été dirigés par les scientifiques de Santé Canada. Les femelles BALB/c n'ont pas présenté de symptômes après une exposition à 10⁶UFC de spores ou de cellules végétatives de la souche 13563-0 de B. amyloliquefaciens, administrées dans un volume de 25 µL par nébulisation endotrachéale. Hormis une réaction inflammatoire transitoire, aucun changement important n'a été observé (annexe 12, Tableau A-59 à Tableau A-63 ).

B. atrophaeus

L'espèce B. atrophaeus est largement répandue dans la nature. Elle est utilisée en tant que substitut non pathogène à l'espèce B. anthracis dans les expériences sur la modélisation de la dispersion des spores dans l'air (Carrera et al., 2007; Page et al., 2007; USEPA, 2013a). Malgré sa présence naturelle et son utilisation dans l'environnement, une recherche exhaustive dans les ouvrages scientifiques de nombreuses sources n'a pas permis de trouver de rapports sur les infections ou des preuves d'effets nocifs sur les les vertébrés, les invertébrés et les plantes aquatiques ou terrestres.

Des essais sur l'exposition de souris ont été menés par les scientifiques de Santé Canada. Les femelles BALB/c n'ont pas présenté de symptômes après une exposition à 10⁶UFC de spores ou de cellules végétatives de la souche 18250-7 de B. atrophaeus, administrées dans un volume de 25 µL par nébulisation endotrachéale. Hormis une réaction inflammatoire transitoire, aucun changement important n'a été observé (annexe 12, Tableau A-59 à Tableau A-63).

B. licheniformis

Les isolats environnementaux de l'espèce B. licheniformis peuvent former des biofilms (Dat et al., 2012) qui jouent un rôle dans la pathogenèse des mammites bovines (Contreras et Rodríguez, 2011; Nieminen et al., 2007)et la toxémie bovine (Murray et al., 1995). L'espèce B. licheniformis peut entraîner un avortement ou des mortinaissances chez les bovins, ainsi que chez les buffles, les moutons, les porcs et les camélidés (Agerholm et al., 1995; Agerholm et al., 1997; Cabell, 2007; Duncanson, 2012; Galiero et De Carlo, 1998; Gill, 1999; Kirkbride et al., 1986; Kirkbride, 1993; Madslien et al., 2012; Mitchell et Barton, 1986). D'autres effets nocifs sur les vertébrés terrestres associés à B. licheniformis incluent la placentite, la kéraconjonctivite, la dégradation des plumes et l'infection du sac vitellin chez les autruches (Johnson et al., 1994; Gill 1999; Sheldon et al., 2002; Murray 2006; Hare et al., 2008; Rajchard 2010; Goncagul et al., 2012). L'espèce B. licheniformis a été associée à des effets nocifs chez des insectes, notamment les punaises de lits, les nématodes cécidogènes, les charançons de l'Eucalyptus et les papillons nocturnes (Reinhardt et al., 2005; Mekete et al., 2008; Molina et Santolmazza-Carbone, 2010; Bilbech et al., 2012). Un isolat de B. licheniformis a été identifié comme agent causal du dépérissement terminal chez la pistache (Baradaran et Ghasemi, 2010).

Dans une étude de six mois, des chercheurs ont tenté de déterminer la cause de 218 fœtus bovins avortés (Agerholm et al., 1997). La cause probable de 73 avortements a été diagnostiquée : parmi les causes les plus communes se trouvaient la diarrhée virale bovine (13 %), Neospora caninum (10 %), la mycose (5 %) et B. licheniformis(4 %) [Agerholm et al., 1997]. Dans une autre étude, B. licheniformis était à l'origine de 3 % des avortements bovins (n = 5 662) (Murray, 2006). Dans la mise à jour du rapport canadien sur les avortements bovins pour la période 1998 à 2004 B. licheniformis aurait été impliqué dans 1,1 à 3,1 % des avortements signalés au Animal Health Laboratory (McEwen et Carman, 2005). En comparaison, les espèces du genre Neospora représentaient entre 8,3 et 19 % des cas et d'autres espèces de bactéries représentaient entre 6,1 et 14 % pour la même période. Dans jusqu'à 60,6 % des cas, aucun agent étiologique n'a été identifié entre 2001 et 2002. Malgré sa présence naturelle à des concentrations élevées dans les milieux agricoles
[10⁴-10⁷ UFC/m3 dans l'air intérieur et 10⁴-10⁶ UFC/g dans la poussière (Andersson et al., 1999)], les avortements résultant d'une exposition aux populations de B. licheniformisnaturellement présentes dans l'environnement ne sont pas courants. La pathogenèse des avortements n'est pas claire, mais l'ingestion d'aliments de mauvaise qualité ou moisis pendant la gestation et la propagation hématogène des pathogènes qui s'ensuit dans l'appareil reproducteur ainsi que leur introduction au cours des activités générales d'élevage ont été avancées (Cabell, 2007; Scott, 2011; Goncagul, 2012). La gentamicine et la ciprofloxacine se sont avérées les antibiotiques les plus efficaces contre l'espèce B. licheniformis isolée du mucus cervicovaginal des vaches soumises à des saillies répétées (Yadav et Kashyap, 2003).

L'infection expérimentale avec la souche DVL 9315323 de B. licheniformis chez les vaches laitières gravides a révélé un tropisme vers le placentome après l'administration de doses contenant entre 10⁹ et 10¹² UFC par animal (Agerholm et al., 1999). Les bactéries B. licheniformis ont été étroitement associées aux lésions dans le placentome et les fœtus. Par ailleurs, il semble que la bactérie pourrait provoquer des avortements ou des naissances prématurées (Agerholm et al., 1999). Dans une autre étude sur les mammifères, des souris BALB/c dont l'immunité avait été affaiblie ont été exposées, par voie intraveineuse, à des isolats environnementaux et alimentaires de B. licheniformis, y compris la souche type ATCC 14580 de B. licheniformis, à des doses variant de moins de 1 × 10⁶ à 6 × 10¹⁰ UFC par animal (Agerholm et al., 1997; annexe 11,Tableau A-54 ). Les souris pouvaient éliminer de grandes quantités de bactéries dans un délai d'une semaine, mais certains des isolats testés ont causé des lésions pulmonaires et cérébrales. Des rats mâles albinos Wistar exposés à une souche de B. licheniformisavaient une DSENO orale de plus de 1,1 × 10¹¹ UFC/kg poids corporel (Nithya et al., 2012; annexe 11, tableau A-54).

Les études sur les effets de la souche SB3086 de B. licheniformis sur différentes espèces environnementales ont été présentées à l'appui de son homologation en tant que fongicide pour les plantes terrestres (annexe 11, Tableau A-53 ). Aucune pathogénicité ou toxicité n'a été observée chez les vertébrés terrestres (rats, Canards colverts), aquatiques (truite arc-en-ciel) ou les invertébrés terrestres (larves d'abeilles domestiques) aux concentrations testées (USEPA, 2001). Des invertébrés aquatiques (Daphnia magna) ont été exposés à la matière active de qualité technique (MAGT). La survie des daphnies exposées à 1 × 10⁷ UFC/mL de matière active de qualité technique (1 000 fois la concentration environnementale escomptée pour l'utilisation dans les pesticides) était de 90 % (deux sont mortes) (Agence de réglementation de la lutte antiparasitaire de Santé Canada, communication personnelle). Pour ce qui est de la survie, de la reproduction, de la longueur et du poids par rapport aux témoins, la matière active de qualité technique n'était pas considérée comme toxique. Bien que les études de pathogénicité et de toxicité sur les plantes aquatiques ou terrestres n'aient pas été déclarées dans le cadre de l'homologation du pesticide, le pesticide contenant cette souche est délibérément appliqué aux plantes terrestres pour lutter contre les pathogènes fongiques. Aucun effet nocif sur les plantes traitées n'a été signalé dans la littérature scientifique ni dans les essais réalisés pour évaluer l'efficacité.

Aucun effet néfaste n'a été déclaré chez les crevettes des salines, les truites arc-en-ciel, les porcs et les poulets exposés à des probiotiques contenant des souches de B. licheniformis (Link et Kovác, 2006; Merrifield et al., 2010a; Merrifield et al., 2010b; Rahimi et Kahsksefidi, 2006; Vinoj et al., 2013). Une amélioration de la prise de poids ou de la résistance aux pathogènes a par ailleurs été notée.

Les scientifiques de Santé Canada ont procédé à des essais chez les souris. Les femelles BALB/c n'ont pas présenté de symptômes après une exposition à 10⁶ UFC de spores ou de cellules végétatives de la souche 12713 de B. licheniformis, administrées dans un volume de 25 µL par nébulisation endotrachéale. Hormis une réaction inflammatoire transitoire, aucun changement important n'a été observé (annexe 12, Tableau A-59 à Tableau A-63).

B. subtilis

L'espèce B. subtilis est naturellement présente dans l'air ambiant et la poussière des établissements agricoles à des densités cellulaires élevées (Andersson et al., 1999). Certaines souches ont été utilisées dans des écosystèmes agricoles en tant que fongicides pour les plantes terrestres (Mendelsohn et Vaituzis, 1999; USEPA; 2006; Agence de réglementation de la lutte antiparasitaire de Santé Canada, 2007a; Agence de réglementation de la lutte antiparasitaire de Santé Canada, 2007b; Agence de réglementation de la lutte antiparasitaire de Santé Canada, 2007c; USEPA, 2010; Agence de réglementation de la lutte antiparasitaire de Santé Canada, 2013); d'autres ont été employées dans des habitats aquatiques pour traiter et adoucir l'eau (Advanced Water Technologies, 2012). Malgré sa présence naturelle dans une variété d'environnements et ses antécédents d'utilisation dans l'environnement, une recherche exhaustive dans les ouvrages scientifiques de nombreuses sources n'a pas permis de trouver de rapports sur des infections ou des preuves d'effets nocifs sur les plantes ou les vertébrés aquatiques.

Des études sur les effets des souches de B. subtilissur différentes espèces environnementales ont été présentées à l'appui de l'homologation de certaines espèces comme biofongicides pour les plantes terrestres (annexe 11, Tableau A-56 et Tableau A-57 ). Aucun effet nocif important n'a été signalé chez les oiseaux, les mammifères, les insectes terrestres, les lombrics ou les micro-organismes du sol à la suite de l'exposition de la souche MBI 600 de B. subtilis(Agence de réglementation de la lutte antiparasitaire de Santé Canada, 2007a). Aucun effet nocif important n'a été signalé chez les oiseaux, les poissons d'eau douce et d'eau salée, les mammifères ou les algues à la suite de l'exposition de la souche QST 713 de B. subtilis (Agence de réglementation de la lutte antiparasitaire de Santé Canada, 2007b). Certaines données indiquent des effets sur les invertébrés aquatiques et terrestres, mais les résultats sont contradictoires. Dans les études examinées par l'Environmental Protection Agency des États-Unis, de la mortalité a été observée chez l'espèce Daphnia magna et l'espèce parasite Hymenoptera après l'exposition à la souche QST 713 de B. subtilis à des concentrations variables (Mendelsohn et Vaituzis, 1999). La cause de la mortalité et l'implication de la souche QST 713 de B. subtilis dans la toxicité ou la pathogénicité n'ont pas pu être déterminées dans ces études.

