Stabilisation du pH pendant un essai de létalité d’un effluent d’eau usée chez la truite arc-en-ciel : chapitre 2

Section 2 : Options pour la stabilisation du pH d’effluents d’eau usée

• 2.1 Exigences générales
  • 2.1.1 Observations et mesures
  • 2.1.2 Échantillons d’eau usée chlorée
  • 2.1.3 Critères de validité de l’essai
• 2.2 Stabilisation du pH par injection de CO₂
  • 2.2.1 Appareillage pour la fourniture du mélange de CO₂
  • 2.2.2 Estimation du pourcentage de mélange de CO₂ dont on a besoin pour stabiliser le pH
  • 2.2.3 Réglages des débits du mélange de CO₂ et de l’air du laboratoire
  • 2.2.4 Maîtrise de la dérive du pH
• 2.3 Stabilisation du pH par recyclage
  • 2.3.1 Montage de la technique de recyclage
  • 2.3.2 Maîtrise de la dérive du pH
• 2.4 Stabilisation du pH au moyen d’un pH-mètre régulateur
  • 2.4.1 Bloc détendeur et solénoïde
  • 2.4.2 pH-mètre régulateur
  • 2.4.3 Maîtrise de la dérive du pH

Dans la présente section, on expose en détail chaque technique de stabilisation du pH d’un effluent d’eau usée :

1. la technique d’injection de CO₂ ;
2. la technique de recyclage ou recirculation ;
3. la technique du pH-mètre régulateur.

Dans l’essai de stabilisation du pH, on maintient le pH de l’échantillon à la valeur mesurée au début de l’essai (pH i) au moyen de l’une des trois techniques exposées ci-dessous. La procédure de stabilisation du pH n’annule pas et ne remplace pas la méthode d’essai de létalité aiguë en vigueur qui emploie la truite arc-en-ciel (EC, 2000), mais elle décrit des techniques « complémentaires ». Tous les essais doivent se conformer aux exigences et aux modes opératoires exposés dans la méthode SPE 1/RM/13. Cependant, l’emploi de ces techniques de stabilisation exige une surveillance et des rapports supplémentaires (respectivement le § 2.1 et la section 3).

2.1 Exigences générales

Les procédures de stabilisation du pH s’appliquent pendant les essais découlant de la méthode SPE 1/RM/13 [section 5 - essai à concentration unique ; section 6 - essai à concentrations multiples (CL50)]. Dans les deux cas, la concentration maximale analysée est celle de l’effluent d’eau usée non dilué.

Avant la réalisation des essais à des fins réglementaires, certaines études préliminaires peuvent être nécessaires sur chaque échantillon d’eau usée, puisque les caractéristiques chimiques de ce dernier peuvent varier d’une installation à l’autre (ou même à l’intérieur d’une même installation). Par exemple, les échantillons d’eau usée ou d’eau de contrôle/de dilution de faible alcalinité ou de faible dureté sont susceptibles d’importantes dérives du pH en raison de leur pouvoir tampon minimal et, par conséquent, ils exigent moins de CO₂. Les données obtenues au cours de la mise au point de la technique d’injection de CO₂ et de la technique du pH-mètre régulateur ont montré que les deux pouvaient donner de bons résultats avec des échantillons d’effluent d’eau usée sans baisse significative du pH. On peut éviter les difficultés posées par les eaux de contrôle/de dilution ayant un faible pouvoir tampon en injectant dans chacune des solutions d’essai et dans le contrôle uniquement la quantité de CO₂ suffisante pour maintenir le pH stable. On s’assure ainsi qu’un contrôle à faible pouvoir tampon recevra probablement moins de CO₂ que la solution d’eau usée d’essai possédant un pouvoir tampon plus grand. On réduit ainsi la probabilité de surmortalité chez les organismes de contrôle par suite de l’ajout d’une quantité excessive de CO₂, tout en atteignant l’objectif de la stabilisation du pH, qui est de maintenir le pH de l’échantillon à sa valeur initiale.

Si on applique les techniques d’injection de CO₂ ou du pH-mètre régulateur, les essais devraient se dérouler dans des aquariums de verre ou dans des récipients en matériaux non toxiques (par ex. polyéthylène, polypropylène). Avec la technique de recyclage, il est recommandé d’employer des aquariums de verre, en raison de la nécessité d’employer des couvercles spécialement adaptés, dont on a besoin pour maîtriser l’espace de tête au-dessus de la solution d’essai.

