Méthode d’essai biologique servant à mesurer l’inhibition de la croissance de la plante macroscopique dulcicole : annexes

Annexes

1. Membres du Groupe intergouvernemental sur la toxicité de l’environnement (en décembre 2006)
2. Administration centrale et bureaux régionaux du Service de la protection de l’environnement d’Environnement Canada
3. Variantes des méthodes de culture de Lemna spp. et des essais de mesure de l’inhibition de sa croissance, décrites dans les méthodes canadiennes, états-uniennes et européennes
4. Milieux de culture et d’essai utilisés dans les essais d’inhibition de la croissance de Lemna spp., selon les méthodes canadiennes, étatsuniennes et européennes
5. Description générale de Lemna minor
6. Techniques de culture axénique des Lemna (Acreman, 2006)
7. Séries logarithmiques de concentrations convenant aux essais toxicologiques
8. Méthodes d’essai biologique et documents d’orientation publiés par la Section de l’élaboration et de l’application des méthodes d’Environnement Canada

Annexe A : Membres du Groupe intergouvernemental sur la toxicité de l’environnement (en décembre 2006)

Gouvernement fédéral, Environnement Canada

W. Antoniolli
Service de la protection de l’environnement
Edmonton (Alberta)

C. Blaise
Centre Saint-Laurent
Montréal (Québec)

U. Borgmann
Institut national de recherche sur les eaux
Burlington (Ontario)

J. Bruno
Centre des sciences de l’environnement, région du Pacifique
North Vancouver (Colombie-Britannique )

C. Buday
Centre des sciences de l’environnement, région du Pacifique
North Vancouver (Colombie-Britannique )

K. Doe
Centre des sciences de l’environnement, région de l’Atlantique
Moncton (Nouveau-Brunswick)

G. Elliott
Service de la protection de l’environnement
Edmonton (Alberta)

F. Gagné
Centre St-Laurent
Montréal (Québec)

M. Harwood
Service de la protection de l’environnement
Montréal (Québec)

S. Hendry
Centre de technologie environnementale
Ottawa (Ontario)

D. Hughes
Centre des sciences de l’environnement, région de l’Atlantique
Moncton (Nouveau-Brunswick)

P. Jackman
Centre des sciences de l’environnement, région de l’Atlantique
Moncton (Nouveau-Brunswick)

N. Kruper
Service de la protection de l’environnement
Edmonton (Alberta)

M. Linssen
Centre des sciences de l’environnement, région du Pacifique
North Vancouver (Colombie-Britannique )

L. Porebski
Direction du milieu marin
Gatineau (Québec)

J. Princz
Centre de technologie environnementale
Ottawa (Ontario)

G. Schroeder
Centre des sciences de l’environnement, région du Pacifique
North Vancouver (Colombie-Britannique)

R. Scroggins
Centre de technologie environnementale
Ottawa (Ontario)

T. Steeves
Centre des sciences de l’environnement, région de l’Atlantique
Moncton (Nouveau-Brunswick)

D. Taillefer
Direction du milieu marin
Gatineau (Québec)

L. Taylor
Centre de technologie environnementale
Ottawa (Ontario)

S. Trottier
Centre St-Laurent
Montréal (Québec)

G. van Aggelen
Centre des sciences de l’environnement, région du Pacifique
North Vancouver (Colombie-Britannique)

L. Van der Vliet
Centre de technologie environnementale
Ottawa (Ontario)

B. Walker
Centre St-Laurent
Montréal (Québec)

P. Wells
Service de la conservation de l’environnement
Dartmouth (Nouvelle-Écosse)

Gouvernement fédéral, Pêches et Océans Canada

R. Roy
Institut Maurice-Lamontagne
Mont-Joli (Québec)

Gouvernement fédéral, Ressources naturelles Canada

M. Schwartz
Laboratoire des sciences minérales, Centre canadien de la technologie des minéraux et de l'énergie (CANMET) Ottawa (Ontario)

B. Vigneault
Laboratoire des sciences minérales, CANMET Ottawa (Ontario)

Gouvernements provinciaux

C. Bastien
Ministère de l’Environnement du Québec
Ste-Foy (Québec)

B. Bayer
Ministère de l’Environnement du Manitoba
Winnipeg (Man.)

K. Hunter
Ministère de l’Environnement de l’Ontario
Rexdale (Ontario)

D. Poirier
Ministère de l’Environnement de l’Ontario
Rexdale (Ontario)

J. Schroeder (président)
Ministère de l’Environnement de l’Ontario
Toronto (Ontario)

T. Watson-Leung
Ministère de l’Environnement de l’Ontario
Rexdale (Ontario)

Annexe B : Administration centrale et bureaux régionaux du Service de la protection de l’environnement d’Environnement Canada

Administration centrale
351, boul. Saint-Joseph
Place Vincent-Massey
Gatineau (Québec)
K1A 0H3

Région de l’Atlantique
Queen Square, 15^e étage
45, Alderney Drive
Dartmouth (Nouvelle-Écosse)
B2Y 2N6

Région du Québec
105, rue McGill, 8^e étage
Montréal (Québec)
H2Y 2E7

Région de l’Ontario
4905, rue Dufferin, 2^e étage
Downsview (Ontario)
M3H 5T4

Région de l’Ouest et du Nord
Twin Atria n^o 2, bureau 210
4999, 98^e Avenue
Edmonton (Alberta)
T6B 2X3

Région du Pacifique et du Yukon
401, rue Burrard
Vancouver (Colombie-Britannique)
V6C 3S5

Annexe C : Variantes des méthodes de culture de Lemna spp. et des essais de mesure de l’inhibition  de sa croissance, décrites dans les méthodes canadiennes, étatsuniennes et européennes

Les documents de base sont énumérés dans l’ordre chronologique, selon le sigle de l’organisme dont ils émanent, dans l’ordre suivant : (1) grands comités et organismes de l’État; (2) principaux auteurs.

ITM (1990) - publication de l’Institut de recherche environnementale appliquée (Institutet för tillämpad miljöforskning (ITM)), qui énonce les modes opératoires de la culture de Lemna minor et des essais toxicologiques avec cette espèce, compilés et utilisés par le Conseil suédois de protection de l’environnement, en collaboration avec le Bureau national d’inspection des produits chimiques (de l’Institut susmentionné), à Solna (Suède).

ASTM (1991) - norme publiée par l’American Society for Testing and Materials (ASTM), pour la réalisation d’essais toxicologiques sans renouvellement des solutions, avec Lemna gibba G3.

APHA (1992) - publication de l’American Public Health Association (APHA), de l’American Water Works Association et de la Water Environment Federation (parue dans Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 18^e éd.), qui expose les méthodes de culture de L. minor et d’essai avec cette espèce, désignées comme moyen de surveillance dans le cadre des Études de suivi des effets sur l’environnement, conformément au Règlement sur les effluents des fabriques de pâtes et papiers, promulgué par le gouvernement fédéral du Canada. Ce document a été révisé en 1996.

