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Ce document vise à expliquer la décision réglementaire prise en vertu de la Partie 6 de la Loi canadienne sur la protection de l’environnement (1999) (LCPE 1999)^{Note de bas de page1}concernant la fabrication ou l’importation de Trichoderma reesei 1391A par Iogen Corporation dans une installation étanche.

Les renseignements pertinents concernant T.reesei;1391A ont été fournis conformément au paragraphe 29.11(4) du Règlement sur les renseignements concernant les substances nouvelles (Règlement sur les RSN) de la LCPE 1999.

La Direction des substances nouvelles d’Environnement Canada et le Bureau de l’évaluation et du contrôle des substances nouvelles de Santé Canada ont évalué l’information soumise par Iogen Corporation et d’autres données scientifiques disponibles en vue de déterminer si T.;reesei;1391A est une substance toxique ou pourrait devenir une substance toxique au sens de l’article 64 de la LCPE 1999.

Décision réglementaire :

En tenant compte des questions de danger et d’exposition et d’après l’évaluation des risques, Environnement Canada et Santé Canada ont déterminé que Trichoderma reseei 1391A n’est pas considéré comme toxique pour l’environnement ou la santé humaine au Canada au sens de l’article 64 de la LCPE (1999).

Par conséquent, la fabrication de T.;reesei;1391A ou son importation pour utilisation dans une installation étanche ou pour exportation uniquement sont autorisées après le 30 septembre 2001.

Cette évaluation ne comprend pas d’évaluation des risques pour la santé humaine dans un environnement professionnel, ni de l’exposition possible et des risques pour la santé humaine associés à l’utilisation de l’organisme dans un produit assujetti à la Loi sur les aliments et drogues ou en tant qu’élément d’un produit assujetti.

Annexe du Règlement sur les RSN : XVI (un micro-organisme fabriqué dans une installation étanche ou importé dans une installation étanche et non destiné à être introduit à l’extérieur d’une installation étanche ou destiné uniquement à l’exportation)
Identification de l’organisme : Trichoderma reesei 1391A
Déclarant: Iogen Corporation, 8 ch. Colonnade, Ottawa (Ontario)  K2E 7M6 Canada
Date de la décision : 30 septembre 2001
Utilisation proposée : Production dans une installation étanche de la nouvelle enzyme xylanase II à stabilité thermique améliorée par Trichoderma;reesei1391A génétiquement modifié.

Historique de la souche/modification génétique :

T.;reesei;1391A est dérivé d’un mutant auxotrophe de la souche parentale M2C38 par l’introduction d’un fragment du vecteur de transformation pFPX#2-TV. La souche parentale M2C38 est un dérivé de la souche publique T. reesei RUTC30. La  cassette de sélection utilisée dans la construction du vecteur de transformation contient un gène de Neurospora crassa servant de marqueur de sélection. La cassette d’expression est composée du gène structural modifié de la xylanase;II de T. reesei (xln2), sous le contrôle des séquences de régulation de T. reesei. La souche RUTC30, obtenue de l’American Type Culture Collection (ATCC), est un dérivé de la souche QM6a (ATCC 13631) qui a été isolée aux Iles Salomon au cours de la Seconde Guerre mondiale à partir de toile de coton (Kuhls et al., 1996). 

Examen des dangers :

En plus de l’information soumise par le déclarant, un examen du matériel de référence interne et une recherche exhaustive des ouvrages scientifiques ont été effectués afin de réunir l’information concernant les effets potentiellement nuisibles pour la santé humaine et pour l’environnement attribuables à T. reesei.

Les espèces de Trichoderma sont des champignons imparfaits, aérobies, métaboliquement versatiles (Nevalainen et al., 1994). Les espèces de Trichoderma se différencient principalement par le profil des ramifications des conidiophores et  la morphologie de la conidie.

En général, la fabrication industrielle à grande échelle de préparations enzymatiques de T. reesei se révèle sans danger dans de nombreuses industries, notamment dans la transformation de l’amidon et des aliments pour animaux, la fermentation, le maltage et le brassage de l’alcool de grains, l’extraction des jus de fruits et de légumes, l’industrie des pâtes et papiers ainsi que l’industrie textile (Hjortkjaer et al., 1986).