Les scientifiques de Santé Canada ont mené des essais chez les souris. Les femelles BALB/c n'ont pas présenté de symptômes après avoir été exposées à 106 UFC de spores ou de cellules végétatives des souches ATCC 6051A de B. subtilis, ATCC 55405 de B. subtilis, ATCC 6051 de B. subtilis sous-espèce subtilis et ATCC 55406 de B. subtilis sous-espèce inaquosorum, administrées dans un volume de 25 µL par nébulisation endotrachéale. Hormis une réaction inflammatoire transitoire, aucun changement important n'a été observé (annexe 12, Tableau A-59 à Tableau A-63).

Des études sur la pathogénicité et la toxicité ont été réalisées par les scientifiques d'Environnement Canada^{Note de bas de page[8]} chez les espèces Festuca rubra (fétuque rouge), Folsomia candida (collembole ou nivicole) et Eisenia andrei (lombric) exposées aux souches ATCC 6051A de B. subtilis ou ATCC 55405 de B. subtilis dans du loam sablo-argileux recueilli dans la nature ou dans un sol limoneux-sableux artificiel (annexe 11, Tableau A-58 ). Concernant la fétuque rouge, les échantillons de sol naturel et artificiel ont été inoculés avec 10⁵ UFC/g de sol (poids sec) avec les souches ATCC 6051A de B. subtilis ou ATCC 55405 de B. subtilis. À la fin de l'étude (jour 21), une réduction importante (environ 18 %) dans la longueur moyenne des pousses a été détectée chez les plantes exposées à la souche 55405 de B. subtilis dans l'échantillon de sol naturel, par rapport aux témoins négatifs dans le sol naturel.

Dans les essais menés avec des collemboles nivicoles, les arthropodes ont été exposés pendant 28 jours à des sols naturels ou artificiels inoculés avec 10⁴ UFC de la souche ATCC 6051A de B. subtilis ou 10³ UFC de la souche 55405 de B. subtilis par gramme de sol sec. Par rapport aux témoins négatifs dans les deux sols, une réduction importante (environ 50 %) de la production de juvéniles a été observée après une exposition à la souche ATCC 55405 de B. subtilis, tandis qu'aucun juvénile n'a été produit après une exposition à la souche ATCC 6051A de B. subtilis. La survie des adultes n'a pas été touchée par l'une ou l'autre de ces souches.

Dans les essais menés avec des lombrics, les invertébrés ont été exposés pendant 35 jours aux naturels et artificiels inoculés avec 10⁴ UFC de la souche ATCC 6051A de B. subtilis ou 10⁵ UFC de la souche 55405 de B. subtilis par gramme de sol sec. On n'a constaté aucun effet nocif sur la reproduction après une exposition à l'une ou l'autre des souches, indépendamment du type de sol. Une augmentation importante de la production de juvéniles a été observée dans le sol naturel par rapport aux témoins négatifs dans le sol naturel, après une exposition à la souche ATCC 55405 de B. subtilis.

Souches maquillées de Bacillus inscrites à la Liste intérieure

Les scientifiques de Santé Canada ont procédé à des essais chez les souris. Les femelles BALB/c n'ont pas présenté de symptômes après avoir été exposées à 10⁶ UFC de spores ou cellules végétatives des espèces Bacillus 16970-5, Bacillus 2 18118-1, Bacillus 4 18121-4 et Bacillus 7 18129-3, administrées dans un volume de 25 µL par nébulisation endotrachéale. Hormis une réaction inflammatoire transitoire, aucun changement important n'a été observé (annexe 12, Tableau A-59 à Tableau A-63 ).

1.1.3.2 Santé humaine

À l'exception de B. cereus, les infections causées par Bacillus chez les humains sont rares. Elles sont variées et tendent à se produire chez les personnes dont le système immunitaire est affaibli (Pennington et al., 1976); elles peuvent également être associées aux implants médicaux (Banerjee et al., 1988) ou à un traumatisme récent (Logan, 2012). Des cas d'intoxication alimentaire causés par des espèces de Bacillus autres que B. cereusont été signalés (Kramer et Gilbert, 1989; Murray et al., 1995). Au cours des dernières années toutefois, aucune intoxication alimentaire due à une espèce de Bacillusautre que B. cereus n'a été signalée(Sorokulova, communication personnelle). En tant que contaminants potentiels des produits du tabac, des espèces du genre Bacillus ont été associées à des infections, des inflammations pulmonaires, des sensibilités allergiques, ainsi qu'à une exsudation plasmatique et à un dysfonctionnement des tissus de la bouche (Rooney, 2005; Rubinstein et Pedersen, 2002).

B. amyloliquefaciens

L'espèce B. amyloliquefaciens est présente partout dans le monde dans une variété de niches écologiques eta déjà été utilisée dans la fermentation industrielle et la lutte contre les ravageurs. Une recherche complète dans la littérature scientifique de toutes les sources majeures n'a pas permis de trouver de rapports sur des infections humaines associées à cette espèce ou sur d'autres effets nocifs chez l'humain provoqués par l'exposition au micro-organisme, à ses métabolites ou à ses composants structurels.

Les études présentées à l'appui de l'homologation des pesticides contenant les souches FZB24 et D747 de B. amyloliquefaciens comportaient une variété d'expositions dans les modèles mammaliens utilisés pour prévoir les effets nocifs chez l'humain (annexe 11, Tableau A-51 et Tableau A-52 ). Les études portant sur l'exposition par les voies orale, pulmonaire et intraveineuse aux souches FZB24 ou D747 de B. amyloliquefaciens ont révélé une faible toxicité, mais aucune pathogénicité chez les rats CD et Sprague-Dawley, et ce, aux doses maximales.

Dans des études faites à Santé Canada, des souris femelles BALB/c ont été exposées à 10⁶ UFC de cellules végétatives ou spores de la souche 13563-0 de B. amyloliquefaciens, administrées dans un volume de 25 µL par nébulisation endotrachéale, en tant que modèle de l'exposition humaine par voie pulmonaire. Les souris semblaient normales et n'ont pas présenté de symptômes après l'exposition aux cellules végétatives ou aux spores. Toutes les souris traitées ont été autopsiées 24 heures après l'exposition aux cellules végétatives et une semaine après l'exposition aux spores, dans le but d'évaluer la clairance bactérienne, l'expression des cytokines pulmonaires et la réponse en phase aiguë (annexe 12, Tableau A-59 à Tableau A-63 ). Une réponse pro-inflammatoire statistiquement significative a été observée, et la concentration de certaines cytokines pulmonaires était élevée 24 heures après l'exposition aux cellules végétatives. Aucun changement important n'a été observé une semaine après l'exposition aux spores. Les souris ayant reçu des spores n'ont pas fait l'objet d'une évaluation de l'inflammation ou de l'expression des cytokines après 24 heures; la présence d'inflammation transitoire n'aurait donc pas été détectée. Dans la réponse en phase aiguë, la concentration de l'amyloïde A sérique était légèrement élevée, et ce, tant 24 heures après l'exposition aux cellules végétatives qu'une semaine après l'exposition aux spores.

Aucun cas d'hypersensibilité aux glucanases ou aux amylases produites par B. amyloliquefaciens n'a été signalé (Caballero et al., 2007). Aucun incident d'hypersensibilité n'a été déclaré dans les conditions de laboratoire contrôlées au cours de la recherche et du développement comprenant les essais, la production ou la manipulation des souches FZB24 et D747 de B. amyloliquefaciens destinées à la lutte biologique contre des espèces nuisibles (USEPA, 2011; USEPA, 2012).

B. atrophaeus

L'espèce B. atrophaeus est largement répandue dans la nature et a déjà été utilisée dans l'environnement comme organisme substitut dans la modélisation de la dispersion dans l'air des espèces pathogènes de Bacillus (Carrera et al., 2007; Page et al., 2007; USEPA, 2013a). Une recherche complète dans les ouvrages scientifiques provenant de toutes les sources majeures n'a pas permis de trouver de rapports sur des infections humaines associées à B. atrophaeus ou sur d'autres effets nocifs chez l'humain provoqués par l'exposition au micro-organisme, à ses métabolites ou à ses composants structurels.

Dans les études dirigées à Santé Canada, des souris femelles BALB/c ont été exposées à 10⁶ UFC de cellules végétatives ou spores de la souche 18250-7 de B. atrophaeus, administrées dans un volume de 25 µL par nébuliseur endotrachéal, en tant que modèle pour l'exposition humaine par voie pulmonaire. Les souris semblaient normales et n'ont pas présenté de symptômes après exposition aux spores et aux cellules végétatives. Toutes les souris traitées ont été autopsiées 24 heures après l'exposition aux cellules végétatives ou une semaine après l'exposition aux spores, dans le but d'évaluer la clairance bactérienne, l'expression des cytokines pulmonaires et la réponse en phase aiguë (annexe 12, Tableau A-48 à Tableau A-52). On a observé une réponse pro-inflammatoire statistiquement significative et certaines cytokines pulmonaires étaient élevées 24 heures après l'exposition aux cellules végétatives. Aucun changement important n'a été observé une semaine après l'exposition aux spores. Les souris ayant reçu des spores n'ont pas fait l'objet d'une évaluation pour contrôler l'inflammation ou l'expression des cytokines après 24 heures; la présence d'inflammation transitoire n'aurait donc pas été détectée. Dans la réponse en phase aiguë, les niveaux de sérum amyloïde A étaient légèrement élevés aussi bien pour les cellules végétatives que pour les spores.

Aucun cas d'hypersensibilité ou d'allergie à B. atrophaeus, à ses métabolites ou à ses composants structurelsn'a été signalé.

B. licheniformis

Bien que l'espèce B. licheniformis soit naturellement présente en concentrations élevées dans une variété de milieux auxquels les humains sont exposés, seuls 35 rapports de cas d'infection ont été publiés dans la littérature scientifique anglaise depuis 1966. Plusieurs d'entre eux étaient des cas de bactériémie ou de septicémie, mais diverses autres infections ont également été signalées (Blue et al., 1995; Castagnola et al., 1997; Cotton et al., 1987; Maucour et al., 1999; Murray et al., 1995; Tabbara et Tarabay, 1979; Thurn et Goodman, 1988). Presque tous les cas impliquaient des facteurs prédisposants : immunodéficience, maladie invalidante ou barrières naturelles contre les infections sérieusement compromises.