USEPA (1992) - norme publiée par l’Office of Pollution Prevention and Toxics (OPPT), de l’United States Environmental Protection Act (USEPA), pour la réalisation d’essais toxicologiques avec L. gibba G3, afin d’obtenir des données sur la phytotoxicité de produits chimiques [sous le régime de la Toxic Substances Control Act (TSCA)]. Elle a été publiée dans le titre 40, chapitre I, sous-chapitre R du Code of Federal Regulations (CFR). Ce document a été révisé, harmonisé avec d’autres publications et publié de nouveau (sous forme de version provisoire) en 1996 (v. la référence suivante).

USEPA (1996) - version provisoire (avril 1996) de la norme OPPTS 850.4400 élaborée par l’OPPT, de l’USEPA, pour la réalisation d’essais toxicologiques avec L. gibba G3 et L. minor, afin d’obtenir des données sur la phytotoxicité de produits chimiques [sous le régime de la TSCA et de la Federal Insecticide, Fungicide, and Rodenticide Act (FIFRA)]. Cette norme amalgame : les conseils et exigences sur les essais en vigueur à l’OPPT, publiés dans le titre 40, chapitre I, sous-chapitre R du CFR; ceux de l’Office of Pesticide Programs (OPP), parus dans les publications du National Technical Information Service (NTIS); les lignes directrices publiées par l’OCDE. Elle résulte de l’harmonisation de deux documents : Lemna Acute Toxicity Test (40 CFR 797.1160); Growth and Reproduction of Aquatic Plants (Tier I) (OPP 122-2) et Growth and Reproduction of Aquatic Plants (Tier 2) (OPP 123-2) (Pesticide Assessment Guidelines, Subdivision J--Hazard Evaluation; Nontarget Plants), rapport EPA 540/09-82-020, 1982.

AFNOR (1996) - norme publiée par l’Association française de normalisation (AFNOR) (méthode d’essai XP T 90-337, 1996). Ce document expose les modes opératoires de la culture de L. minor et des essais toxicologiques avec cette espèce.

OCDE (1998) - version provisoire (juin 1998) de la norme publiée par l’Organisation de coopération et de développement économiques (OCDE). Elle vise à évaluer la toxicité de substances à l’égard de L. gibba et de L. minor et se fonde sur des lignes directrices et des normes en vigueur publiées par l’ASTM (1991), l’USEPA (1996), l’AFNOR (1996) et le SIS (1995) de Suède.

SRC (1997) - mode opératoire normalisé (inédit) élaboré en 1997 par h. Peterson et M. Moody, du Saskatchewan Research Council (SRC) (Laboratoire de la section de la qualité de l’eau), pour la culture de L. minor et son emploi dans des essais. Il se fonde sur la recherche effectuée par Peterson et Moody (1994-1997) et constitue une modification de la méthode d’essai toxicologique (proposée) avec des Lemna, n° 1995-8211 de l’APHA.

MPO (1979) - voir la référence Lockhart et Blouw, 1979. Cette méthode, publiée dans un document intitulé Toxicity Tests for Freshwater Organisms, E. Scherer (réd.), décrit les modes opératoires utilisés pour les essais sur des herbicides et des sédiments avec L. minor.

B & P (1981) - voir la référence Bishop et Perry, 1981. Cette publication décrit un essai normalisé d’inhibition de la croissance de L. minor faisant appel à un renouvellement continu des solutions. Elle compare aussi la sensibilité relative des Lemna à celle de poissons et d’invertébrés à l’égard de diverses matières d’essai.

C & M (1989) - voir la référence Cowgill et Milazzo, 1989. Cette publication expose les conditions de culture et la composition d’un milieu de culture à long terme pour le maintien de L. gibba G3 ainsi que de plusieurs clones de L. minor. Les auteurs y examinent et y comparent un certain nombre de paramètres et y étudient la sensibilité relative des deux espèces de Lemna et de divers clones à différentes matières.

T & N-K (1990) - voir la référence Taraldsen et Norberg-King, 1990. Cette publication décrit une méthode de culture de L. minor ainsi qu’une méthode d’essai avec cette espèce, principalement pour les effluents. Les auteurs y analysent également la sensibilité relative de la lentille d’eau, de Ceriodaphnia dubia et de la tête-de-boule (Pimephales promelas) à différents produits chimiques et effluents.

Annexe D : Milieux de culture et d’essai utilisés dans les essais d’inhibition de la croissance de Lemna spp., selon les méthodes canadiennes, étatsuniennes et européennes

Les documents de base sont énumérés dans l’ordre chronologique, selon le sigle de l’organisme dont ils émanent.

ITM (1990) - publication de l’Institut de recherche environnementale appliquée (Institutet för tillämpad miljöforskning), qui énonce les modes opératoires de la culture de Lemna minor et des essais toxicologiques avec cette espèce, compilés et utilisés par le Conseil suédois de protection de l’environnement, en collaboration avec le Bureau national d’inspection des produits chimiques (de l’Institut susmentionné), à Solna (Suède).

ASTM (1991) - norme publiée par l’American Society for Testing and Materials, pour la réalisation d’essais toxicologiques sans renouvellement des solutions, avec Lemna gibba G3.

APHA (1992) - publication de l’American Public Health Association, de l’American Water Works Association et de la Water Environment Federation (parue dans Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 18^e éd.), qui expose les méthodes de culture de L. minor et d’essai avec cette espèce, désignées comme moyen de surveillance dans le cadre des Études de suivi des effets sur l’environnement, conformément au Règlement sur les effluents des fabriques de pâtes et papiers, promulgué par le gouvernement fédéral du Canada. Ce document a été révisé en 1996.

USEPA (1992) - norme publiée par l’Office of Pollution Prevention and Toxics (OPPT), de l’USEPA, pour la réalisation d’essais toxicologiques avec L. gibba G3, afin d’obtenir des données sur la phytotoxicité de produits chimiques [sous le régime de la Toxic Substances Control Act (TSCA)]. Elle a été publiée dans le titre 40, chapitre I, sous-chapitre R du Code of Federal Regulations (CFR). Ce document a été révisé, harmonisé avec d’autres publications et publié de nouveau (sous forme de version provisoire) en 1996 (v. la référence suivante).