Durant l’essai, il faut, pour l’aération de toutes les solutions, utiliser de l’air comprimé du laboratoire exempt d’huile, au débit régulé de 6,5 ± 1 mL/min. · L. Il faut préparer toutes les solutions pour les essais avant le début de l’aération. Les solutions d’essai étant prêtes, il faut les aérer toutes pendant 30 min. au débit de 6,5 ± 1 mL/min. · L. Il faut commencer à stabiliser le pH quand l’aération débute. Après 30 min. d’aération, il faut doser l’oxygène dissous dans au moins la solution la plus concentrée (normalement l’effluent à 100 %). Si (et seulement si) le taux d’oxygène dans la solution la plus concentrée représente moins de 70 % ou plus de 100 % de saturation de l’air, il faut poursuivre l’aération (c’est-à-dire avant l’exposition du poisson) de toutes les solutions, y compris du ou des contrôles, au débit de 6,5 ± 1 mL/min. · L. Cette période d’aération doit se terminer à la survenue de la première de l’une des éventualités suivantes : après 90 min. d’aération ou à l’atteinte de 70 % de saturation dans la solution d’essai la plus concentrée (ou de 100 %, si la sursaturation est manifeste). Immédiatement après, il faut répartir les poissons au hasard dans chaque solution d’essai, et il faut faire débuter l’essai, qu’un taux de 70 à 100 % de saturation ait été atteint ou non dans toutes les solutions d’essai.

Environnement Canada (2000) exige un diffuseur propre pour le bullage de l’air comprimé. Pour la technique d’injection de CO₂, il faut des diffuseurs pour injecter le mélange de CO₂. Pour la technique de recyclage et celle qui utilise un pH-mètre régulateur, il faut utiliser des diffuseurs pour l’air de laboratoire. Pour la technique employant le pH-mètre régulateur, on recommande fortement l’emploi d’une pipette de verre pour la fourniture du CO₂ gazeux. L’emploi d’une pipette de verre assure une meilleure maîtrise de la quantité de CO₂ fourni à l’échantillon lorsque l’on met en marche le pH-mètre régulateur.

Les résultats expérimentaux peuvent être confus ou difficiles à interpréter dans les cas où il existe une différence de pH (> 0,2 unité de pH) entre l’échantillon d’effluent d’eau usée à 100 % et l’eau de dilution du laboratoire utilisé pour la préparation des solutions filles pour un essai à concentrations multiples. Il faut maintenir le pH de chaque concentration d’effluent (c’est-à-dire à 100, 50, 25, 12,5, 6,25 %) à la valeur mesurée au début de l’essai (préalablement à toute aération) à chaque concentration d’exposition et dans le contrôle. Toutefois, un gradient des valeurs observées du pH pendant l’essai pourrait entraîner une réponse sans rapport avec la dose. Dans ce cas (c’est-à-dire lorsque l’on observe une mortalité dans les dilutions de l’effluent, mais non dans l’effluent à 100 %), on ne devrait pas calculer de CL50. Les résultats correspondant à l’échantillon d’effluent d’eau usée à 100 % continueront d’être considérés comme acceptables, à la condition de satisfaire à tous les autres critères de validité (voir § 2.1.3).

2.1.1 Observations et mesures

Outre les observations et les mesures décrites dans la méthode SPE 1/RM/13 (par ex. la température, l’oxygène dissous, la couleur, la turbidité, l’odeur ainsi que les matières flottantes ou les matières décantables), le laboratoire doit mesurer le pH, la teneur en ammoniac total et la dureté de chaque échantillon d’effluent d’eau usée. Il faut doser l’ammoniac total avec une précision d’au moins deux décimales. Il faut mesurer l’alcalinité si l’on doit utiliser la technique d’injection de CO₂. On ne doit effectuer les mesures qu’après avoir mélangé à fond le contenu de tous les récipients et avoir ajusté la température à 15 ± 1 °C. Il faut mesurer ces variables dans l’échantillon non dilué après combinaison des sous-échantillons (par exemple aliquotes d’un échantillon réparties entre au moins deux récipients). Dans l’essai à concentrations multiples (CL50), il faut mesurer le pH, la teneur en ammoniac et la dureté de chaque solution d’essai ; avec la technique d’injection de CO₂, il faut mesurer l’alcalinité dans l’échantillon d’effluent d’eau usée à 100 %.

Avant d’aérer les solutions d’essai, il faut calculer la concentration d’ammoniac non ionisé à partir du résultat du dosage de l’ammoniac total et du pH initial (pH i) de l’échantillon, la température de 15 °C et du pH initial (pH i = pH mesuré dans l’échantillon composé à 100 %, à 15 °C, avant toute aération des solutions d’essai). Il ne faut pas utiliser de technique de stabilisation du pH si la concentration d’ammoniac non ionisé dans un échantillon d’eau usée égale ou dépasse 1,25 mg/L.

Il faut mesurer et consigner le pH au début de l’essai (lors du transfert des poissons dans l’effluent d’eau usée et dans le contrôle) ainsi qu’à la fréquence exigée par chaque mode opératoire, à toutes les concentrations et dans le contrôle (§ 2.2.4, 2.3.2, 2.4.3). En outre, on peut devoir surveiller le pH pendant les 8 premières heures de l’essai lorsque l’on utilise la procédure de stabilisation du pH. Pendant le reste de l’essai, il faut mesurer le pH à toutes les 24 h (au moins) pour faire le suivi des variations du pH et s’assurer que ce dernier respecte les critères de validité de l’essai (§ 2.1.3). Une surveillance plus fréquente (par exemple deux fois par jour) peut être nécessaire si l’échantillon d’effluent d’eau usée possède un faible pouvoir tampon (faible alcalinité), ce qui peut entraîner des variations rapides du pH.