Des bactériémies liées à B. licheniformis ont été signalées chez des patients ayant un cancer (Banerjee et al., 1988; Ozkocaman et al., 2006), une péritonite (Sugar et McCloskey, 1977) ou un cathéter veineux central (Blue et al., 1995; Castagnola et al., 1997) et d'une procédure bronchoscopique (Hong et al., 2004). D'autres ont été observées en association avec des lésions aux pieds (Gayet et al., 2005) et chez une femme enceinte (Peloux et al., 1976). Une co-bactériémie liée aux espèces B. licheniformis et B. subtilis a été observée chez un patient âgé ayant des facteurs prédisposants (La Jeon et al., 2012). Dans trois cas de septicémie liée à B. licheniformis, l'un était dû à une ligne intraveineuse contaminée (Matsumoto et al., 2000), l'autre s'est déclaré après une artériographie (Hardy et al., 1986) et le troisième a été observé chez un nourrisson prématuré (Lépine et al., 2009; Thomson et al., 1990). Dans deux cas, des personnes se sont délibérément injecté des produits contenant des spores de B. licheniformis (seules ou en association avec des spores d'autres espèces de Bacillus), provoquant alors une bactériémie (Galanos et al., 2009; Hannah et Ende, 1999). La bactériémie était récurrente dans un cas, en raison peut-être des spores qui ont résisté au traitement antibiotique, qui sont restées dans les tissus et qui ont germé de façon périodique (Hannah et Ender, 1999). Ce genre de septicémie récurrente causée par B. licheniformis a également été observé plus récemment chez une personne immunocompétente ne présentant pas de conditions sous-jacentes apparentes (Haydushka et al., 2012).

Une ophtalmie ou une endophtalmie liée à B. licheniformis (Maucour et al., 1999; Tabbara et Tarabay, 1979; Thurn et Goodman, 1988) et un abcès cérébral (Jones et al., 1992), chacun d'entre eux résultant d'un traumatisme oculaire pénétrant, ont été signalés. Un abcès cérébral provoqué par l'espèce B. licheniformis a aussi été décrit chez un patient souffrant de leucémie myéloblastique aiguë (Mochiduki et al., 2007), ainsi que chez un patient en bonne santé, où l'abcès s'est ensuite transformé en tumeur cérébrale maligne (Flores et al., 2001). Dans le dernier cas, en plus d'avoir donné lieu à la formation d'un abcès cérébral, il semble que B. licheniformis aurait été l'agent oncogène. Malgré le manque de preuve concluante concernant une telle relation de cause à effet, on a émis l'hypothèse que B. licheniformis était une bactérie oncogène au même titre que d'autres, comme Heliobacter pylori (Wainwright et Al Talih, 2003). Parmi les autres infections associées à B. licheniformis, mentionnons les suivantes : abcès de la glande parotide (Longo et al., 2003), infection cutanée découlant d'une blessure (Ameur et al., 2005), endocardite sur valve prothétique (Santini et al., 1995), infection provoquée par le fil d'un stimulateur cardiaque avec bactériémie (Quan et al., 2000), inflammation post-opératoire des ventricules où B. licheniformis a été isolé du liquide céphalorachidien (Young et al., 1982) et spondylite en association avec une bactériémie chez un patient atteint d'un cancer du poumon (Kim et al., 2012).

L'innocuité de la souche Mel de B. licheniformis (isolée du lait) a été évaluée aux fins d'utilisation dans l'industrie alimentaire (annexe 11, Tableau A-54 ). La dose orale sans effet nocif observé était supérieure à 1,1 × 10¹¹ UCF/kg poids corporel chez les rats mâles albinos Wistar (Nithya et al., 2012). Les études présentées à l'appui de l'homologation des pesticides contenant la souche SB3086 de B. licheniformis comportaient une variété d'expositions dans des modèles mammaliens utilisés pour prévoir les effets nocifs chez les humains (annexe 11, Tableau A-53). Les études portant sur l'exposition par les voies orale, pulmonaire et intraveineuse avec la souche SB3086 de B. licheniformis ont révélé une faible toxicité, mais aucune pathogénicité chez les rats, et ce, aux doses maximales testées.

Des souris dont le système immunitaire avait été artificiellement affaibli (souris BALB/c traitées par voie intrapéritonéale avec de la cyclophosphamide à 0,2 mg/g poids corporel), ont reçu, par voie intraveineuse, moins de 1 × 10⁶ jusqu'à 6 × 10¹⁰ UFC par animal, d'isolats cliniques, environnementaux et alimentaires de B. licheniformis, dont la souche type ATCC 14580 (Agerholm et al., 1997; annexe 11, Tableau A-54). Malgré l'affaiblissement de leur système immunitaire, les souris ont pu éliminer de grandes quantités de bactéries dans un délai d'une semaine; l'espèce B. licheniformis a toutefois été récupérée dans le foie et la rate de la plupart des souris, ainsi que dans les reins de certaines souris une semaine après l'exposition. Certains des isolats testés ont entraîné des lésions pulmonaires et cérébrales. Les signes n'ont été observés que chez deux souris, et aucune mortalité attribuée au traitement n'a été signalée. Étant donné les doses élevées, l'absence de mortalité liée au traitement et la clairance de la plupart des bactéries des tissus, la pathogénicité de toutes les souches testées de B. licheniformis a été considérée comme faible chez les souris au système immunitaire affaibli.

Dans les études faites à Santé Canada, des souris femelles BALB/c ont été exposées à 10⁶ UFC/25 µL de cellules végétatives ou spores de la souche 12713 de B. licheniformis, administrées dans un volume de 25 µL par nébulisation endotrachéale, dans un modèle pour l'exposition humaine par voie pulmonaire. Les souris semblaient normales et n'ont pas présenté de symptômes après l'exposition aux cellules végétatives ou aux spores. Toutes les souris traitées ont été autopsiées 24 heures après l'exposition aux cellules végétatives ou une semaine après l'exposition aux spores, dans le but d'évaluer la clairance bactérienne, l'expression des cytokines pulmonaires et la réponse en phase aiguë (annexe 12, Tableau A-59 à Tableau A-63 ). Une réponse pro-inflammatoire statistiquement significative a été observée, et la concentration de certaines cytokines pulmonaires était élevée 24 heures après l'exposition aux cellules végétatives. Chez les cellules végétatives de la souche ATCC 12713 de B. licheniformis, une augmentation de la concentration d'amyloïde A sérique a été observée dans la réponse en phase aiguë par rapport aux témoins. Aucune donnée sur les cytokines pulmonaires ou l'amyloïde A sérique n'était disponible relativement à l'exposition aux spores de la souche ATCC 12713 de B. licheniformis.

Selon la littérature scientifique, l'espèce B. licheniformis a été impliquée dans des éclosions d'intoxication alimentaire (annexe 13). Les bactéries qui forment des endospores, comme B. licheniformis, et les substances toxiques résistant à la chaleur qu'elles produisent, peuvent résister à la pasteurisation et à d'autres procédés de transformation des produits laitiers, ainsi qu'aux températures de cuisson (Biesta-Peters et al., 2010; Nieminen et al., 2007). Pour qu'une dose toxique d'entérotoxines soit produite dans le lait ou d'autres aliments contaminés, on estime qu'il faut de 10⁵ à 10⁹ UFC/g (Cosentino et al., 1997; Griffiths, 1990; Logan, 2012; Lund, 1990;Rosenkvist et Hansen, 1995; Salkinoja-Salonen et al., 1999). Les symptômes d'intoxication alimentaire découlant de l'ingestion d'aliments contaminés par B.licheniformisapparaissent de 5 à 12 heures après la consommation (huit heures en moyenne).Les symptômes diarrhéiques de l'intoxication alimentaire à B. licheniformis ressemblent à ceux provoqués par les espèces Clostridium perfringens et B. cereus (Drobniewski, 1993; Kramer et Gilbert, 1989). La mort par suite d'une intoxication alimentaire liée à B. licheniformis a été signalée chez un nourrisson qui avait consommé du lait maternisé contaminé (Mikkola et al., 2000; Salkinoja-Salonen et al., 1999). Deux isolats de B. licheniformis provenant de ce lait se sont révélés toxigènes (Salkinoja-Salonen et al., 1999). Selon les rapports, la souche 14580 de B. licheniformis (souche type) est non toxigène (Pedersen et al., 2002). La production de toxines Hbl et Nhe par la souche ATCC 12713 de B. licheniformis inscrite à la Liste intérieurea été vérifiée à Santé Canada et, selon les observations, la souche ne produisait pas ces toxines diarrhéiques. La germination des spores et la croissance des Bacillus spp. dans le lait cru et dans d'autres aliments traités à la chaleur entraînent des « saveurs atypiques » et une mauvaise apparence, ce qui peut en dissuader la consommation et donc prévenir l'exposition (Abo-Elnaga et al., 2002; Davies et Wilkinson, 1973).

Le potentiel d'allergénicité et de toxicité de la glyphosate acétyltransférase produite par B. licheniformis et utilisée dans les herbicides a été évalué (Delaney et al., 2008). Les auteurs ont conclu que dans le contexte de la biotechnologie agricole, au moins, il ne devrait y avoir aucun effet nocif sur les humains et que le risque d'exposition humaine à la protéine est faible si elle est exprimée dans les plantes transgéniques. (Delaney et al., 2008). La sensibilité retardée au contact de la souche SB3086 de B. licheniformis a été évaluée chez les cobayes et on a conclu que la souche n'était pas un sensibilisant cutané. Il n'y a eu aucun signalement d'hypersensibilité ni d'allergénicité impliquant la souche ATCC 12713 de B. licheniformis inscrite à la Liste intérieure.

B. subtilis

Des bactériémies, des septicémies et d'autres infections liées à B. subtilis ont été signalées (De Boer et al., 1991; Drobniewski, 1993; Ihde et Armstrong, 1973; Logan, 1988; Murray et al., 1995; Olszewski et al., 1999; Pennington et al., 1976; Tuazon et al., 1979; Turnbull et al., 1979); toutefois, les infections causées par B. subtilis sont rares et impliquent des conditions prédisposantes, notamment l'immunodéficience, les maladies invalidantes et des barrières naturelles aux infections sérieusement compromises. Peu de cas d'infection et aucune mortalité attribuables à B. subtilis n'ont été déclarés depuis 1980.

Une bactériémie liée à B. subtilis a été signalée chez des patients atteints d'un cancer (Banerjee et al., 1988). Une bactériémie nosocomiale provoquée par B. subtilis a été signalée chez quatre patients sur huit qui avaient des conditions sous-jacentes (cancer, traumatisme crânien ou chirurgie récente) et qui ont reçu un probiotique contenant des spores de B. subtilis (109 spores par comprimé) [Richard et al., 1988]. Une septicémie liée à B. subtilis a été signalée chez un jeune enfant(Cox et al., 1959) et chez des patients hospitalisés qui avaient des lignes intraveineuses (Matsumoto et al., 2000).