USEPA (1996) - version provisoire (avril 1996) de la norme OPPTS 850.4400 élaborée par l’OPPT, de l’USEPA, pour la réalisation d’essais toxicologiques avec L. gibba G3 et L. minor, afin d’obtenir des données sur la phytotoxicité de produits chimiques [sous le régime de la TSCA et de la Federal Insecticide, Fungicide, and Rodenticide Act (FIFRA)]. Cette norme amalgame : les conseils et exigences sur les essais en vigueur à l’OPPT, publiés dans le titre 40, chapitre I, sous-chapitre R du CFR; ceux de l’Office of Pesticide Programs (OPP), parus dans les publications du National Technical Information Service (NTIS); les lignes directrices publiées par l’OCDE. Elle résulte de l’harmonisation de deux documents : Lemna Acute Toxicity Test (40 CFR 797.1160); Growth and Reproduction of Aquatic Plants (Tier I) (OPP 122-2) et Growth and Reproduction of Aquatic Plants (Tier 2) (OPP 123-2) (Pesticide Assessment Guidelines, Subdivision J--Hazard Evaluation; Nontarget Plants), rapport EPA 540/09-82-020, 1982.

AFNOR (1996) - norme publiée par l’Association française de normalisation (méthode d’essai XP T 90-337, 1996). Ce document expose les modes opératoires de la culture de L. minor et des essais toxicologiques avec cette espèce.

OCDE (1998) - version provisoire (juin 1998) de la norme publiée par l’OCDE. Elle vise à évaluer la toxicité de substances à l’égard de L. gibba et de L. minor et se fonde sur des lignes directrices et des normes en vigueur publiées par l’ASTM (1991), l’USEPA (1996), l’AFNOR (1996) et le SIS (1995) de Suède.

SRC (1997) - mode opératoire normalisé (inédit) élaboré en 1997 par h. Peterson et M. Moody, du Saskatchewan Research Council (Laboratoire de la section de la qualité de l’eau), pour la culture de L. minor et son emploi dans des essais. Il se fonde sur la recherche effectuée par Peterson et Moody (1994-1997) et constitue une modification de la méthode d’essai toxicologique (proposée) avec des Lemna, n° 1995-8211 de l’APHA.

SRC (2003) - rapport (inédit) préparé par M. Moody du Saskatchewan Research Council (Laboratoire de la section de la qualité de l’eau), décrivant la mise au point d’un milieu E+ Hoagland modifié pour la culture de L. minor, à l’issue de recherches effectuées par l’auteure. Ce milieu constitue une modification du milieu E+ Hoagland décrit dans la première édition de la méthode d’essai d’Environnement Canada avec L. minor.

ISO (2005) - version provisoire d’une méthode d’essai normalisée internationale servant à mesurer les effets de composantes de l’eau et d’eau usée sur la croissance de L. minor, publiée par l’Organisation internationale de normalisation, Genève, Suisse.

MPO (1979) - voir la référence Lockhart et Blouw, 1979. Cette méthode, publiée dans un document intitulé Toxicity Tests for Freshwater Organisms, E. Scherer (réd.), décrit les modes opératoires utilisés pour les essais sur des herbicides et des sédiments avec L. minor.

Rajustement du pH : Rajuster le pH à 6,5 au moyen de NaOH ou de HCl.

Stérilisation : On stérilise les solutions mères par filtration stérilisante (pores de 0,2 µm) ou par autoclavage.

Rajustement du pH : Rajuster le pH à 4,60 au moyen de KOH ou de HCl.

Stérilisation : Autoclaver 20 min à 121 °C et sous pression de 1,1 kg/cm².

Rajustement du pH : Rajuster le pH à 5,0 ± 0,1 au moyen de KOH ou de HCl N 0,1.

Stérilisation : Autoclaver 20 min à 121 °C et sous pression de 1,1 kg/cm².

Rajustement du pH : Rajuster le pH à 7,5 ± 0,1 au moyen de NaOH ou de HCl 0,1 N.

Stérilisation : Passer le milieu sur un filtre à membrane à pores de 0,22 µm et recueillir dans un récipient stérile.

Rajustement du pH : Rajuster le pH à 7,5-8,0.

Stérilisation : Aucune.

Rajustement du pH : Rajuster le pH à 5,0 ± 0,2 au moyen de NaOH 0,1 N^{Note de la table g.6}.

Stérilisation : Autoclave.

Rajustement du pH : Rajuster le pH des milieux de culture et d’essai à 5,5 ± 0,5 au moyen de NaOH ou de HCl^{Note de la table e.13}.

Stérilisation : Passer sur un filtre à ouvertures de 0,22 µm.

Rajustement du pH : Rajuster le pH à 6,5 ± 0,2 au moyen de NaOH ou de HCl.

Stérilisation : On stérilise les solutions mères I à V par autoclavage (120 °C, pendant 15 min) ou par filtration sur membrane (à pores de 0,2 µm); on stérilise les solutions mères VI (et, facultativement, VII) uniquement par filtration sur membrane (en d’autres termes, ces solutions ne devraient pas être autoclavées).

Rajustement du pH : Rajuster le pH à 8,30 ± 0,05 immédiatement avant l’essai.

Stérilisation : Aucune.

Rajustement du pH : Rajuster le pH à 4,6 ± 0,2 au moyen de NaOH ou de HCl.

Stérilisation : Autoclaver 20 min à 121 °C et sous pression de 124,2 kPa (1,1 kg/cm²).

Rajustement du pH : Rajuster le pH à 5,5 ± 0,2 au moyen de NaOH ou de HCl, au besoin.

Stérilisation : Autoclaver 20 min à 121 °C ou filtrer (pores de 0,2 µm) pour assurer une plus longue durée de conservation.

Rajustement du pH : n.i.

Stérilisation : n.i.

Annexe E : Description générale de Lemna minor

Taxinomie et rapports phylogénétiques

Lemna minor Linné (Arales : Lemnaceae) est une petite plante macroscopique (macrophyte) vasculaire aquatique, appartenant à la famille des lemnacées. Les membres de cette famille sont les plantes à fleurs les plus petites et à la structure la plus simple du monde entier, aboutissement probable de la réduction d’ancêtres plus complexes (Godfrey et Wooten, 1979). La plupart des chercheurs placent les lemnacées dans l’ordre des spadiciflores (Arales), ce qui les relie aux aracées par la laitue d’eau du genre Pistia (Hillman, 1961).

On reconnaît généralement quatre genres de lemnacées : Spirodela, Lemna, Wolffiella et Wolffia (Hillman, 1961). Les thalles (ou frondes) de Spirodela et de Lemna sont plats, de contour plus ou moins ovale, à l’aspect foliacé. Spirodela porte au moins deux radicelles filiformes sur chaque thalle, tandis que Lemna n’en porte qu’une. Les deux genres ont été groupés dans une tribu (Lemneae) (Hegelmaier - 1895) ou une sous-famille (Lemnoideae) (Lawalrée - 1945) (Hillman, 1961). On a aussi considéré Spirodela comme un sous-genre de Lemna (Hutchison, 1934, dans Hillman, 1961). Wolffiella et Wolffia ne possèdent pas de radicelle et ces deux genres ont été groupés dans une tribu (Wolffieae, Hegelmaier) ou une sous-famille (Wolffioideae, Lawalrée) (Hillman, 1961). Wolffia prend la forme d’organismes quasi microscopiques qui ressemblent à de la farine, et Wolffiella, d’organismes en forme de rubans, simples ou rayonnant à partir d’un point (Fassett, 1957).