2.1.2 Échantillons d’eau usée chlorée

Le laboratoire devrait doser le chlore résiduel total (C.R.T.) de chaque échantillon d’effluent d’eau usée qu’il a reçu (c’est-à-dire en même temps que l’ammoniac). Ce dosage est obligatoire si le poisson manifeste du stress ou un comportement atypique au début de l’essai. Si l’échantillon renferme du chlore (C.R.T. > 0,1 mg/L), on ne devrait pas employer de procédures de stabilisation du pH, puisqu’il y aura mortalité de truites, que celles-ci se montreront stressées ou qu’elles présenteront un comportement atypique, indépendamment de la dérive du pH. Le laboratoire d’essais devrait contacter la station de traitement des eaux usées pour en revoir les opérations (c’est-à-dire pour déterminer si l’eau usée est chlorée, puis déchlorée avant son rejet) et obtenir des données sur les antécédents de l’eau usée (c’est-à-dire pour déterminer les concentrations typiques de chlore total dans le rejet final), parce que la stabilisation du pH serait inutile si la teneur en chlore total dans les échantillons d’effluent d’eau usée était létale. On trouvera dans Environnement Canada (2008) des renseignements supplémentaires sur la marche à suivre pour éliminer le chlore des échantillons d’effluent d’eau usée à des fins d’étude.

2.1.3 Critères de validité de l’essai

L’essai n’est pas considéré comme valide si l’une des éventualités suivantes se présente :

1. le pH moyen de la solution d’essai de l’effluent d’eau usée à 100 % dont on a stabilisé le pH s’écarte de ± 0,2 unité par rapport au pH initial ;
2. le pH instantané dans la solution d’essai de l’effluent d’eau usée à 100 % dont on a stabilisé le pH s’écarte de ± 0,3 unité par rapport au pH initial ;
3. plus de 10 % des poissons (données combinées si on utilise des répétitions) dans le contrôle dont on a stabilisé le pH meurent ou manifestent un comportement atypique ou stressé.

Dans le cas d’un essai à concentrations multiples, le calcul de la CL50 ne doit pas tenir compte des concentrations d’exposition n’ayant pas satisfait aux critères relatifs au pH^{Note de bas de page 3}.

2.2 Stabilisation du pH par injection de CO₂

Dans la technique de stabilisation du pH par injection de CO₂, on neutralise l’augmentation du pH par aération des solutions d’essai d’eau usée (y compris du contrôle) à l’aide d’un mélange constitué de 15 % de CO₂, de 21 % d’oxygène (O₂) et de 64 % d’azote (N₂) [dit mélange de CO₂] mélangé avec de l’air du laboratoire fourni par une autre source.

Outre l’équipement et les installations ordinaires exigés pour la réalisation de la méthode SPE 1/RM/13, cette technique exige le matériel et l’équipement ci-dessous :

• bouteille certifiée de gaz comprimé contenant un mélange de 15 % de CO₂, de 21 % d’O₂ et de 64 % de N₂, avec raccord de sortie CGA 590, d’un fournisseur homologué de gaz comprimés (par exemple Praxair, Air Liquide, BOC Gases) ;
• détendeur CGA 590 en laiton chromé, à double détente (par exemple Concoa, Fisherbrand, Restek, Cole-Parmer, VWR) ;
• six débitmètres de 150 mm à vannes réglables (plage approximative de mesure de 0 à 137 mL/min.) [par exemple Cole Parmer, Gilmont, Scienceware]^{Note de bas de page 4} ;
• six débitmètres de 150 mm à vannes réglables (plage approximative de mesure de 0 à 300 mL/min.) [par exemple Cole Parmer, Gilmont, Scienceware)^{Note de bas de page 4} ;
• raccords mâles en plastique 1/8 sur 3/16 po (0,32 sur 0,48 cm) ou l’équivalent pour relier débitmètres et tubes de plastique ;
• tubes d’air flexibles en plastique ;
• tuyaux en Tygon® (R-3606) ou l’équivalent ;
• raccords tronconiques en Y, en plastique, pour les tubes d’air (par exemple VWR, Fisherbrand) ;
• raccords assortis de plastique ;
• claviatures de vannes à deux et à quatre voies (par exemple Cole Parmer).

Des schémas et des photos des montages employés pour la technique d’injection de CO₂ sont montrés dans les figures 1 à 5.

Figure 1. - Schéma du montage nécessaire à un essai à six concentrations employant la technique d’injection de CO₂.

Deux débitmètres sont affectés à chaque concentration. L’un mesure le débit du mélange de CO₂, l’autre le débit de l’air du laboratoire. Un débitmètre mesure un débit maximal de 300 mL/min., l’autre un débit maximal de 137 mL/min. Cela permet une fourchette de 0,5 à 15 % de CO₂ pour des volumes d’échantillon de 20 à 40 L. le pourcentage final de CO₂ détermine quel débitmètre régule les débits de CO₂ et de l’air du laboratoire. Se reporter au paragraphe sur la technique d’injection de CO₂ pour connaître la façon de déterminer le pourcentage final de CO₂. Le débit final alimentant un aquarium doit être de 6,5 mL/min. · L (c’est-à-dire que, pour 20 L d’échantillon, le débit final sortant des deux débitmètres doit totaliser 130 mL/min.).