B. subtilis a été impliqué dans un cas de cellulite qui s'est transformé en fasciite nécrosante chez un patient atteint d'un cancer (Tuazon et al., 1979). Des infections, dans lesquelles B. subtilis était l'agent étiologique ou un contaminant d'instruments médicaux à demeure ont été signalées (Ihde et Armstrong, 1973; Schoenbaum et al., 1975). Chez certains, les infections à B. subtilis ont été mortelles (Ihde et Armstrong, 1973; Pennington et al., 1976; Tuazon et al., 1979). Dans ces cas-là, les patients présentaient de graves comorbidités et dans certains cas, on pensait que B. subtilis était un contaminant et que son rôle en tant qu'agent causal n'a pas été pris en compte.

Les études présentées à l'appui de l'homologation des pesticides contenant les souches QST 713 et MBI 600 de B. subtilis comportaient une variété d'expositions dans des modèles mammaliens standards utilisés pour prévoir les effets nocifs chez les humains (annexe 11, Tableau A-56 et Tableau A-57 ). Les études portant sur l'exposition par les voies orale, pulmonaire et intraveineuse aux souches QST 713 et MBI 600 de B. licheniformis ont révélé une faible toxicité et aucune pathogénicité chez les rats CD, et ce, même aux doses maximales.

Dans les études menées à Santé Canada, des souris femelles BALB/c ont été exposées à 10⁶ UFC de cellules végétatives ou de spores des souches ATCC 6051A de B. subtilis, ATCC 55405 de B. subtilis, ATCC 6051 de B. subtilis sous-espèce subtilis et ATCC 55406 de B. subtilis sous-espèce inaquosorum, administrées dans un volume de 25 µL par nébulisation endotrachéale, dans un modèle pour l'exposition humaine par voie pulmonaire. Les souris semblaient normales et n'ont pas présenté de symptômes après l'exposition aux cellules végétatives ou aux spores. Toutes les souris traitées ont été autopsiées 24 heures après l'exposition aux cellules végétatives ou une semaine après l'exposition aux spores, dans le but d'évaluer la clairance bactérienne, l'expression des cytokines pulmonaires et la réponse en phase aiguë (annexe 12, Tableau A-59 à Tableau A-63 ). Les cellules végétatives et les spores ont été dénombrées dans les poumons, la trachée et l'œsophage. Des changements dans les concentrations de cytokines et d'amyloïde A sérique au cours de la réponse en phase aiguë n'ont été observés qu'avec les cellules végétatives de la souche ATCC 55406 de B. subtilis sous-espèce inaquosorum.

Les bactéries formant des endospores, comme les espèces du genre Bacillus, et les substances toxiques résistant à la chaleur qu'elles produisent, peuvent résister à la pasteurisation et à d'autres procédés de transformation des produits laitiers (Nieminen et al., 2007). La prolifération de ces micro-organismes dans les aliments représente un risque potentiel d'intoxication alimentaire (Beattie et Williams, 1999). Après avoir consommé des aliments contenant de fortes charges bactériennes (10⁵ - 10⁹UFC/g), les symptômes d'intoxication alimentaire provoquée par B. subtilis peuvent apparaître dans un délai de 10 minutes à 14 heures (2,5 heures en moyenne) avec des vomissements importants (Rosenkvist et Hansen, 1995; Logan, 2012). Les aliments en cause sont souvent des plats à base de viande, de fruits de mer, de pâtisserie et de riz. Des intoxications alimentaires liées à B. subtilis ont également été associées à la consommation de pain moisi (filant) dans lequel la concentration de B. Subtilis était d'environ 10⁸ UFC/g. Les maladies d'origine alimentaire liées au pain filant sont peu probables étant donné l'apparence non attrayante du pain (décoloré, collant et miettes molles) résultat du grand nombre de cellules présentes qui dégradent l'amidon et les protéines (Rosenkvist et Hansen, 1995; Logan, 2012; Lund, 1990). La production de toxines Hbl et Nhe des souches ATCC 6051A de B. subtilis, ATCC 55405 de B. subtilis, ATCC 6051 de B. subtilis sous-espèce subtilis et ATCC 55406 de B. subtilissous-espèce inaquosorum inscrites à la Liste intérieure a été vérifiée par Santé Canada et, selon les observations, elles ne produisaient pas ces toxines diarrhéiques.

Dans un article récent, des dommages au foie ont été signalés chez des patients qui avaient consommé des suppléments nutritifs contenant B. subtilis (Logan, 2012). Plus tard, il a été démontré dans un essai sur culture de cellules Hep2G que la souche était hépatotoxique. Plusieurs souches de B. subtilis ont été testées chez les rats et d'autres vertébrés et aucun effet nocif n'a été observé.

Aucun incident d'hypersensibilité n'a été déclaré pendant les essais, la production ou la manipulation des souches QST 713 ou MBI 600 de B. subtilis (Agence de réglementation de la lutte antiparasitaire de Santé Canada, 2007b; Agence de réglementation de la lutte antiparasitaire de Santé Canada, 2007c).La souche MBI 600 de B. subtilis s'est révélée un sensibilisant cutané modéré 24 à 72 heures après l'administration (Agence de réglementation de la lutte antiparasitaire de Santé Canada, 2007c; USEPA, 2012). B. subtilis produit des exo-enzymes qui facilitent la décomposition de la matière organique (Tjalsma et al., 2004). Les subtilisines sont des enzymes protéolytiques produites par B. subtilis qui sont connues pour provoquer des réactions allergiques, comme des dermatites et des allergies respiratoires chez les humains après des expositions répétées (Juniper et al., 1977; Norris et al., 1981; Schweigert et al., 2000; Thorne et al., 1986; Tripathi et Grammer, 2001; Weissman et Lewis, 2002). Il a été montré que B. subtilis produit des enzymes causant des symptômes associés à l'allergénicité, notamment l'asthme et l'irritation (Flindt et Hendrick, 2002).

Souches maquillées de Bacillus inscrites à la Liste intérieure

Dans les études faites à Santé Canada, des souris femelles BALB/c ont été exposées à 10⁶ UFC de cellules végétatives ou de spores des espèces Bacillus 16970-5, Bacillus 2 18118-1, Bacillus 4 18121-4 et Bacillus 7 18129-3, administrées dans un volume de 25 µL par nébulisation endotrachéale, dans un modèle pour l'exposition humaine par voie pulmonaire. Les souris semblaient normales et n'ont pas présenté de symptômes après exposition aux cellules végétatives ou aux spores. Toutes les souris traitées ont été autopsiées 24 heures après l'exposition aux cellules végétatives ou une semaine après l'exposition aux spores, dans le but d'évaluer la clairance bactérienne, l'expression des cytokines pulmonaires et la réponse en phase aiguë (annexe 12, Tableau A-59 à Tableau A-63 ). Les cellules végétatives et les spores ont été dénombrées dans les poumons, la trachée et l'œsophage. Des changements dans la concentration des cytokines après l'exposition aux cellules végétatives et aux spores des espèces Bacillus 16970-5, Bacillus 2 18118-1 et Bacillus 4 18121-4 ont été observés. L'espèce Bacillus 7 18129-3 n'a pas été testée. Des changements dans la concentration des cytokines et de l'amyloïde A sérique au cours de la réponse en phase aiguë n'ont été déclarés que pour les cellules végétatives des espèces Bacillus 16970-5, Bacillus 2 18118-1 et Bacillus 4 18121-4 et pour les spores des espèces Bacillus 16970-5 et Bacillus 2 18118-1.

1.2 Gravité du danger

Une exposition régulière aux membres du complexe B. subtilis se produit en raison de leur présence généralisée dans l'environnement (Murray et al., 1995). On retrouve les souches dans des particules de poussière qui peuvent être inhalées (Andersson et al., 1999). Un contact cutané peut se produire, compte tenu du fait que les souches sont couramment présentes dans les sols et sur la plupart des surfaces (Logan et De Vos, 2009; Murray et al., 1995; Thatoi et al., 2013). Malgré la forte exposition naturelle à ces micro-organismes, le taux d'infections signalées est faible (Rooney, communication personnelle). En outre, les membres du complexe B. subtilis ont déjà été utilisés dans la lutte biologique, la promotion de la croissance et en tant que probiotiques, des utilisations qui entraînent toutes une exposition directe des humains et des espèces environnementales, sans que des effets nocifs n'aient été déclarés. Enfin, les souches inscrites à la Liste intérieure sont largement utilisées dans une variété de secteurs au Canada (consulter la section 2.1 Sources d'exposition) et aucun effet nocif n'a été signalé en association avec ces utilisations.

1.2.1 Danger pour l'environnement

1.2.1.1 B. amyloliquefaciens

Le danger que présente la souche 13563-0 de B. amyloliquefaciens pour l'environnement est considéré comme faible, étant donné que la littérature scientifique ne révèle aucun signalement d'infection ou d'effet nocif chez les vertébrés, les invertébrés et les plantes terrestres et aquatiques. Les tests faits sur des vertébrés et des invertébrés terrestres et aquatiques avec les souches de B. amyloliquefaciens utilisées dans des pesticides indiquent un faible pouvoir pathogène ou toxique. Les résultats des essais réalisés par les scientifiques de Santé Canada dans des modèles murins et des lignées cellulaires montrent que le pouvoir pathogène de B. amyloliquefaciens 13563-0 est faible. Par le passé, l'utilisation de la souche B. amyloliquefaciens 13563-0 et des souches B. amyloliquefaciens employées dans les pesticides s'est avérée sécuritaire.

1.2.1.2 B. atrophaeus

Le danger que présente la souche 18250-7 de B. atrophaeus pour l'environnement est considéré comme faible, étant donné que les renseignements provenant de la littérature scientifique indiquent que B. atrophaeus présente un faible potentiel toxique et pathogène pour les vertébrés, les invertébrés et les plantes terrestres et aquatiques et qu'aucun effet nocif n'a été signalé. Les essais faits par les scientifiques de Santé Canada dans des modèles murins et des lignées cellulaires montrent que le pouvoir pathogène de B. atrophaeus 18250-7 est faible

1.2.1.3 B. licheniformis

Le danger que présente la souche ATCC 12713 de B. licheniformis pour l'environnement est considéré comme faible, étant donné que les renseignements provenant de la littérature scientifique indiquent que le pouvoir pathogène de B. licheniformis est faible pour les plantes ou les invertébrés terrestres et aquatiques. Même si B. licheniformis peut entraîner des avortements dans les milieux agricoles, ceux-ci sont rares, et dans les conditions expérimentales, les doses requises pour que l'infection s'établisse dans le placenta bovin étaient élevées et donnaient lieu à des concentrations de bactéries dans le sang qui étaient plus élevées que celles auxquelles on s'attendrait au cours d'une infection dans des conditions naturelles. Dans le cas improbable d'une infection, il existe des antibiotiques d'usage vétérinaire efficaces contre B. licheniformis ATCC 12713. Cette souche a d'ailleurs été utilisée comme probiotique chez les artémies, la truite arc-en-ciel, les porcs et les poulets, sans effet nocif déclaré. Les essais faits par les scientifiques de Santé Canada dans des modèles murins et des lignées cellulaires montrent que le pouvoir pathogène de B. licheniformis ATCC 12713 est faible (comme celui des espèces de Bacillus évaluées dans ce rapport).