La taxinomie des Lemna (appelées aussi lentilles d’eau ou lenticules) est compliquée par l’existence d’une large gamme de phénotypes (OCDE, 1998). En 1957, Landolt a signalé l’existence d’au moins deux souches distinctes de L. minor aux États-Unis, qui différaient par leur taille et par leur capacité de fleurir en culture (Hillman, 1961). On pourrait facilement confondre L. perpusilla et les formes aux feuilles lisses de L. gibba avec L. minor (v. Mason, 1957, dans Hillman, 1961). L. gibba diffère de L. minor par ses thalles largement elliptiques à ronds, leur face supérieure souvent parsemée de taches rouges et leur face inférieure généralement bosselée (gibbeuse). L. perpusilla peut se distinguer de L. minor par ses appendices aliformes à la base de la gaine des radicelles et, parfois, par ses papilles apicales et centrales proéminentes, qui manquent chez L. minor (Hillman, 1961; Godfrey et Wooten, 1979). L’absence de turions (plantes filles vert foncé ou brunâtres) hivernants, de papules dorsales proéminentes et de tachetures d’anthocyanine rougeâtre sur la face ventrale sépare L. minor d’une autre espèce très apparentée, L. turionifera Landolt. On peut trouver des descriptions taxinomiques et des photographies de nombreuses espèces de lemnacées sur le site Internet consacré à la clé des lemnacées de l’ouest de l’Amérique du Nord (en anglais seulement), de Wayne P. Armstrong (collège Palomar, Université d’État de l’Oregon).

Description de l’espèce

L. minor est une petite plante coloniale possédant un seul thalle plat, arrondi à elliptique-obové, à l’aspect de feuille (tige discoïde). Chaque plante mesure de 2 à 4 mm de longueur et comprend un seul thalle ou, dans le cas d’une colonie, plusieurs thalles (3 à 5) (Hillman, 1961; ITM, 1990). Le thalle est une structure complexe représentant à la fois la feuille et la tige (Hillman, 1961), son extrémité distale étant foliaire et son extrémité proximale étant axiale (Arber, 1963). Le thalle est constitué en grande partie de cellules chlorenchymateuses, séparées par d’importantes lacunes, remplies d’air ou d’autres gaz, qui le font flotter (Hillman, 1961).

Les thalles de L. minor sont obscurément trinervés, et leur face dorsale lisse est convexe ou quelque peu aplatie. La face dorsale possède une petite papille centrale, qui n’est cependant pas proéminente (Hillman, 1961; Britton et Brown, 1970). Habituellement, elle est traversée par une ligne médiane de papilles plus petites, jusque près de la pointe (Godfrey et Wooten, 1979). La face inférieure du thalle est convexe (rarement concave, comme lorsque la lumière ou les nutriments sont insuffisants pendant la croissance) (Godfrey et Wooten, 1979). Quand les thalles sont frais, ils sont lustrés et verts à vert lime (Godfrey et Wooten, 1979).

La plante possède une seule racine ou radicelle qui prend naissance dans une gaine profonde située au centre de la face inférieure de chaque thalle (Hillman, 1961). La radicelle prend naissance au nœud qui se trouve juste sous l’épiderme inférieur; d’un diamètre habituellement inférieur à 0,5 mm, elle est dépourvue de tissus vasculaires et dotée d’une coiffe obtuse ou subtronquée (Hillman, 1961; Britton et Brown, 1970). Comme toute la face inférieure des thalles peut absorber les nutriments du milieu et que les plantes peuvent croître sans entrave dans des conditions qui empêchent totalement l’allongement des radicelles, on connaît mal l’importance fonctionnelle de ces dernières (Hillman, 1961). Des auteurs (v. Arber, 1920, dans Hillman, 1966) ont avancé qu’elles servent principalement d’organe d’ancrage pour empêcher les thalles de chavirer et pour former les enchevêtrements qui favorisent la dispersion et la protection contre les mouvements de l’eau (Hillman, 1961).

Répartition et écologie

Cosmopolite, L. minor est présente presque partout dans le monde (Godfrey et Wooten, 1979). Elle est largement répandue dans toute l’Amérique du Nord, sauf dans l’extrême nord et dans les Bahamas. On la trouve aussi en Europe, en Asie, en Afrique et en Australie (Britton et Brown, 1970). En Amérique du Nord, on la trouve de Terre-Neuve à l’Alaska et au sud jusqu’en Californie, au Texas et en Floride (Newmaster et coll., 1997). Au Canada, sa répartition vers le nord atteint le Grand lac des Esclaves, dans les Territoires du Nord-Ouest; le lac Athabasca, en Alberta et en Saskatchewan; Churchill, au Manitoba; la baie James, en Ontario; la Côte-Nord et l’île d’Anticosti, au Québec; Terre-Neuve, le Nouveau-Brunswick, l’Île-du-Prince-Édouard et la Nouvelle-Écosse (Scoggan, 1978).

La lenticule mineure croît dans les milieux stagnants des zones tropicale à tempérée, des eaux douces aux estuaires saumâtres et dans une large gamme de conditions trophiques (Hillman et Culley, 1978). On peut la trouver dans l’eau calme ou faiblement courante des étangs d’eau douce, des marais, des lacs et des cours d’eau tranquilles. On peut observer sa floraison dans les marais, les tourbières oligotrophes, les petits étangs et les fossés aux eaux stagnantes, riches en nutriments et en matière organique. On la trouve souvent près des sorties d’égout (ITM, 1990).

Les lenticules forment un élément essentiel de l’écosystème des eaux stagnantes et peu profondes. Elles font partie intégrante de la chaîne alimentaire, fournissant de la nourriture à la sauvagine et aux oiseaux des marais tels que les foulques, les canards noirs, les canards colverts, les sarcelles, les canards branchus, les petits garrots et les râles. Les petits mammifères, notamment le rat musqué et le castor, s’en nourrissent parfois. Ces plantes fournissent aussi de la nourriture, un abri, de l’ombrage et un substrat aux poissons et aux invertébrés aquatiques (Jenner et Janssen-Mommen, 1989; Taraldsen et Norberg-King, 1990; APHA et coll., 1992; Newmaster et coll., 1997). Dans les conditions favorables à la croissance, elles peuvent se multiplier rapidement et former un tapis dense, constitué de divers genres et espèces (Riemer, 1993), dominé par une seule espèce (Wang, 1987; ASTM, 1991).