Figure 2. - Vue de face du tableau de contrôle et des débitmètres pour l’application de la technique d’injection de CO₂.

À chaque concentration correspondent deux débitmètres, dont les plages de mesure sont respectivement de 137 et de 300 mL/min. Le pourcentage requis de CO₂ détermine lequel régule le débit du mélange de CO₂ ou celui de l’air du laboratoire.

Figure 3. - Vue de derrière du tableau de contrôle pour l’application de la technique d’injection de CO₂ montrant les liaisons

Figure 4. - Aquariums de verre employés pour la technique d’injection de CO₂

Figure 5. - Seaux de plastique employés pour la technique d’injection de CO₂

2.2.1 Appareillage pour la fourniture du mélange de CO₂

Le CO₂ est débité dans le récipient d’essai par une bouteille de gaz comprimé constitué d’un mélange de 15 % de CO₂, de 21 %, d’O₂, de 64 % de N₂, via un détendeur, un tube d’air flexible en Tygon® puis une claviature de vannes à quatre voies, un débitmètre, le mélange étant ensuite combiné à l’air normal du laboratoire par l’entremise d’un raccord de plastique en Y, puis alimentant les solutions d’essai au moyen d’un diffuseur. L’air normal du laboratoire est fourni via un tube d’air flexible en Tygon® R-3603, traverse un débitmètre et se combine à la veine du mélange de CO₂ au moyen du raccord en Y susmentionné (fig. 1 et 3).

On devrait bien arrimer la bouteille du mélange de CO₂ à proximité des enceintes expérimentales en l’enchaînant à un mur ou à une autre structure solide. Ne jamais utiliser d’huile ni de graisse sur le détendeur ou les raccords de la bouteille, ce qui pourrait contaminer le mélange de gaz purs ou créer un risque d’incendie.

2.2.2 Estimation du pourcentage de mélange de CO₂ dont on a besoin pour stabiliser le pH

On estime le pourcentage initial du mélange de CO₂ dont on a besoin pour stabiliser le pH en mesurant le pH initial (pH i) et l’alcalinité de la solution d’essai à 100 %. Dans un essai à concentrations multiples (CL50), on procède comme suit pour déterminer le pourcentage du mélange de CO₂ au début de l’essai : (i) il faut mesurer le pH initial (pH i) de chaque concentration ; (ii) il faut mesurer l’alcalinité de l’effluent d’eau usée à 100 %. On peut estimer l’alcalinité dans les solutions diluées restantes, d’après les valeurs connues de l’alcalinité de l’eau de contrôle/de dilution et de l’effluent d’eau usée à 100 %.

Une fois le pH initial et l’alcalinité déterminés, on consulte la table d’étalonnage du CO₂(tableau 1) pour estimer le pourcentage de CO₂ à appliquer à un pH initial et à une alcalinité donnés pour réguler le pH. Par exemple, une solution d’essai d’une alcalinité de 300 mg/L, en carbonate de calcium (CaCO₃), dont le pH initial est 7,1, exigera un apport final de 5 % de CO₂ pour maintenir le pH à sa valeur initiale. La table d’étalonnage du CO₂ sert uniquement à des fins d’estimation et d’approximation.

Il faudra corriger le pourcentage de CO₂ si le pH présente une tendance à la hausse ou à la baisse après le début de l’aération avec le mélange de CO₂. Par exemple, il faudrait augmenter le pourcentage du mélange de CO₂ si le pH présente une tendance à la hausse ou l’abaisser dans le cas contraire.

Le pourcentage de mélange de CO₂ exigé pour stabiliser le pH dépend des caractéristiques chimiques (c’est-à-dire de l’alcalinité ou du pouvoir tampon) de la solution d’essai. Par exemple, les échantillons d’effluent d’eau usée possédant un faible pouvoir tampon ont besoin de moins de CO₂ pour stabiliser le pH que les échantillons au pouvoir tampon élevé.

2.2.3 Réglages des débits du mélange de CO₂ et de l’air du laboratoire

Pour un essai à concentrations multiples (CL50) [5 concentrations d’essai plus contrôle], on aura besoin de six débitmètres dans la plage de 0 à 137 mL/min. et de six débitmètres dans la plage de 0 à 300 mL/min. Les vannes de tous les débitmètres sont réglables. Chaque concentration d’essai et chaque contrôle possède un débitmètre de chaque type : un pour réguler le débit du mélange de CO₂, l’autre pour réguler le débit de l’air du laboratoire.

Après avoir déterminé le pourcentage nécessaire de CO₂ (tableau 1), on peut ajuster le débit du mélange de CO₂ et de l’air du laboratoire pour obtenir le pourcentage requis de CO₂ au moyen des vannes ajustables des débitmètres. Le volume de la solution d’essai et le pourcentage final requis de CO₂ déterminent lequel des débitmètres servira à réguler soit le débit du mélange de CO₂, soit celui de l’air du laboratoire.