1.2.1.4 B. subtilis

Le danger pour l'environnement que présentent les souches ATCC 6051A de B. subtilis, ATCC 55405 de B. subtilis, ATCC 6051 de B. subtilis sous-espèce subtilis et ATCC 55406 de B. subtilissous-espèce inaquosorum est considéré comme faible, étant donné que les renseignements provenant de la littérature scientifique concernant l'espèce B. subtilis indiquent un faible pouvoir toxique et pathogène pour les vertébrés, les invertébrés et les plantes terrestres et aquatiques. Toutefois, certains effets nocifs ont été signalés après une exposition à des concentrations élevées d'autres souches de B. subtilis. Les essais faits avec les souches de B. subtilis utilisées dans les pesticides sur les vertébrés et les invertébrés terrestres et aquatiques indiquent généralement un faible pouvoir pathogène ou toxique, bien que certains effets aient été observés chez des invertébrés terrestres et aquatiques. Dans les essais réalisés par les scientifiques d'Environnement Canada, des réductions importantes de la longueur moyenne des pousses des plantes terrestres et de la production de juvéniles chez les arthropodes terrestres ont été constatées à la suite d'une exposition aux souches ATCC 6051A de B. subtilis et ATCC 55405 de B. subtilis. Les essais faits par les scientifiques de Santé Canada dans des modèles murins et des lignées cellulaires montrent que le pouvoir pathogène des souches suivantes est faible : souche ATCC 6051A de B. subtilis, souche ATCC 55405 de B. subtilis, souche ATCC 6051 de B. subtilis sous-espèce subtilis et la souche ATCC 55406 de B. subtilissous-espèce inaquosorum. Par le passé, l'utilisation de toutes les souches de B. subtilis de la Liste intérieure s'est avérée sécuritaire.

1.2.1.5 Souches maquillées de Bacillus inscrites à la Liste intérieure

Le danger que présentent les espèces Bacillus16970-5, Bacillus 2 18118-1, Bacillus 4 18121-4 et Bacillus 7 18129-3 pour l'environnement est considéré comme faible, étant donné le faible pouvoir pathogène mis en évidence par les essais effectués par les scientifiques de Santé Canada sur des modèles murins et des lignées cellulaires. Par le passé, l'utilisation de toutes les souches maquillées de B. subtilis de la Liste intérieure s'est avérée sécuritaire.

1.2.2 Danger pour la santé humaine

1.2.2.1 B. amyloliquefaciens

Le danger que présente la souche 13563-0 de B. amyloliquefaciens pour la santé humaine est considéré comme faible, étant donné que les renseignements provenant des ouvrages scientifiques indiquent un faible pouvoir pathogène et qu'aucun cas d'infection n'a été signalé. Les essais faits avec les souches de B. amyloliquefaciens utilisées dans les pesticides sur des modèles d'infection chez l'humain révèlent un faible pouvoir pathogène ou toxique. Les essais faits par les scientifiques de Santé Canada dans des modèles murins et des lignées cellulaires montrent que le pouvoir pathogène de la souche 13563-0 de B. amyloliquefaciens est faible. Les tests de sensibilité aux antibiotiques faits par les scientifiques de Santé Canada montrent que les antibiotiques pertinents sur le plan clinique sont efficaces contre cette souche. Par le passé, l'utilisation de la souche 13563-0 de B. amyloliquefaciens s'est avérée sécuritaire.

1.2.2.2 B. atrophaeus

Le danger que présente la souche 18250-7 de B. atrophaeus pour la santé humaine est considéré comme faible parce que les données publiées dans la littérature scientifique révèlent un faible pouvoir pathogène et qu'aucun cas d'infection n'a été signalé. Les essais faits par les scientifiques de Santé Canada dans des modèles murins et des lignées cellulaires montrent que le pouvoir pathogène de la souche 18250-7 de B. atrophaeus est faible. Les tests de sensibilité aux antibiotiques faits par les scientifiques de Santé Canada montrent que les antibiotiques pertinents sur le plan clinique sont efficaces contre cette souche. Par le passé, l'utilisation de la souche 18250-7 de B. atrophaeus s'est avérée sécuritaire.

1.2.2.3. B. licheniformis

Le danger que présente la souche ATCC 12713 de B. licheniformis pour la santé humaine est considéré comme faible parce que les renseignements provenant de la littérature scientifique indiquent un certain pouvoir pathogène; toutefois, les rapports de cas sont rares et sont principalement observés chez des personnes ayant un système immunitaire affaibli, une maladie invalidante ou des personnes chez lesquelles les barrières normales aux infections sont brisées par des appareils médicaux implantés ou des blessures. Dans un cas, une septicémie récurrente a été signalée chez une personne qui ne présentait aucune prédisposition connue et qui s'est complètement rétablie. Les essais faits par les scientifiques de Santé Canada dans des modèles murins et des lignées cellulaires montrent que le pouvoir pathogène de la souche ATCC 12713 de B. licheniformis est faible (ce qui concorde avec les résultats obtenus pour les autres souches évaluées) et aucune toxicité ou pathogénicité n'a été observée. Une intoxication alimentaire associée à B. licheniformis a été signalée, mais dans les essais réalisés par les scientifiques de Santé Canada, la souche inscrite à la Liste intérieure n'a pas produit de toxines analogues à celles produites par B. cereus. Par ailleurs, des facteurs d'atténuation tels que des saveurs atypiques et l'apparence décourageraient probablement la consommation d'aliments contaminés. Par le passé, l'utilisation de la souche ATCC 12713 de B. licheniformis s'est avérée sécuritaire.

Les tests de sensibilité aux antibiotiques faits par les scientifiques de Santé Canada ont d'abord montré que la souche ATCC 12713 de B. licheniformis était résistante à beaucoup des antibiotiques contre lesquels elle avait été testée (existence de critères d'interprétation pour la plupart de ces antibiotiques, à l'exception de la tétracycline et de la rifampicine); toutefois, après une étude plus poussée, il a été conclu que la résistance apparente élevée observée était un artéfact de l'essai sur la concentration minimale inhibitrice mesurée en milieu liquide. La réinterprétation des données avec un seuil d'activité de bioréduction de 95 % a permis de conclure que le profil de sensibilité concorde aux valeurs figurant dans les ouvrages scientifiques portant sur l'espèce. Dans le cas de la vancomycine, cela a été confirmé avec une méthode commerciale utilisant des bandelettes diagnostiques.

1.2.2.4 B. subtilis

Le danger pour la santé humaine que présentent les souches ATCC 6051A de B. subtilis, ATCC 55405 de B. subtilis, ATCC 6051 de B. subtilissous-espèce subtilis et ATCC 55406 de B. subtilis sous-espèce inaquosorum est considéré comme faible, étant donné que les renseignements provenant de la littérature scientifique indiquent un certain pouvoir pathogène chez les personnes ayant une immunité compromise ou dont les barrières normales aux infections sont brisées. Toutefois, le nombre de signalements est limité et la plupart des cas signalés l'ont été avant les années 1980. Aucun décès n'a été déclaré depuis ce temps. Les essais faits par les scientifiques de Santé Canada dans des modèles murins et des lignées cellulaires montrent que le pouvoir pathogène des souches ATCC 6051A de B. subtilis, ATCC 55405 de B. subtilis, ATCC 6051 de B. subtilis sous-espèce subtilis et ATCC 55406 de B. subtilissous-espèce inaquosorum est faible. Bien qu'une intoxication alimentaire associée à l'espèce B. subtilis ait été déclarée, dans les essais réalisés par les scientifiques de Santé Canada, les souches inscrites à la Liste intérieure n'ont pas produit de toxines analogues à celles de B. cereus. Par ailleurs, des facteurs d'atténuation tels que les saveurs atypiques et l'apparence décourageraient probablement la consommation d'aliments contaminés. Dans les modèles d'infection humaine, les essais faits avec les souches de B. subtilis utilisées dans les pesticides indiquent un faible pouvoir pathogène ou toxique. Par le passé, l'utilisation des souches figurant dans la Liste intérieure s'est avérée sécuritaire.

1.2.2.5 Souches de Bacillus maquillées inscrites à la Liste intérieure des substances

Le danger que présentent les espèces Bacillus16970-5, Bacillus 2 18118-1, Bacillus 4 18121-4 et Bacillus 7 18129-3 pour la santé humaine est considéré comme faible, étant donné que les essais faits par les scientifiques de Santé Canada dans des modèles murins et des lignées cellulaires montrent que le pouvoir pathogène de ces souches est faible. Par le passé, l'utilisation des souches maquillées de Bacillus inscrites à la Liste intérieure s'est avérée sécuritaire.

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2. Évaluation de l'exposition

2.1 Sources d'exposition

Cette évaluation porte sur l'exposition aux souches du groupe B. licheniformis/subtilis inscrites à la Liste intérieure par suite de leur ajout à des produits commerciaux ou de consommation et de leur utilisation dans les procédés industriels au Canada.

Les souches du groupe B. licheniformis/subtilis ont été inscrites sur la Liste intérieure en raison de leur utilisation dans des produits commerciaux et de consommation, dont des produits pour nettoyer et désodoriser, des produits de nettoyage et de dégraissage de canalisations, de traitement des fosses septiques et des réservoirs de véhicules récréatifs, de même que dans des produits employés pour la biorestauration et la biodégradation, le traitement des déchets solides et des eaux usées ainsi que l'adoucissement de l'eau.

Les réponses à un questionnaire volontaire envoyé en 2007 à un sous-ensemble d'entreprises de biotechnologie clés, combinées aux renseignements obtenus d'autres programmes fédéraux de réglementation ou autres, indiquent que les souches du groupe B. licheniformis/subtilis inscrites à la Liste intérieure étaient utilisées dans le commerce en 2006. Aucune information sur les utilisations de B. atrophaeusn'a été recueillie à ce moment-là, puisque cette espèce a été inscrite à la Liste intérieure après la tenue de l'enquête.