Biologie de la reproduction

Les Lemna sont des organismes à croissance rapide, qui se reproduisent rapidement aussi, comparativement aux autres plantes vasculaires à fleurs (Hillman, 1961; APHA et coll., 1992). La reproduction de L. minor est habituellement végétative (c.-à-d. asexuée). Les nouveaux thalles, ou thalles « filles », se forment à partir de deux poches situées de chaque côté de l’extrémité la plus étroite d’un thalle préexistant, le thalle « mère », très près du point où prend naissance la radicelle (Hillman, 1961). Cette extrémité du thalle est habituellement dite « basale » ou « proximale », car chez le thalle fille fixé au thalle mère, elle constitue le point le plus rapproché du thalle mère. L’extrémité large du thalle est dite « distale » (Hillman, 1961). Chaque thalle fille engendre à son tour un thalle, habituellement quand il est encore fixé au thalle mère. Les groupes de thalles fixés les uns aux autres forment des colonies (Hillman, 1961). Chez les Lemna, les thalles filles se forment à tour de rôle de chaque côté du thalle mère, leur développement se faisant plus rapidement dans une poche que dans l’autre. Les clones de la même espèce diffèrent par le côté où se formera le premier thalle fille, ce côté restant normalement constant dans le clone (Hillman, 1961).

Chez L. minor, la floraison (c.-à-d. la reproduction sexuée) est rare et ne survient que lorsque les conditions du milieu changent. On l’a associée à la photopériode et à des températures élevées (Landolt, 1957, dans Hillman, 1961). D’après les connaissances actuelles, le thalle ne produit qu’une seule fleur durant son existence. La fleur prend naissance dans la partie du méristème, ou à proximité, qui donne naissance aux thalles filles (Hillman, 1961). Chaque fleur consiste en un seul pistil ampoulé (qui mûrit le premier) et d’une ou deux étamines (qui mûrissent successivement) (Hillman, 1961; Newmaster et coll., 1997). Au cours de leur développement, ces organes sont entourés d’une spathe membraneuse, ouverte à son sommet, comme un sac (Hillman, 1961).

Le fruit est symétrique, ovoïde ou ellipsoïde, dépourvu d’ailes, et la graine est dotée de 12 à 15 nervures profondes et inégales, ainsi que d’un hile proéminent (Britton et Brown, 1970; Godfrey et Wooten, 1979).

Annexe F : Techniques de culture axénique des Lemna (Acreman, 2006)

Diverses espèces de Lemna (lenticules) -- des macrophytes vasculaires aquatiques de la famille des Lemnaceae -- peuvent être cultivées dans des conditions axéniques en milieu liquide ou sur gélose nutritive à l’aide de méthodes semblables à celles utilisées pour la culture de tissus végétaux. Les cultures axéniques sont exemptes de contaminants et, littéralement, d’« espèces vivantes étrangères ». Deux éléments sont essentiels à la culture axénique des Lemna : de bonnes techniques stériles et l’utilisation d’une hotte à flux laminaire. Il est aussi indispensable de surveiller les cultures de près et de vérifier régulièrement si elles sont contaminées. Une règle de base à appliquer à l’égard de toute culture axénique consiste à traiter la zone de manipulation des cultures de la même façon qu’un bloc opératoire. Une culture axénique est précieuse; si elle devient contaminée, il n’est pas toujours facile de l’assainir. Il faut toujours prévoir de nombreuses cultures filles pour s’assurer qu’au moins une culture reste stérile. Les conseils fournis ici devraient contribuer à réduire la contamination éventuelle des cultures.

Maintien de la propreté du laboratoire

On devrait nettoyer périodiquement les zones de culture, comme les tables de travail ou les tablettes où se trouvent les cultures stériles, à l’aide d’une solution d’hypochlorite de sodium (agent de blanchiment) à 1 % afin de réduire la quantité d’acariens détriticoles, de bactéries et de spores fongiques. Il faut nettoyer la zone à l’aspirateur avant d’employer cette solution afin d’éliminer les contaminants organiques présents, car ceux-ci atténueront l’efficacité du traitement. On devrait toujours utiliser une solution fraîchement préparée et la laisser agir pendant au moins 20-30 min sur les surfaces traitées. Une fois le contenant ouvert, la solution de blanchiment concentrée se conserve de 4 à 6 mois, selon qu’elle est exposée ou non à la lumière et à des températures élevées. Comme solution de rechange, on peut mélanger de l’hypochlorite de calcium granulaire dans de l’eau, à raison d’environ 10 g/L, ce qui donnera une solution possédant une teneur en chlore disponible de 70 %. La poudre sèche a pour avantage supplémentaire de se conserver longtemps : si elle est gardée au sec et au frais dans un contenant hermétique, on peut l’entreposer jusqu’à 10 ans, sans qu’elle subisse de dégradation importante. V. l’annexe 1 qui suit pour plus de détails sur la préparation de ces solutions.

Hotte à flux laminaire : fonctionnement et entretien

Il est très important d’utiliser une hotte à flux laminaire pour le maintien des cultures axéniques, et de bonnes procédures d’entretien sont essentielles au rendement de la hotte. Si l’on manipule les cultures axéniques en l’absence d’une hotte à flux laminaire, on expose celles-ci à une contamination à long terme. On peut se procurer des hottes peu coûteuses, dont le prix varie entre 1 000 $ et 3 000 $, auprès de Envirco Corporation, 1185 Mt. Aetna Road, Hagerstown, MD 21740, États-Unis (tél. : 1-800-645-1610).

Le filtre à particules à haute efficacité (HEPA) constitue l’élément le plus important d’une hotte à flux laminaire. L’air de la pièce est aspiré dans l’unité et passe à travers un préfiltre qui retient les contaminants grossiers (charpie, poussière, etc.). L’air est ensuite comprimé et entraîné derrière le filtre HEPA puis à travers celui-ci en un écoulement laminaire. L’air purifié ressort au-dessus de l’ensemble de la surface de travail sous forme de lignes parallèles, et ce, à une vitesse uniforme. Le filtre HEPA supprime environ 99 % des bactéries et des spores fongiques de plus de 22 µm de diamètre présents dans l’air. Pour que son rendement soit maximal, il devrait être remplacé approximativement tous les 7 ans. Il convient de vérifier régulièrement le filtre pour détecter toute fissure ou tout dommage attribuable à des instruments coupants. Un professionnel d’une entreprise spécialisée dans les filtres (p. ex. H.E.P.A. Filter Services Inc.; tél. : 1-800-669-0037) devrait vérifier chaque année la vitesse d’écoulement laminaire afin de repérer toute zone obstruée ou endommagée.