Les équations suivantes servent à déterminer les débits du mélange de CO₂ et d’air du laboratoire^{Note de bas de page 5}

(1) Débit combiné acheminé vers l'enceinte expérimental (ml/min.) = 6,5 mL/min. · L × volume de l'enceinte (L)

(2) Débit du mélange de CO₂ = [5 de CO₂ (d'après le tableau 1)] ÷ [% de CO₂ dans le mélange (c'est-à-dire 15 %)] × Débit combiné acheminé vers l'enceinte expériementale (1)

(3) Débit de l'air du laboratoire = Débit combiné acheminé vers l'enceinte expérimentale (1) - Débit du mélange de CO₂ (2)

En tout temps pendant l’essai, on peut ajuster le débit de CO₂ pour assurer la maîtrise du pH.

2.2.4 Maîtrise de la dérive du pH

La stabilisation du pH commence dès le début de l’aération au débit de 6,5 ± 1 mL/min. · L (voir § 2.1). Les débits d’aération (CO₂ et air du laboratoire) doivent totaliser 6,5 ± 1 mL/min. · L durant l’essai à toutes les concentrations d’exposition, y compris le contrôle (suivant la méthode SPE 1/RM/13). Par l’entremise d’un diffuseur, chaque enceinte expérimentale est aérée par un mélange d’air du laboratoire et de CO₂ au débit combiné de 6,5 ± 1 mL/min. · L dont le pourcentage de CO₂ permet de maintenir le pH moyen (à toutes les concentrations  d’effluent, à l’exclusion du contrôle) dans l’intervalle de ± 0,2 unité de pH et le pH instantané dans l’intervalle de ± 0,3 unité de pH par rapport au pH initial^{Note de bas de page 6}.

Il faut mesurer fréquemment le pH et apporter les ajustements appropriés au débit du mélange de CO₂ pour stabiliser le pH, particulièrement pendant les trois premières heures de l’essai. Pour la plupart, les ajustements du débit du mélange de CO₂ ont lieu dans les quelques premières heures de l’aération. Dans les jours suivants, probablement moins de corrections seront nécessaires (une ou deux fois par jour).

Il faut mesurer et consigner le pH immédiatement avant l’aération (pH i), à t = 0 h (début de l’essai, lors de l’introduction des poissons), puis à t = 0,5, 1, 2, 3, 24, 48, 72 et 96 h dans les enceintes de contrôle et les enceintes renfermant les concentrations d’exposition. On disposera ainsi de données montrant le maintien du pH durant l’essai. Il faut également mesurer et consigner le pH toutes les fois que l’on ajuste le débit du CO₂, après quoi il faut mesurer le pH dans les 30 min. ou moins qui suivent, pour s’assurer du maintien du pH. On consigne le pH final avant la fin de la période d’essai de 96 h si, à une concentration expérimentale, toutes les truites meurent.

Si le pH de la solution d’essai commence à diminuer dans les 30 premières minutes du début de l’aération, on devrait diminuer le pourcentage de CO₂ par pas de 0,5 % jusqu’à ce que le pH se maintienne à ± 0,2 unité de pH par rapport au pH initial. Si le pH de la solution d’essai commence à augmenter dans les 30 premières minutes du début de l’aération, on augmente le pourcentage de CO₂ par pas de 0,5 % jusqu’à ce que le pH se maintienne à ± 0,2 unité de pH par rapport au pH initial. On poursuit les ajustements du pourcentage de CO₂ par pas de 0,5 % jusqu’à ce que le pH se maintienne à ± 0,2 unité de pH par rapport au pH initial. Il faut consigner le pourcentage de CO₂ acheminé vers chaque enceinte expérimentale.

Dans les cas où l’eau de contrôle/de dilution possède un pouvoir tampon inférieur à celui de la solution d’essai de l’effluent d’eau usée, la quantité de CO₂ nécessaire au maintien du pH dans l’échantillon ne parviendrait probablement pas à le maintenir dans la fourchette de ± 0,2 unité par rapport au pH initial de l’eau de contrôle/de dilution du laboratoire. Dans un essai à concentration unique avec stabilisation du pH, il n’est donc pas nécessaire d’ajouter la même quantité de CO₂ à l’échantillon d’effluent d’eau usée à 100 % et au contrôle, puisque cette procédure de stabilisation du pH vise à combattre la dérive du pH de l’échantillon en remplaçant le CO₂ perdu, du fait de l’aération, par la solution d’essai originelle pendant l’essai de létalité aiguë employant des truites arc-en-ciel.

Il faut inspecter la conduite d’aération au moins une fois par jour afin d’assurer un apport continu du mélange de CO₂ et d’air du laboratoire à toutes les solutions d’essai.

2.3 Stabilisation du pH par recyclage

Cette technique permet de combattre l’augmentation du pH par recyclage (recirculation) du CO₂ en système fermé (Elliott et al., 2003). On fixe solidement un couvercle sur l’enceinte expérimentale, et l’air, qui renferme du CO₂, est recirculé dans l’espace de tête de l’enceinte au moyen d’une pompe à air, ce qui empêche la perte de CO₂ dans l’atmosphère ambiante et permet de maintenir le pH.