Le gouvernement a mené une enquête de collecte obligatoire de renseignements (Avis) en vertu de l'article 71 de la LCPE (1999), qui a été publiée dans la Partie I de la Gazette du Canada, le 3 octobre 2009 (Avis en vertu de l'article 71) . L'Avis en vertu de l'article 71 s'appliquait à toute personne qui, au cours de l'année civile 2008, avait fabriqué ou importé des souches du groupe B. licheniformis/subtilis inscrites sur la Liste intérieure, seules, dans un mélange ou dans un produit. Une activité commerciale ou de consommation a été déclarée pour ces micro-organismes dans une variété de secteurs différents (pour connaître les quantités et les concentrations, consultez le Tableau 2-1 ). Parmi les utilisations déclarées concernant les membres du groupe B. licheniformis/subtilisinscrits à la Liste intérieure, on trouve les suivantes : biodégradation; traitement biologique des déchets; biorestauration; produits de nettoyage à usage professionnel ou autres produits connexes; nettoyage et dégraissage des canalisations; production de fragrance, parfum ou désodorisant; d'enzymes ou de produits chimiques; recherche et développement; additifs pour les fosses septiques et pour les réservoirs de véhicules récréatifs et traitement des déchets solides et des eaux usées. Aucune information sur les utilisations de B. atrophaeus n'a été recueillie par l'intermédiaire de l'Avis en vertu de l'article 71, puisque cette espèce a été inscrite à la Liste des substances intérieure après la tenue de l'enquête.

Tableau 2-1. Quantités déclarées des souches du groupe *B. licheniformis/subtilis* inscrites à la *Liste intérieure* importées ou fabriquées au Canada en 2009^{Note de bas de page Tableau 2-1[a]}
Espèce^{Note de bas de page Tableau 2-1[b]}	Plage de quantités totales^{Note de bas de page Tableau 2-1[c]}(kg)	Plage de concentrations^{Note de bas de page Tableau 2-1[d]}(UFC/mL)
Bacillus amyloliquefaciens	De 10 000 à 100 000	de 2,0 × 10⁸ à 1,0 × 10¹⁰
Bacillus licheniformis	de 100 000 à 1 000 000	de 4,0 × 10⁶ à 1,0 × 10¹⁰
Bacillus subtilis^{Note de bas de page Tableau 2-1[e]}	de 100 000 à 1 000 000	de 1,0 × 10⁵ à 1,0 × 10¹⁰

Notes de bas de page a.9

Aucune information sur les utilisations de la souche B. atrophaeus n'a été recueillie par l'entremise de l'avis, car elle a été inscrite à la Liste intérieure une fois que le sondage a eu lieu.

Retour à la référence de la note de bas de pagea.9

Notes de bas de page b.9

Comprend toutes les souches de l'espèce inscrites à la Liste intérieure

Retour à la référence de la note de bas de pageb.9

Notes de bas de page c.8

Quantité combinée de tous les produits contenant les micro-organismes fabriqués ou importés au Canada

Retour à la référence de la note de bas de pagec.8

Notes de bas de page d.8

Plage de concentrations des micro-organismes dont l'importation ou la fabrication a été déclarée au Canada

Retour à la référence de la note de bas de paged.8

Notes de bas de page e.7

Comprend la souche ATCC 55406 de B. subtilis sous-espèce inaquosorum

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Une recherche du domaine public (Internet, base de données sur les brevets, fiches signalétiques, etc.) révèle une multitude d'utilisations potentielles du complexe B. subtilis, y compris les souches du groupe B. licheniformis/subtilis inscrit à la Liste intérieure.

B. amyloliquefaciens

En tant que micro-organisme produisant des enzymes (p. ex. amylases, isoprènes, protéases, protéine non structurelle 3, ribonucléases et phytases), biosurfacants, antibiotiques et détergents destinés à des applications industrielles et commerciales (Madslien et al., 2012) y compris des applications de nettoyage, de dégraissage et des utilisations antibactériennes (ATCC, 2012c; James et al., 1995; Madslien et al., 2012; Moons et al., 2009; Pérez-García et al., 2011; Rendueles et Ghigo, 2012; Rivardo et al., 2009).
Applications aux surfaces pour favoriser la formation d'un biofilm à base de B. amyloliquefaciens afin de déplacer des micro-organismes indésirables ou inconnus (James et al., 1995; Moons et al., 2009; Rendueles et Ghigo 2012; Rivardo et al., 2009).
Application dans un mélange avec d'autres espèces bactériennes dans le cadre du traitement de l'eau et des eaux usées pour traiter les efflorescences algales, les odeurs et l'accumulation de boue (Advanced Water Technologies, 2012; RoeTech, 2014).

B. atrophaeus

Utilisation de spores en tant que substitut de B. anthracis (utilisé comme arme) dans la mise au point de l'équipement de surveillance de défense et en tant qu'agent de provocation (Blecka et al., 2012; Carrera et al., 2007; Grinshpun et al., 2012; Page et al. 2007; USEPA 2013a).
Utilisation de spores pour tester l'efficacité de la stérilisation à la chaleur sèche et à l'oxyde d'éthylène, ainsi que la stérilisation à la vapeur, dans le cadre de l'assurance et du contrôle de la qualité dans la production de produits pharmaceutiques et produits d'hygiène et de beauté (ATCC, 2012d).
Modélisation de la transmission d'agents pathogènes (Gerhardts et al., 2012).

B. licheniformis

En tant qu'organisme produisant des enzymes et des biosurfactants, notamment l'alpha-amylase, la lichénysine, les pentosanases, la désoxyribonucléase (NucB), la nitroréductase et la lévansucrase (ATCC, 2013; Komolprasert et Ofoli, 1991; Moons et al., 2009; Nerurkar, 2010; Rendueles et Ghigo, 2012; Rey et al., 2004; Rivardo et al., 2009; Thatoi et al., 2013; Yakimov et Golyshin, 1997).
Biosynthèse de nanocristaux d'argent (Kalimuthu et al., 2008) et de nanocubes d'or (Kalishwaralal et al., 2009).
Dégradation des déchets de plumes produits par les fermes avicoles et les établissements de transformation (Ichida et al., 2001).
Biorestauration des métaux lourds (p. ex. zinc, cadmium et aluminium) [Kamika et Momba, 2013].
Traitement de l'eau et des eaux usées pour réduire les efflorescences algales, les odeurs et l'accumulation de boues (Advanced Water Technologies, 2012).
Bioindicateur de la toxicité des élutriats de sédiments (Campbell et al., 1993).
Formation de biofilms utiles (James et al., 1995; Moons et al., 2009; Rendueles et Ghigo, 2012; Rivardo et al., 2009).
Dans les produits probiotiques pour les humains et les animaux (Cutting, 2011; Nithya et al., 2012).

B. subtilis

En tant qu'organisme produisant des lipopeptides (biosurfactants), des enzymes (p. ex. amylase, protéase) ainsi que des composés antibiotiques (p. ex. aterrimin)et isoprène (ATCC, 2012b; ATCC, 2012f; Moons et al., 2009; Rendueles et Ghigo, 2012; Rivardo et al., 2009; Thatoi et al., 2013).
Traitement de l'eau et des eaux usées pour réduire les efflorescences algales, les odeurs, l'accumulation de boue, les fosses septiques et les fosses de déchets agricoles (Advanced Water Technologies, 2012; RoeTech, 2014).
Fermentation d'aliments traditionnels (Inatsu et al., 2006; Leejeerajumnean, 2003).
Formation de biofilms utiles (James et al., 1995; Moons et al., 2009; Rendueles et Ghigo, 2012; Rivardo et al., 2009).
Utilisation de spores pour tester l'assurance en matière de stérilité ainsi que dans la résistance bactérienne de la peinture au latex (ATCC, 2012f).
Applications dans la recherche en tant qu'hôte bactériophage (ATCC, 2012f).
Applications dans les diagnostics dans le cadre du dépistage sanguin pour la phénylcétonurie (ATCC, 2012f).
Application dans la production d'aliments complémentaires (ATCC, 2012a).
Dans les produits probiotiques pour les humains et les animaux (Cutting, 2011).

2.2 Caractérisation de l'exposition

2.2.1 Environnement

2.2.1.1 B. atrophaeus

L'exposition environnementale à la souche 18250-7 de B. atrophaeus est possible pour les espèces terrestres et, dans une moindre mesure, pour les espèces aquatiques, lors de son utilisation dans l'environnement comme substitut de B. anthracis dans la modélisation de la dispersion et la mise au point d'équipement de surveillance militaire. L'ampleur de l'exposition dépendra de la méthode de libération des bactéries, du volume libéré, des conditions météorologiques et de la vitesse du vent. En général, on s'attend à ce que l'exposition soit faible concernant ces applications, car il s'agit d'une activité spécialisée au Canada qui se fait à un seul endroit éloigné. L'inhalation constituerait la principale voie d'exposition. L'exposition résultant d'un contact cutané avec des surfaces contaminées et de l'ingestion fortuite provoquée par la contamination secondaire de ressources alimentaires devrait être faible. L'exposition générale de l'environnement à la souche 18250-7 de B. atrophaeus est considérée comme faible.

2.2.1.2 Souches de B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. subtilis et souches maquillées de Bacillusinscrites à la Liste intérieure

L'exposition de l'environnement aux autres souches de B. licheniformis/subtilis inscrites à la Liste intérieure sera considérée dans son ensemble, étant donné que les utilisations connues et potentielles sont semblables.

Les membres du complexe B. subtilis ont la capacité de s'adapter à plusieurs habitats terrestres et aquatiques et d'y prospérer. De nombreuses variations physiologiques existent dans la nature, ce qui permet à ce complexe de se développer fortement dans presque tous les environnements. Malgré la répartition généralisée du complexe d'espèces, des données révèlent un déclin des populations inoculées (de façon artificielle) dans des microcosmes du sol et des milieux marins (Medina et al., 2003; Nybroe et al., 1992). Il est peu probable que de grandes quantités de cellules végétatives restent dans l'eau ou dans le sol en raison de la concurrence pour les éléments nutritifs (Leung et al., 1995) et de la microbiostase, qui est un effet inhibiteur du sol, ce qui entraîne une diminution rapide des populations de bactéries introduites (Van Veen et al., 1997).

Afin d'estimer les concentrations environnementales escomptées à partir des applications prévues, des études sur la biorestauration et le traitement des eaux usées ont été explorées. Un mélange d'espèces de Bacillus, telles que B. amyloliquefaciens et B. subtilis(jusqu'à 10¹¹ UFC/g), a été ajouté pour traiter des eaux usées municipales à raison de 7,5 ppm (RoeTech, 2014), entraînant alors une concentration allant jusqu'à 7,5 × 10⁵ UFC/mL dans les eaux usées traitées. Dans une étude de validation du principe à l'échelle du laboratoire, 1,5 × 10⁹ cellules d'une souche de B. subtilis ont été ajoutées à 60 g de sol contaminé par des hydrocarbures pétroliers de manière à ce que la concentration finale soit de 2,5 × 10⁷ cellules par gramme (Wu et al., 2013). Il est peu probable que ces concentrations restent dans l'effluent d'eaux usées ou dans les sols, car les cellules végétatives des souches de B. licheniformis/subtilis inscrites à la Liste intérieure n'ont pas d'avantage concurrentiel sur les populations de micro-organismes semblables naturellement présentes et elles seraient confrontées à une concurrence pour les éléments nutritifs avec la flore indigène. Les populations de cellules végétatives des souches de B. licheniformis/subtilis inscrites à la Liste intérieure introduites dans le sol et dans l'eau diminueront probablement jusqu'à atteindre des concentrations de fond avec le temps. Dans des conditions sous-optimales, les spores des souches de B. licheniformis/subtilis inscrites à la Liste intérieure devraient persister et s'accumuler dans l'environnement.