S’il n’existe pas de service d’évaluation ou si votre budget ne vous permet pas d’assumer les coûts d’un tel service, vous pouvez vérifier l’efficacité de la hotte à l’aide de plaques à la gélose pour essais de stérilité (v. la rubrique « Essai de stérilité des Lemna » ci-dessous). Il est indiqué de vérifier périodiquement l’efficacité de la hotte au moyen de cette méthode entre les visites du spécialiste des filtres. Répartir les plaques au centre de la table de travail et les laisser ouvertes pendant au moins 24 h, avec la hotte en marche. Noter l’emplacement de chaque plaque numérotée. Fermer les plaques, les sceller à l’aide de deux feuilles de Parafilm et les laisser dans un endroit chaud et sombre pendant au moins 5 jours afin de surveiller la croissance bactérienne ou fongique. Si ce test montre que certaines parties du filtre HEPA sont défectueuses, il est possible de réparer le filtre en injectant un produit d’étanchéité à base de silicone, à la condition que les zones endommagées soient peu étendues. Les réparations étendues entraîneront une certaine turbulence de l’air dans la zone de travail. Idéalement, on devrait confier les réparations à une entreprise spécialisée dans l’équipement doté de filtres HEPA.

En théorie, les hottes à flux laminaire devraient être laissées en marche en permanence. Si cela n’est pas possible, il convient d’installer une lampe ultraviolette germicide afin de stériliser toutes les surfaces. Le ventilateur soufflant de la hotte devrait être mis en marche au moins 30 min avant l’utilisation afin de s’assurer que l’air présent dans la hotte est stérile.

Il est recommandé de laisser une lampe ultraviolette allumée lorsque la hotte n’est pas utilisée. Si cela n’est pas faisable, on devrait la laisser allumée au moins pendant la nuit et l’éteindre juste avant d’utiliser la hotte. Si elle est mal employée, une lampe ultraviolette peut occasionner des brûlures de la peau et des yeux. L’observation des recommandations suivantes assurera une utilisation sûre et fiable des lampes germicides :

• Afficher des mises en garde près de la lampe.
• Nettoyer l’ampoule au moins toutes les deux semaines; après avoir débranché la lampe, essuyer l’ampoule avec un chiffon humecté d’alcool.
• Des facteurs comme l’âge de la lampe et un mauvais entretien peuvent réduire le rendement de celle-ci. Mesurer la puissance de rayonnement de l’ampoule au moins deux fois par année à l’aide d’un UV-mètre ou remplacer l’ampoule lorsque le rayonnement diminue à 70 % de sa puissance nominale (après un an, environ, d’usage normal). Si aucun UV-mètre n’est disponible, remplacer l’ampoule une fois par année.

Il faudrait nettoyer la zone de travail sous la hotte, y compris le dessus et les côtés de la table de travail, au moyen d’un agent nettoyant comme Bio-Clean, Cidex, Sporocidin (VWR) ou Viralex (Canadawide). L’éthanol est un bon désinfectant microbien, mais il n’est pas recommandé comme agent de stérilisation, car il ne constitue pas un fongicide ou un virucide efficace et il ne détruira pas les spores bactériennes. L’alcool (p. ex. l’éthanol) à des concentrations inférieures à 90 % est plus efficace du fait que l’eau servant à le diluer permet une meilleure pénétration des parois cellulaires bactériennes. La gamme optimale de concentrations se situe entre 70 % et 80 %; le temps de contact ne devrait pas être inférieur à 10 min. On vaporise les agents de nettoyage sur la surface à traiter, puis on les laisse agir pendant le laps de temps approprié avant de les essuyer avec des essuie-tout ou des chiffons non pelucheux. Il faut nettoyer la surface de travail avant et après chaque utilisation.

La hotte doit être dégagée. Il faut maintenir une voie directe et non obstruée entre le filtre HEPA et la zone de manipulation des cultures à l’intérieur de la hotte. Les particules qui se détachent des objets non stériles (contenants de solutions, mains, etc.) contaminent l’air en aval de ceux-ci. Éviter de conserver de grands contenants dans la hotte.

Il faudrait vérifier qu’il n’y a aucune accumulation de poussière dans les préfiltres; ceux-ci devraient être lavés tous les 2-3 mois, selon le degré d’empoussièrement de la zone de travail. On devrait les assécher entièrement avant de les remettre en place. Les préfiltres non lavables devraient être jetés lorsqu’ils sont poussiéreux.

Stérilisation des anses et autres instruments

Les becs Bunsen et autres brûleurs à gaz à flamme continue sont efficaces, mais ils peuvent créer de la turbulence et perturber ainsi l’écoulement d’air protecteur de l’enceinte à flux laminaire; en outre, la chaleur produite par la flamme continue peut endommager le filtre HEPA. S’il faut utiliser un brûleur à gaz, on devrait en choisir un doté d’une veilleuse; au moins 20 cm devraient séparer le brûleur du filtre HEPA. On pourrait aussi envisager l’utilisation d’un stérilisateur électrique. On peut également employer des anses et des aiguilles en plastique jetables pour les travaux de culture si l’on ne dispose pas d’un incinérateur électrique ou d’une flamme au gaz.

Nettoyage des mains

Avant de procéder à une manipulation ou à un repiquage, enlevez vos bagues et lavez vos mains à fond avec un savon antibactérien, puis avec un nettoyant (p. ex. One-Step, Endure ou éthanol dilué à 70 %). Portez une attention particulière aux parties de vos mains qui peuvent entrer en contact avec les récipients de culture ou les anses de transfert. Des gants d’examen (p. ex. Nitrile) peuvent être utilisés; dans ce cas, il faut les vaporiser d’éthanol avant de manipuler les cultures.

Préparation et stérilisation des milieux d’essai

L’autoclavage constitue la technique de stérilisation des milieux de culture la plus répandue et la garantie ultime de stérilité (y compris pour détruire les virus). Les autoclaves commerciaux sont le plus indiqués, mais les autocuiseurs de différentes capacités conviennent également. La stérilisation exige le maintien d’une pression de 15 psi et d’une température de 121 °C pendant 15 min dans la totalité du liquide (il faut prévoir des périodes plus longues pour des volumes plus élevés, soit environ 25 min pour 100-200 mL, 30 min pour 200-1 000 mL, 45 min pour 1-2 L et 60 min pour >2 L). Il est préférable d’autoclaver le milieu en petits lots afin de réduire la durée de l’autoclavage efficace et de prévenir tout changement chimique du milieu en raison d’une longue exposition à des températures élevées. On devrait éviter de mettre des charges trop élevées dans l’autoclave, car il faudra plus de temps pour qu’elles atteignent la température de stérilisation, sans compter le risque que le milieu ne soit pas stérilisé adéquatement.