Il a été démontré que T. reesei est non pathogène et non toxique pour les animaux de laboratoire en bonne santé (Hjortkjaer et al., 1986). Toutefois, cette espèce peut se comporter comme un pathogène opportuniste chez les animaux immunodéprimés dans des conditions expérimentales extrêmes (Hjortkjaer et al., 1986). Rien n’indique que T.;reesei soit un pathogène absolu des végétaux ou des animaux, y compris l’espèce humaine.

Certaines espèces de Trichoderma peuvent produire des toxines sous certaines conditions; cependant, l’expérience pratique d’utilisation de T. reesei indique qu’il est peu probable que cette espèce soit toxigène (Hjortkjaer et al., 1986). Des tests effectués sur des préparations enzymatiques commerciales confirment qu’aucune substance antibiotique ou inhibitrice n’est produite pendant la croissance des souches industrielles de T. reesei (Hjortkjaer et al., 1986). En outre, des tests menés sur cette préparation enzymatique commerciale produite par la souche 1391A confirment le respect des recommandations en ce qui a trait aux quantités non détectables de la mycotoxine aflatoxine B1.

Bien que certaines espèces du genre Trichodermapuissent être utilisées comme agents de lutte biologique dans l’agriculture puisqu’il s’agit d’antagonistes connus de plusieurs champignons phytopathogènes, T.;reesei;1391A n’est pas un tel agent.

Aucun rapport n’indique que N. crassa, la source fongique du gène marqueur de sélection utilisé dans la construction du vecteur de transformation, soit un pathogène absolu. Le produit génique de N. crassa facilite la sélection de cette souche à partir d’un mélange d’autres micro-organismes et il est peu probable qu’il présente un danger pour l’environnement étant donné qu’il a de nombreux équivalents fonctionnels chez la plupart des organismes vivants.

T. reesei et N. crassa sont tous deux classifiés comme organismes de niveau de biosécurité;1 par l’ATCC. De plus, T. reesei a été désigné comme organisme du groupe de risque 1 par le Bureau de la sécurité des laboratoires de l’Agence de santé publique du Canada.

Les fragments d’ADN utilisés dans la construction du vecteur de transformation sont bien caractérisés et ils ne contiennent aucun grand fragment non défini. Les séquences codant la résistance à l’ampicilline, utilisées pour la construction du vecteur de transformation, ont été enlevées de la construction finale. Les modifications génétiques effectuées en vue du développement de T.;reesei;1391A ne soulèvent pas d’inquiétude quant à l’augmentation de la virulence ou du pouvoir pathogène vis à vis des espèces humaines, animales et végétales ni en ce qui a trait à un danger accru pour l’environnement. Le phénotype résultant de la modification est bien caractérisé et il est peu probable qu’il influe sur le comportement normal de T. reesei.

Des études de toxicité sur des xylanasesindigènes de Aspergillus et de Thermomyces administrées par voie orale à des rats et des souris n’ont révélé aucun effet nocif (Pederson et Broadmeadow, 2000). L’essai de mutation inverse de Salmonella typhimurium n’a pas indiqué que les xylanases indigènes étaient mutagènes et ces enzymes n’ont pas causé d’aberrations chromosomiques dans les lymphocytes humains cultivés in vitro (Pederson et Broadmeadow, 2000).

Examen des aspects liés à l’exposition :

T. reesei est une espèce courante de champignons saprophytes dans le sol. Les espèces Trichoderma sont courantes dans les sols de toutes les régions climatiques et elles sont particulièrement répandues dans la litière des forêts mixtes et humides de feuillus (Nevalainen et al., 1994).

T.;reesei;1391A est fabriqué uniquement comme intermédiaire dans la production d’une nouvelle enzyme xylanase II dans une installation étanche et il n’est pas destiné à être disséminé à l’extérieur de l’installation étanche. Par conséquent, la probabilité d’exposition de l’environnement et de la population en général est considérée d‘être faible. 