L'exposition aux souches de la Liste intérieure devrait être plus importante pour les organismes situés à proximité du lieu d'application des souches, que ce soit dans les écosystèmes aquatiques aux fins de traitement de l'eau (p. ex. aquariums et étangs) ou dans les sols aux fins de biorestauration des contaminants.

L'exposition indirecte des espèces environnementales découlant de l'utilisation et de l'élimination des produits de nettoyage devrait être faible par rapport aux applications directes dans des écosystèmes aquatiques ou des sols. L'accroissement du nombre de produits microbiens « plus écologiques » sur le marché peut toutefois augmenter ces expositions (Spök et Klade, 2009).

On n'a trouvé aucun rapport pertinent sur la persistance des toxines produites par les souches du complexe B. subtilisdans l'environnement après avoir effectué une recherche exhaustive dans les ouvrages scientifiques de nombreuses sources.

D'après la grande variété d'utilisations déclarées en réponse à l'Avis, l'exposition environnementale aux autres souches de B. licheniformis/subtilis inscrites à la Liste intérieure devrait être moyenne.

2.2.2 Humains

2.2.2.1 B. atrophaeus

Une exposition humaine fortuite à la souche 18250-7 de B. atrophaeus est possible lors de son utilisation dans l'environnement comme substitut de B. anthracis dans la modélisation de la dispersion et dans la mise au point d'équipement de surveillance militaire. L'ampleur de l'exposition dépendra de la méthode de libération des bactéries, du volume libéré, des conditions météorologiques, de la vitesse du vent et de la proximité des tierces personnes au site d'application. En général, on s'attend à ce que l'exposition soit faible pour ces applications, car il s'agit d'une activité spécialisée au Canada qui se fait à un seul endroit éloigné. L'inhalation constituerait la principale voie d'exposition. L'exposition découlant d'un contact cutané avec des surfaces contaminées et d'une ingestion fortuite créée par la contamination secondaire de produits alimentaires devrait être faible. L'exposition humaine générale concernant la souche 18250-7 de B. atrophaeusest considérée comme faible.

2.2.2.2 Souches de B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. subtilis et de Bacillus maquillées inscrites à la Liste intérieure

L'exposition humaine aux autres souches de B. licheniformis/subtilis inscrites à la Liste intérieure sera considérée dans son ensemble, étant donné que les utilisations connues et potentielles sont semblables.

L'exposition humaine devrait être plus importante à la suite de l'utilisation directe de produits de consommation contenant des spores ou des cellules viables utilisés pour le nettoyage ou le traitement de l'eau. On s'attend à ce que la manipulation et l'application de ces produits entraînent directe de la peau et l'inhalation de gouttelettes pulvérisées ou de spores soulevées dans l'air. L'ingestion fortuite se produisant après une utilisation sur des surfaces de préparation alimentaire, ou près de ces dernières, et après un contact avec les yeux, constitue une voie d'exposition secondaire possible.

Les humains peuvent également être exposés en tant que tierces personnes pendant l'application commerciale de produits de nettoyage, de traitement de l'eau, de produits agricoles ou de biodégradation. Le degré d'exposition fortuite dépendra du mode d'application, du volume appliqué et de la proximité des tierces personnes par rapport au lieu de l'application. En général, l'exposition devrait être faible pour ces applications.

L'exposition humaine indirecte aux souches du groupe B. licheniformis/subtilis inscrites à la Liste intérieure, rejetées dans l'environnement après leur utilisation dans le traitement de l'eau, les applications agricoles ou la biodégradation, devrait également se produire à proximité des sites traités, mais devrait être moins importante que l'exposition directe découlant de l'utilisation de ces organismes dans les produits de consommation. L'exposition humaine à des plans d'eau et à des sols traités avec les souches de B. licheniformis/subtilis inscrites à la Liste intérieure (p. ex. par l'entremise d'activités récréatives) pourrait également conduire à l'exposition de la peau et des yeux, ainsi qu'à ingestion fortuite; toutefois, la dilution de ces produits devrait réduire de façon importante l'exposition pour ce qui est des scénarios d'applications ménagères. L'activité humaine sur les sols récemment traités avec les souches de B. licheniformis/subtilis inscrites à la Liste intérieure pourrait soulever les spores dans l'air, qui pourraient alors être inhalées et exposer la peau et les yeux. Cette exposition devrait également être faible par rapport à l'utilisation directe de produits de consommation.

Le rejet des souches du groupe B. subtilis/licheniformis inscrites à la Liste intérieure à partir des installations fabriquant des enzymes ou des produits chimiques biologiques est possible; ce rejet devrait toutefois être limité par l'application de bonnes pratiques de fabrication, dans le cadre desquelles des mesures devraient être prises pour minimiser la probabilité de rejet de micro-organismes de production.

Dans le cas des utilisations de prébiotiques et de probiotiques contenant des spores des souches B. amyloliquefaciens, B. licheniformis et B. subtilis, l'exposition directe se ferait principalement par ingestion orale. Une exposition indirecte pourrait se produire à la suite de l'élimination des probiotiques ou par les pertes dans les matières fécales dans le réseau d'assainissement. Dans le cas des matières fécales ou de l'élimination dans le réseau d'assainissement, le traitement des eaux usées municipales devrait réduire le fardeau microbien avant le rejet des effluents dans l'environnement. L'exposition humaine aux souches par l'intermédiaire de l'environnement devrait être faible. L'élimination des probiotiques non utilisés dans les sites d'enfouissement ne devrait pas entraîner une exposition humaine importante.

Lorsque les spores des souches du groupe B. subtilis/licheniformis inscrites à la Liste intérieure entrent dans les sources d'eau des stations de traitement de l'eau potable après un rejet provoqué par les utilisations prévues et potentielles, les procédés de traitement de l'eau potable (p. ex. coagulation, floculation, ozonisation, filtration et chloration) devraient éliminer efficacement ces micro-organismes et donc limiter leur ingestion.

L'exposition aux autres souches de B. subtilis/licheniformis inscrites à la Liste intérieure découlant de l'utilisation de produits de consommation devrait être moyenne; elle devrait aussi être faible dans le cas des expositions indirectes se produisant à la suite d'un rejet dans l'environnement dans le cadre de la biodégradation, la biorestauration et le traitement de l'eau ou des eaux usées ou le rejet des effluents à partir des installations fabriquant des enzymes et des produits chimiques biologiques.

L'accroissement du nombre de produits microbiens « plus écologiques » sur le marché peut augmenter l'exposition humaine directe à des souches du groupe B. subtilis/licheniformis inscrites à la Liste intérieure et ayant des applications potentielles dans ces produits (Spök et Klade, 2009).

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3. Caractérisation des risques

Dans cette évaluation, le risque est caractérisé selon un paradigme intégré à l'article 64 de la LCPE (1999) qui veut qu'un danger et l'exposition à ce danger soient tous deux nécessaires pour qu'il y ait un risque. La conclusion de l'évaluation des risques est basée sur le danger et sur ce que l'on connaît de l'exposition due aux utilisations actuelles.

La détermination du risque posé que présentent les utilisations actuelles est suivie par la prise en compte du danger estimé lié à de futures expositions prévisibles (découlant de nouvelles utilisations).

B. amyloliquefaciens

Le danger que présente la souche 13563-0 de B. amyloliquefaciens pour l'environnement et la santé humaine est considéré comme faible. Selon la grande variété d'utilisations déclarées en réponse à l'Avis relatif à l'article 71, l'exposition de l'environnement à la souche 13563-0 de B. amyloliquefaciens devrait être moyenne. Toujours d'après la grande variété d'utilisations déclarées en réponse à l'Avis relatif à l'article 71, l'exposition humaine devrait être moyenne pour ce qui est de l'utilisation directe des produits de consommation, et faible dans le cas des expositions indirectes survenant après un rejet dans l'environnement. Le risque associé aux utilisations courantes est considéré comme faible tant pour l'environnement que pour la santé humaine.

L'accroissement du nombre de produits microbiens « plus écologiques » sur le marché pourrait augmenter l'exposition humaine aux souches du groupe B. subtilis/licheniformis inscrites à la Liste intérieure et ayant des applications potentielles dans ces produits (Spök et Klade, 2009); toutefois le risque découlant des futures utilisations prévisibles devrait également être faible, compte tenu du faible risque associé à la souche 13563-0 de B. amyloliquefaciens.

B. atrophaeus

Le danger que présente la souche 18250-7 de B. atrophaeus pour l'environnement et la santé humaine est considéré comme faible. D'après les utilisations connues de la souche 18250-7 de B. atrophaeus, l'exposition environnementale devrait être moyenne, et l'exposition humaine, faible. Le risque associé aux utilisations courantes est considéré comme faible tant pour l'environnement que pour la santé humaine.

Le risque découlant des futures utilisations prévisibles devrait également être faible, compte tenu du faible danger associé à la souche 18250-7 de B. atrophaeus.

B. licheniformis

Le danger que présente la souche ATCC 12713 de B. licheniformis est considéré comme faible tant pour l'environnement que pour la santé humaine, étant donné que les ouvrages scientifiques et les résultats obtenus en laboratoire propres à la souche inscrite à la Liste intérieureindiquent un faible pouvoir pathogène (ce qui concorde avec les résultats obtenus pour les autres souches évaluées) et, que par le passé, l'utilisation de la souche inscrite à la Liste intérieure s'est avérée sécuritaire. B. licheniformis a été asssocié à des avortements chez le bétail. Les voies d'exposition menant à l'avortement dû à B. licheniformis chez les animaux d'élevage semblent comprendre l'ingestion d'aliments de mauvaise qualité ou moisis pendant la gestation et la propagation hématogène subséquente à l'appareil reproducteur ainsi que l'introduction au cours des activités générales d'élevage (p. ex. reproduction naturelle, insémination artificielle, parturition et pendant les examens) (Cabell, 2007; Scott, 2011; Goncagul, 2012). Les applications actuelles de la souche inscrite à la Liste intérieure ne devraient pas fortement accroître l'exposition du bétail par ces voies. Selon la grande variété d'utilisations déclarées en réponse à l'Avis relatif à l'article 71, l'exposition de l'environnement à la souche ATCC 12713 de B. licheniformis devrait être moyenne. L'exposition humaine devrait être moyenne pour ce qui est de l'utilisation directe des produits de consommation, et faible dans le cas des expositions indirectes survenant après des rejets dans l'environnement, d'après la grande variété d'utilisations déclarées en réponse à l'Avis relatif à l'article 71. Le risque associé aux utilisations courantes est considéré comme faible tant pour l'environnement que pour la santé humaine.