Pour savoir si la température voulue a été atteinte, on devrait apposer, sur l’extérieur des récipients contenant le milieu d’essai et sur les emballages du matériel à stériliser, une bandelette indicatrice thermosensible qui change de couleur. De telles bandelettes NE SONT PAS une garantie de stérilité - elles indiquent seulement qu’une procédure de stérilisation a été appliquée. Il est impératif de vérifier que les volumes importants de milieu d’essai ou que les charges élevées placés dans l’autoclave ont atteint la température de stérilisation voulue. On peut se servir de bioindicateurs vendus sur le marché dans des ampoules scellées (p. ex. Raven Biological Laboratories), ou encore d’intégrateurs chimiques à bande de couleur (p. ex. STEAMPlus Steam Sterilization Integrator, de SPS Medical). Il existe une autre méthode de rechange simple : on place un petit morceau de ruban à autoclave dans une pipette Pasteur, on scelle la pointe de celle-ci à la chaleur et on bouche l’autre extrémité à l’aide d’un tampon ouaté. Après avoir attaché une ficelle à la pipette, on abaisse celle-ci dans le milieu, en maintenant l’extrémité dotée du tampon ouaté à 10-15 cm au-dessus de la surface du liquide. On fixe au moyen d’une bande adhésive l’autre extrémité de la ficelle sur l’extérieur du flacon, ce qui permet de retirer facilement l’indicateur. On récupère l’indicateur une fois l’opération terminée et l’on confirme que sa couleur a changé également. Cette dernière méthode n’est pas aussi fiable que celle faisant appel à des bioindicateurs ou à des intégrateurs chimiques à bande de couleur.

Il faudrait vérifier régulièrement l’efficacité de l’autoclave au moyen d’essais avec des bioindicateurs renfermant des spores bactériennes. Il existe sur le marché des trousses d’indicateur d’essai (p. ex. VWR, n^o de cat. 55710-014) qui utilisent des spores de Bacillus stearothermophilus rendues non viables à 121 °C (250 °F). Pour l’essai, on autoclave des bandelettes ou des ampoules de spores de B. stearothermophilus, on les met à incuber pendant 48 h dans un bouillon de soja trypsique, puis on observe tout indice de croissance, ce qui indiquerait que l’autoclave ne fonctionne pas adéquatement.

On ne devrait pas remplir à plus des deux tiers de leur capacité les bouteilles et les tubes renfermant le milieu d’essai, et ce, pour éviter tout débordement causé par l’ébullition. Si l’on utilise des bouteilles munies d’un bouchon à vis, il faut laisser celui-ci légèrement dévissé. Les flacons peuvent être bouchés de manière lâche à l’aide d’une bonde faite de ouate non absorbante recouverte d’étamine et d’une « jupe » carrée faite de Bio-Shield Wrap (VWR 59100-234) ou d’une feuille d’aluminium. Après autoclavage, la soupape de sûreté de l’autoclave ne devrait pas être ouverte tant que la température n’a pas baissé à moins de 80 °C. Du fait que le pH du milieu s’élève pendant l’autoclavage, attendre au moins une journée avant d’utiliser le milieu pour que le pH se stabilise à la valeur établie avant la stérilisation.

Le procédé d’autoclavage peut avoir des effets néfastes sur le milieu, étant donné que des composants de ce dernier peuvent se désagréger après une exposition prolongée à la chaleur. À l’occasion, il peut y avoir précipitation du phosphate (blanc) et du fer (jaune). Pour contourner ce problème, on peut stériliser séparément les solutions de fer et de phosphate, puis les ajouter en asepsie après l’autoclavage. On peut aussi avoir recours à la stérilisation sur filtre (pores de 0,22 µm ou moins).

Les plaques à la gélose sont utiles pour le maintien à long terme des cultures de Lemna. On les prépare habituellement au moins deux jours avant leur utilisation, puis on les laisse sécher dans la hotte à flux laminaire avant de les sceller avec deux feuilles de Parafilm (VWR) ou de Duraseal (VWR ou Sigma). Si les plaques à la gélose ne sont pas utilisées une semaine, environ, après leur préparation, il faudrait les envelopper dans une pellicule plastique, les retourner, puis les entreposer à la température ambiante pendant quelques jours, ce qui permettra de surveiller toute trace de contamination avant de les mettre au réfrigérateur. Dans le cas des géloses inclinées, placer les tubes à un angle de 45° et laisser la gélose prendre; les bouchons doivent être légèrement dévissés afin de prévenir une condensation excessive. Après le séchage, bien resserrer les bouchons et réfrigérer les géloses inclinées après les avoir laissées à la température ambiante afin de surveiller toute trace de contamination. Les géloses inclinées et les plaques à la gélose peuvent être entreposées pendant plusieurs mois à 4 °C.

Techniques de transfert

Il faudrait toujours observer les procédures suivantes lors du transfert des cultures :

• Tous les récipients de culture, outils de transfert, pipettes avec tampon ouaté et milieux doivent être stérilisés et prêts à l’emploi. Les milieux de culture devraient être maintenus à la température ambiante.
• Les anses devraient d’abord être trempées dans l’éthanol dilué à 95 % avant d’être stérilisées au moyen d’un stérilisateur à flamme ou électrique pendant 15 secondes, soit jusqu’à ce qu’elles soient chauffées au rouge. Les refroidir par contact avec la gélose ou un liquide stériles avant de les utiliser pour prélever les plantes. La flamme d’un brûleur à gaz stérilise efficacement les petits objets en verre ou en métal, comme les anses d’inoculation, mais il faut éviter de « roussir » les plantes en les mettant en contact avec les objets chauffés à la flamme.
• Dégager la hotte à flux laminaire pour que rien n’entrave l’air circulant entre le filtre HEPA et la zone de repiquage. Rien ne doit venir en contact avec le filtre HEPA.
• Nettoyer à fond la table de travail sous la hotte immédiatement avant chaque utilisation, tout en prenant soin de ne pas vaporiser de solution sur le filtre HEPA.
• Se laver les mains à fond ou enfiler des gants (voir ci-dessus) immédiatement avant de procéder au repiquage.
• Passer à la flamme toutes les ouvertures des récipients de culture en verre pendant 15 secondes avant et après le transfert de nouvelles cultures dans ces récipients.
• Pour réduire au minimum la contamination, toujours procéder aux transferts à au moins 6 po (15 cm) à l’intérieur du devant de la hotte afin de s’assurer que l’air de la pièce ne contamine pas la zone de travail. Dans la mesure du possible, exécuter l’opération à la hauteur des yeux.
• Ne rien toucher qui viendra en contact avec la culture; s’il y a contact, procéder à une nouvelle stérilisation avant de continuer.
• Pour les repiquages dans des tubes munis de bouchons à vis, dévisser légèrement ces derniers avant de prélever les plantes à transférer afin d’empêcher celles-ci de tomber de l’anse pendant l’ouverture de tubes dont le bouchon est vissé très serré.
• Éviter de parler, de chanter, de siffler, de tousser ou d’éternuer dans la direction des objets qui devraient être stériles. Les cheveux longs, s’ils ne sont pas attachés, peuvent être une source de contamination.
• Travailler rapidement afin de réduire au minimum le temps pendant lequel les récipients de culture sont ouverts.
• Dans la mesure du possible, ne pas toucher les extrémités des couvercles des boîtes de Petri. Tenir les couvercles par le dessus.
• Sceller toutes les boîtes de Petri à l’aide de deux feuilles de Parafilm ou de Duraseal. Examiner soigneusement les boîtes pour détecter toute fissure. (L’odeur du milieu de culture attire les acariens détriticoles, et ceux-ci peuvent ramper jusque dans les plaques stériles.)
• Tous les 2-3 jours, vérifier que les plaques ne sont pas contaminées.
• Pour de meilleurs résultats, transférer les cultures toutes les 2-3 semaines.