En sus des installations et de l’équipement ordinaires dont on a besoin pour appliquer la méthode SPE 1/RM/13, cette technique de stabilisation du pH requiert le matériel et l’équipement suivants :

• tubes de Tygon® (siphons et conduites d’air) ;
• pompes d’aération pour aquarium débitant 6,5 ± 1 mL/min. · L et compatible avec le couvercle (par exemple pompe Elite 799 & 800, de 115 V) ;
• pipettes à usage unique, de 10 mL ;
• couvercle permettant la recirculation [joints de néoprène, joints toriques et élastiques en place ; les couvercles sont fabriqués de manière à s’ajuster solidement aux enceintes expérimentales utilisées ; on peut les faire fabriquer et les acheter d’un transformateur de plastiques, par ex. Allwest Plastic Fabricators (en anglais seulement), d’Edmonton] ;
• fiole conique de 250 mL, servant de piège à condensats pour empêcher ces derniers d’entrer dans les débitmètres ;
• enceintes expérimentales (aquariums ou autres récipients tels que seaux).

Dans les figures 6 et 7, on trouvera le schéma et la photo du dispositif expérimental employant la technique de recyclage.

2.3.1 Montage de la technique de recyclage

Pour réduire l’espace de tête de l’enceinte, on remplit cette dernière jusqu’au bord avec l’échantillon, sans y plonger la pompe. On pose ensuite le couvercle, sans le fixer solidement, sur le dessus de l’enceinte. Le premier tube (n^o 1) d’air relie la pompe au piège à condensats (v. fig. 6), tandis que le deuxième tube d’air (n^o 2) relie le piège à condensats au débitmètre. Le troisième tube d’air (n^o 3) relie le débitmètre à un raccord se trouvant dans le couvercle de l’enceinte. Un quatrième tube d’air (n^o 4) est fixé au bas du même raccord et le relie à un diffuseur plongé dans l’échantillon. Un siphon est également fixé au couvercle pour prélever une aliquote de l’échantillon à toutes les 24 h d’observation, en vue de mesures physicochimiques. Il est réalisé par fixation d’un tube de Tygon® (n^o 5) à la partie supérieure d’un raccord fixé au couvercle et d’un autre tube de Tygon® (n^o 6) au bas du même raccord. Une pipette de 10 mL, fixée à l’extrémité de ce tube de Tygon® (n^o 6) plonge dans l’échantillon. Après le prélèvement de l’aliquote, s’assurer de ranger l’extrémité du siphon au-dessus du niveau de l’échantillon pour éviter de perdre de ce dernier. Par précaution, on peut obturer l’extrémité du siphon au moyen d’une pince. Il faut également prendre des précautions supplémentaires lors du prélèvement de sous-échantillons pour le contrôle des paramètres de qualité de l’eau (par exemple pH, température), une dépression pouvant se former et conduire à une perte notable d’échantillon de l’enceinte expérimentale.

On fixe solidement le couvercle et on étanchéifie le joint entre ce dernier et l’enceinte expérimentale en attachant tous les joints toriques et tous les élastiques aux ergots d’accrochage en plastique de l’enceinte expérimentale. La technique de recyclage ne donnera de bons résultats pour la stabilisation du pH que si le joint est étanche.

La présence, dans l’enceinte étanchéifiée, de solutions fortement colorées, opaques ou écumeuses pourrait rendre difficile la constatation des signes de stress et de mortalité chez le poisson. Il faut effectuer les vérifications et retirer les poissons morts le plus rapidement possible pour empêcher la dérive du pH.

Dans les échantillons d’effluent d’eau usée dont la DBO est élevée, on pourrait observer une baisse de la teneur en oxygène dissous pendant l’essai de létalité aiguë employant des truites arc-en-ciel lorsque le pH n’est pas stabilisé. Cette baisse pourrait être aggravée par l’emploi de la technique de stabilisation du pH par recyclage.

2.3.2 Maîtrise de la dérive du pH

La stabilisation du pH commence dès le début de l’aération et elle dure 30 min., au débit de 6,5 ± 1 mL/min. · L, avant l’introduction des poissons (voir § 2.1). Pour faire débuter l’aération, on fait démarrer la pompe et on ajuste le réglage des débitmètres. L’aération doit se faire au débit de 6,5 ± 1 mL/min. · L pendant la durée de l’essai, à toutes les concentrations d’exposition, y compris dans le contrôle (suivant la méthode SPE 1/RM/13).

À la fin de la durée requise d’aération (c’est-à-dire 30 min. au moins), on enlève les élastiques du point de prise d’échantillons du couvercle de toutes les concentrations. On ouvre le point de prise d’échantillons et on introduit les poissons, rapidement et au hasard. On referme le point de prise d’échantillons et on poursuit l’essai.