Selon les Lignes Directrices en Matière de Biosécurité en Laboratoire (1996) de Santé Canada, les procédures sécuritaires recommandées pour la manipulation, l’entreposage et le transport des agents du groupe de risque 1 sont les suivantes;: le port de vêtements protecteurs appropriés pour la manipulation de l’organisme est recommandé, notamment le sarrau, les chaussures fermées et les gants. Ce niveau ne requiert aucune caractéristique spéciale de conception autre que celles qui conviennent à un laboratoire fonctionnel et bien conçu, régi par de bonnes pratiques de microbiologie. On recommande l’entreposage et le transport dans un contenant dûment étiqueté, conçu, fabriqué, rempli, fermé, scellé et bien entretenu de façon à ce que, dans des conditions normales de transport et de manutention, il n’y ait pas de déversement accidentel.

Le processus de fabrication respecte les normes du niveau d’étanchéité des Good Large Scale Practices (GLSP) telles que décrites à l’annexe K du document du National Institutes of Health (NIH) des États-Unis intitulé Guidelines for Research Involving Recombinant DNA Molecules (directives du NIH). Les déclarants doivent décrire les procédures visant à restreindre l’exposition potentielle des travailleurs. Celles-ci comprennent entre autres le port d’un équipement de protection (des masques respiratoires avec filtres à particules, des visières ou des lunettes de sécurité avec protecteurs latéraux, des gants de caoutchouc, des sarraus ou des combinaisons, tous approuvés par le National Institute for Occupational Safety and Health (NIOSH) pour les travailleurs exposés de façon chronique aux poussières ou aérosols d’enzymes au cours d’opérations comme les transferts ou la préparation des bouillons de fermentation.  

Des précautions sont mises en place et utilisées par le déclarant afin de s’assurer que les gaz d’échappement et les aérosols émanant du fermenteur sont décontaminés par rayonnement UV et au moyen d’un système de cyclone avec épurateur. Le fermenteur est équipé d’un système d’alarme activé en cas de pression élevée, de débordement de mousse et d’un bas niveau; il est aussi entouré d’une digue en cas de déversement important. Conformément à la réglementation provinciale, avant d’être expédié dans un site d’enfouissement ou de compostage enregistré, l’amas de cellules utilisées est traité chimiquement à l’aide d’un composé d’ammonium quaternaire dont l’efficacité est de 99,999;%. Étant donné que T.;reesei;1391A n’est pas intrinsèquement dangereux, on prévoit que la probabilité de dommages importants pour l’environnement ou pour la santé humaine découlant de cette voie d’exposition sera minime.

Références :

Santé Canada, Laboratoire de lutte contre la maladie (1996). Lignes directrices en matière de biosécurité en laboratoire, 2e édition, Kennedy, M.E., éd., 84 p.

Hjortkjaer, R.K.,  Bille-Hansen, V., Hazelden, K.P., McConville, M., McGregor, D.B., Cuthbert,
J.A., Greenough, R.J., Chapman, E., Gardner, J.R., et Ashby, R (1986). Safety
evaluation of Celluclast®, an acid cellulase derived from Trichoderma reesei, Journal of
Food and Chemical Toxicology, 24(1), p. 55-63.

Kuhls, K., Lieckfeld, E., Samuels, G.J., Kovacs, W., Petrini, O., Gams, W., Borner, T., et
Kubicek, C.P (1996). Molecular Evidence that the asexual industrial fungus Trichoderma reesei is a clonal derivative of the ascomycete Hypocrea jecorina. Proc. Nat. Acad. Sci.  USA, 93, p, 7755-7760.

Nevalainen, H., Suominen, P., et Taimisto, K (1994). Minireview on the safety of Trichoderma
reesei. Journal of Biotechnology. 37, p. 193-200.

Pedersen, P.B. et Broadmeadow, A (2000). Toxicological studies on Thermomyces
lanuginosus xylanase expressed in Fusarium venenatum, intended for use in food. Food
Additives and Contaminants, 17(9), p. 739-747.