Essai de stérilité des Lemna

Des contaminants comme les bactéries et les champignons microscopiques sont facilement visibles lorsque les Lemna sont cultivées dans un milieu enrichi de composants organiques (p. ex. le milieu E+ Hoagland). Si les plantes ne sont pas cultivées de façon courante dans un tel milieu, on devrait vérifier périodiquement qu’elles sont stériles en prélevant quelques sujets et en les plaçant dans un milieu E+ Hoagland renfermant 1 % de sucrose, 0,6 % de bactotryptone (ou de peptone) et 0,1 % d’extrait de levure. Cet essai peut se faire dans une culture liquide ou sur des plaques à la gélose. La contamination fongique ou bactérienne apparaît habituellement en quelques jours dans les solutions ou sur les plaques à la gélose. Si les solutions deviennent troubles ou que des colonies de bactéries ou de champignons croissent sur les plaques, on peut toujours avoir recours à la technique de décontamination décrite ci-dessous ou se procurer une nouvelle culture axénique d’une source extérieure.

Décontamination des Lemna

Si les Lemna sont contaminées, on peut les stériliser de nouveau, mais il faut pour cela du temps et de la patience. Ainsi, les plantes formant des grappes clonales devraient être séparées les unes des autres. Chaque plante devrait être trempée dans une solution d’hypochlorite de sodium à 0,5 % (solution de blanchiment Clorox^MC ou Purex^MC à 10 %) pendant au moins 1 min. Traiter les plantes pendant un laps de temps variable afin de s’assurer que l’on dispose d’au moins une culture vivante stérile. Il faut veiller à rincer les plantes avec plusieurs nouveaux milieux stériles ou de l’eau stérile avant de les transférer dans un milieu de croissance dilué (p. ex. un milieu Hoagland modifié renfermant 1 % de sucrose). Examiner les plantes après leur rinçage avec un milieu frais. Les plantes stérilisées adéquatement présenteront une petite partie verte dans la zone de bourgeonnement, le long du centre du thalle. S’il ne reste aucun bourgeon vert, le traitement a été trop long et la plante est morte. Étant donné qu’il ne reste qu’un petit bourgeon de croissance après la stérilisation de la surface, il peut s’écouler un certain temps avant que l’on dispose de suffisamment de matériel végétal pour les expériences.

D’après Landolt (1987), environ 1-10 % des plantes survivent habituellement à ce traitement et deviennent axéniques. Les plantes qui ont survécu (et qui ne sont pas contaminées ou infectées par une moisissure fongique ou des bactéries) peuvent être transférées dans un milieu enrichi, notamment un milieu E+ Hogland sous forme liquide ou sous forme solidifiée avec de la gélose Difaco-Bacto (1,25 %) dans des boîtes de Petri ou des tubes.

Conservation à long terme des Lemna grâce à la cryoconservation

La cryoconservation est une technique permettant d’entreposer indéfiniment des cellules vivantes à des températures ultrabasses. Des souches utiles de Lemna peuvent être conservées à de telles températures dans la phase liquide ou gazeuse de l’azote liquide afin de préserver leurs caractéristiques génétiques et de maintenir des cultures à long terme sans avoir à procéder à des repiquages (Day, 1995; Kartha, 1985).

Les techniques employées doivent réduire au minimum la formation de cristaux de glace intracellulaire, qui endommagent les membranes et les parois cellulaires. Les procédures de base de la cryoconservation supposent l’élimination de l’eau libre par des agents osmotiques, puis l’ajout de cryoprotecteurs, comme le sucrose ou le glycérol. On entrepose les cultures dans des cryovials, après quoi on les refroidit lentement jusqu’à -80 °C afin de réduire au minimum la formation de cristaux de glace avant de les immerger directement dans de l’azote liquide à -196 °C. On régénère les cultures en les décongelant rapidement dans un bain d’eau à 45 °C, puis on les repique dans un milieu frais.

Pour de plus amples renseignements, prière de consulter les sites Web suivants :

Armstrong, Wayne. Treatment of the Lemnaceae (en anglais seulement). Palomar University

Cross, John. The Charms of Duckweed (en anglais seulement).

McCauley, D. Aseptic technique (en anglais seulement). GlobalRPh Inc.

Annexe 1 : Solutions pour la désinfection des surfaces de travail

Solution d’hypochlorite de sodium à 1 % (0,5 L)

1. L’agent de blanchiment de préparation commerciale est habituellement une solution d’hypochlorite de sodium à 5 % (eau de Javel). Préparer la dilution immédiatement avant emploi.
2. Utiliser une éprouvette graduée d’une capacité de 500 mL pour mesurer les 100 mL requis d’agent de blanchiment. Ajouter 400 mL d’eau distillée ou désionisée afin de diluer l’agent et d’obtenir 500 mL de solution.

Solution chlorée à partir d’une poudre

1. Ajouter 10 g d’hypochlorite de calcium granulaire à 1 L d’eau distillée.
2. Brasser vigoureusement et laisser le mélange reposer pendant 6 h ou toute la nuit. Porter des gants et un masque, car le chlore est corrosif. Si possible, préparer la solution sous une hotte.
3. Filtrer le surnageant dans un bidon en plastique propre et bien refermer. Si la solution est entreposée dans un contenant en verre, celui-ci devrait être conservé dans un endroit obscur.

Éthanol à 70 % (utilisé pour essuyer la hotte à flux laminaire et vaporiser les gants)

1. Utiliser une éprouvette graduée d’une capacité de 500 mL pour mesurer les 370 mL requis d’éthanol à 95 %.
2. Ajouter suffisamment d’eau distillée pour porter le volume de liquide à 500 mL.
3. Conserver la solution dans un contenant fermé hermétiquement.

Annexe G : Séries logarithmiques de concentrations convenant aux essais toxicologiques^{Note de bas de page 77}

Annexe H : Méthodes d’essai biologique et documents d’orientation publiés par la Section de l’élaboration et de l’application  des méthodes d’Environnement Canada^{Note de bas de page 79}