Figure 6. - Schéma du montage employé pour la technique de recyclage

Figure 7. - Aquariums de verre avec point de prise d’échantillons, pompe à air et couvercle pour l’application de la technique de recyclage

Il faut mesurer le pH et le consigner immédiatement avant toute aération (pH i), à t = 0 h (début de l’essai, lors de l’introduction des poissons), puis à 24, 48, 72 et 96 h dans le contrôle et à toutes les concentrations d’exposition. On obtient de la sorte les données montrant que le pH a été maintenu constant durant l’essai. Il est également recommandé de mesurer le pH à t = 0,5, 1 et 2 h, pour s’assurer de l’étanchéité du joint du couvercle. Il faut également mesurer et consigner le pH chaque fois que l’on ouvre l’enceinte expérimentale (c’est-à-dire pour en retirer les poissons morts). On consigne le pH final d’une concentration d’essai avant la fin des 96 h si la mortalité des truites y est de 100 %.

Il faut retirer aussi rapidement que possible tout poisson mort observé à chaque intervalle de 24 h. Pour cela, on défait les élastiques du point de prise d’échantillons sur le couvercle et on retire les poissons morts. On remet ensuite les élastiques pour étanchéifier l’enceinte expérimentale. Il importe d’agir rapidement à chaque ouverture de l’enceinte, puisqu’une perte de CO₂ pendant l’opération peut entraîner une augmentation du pH.

Une inspection visuelle au moins quotidienne doit être faite pour s’assurer du bon fonctionnement des conduites d’air, des pompes et des débitmètres.

2.4 Stabilisation du pH au moyen d’un pH-mètre régulateur

La technique de stabilisation du pH au moyen d’un pH-mètre régulateur utilise du CO₂ pur (ou un mélange de gaz constitué de 15 % de CO₂, de 21 % d’O₂ et de 64 % de N₂) avec des conduites séparées pour l’apport d’air du laboratoire. Si le pH s’élève au-dessus de la valeur de consigne, le régulateur entre en action, et du CO₂ est ajouté pour abaisser le pH. Une fois le pH revenu à la limite acceptable, l’injection de CO₂ s’arrête automatiquement.

Outre l’équipement et les installations ordinairement exigés pour la réalisation de la méthode SPE 1/RM/13, on a besoin, pour l’application de cette technique de stabilisation du pH, du matériel et de l’équipement suivants :

• solénoïdes (un pour chaque concentration d’exposition) pour réguler le débit de CO₂;
• bloc détendeur de CO₂ et vanne à pointeau ;
• bouteille certifiée de gaz comprimé (100 % de CO₂), d’un fournisseur homologué de gaz comprimé (par exemple Praxair) [nota : on peut également employer le mélange de gaz (15 % de CO₂, 21 % d’O₂ et 64 % de N₂) utilisé pour la technique d’injection de CO₂ afin de stabiliser le pH au moyen du pH-mètre régulateur] ;
• pH-mètre régulateur [par exemple American Marine Inc. (n^o de catalogue CRT4) ou l’équivalent ; disponible auprès de Fish Farm Supply, Elmira (Ontario)] ;
• pipettes de verre (1 mL) ;
• antiretours (par exemple disponibles auprès de Hagen®) ;
• divers raccords [tuyau de fer noir de 0,5 po (1,25 cm) pour gaz naturel, pour le montage servant à la détermination de la CL50 ; raccords à 90° de 0,5 po ; raccords en T de 0,5 po ; mamelons de 0,5 po sur 2,5 po ; tubes de Tygon® d’1/8 po de diamètre intérieur (0,32 cm), destinés à servir de liaison avec les pipettes ; mamelons de 0,5 po sur 6 (15,2 cm)].

Nous recommandons fortement l’emploi d’une pipette de verre pour la fourniture du gaz CO₂, car elle assure une meilleure maîtrise de la quantité de CO₂ fourni à l’échantillon lors de la mise en marche du pH-mètre régulateur. Les figures 8 à 13 sont constituées de diagrammes et de photos montrant le montage utilisé pour l’application de la technique du pH-mètre régulateur.

2.4.1 Bloc détendeur et solénoïde

Chaque détendeur est relié au bloc de mesure (claviature) [fig. 8 et 9]. Le détendeur de CO₂ est relié à une bouteille de CO₂. Ne jamais huiler ni graisser le détendeur ou les raccords de la bouteille, ce qui pourrait contaminer le mélange de gaz purs ou causer un risque d’incendie.

La claviature est relié au détendeur de la bouteille de CO₂ par un tube haute pression (0,25 po [0,64 cm] de diamètre extérieur) de polypropylène. Toutes les vannes à pointeau des solénoïdes doivent être en position hors tension. Le chapeau hexagonal autobloquant du détendeur du bloc à solénoïde est retiré pour montrer la vis de réglage (on pourra avoir besoin d’une clé hexagonale ou d’une clé Allen), et on tourne la vis dans le sens antihoraire jusqu’à ce qu’elle n’oppose plus de résistance.

On ouvre le robinet de la bouteille de CO₂ et on règle la pression à environ 40 lb/po². On ajuste la pression de travail sur le solénoïde (à l’aide de la clé hexagonale ou de la clé Allen) à environ 20 lb/po². On devrait vérifier l’étanchéité des joints au moyen de détersif à vaisselle diluée (la formation de bulles révèle la présence de fuites, et, le cas échéant, on devrait revérifier le montage et l’étanchéifier).