L'exposition humaine devrait être moyenne pour ce qui est de l'utilisation directe des produits de consommation, et faible dans le cas des expositions indirectes survenant après des rejets dans l'environnement, d'après la grande variété d'utilisations déclarées en réponse à l'Avis relatif à l'article 71. Le risque associé aux utilisations courantes est considéré comme faible tant pour l'environnement que pour la santé humaine.

L'accroissement du nombre de produits microbiens « plus écologiques » sur le marché pourrait augmenter l'exposition humaine aux souches du groupe B. subtilis/licheniformisinscrites à la Liste intérieure et ayant des applications potentielles dans ces produits (Spök et Klade, 2009); toutefois le risque découlant des futures utilisations prévisibles devrait rester faible pour les humains et l'environnement, compte tenu du faible risque associé à la souche 12713 de B. licheniformis.

B. subtilis

Le danger que présentent les souches ATCC 6051A de B. subtilis, ATCC 55405 de B. subtilis, ATCC 6051 de B. subtilis sous-espèce subtilis et ATCC 55406 de B. subtilis sous-espèce inaquosorum pour l'environnement et la santé humaine est considéré comme faible. Selon la grande variété d'utilisations déclarées en réponse à l'Avis relatif à l'article 71, l'exposition de l'environnement aux souches ATCC 6051A de B. subtilis, ATCC 55405 de B. subtilis, ATCC 6051 de B. subtilissous-espèce subtilis et ATCC 55406 de B. subtilis sous-espèce inaquosorum devrait être moyenne. Toujours d'après la grande variété d'utilisations déclarées en réponse à l'Avis relatif à l'article 71, l'exposition humaine devrait aussi être moyenne pour ce qui est de l'utilisation directe des produits de consommation, et faible dans le cas des expositions indirectes par suite de rejets dans l'environnement. Le risque associé aux utilisations courantes est considéré comme faible tant pour l'environnement que pour la santé humaine.

L'accroissement du nombre de produits microbiens « plus écologiques » sur le marché pourrait augmenter l'exposition humaine aux souches du groupe B. subtilis/licheniformisinscrites à la Liste intérieure et ayant des applications potentielles dans ces produits (Spök et Klade, 2009); toutefois le risque découlant des futures utilisations prévisibles devrait également être faible, compte tenu du faible risque associé aux souches ATCC 6051A de B. subtilis, ATCC 55405 de B. subtilis, ATCC 6051 de B. subtilis sous-espèce subtilis et ATCC 55406 de B. subtilis sous-espèce inaquosorum pour la santé humaine et la salubrité de l'environnement.

Souches de maquillées Bacillus inscrites à la Liste intérieure

Le danger que présentent les espèces Bacillus16970-5, Bacillus 2 18118-1, Bacillus 4 18121-4 et Bacillus 7 18129-3 pour l'environnement et la santé humaine est considéré comme faible, étant donné les résultats obtenus en laboratoire avec les souches maquillées inscrites à la Liste intérieure ainsi que leurs antécédents d'utilisation sécuritaire. D'après la grande variété d'utilisations déclarées en réponse à l'Avis relatif à l'article 71, l'exposition de l'environnement aux espèces Bacillus 16970-5, Bacillus 2 18118-1, Bacillus 4 18121-4 et Bacillus 7 18129-3 devrait être moyenne. Toujours d'après la grande variété d'utilisations déclarées en réponse à l'Avis relatif à l'article 71, l'exposition humaine devrait aussi être moyenne pour ce qui est de l'utilisation directe des produits de consommation, et faible dans le cas des expositions indirectes par suite de rejets dans l'environnement. Le risque associé aux utilisations courantes est considéré comme faible tant pour l'environnement que pour la santé humaine.

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4. Conclusions

D'après l'information présentée dans cette évaluation préalable, on peut conclure que les souches 13563-0 de Bacillus amyloliquefaciens, 18250-7 de Bacillus atrophaeus, ATCC 12713 de Bacillus licheniformis, ATCC 6051A de Bacillus subtilis, ATCC 55405 de Bacillus subtilis, ATCC 6051 de Bacillus subtilis sous-espèce subtilis, ATCC 55406 de Bacillus subtilis sous-espèce inaquosorum, et les espèces Bacillus 16970-5, Bacillus 2 18118-1, Bacillus 4 18121-4 et Bacillus 7 18129-3 ne pénètrent pas dans l'environnement en une quantité, à une concentration ou dans des conditions de nature à :

avoir, immédiatement ou à long terme, un effet nocif sur l'environnement ou sur la diversité biologique;
mettre en danger l'environnement essentiel pour la vie;
constituer ou pouvoir constituer un danger au Canada pour la vie ou la santé humaines.

Il est donc proposé de conclure que les souches du groupe Bacillus licheniformis/subtilis inscrites à la Liste intérieure ne satisfont pas aux critères établis à l'article 64 de la LCPE (1999).

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5. Références

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Annexes

Notes de bas de page

Notes de bas de page [1]

American Type Culture Collection

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Notes de bas de page [2]

La détermination de la conformité à l'un ou plusieurs des critères énoncés à l'article 64 de la LCPE (1999) est basée sur une évaluation des risques pour l'environnement et/ou la santé humaine liés à l'exposition dans l'environnement en général. Pour les humains, cela inclut, sans toutefois s'y limiter, l'exposition par l'air, l'eau et l'utilisation de produits contenant la substance. Une conclusion établie en vertu de la LCPE (1999), sur les souches du groupe Bacillus licheniformis/subtilis de la Liste intérieure n'a pas rapport avec une évaluation, qu'elle n'empêche pas non plus, réalisée en fonction des critères de risque du Système d'information sur les matières dangereuses utilisées au travail (SIMDUT), critères qui sont définis dans le Règlement sur les produits contrôlés pour les produits destinés à être utilisés au travail.

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Notes de bas de page [3]

Essais réalisés par la Division des méthodes biologiques d'Environnement Canada.

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Notes de bas de page [4]

Essais dirigés par le Bureau de la science et de la recherche en santé environnementale de Santé Canada.

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Notes de bas de page [5]

Les activités de lutte biologique et de promotion de la croissance ne s'inscrivent pas dans la portée de la présente évaluation.

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Notes de bas de page [6]

Les souches ATCC 12713 de B. licheniformis, ATCC 6051A de B. subtilis, ATCC 6051 de B. subtilis sous-espèce subtilis, ATCC 55406 de B. subtilis sous-espèce inaquosorum, les espèces Bacillus 2 18118-1 et Bacillus 7 18129-3.

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Notes de bas de page [7]

Données générées par la Direction générale de la santé environnementale et de la sécurité des consommateurs de Santé Canada. Travaux menés selon la méthode d'essai liquide TBS-MTT pour déterminer les valeurs de la concentration minimale inhibitrice pour les bactéries d'après des expériences répétées (Seligy et al., 1997). Les valeurs correspondent à la concentration minimale inhibitrice (en μg/mL) pour l'espèce Bacillus cultivée en présence de l'antibiotique pendant 24 h à 37 °C.

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Notes de bas de page [8]

Essais réalisés conformément au « Guide des essais de pathogénicité et de toxicité de nouvelles substances microbiennes pour les organismes aquatiques et terrestres (SPE 1/RM/44, mars 2004) ».

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Date de modification :: 2015-07-31

Évaluation préalable finale des souches

Environnement CanadaSanté CanadaAoût 2015

Table des matières

Liste des tableaux

Liste des figures

Sommaire

Introduction

Décisions d'autorités compétentes sur le plan national et international

Échelle nationale

Échelle internationale

1. Évaluation du danger

1.1 Caractérisation des souches inscrites à la Liste intérieure faisant l'objet d'une évaluation

1.1.1 Taxonomie, identification et historique de la souche

Désignation taxonomique

1.1.1.1 Identification phénotypique et profil biochimique

1.1.1.2 Identification moléculaire

Figure 1-1 : Liens phylogéniques de l'espèce Bacillaceae d'après l'alignement de la région codante de la séquence génétique de l'acide ribonucléique (ARN) ribosomique 16S

1.1.1.3 Historique de la souche

1.1.2 Propriétés biologiques et écologiques

1.1.2.1 Présence naturelle

1.1.2.2 Survie et persistance dans des environnement

Figure 1-2. Persistance des souches ATCC 6051 de Bacillus subtilis et ATCC 13933 de Bacillus subtilis dans le sol, selon les analyses de PCR quantitative de l'ADN pouvant être extrait du sol

1.1.2.3 Paramètres de croissance

1.1.2.4 Lutte biologique et promotion de la croissanceNote de bas de page[5]

Lutte biologique

Promotion de la croissance

1.1.2.5 Transfert génque

1.1.2.6 Caractéristiques pathogéniques et toxigènes

Spores

Déterminants de l'infectiosité

Métabolites secondaires

Toxines

1.1.2.7 Profil de sensibilité aux antibiotiques

1.1.3 Effets

1.1.3.1 Environnement

B. amyloliquefaciens

B. atrophaeus

B. licheniformis

B. subtilis

Souches maquillées de Bacillus inscrites à la Liste intérieure

1.1.3.2 Santé humaine

B. amyloliquefaciens

B. atrophaeus

B. licheniformis

B. subtilis

Souches maquillées de Bacillus inscrites à la Liste intérieure

1.2 Gravité du danger

1.2.1 Danger pour l'environnement

1.2.1.1 B. amyloliquefaciens

1.2.1.2 B. atrophaeus

1.2.1.3 B. licheniformis

1.2.1.4 B. subtilis

1.2.1.5 Souches maquillées de Bacillus inscrites à la Liste intérieure

1.2.2 Danger pour la santé humaine

1.2.2.1 B. amyloliquefaciens

1.2.2.2 B. atrophaeus

1.2.2.3. B. licheniformis

1.2.2.4 B. subtilis

1.2.2.5 Souches de Bacillus maquillées inscrites à la Liste intérieure des substances

2. Évaluation de l'exposition

2.1 Sources d'exposition

B. amyloliquefaciens

B. atrophaeus

B. licheniformis

B. subtilis

2.2 Caractérisation de l'exposition

2.2.1 Environnement

2.2.1.1 B. atrophaeus

2.2.1.2 Souches de B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. subtilis et souches maquillées de Bacillusinscrites à la Liste intérieure

2.2.2 Humains

2.2.2.1 B. atrophaeus

2.2.2.2 Souches de B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. subtilis et de Bacillus maquillées inscrites à la Liste intérieure

3. Caractérisation des risques

B. amyloliquefaciens

B. atrophaeus

B. licheniformis

B. subtilis

Souches de maquillées Bacillus inscrites à la Liste intérieure

4. Conclusions

5. Références

Environnement Canada
Santé Canada
Août 2015

1.1.2.4 Lutte biologique et promotion de la croissance^{Note de bas de page[5]}