On fixe une longueur convenable de conduite à air en silicone (diamètre extérieur de 0,25 po) à la vanne à pointeau et on fixe l’autre bout à l’antiretour de la pipette (fig. 13).

2.4.2 pH-mètre régulateur

Il faut étalonner le pH-mètre régulateur (v. fig. 12) journellement à l’aide d’étalons certifiés de pH. Il faut fixer avant le début de l’essai la tolérance du pH-mètre régulateur (c’est-à-dire la sensibilité du réglage du pH) [± 0,2 unité de pH]. Pendant l’étalonnage, il faut retirer de la solution d’exposition les tubes à CO₂. Il faut étalonner rapidement l’appareil de mesure pour prévenir une variation du pH. Les consignes d’étalonnage et d’entretien devraient être fournies par le fabricant et elles devraient être étudiées avant le début de l’essai.

On place la sonde de pH du pH-mètre régulateur dans une seule solution d’essai pour la durée de l’essai (on peut temporairement retirer la sonde pour les besoins de l’étalonnage). On devrait fixer la sonde à 3-5 cm sous la surface de la solution d’essai. La pipette d’amenée du CO₂ devrait être située directement sous la sonde et attachée au conducteur de la sonde. Il importe de le faire pour maîtriser le pH avec précision. Une vanne antiretour à ressort (acier inoxydable) empêche un éventuel retour en arrière de liquide dans la conduite de CO₂ (fig. 13). On devrait utiliser des sondes de pH durable, afin de réduire le risque de fuite de solution de chlorure de potassium (KCl) de la sonde vers la solution d’exposition.

Figure 8. - Schéma du montage employé pour un essai à six concentrations utilisant la technique du pH-mètre régulateur

Figure 9. - Bloc solénoïde, détendeur et vanne à pointeau pour la technique du pH-mètre régulateur

Figure 10. - Montage expérimental pour la technique du pH-mètre régulateur

Figure 11. - Vue générale du montage employé pour l’essai de détermination de la CL50 utilisant la technique du pH-mètre régulateur

Figure 12. - Exemple de pH-mètre régulateur

Figure 13. - Conduite de CO₂ et antiretour

2.4.3 Maîtrise de la dérive du pH

La stabilisation du pH commence dès le début de la période d’aération de 30 min. au débit de 6,5 ± 1 mL/min. · L, avant l’introduction des poissons (voir § 2.1). Au début de l’aération, on ouvre le robinet principal de la bouteille de CO₂ à environ 40 lb/po². Le manomètre du détenteur du solénoïde devrait indiquer environ 20 lb/po².

Le débit de l’aération avec l’air du laboratoire doit se maintenir à 6,5 ± 1 mL/min. · L durant l’essai, à toutes les concentrations, y compris le contrôle (suivant la méthode SPE 1/RM/13). Chaque enceinte expérimentale est aérée par l’entremise d’un diffuseur, au débit de 6,5 ± 1 mL/min. · L. L’ajout de CO₂ augmentera légèrement le débit d’aération chaque fois que le régulateur de pH entre en action puis s’arrête afin de maintenir le pH moyen dans la solution d’essai à 100 % à ± 0,2 unité de pH et le pH instantané à ± 0,3 unité de pH du pH initial. L’augmentation du débit d’aération est considérée comme insignifiante, puisqu’elle ne survient que périodiquement, pour neutraliser l’augmentation du pH, et qu’elle devrait se maintenir dans des limites acceptables.

La mesure fréquente du pH et les corrections appropriées du débit de CO₂ sont cruciales pour la stabilisation du pH, notamment au cours des quelques premières heures de l’essai. Il faut surveiller étroitement la valeur du pH affichée par les pH-mètres régulateurs afin d’assurer le bon fonctionnement du solénoïde. Il importe que le régulateur se mette en marche et s’arrête pour réguler le débit de CO₂. Si le cycle de marche/arrêt ne survient pas en deux à cinq minutes de fonctionnement et que le solénoïde reste ouvert (sur tension), on devrait graduellement augmenter le débit de CO₂ au moyen de la vanne à pointeau jusqu’à l’obtention de la valeur requise de pH et à la fermeture du solénoïde.

Il faut mesurer et consigner le pH immédiatement avant toute aération (pH i), à t = 0 h (au début de l’essai, à l’introduction des poissons) puis à 24, 48, 72 et 96 h, dans le contrôle et à toutes les concentrations d’exposition. On obtiendra ainsi les données montrant que le pH a été maîtrisé durant tout l’essai. Il faut également mesurer et consigner le pH chaque fois que l’on ajuste manuellement le débit de CO₂. Après un ajustement, la mesure du pH doit avoir lieu dans les 30 min. ou moins qui suivent, pour s’assurer du maintien du pH. On prend une lecture finale du pH avant la fin de la période d’essai de 96 h si on observe un taux de mortalité des truites de 100 % dans une concentration d’essai.

Il faut faire des vérifications visuelles une fois par jour pour s’assurer du bon fonctionnement des pH-mètres régulateurs et des conduites d’air.