Méthode d’essai biologique : essai sur la fécondation chez les échinides ou oursins globuleux et oursins plats, chapitre 3

Section 1 : Introduction

• 1.1 Contexte
• 1.2 Caractéristiques générales et utilisation des échinides dans des essais

1.1 Contexte

Au Canada et ailleurs dans le monde, les essais toxicologiques en milieu aquatique servent à mesurer, à prévoir et à réglementer le rejet de substances ou de matières qui pourraient être nocives pour les organismes aquatiques en milieu naturel. Il y a deux décennies, reconnaissant qu’une seule méthode d’essai ou un seul organisme d’essai ne pouvait répondre aux besoins d’une démarche globale en matière de conservation et de protection de l’environnement, le Groupe intergouvernemental sur les essais écotoxicologiques (v. annexe B) a proposé de mettre au point et de normaliser une batterie d’essais de toxicité monospécifiques en milieu aquatique, qui seraient généralement acceptables et qui permettraient de mesurer différents types d’effets toxiques chez des organismes représentatifs de différents niveaux trophiques et groupes taxinomiques (Sergy, 1987). Un essai portant sur le succès de la fécondation à l’aide de gamètes d’oursins globuleux ou d’oursins plats a ensuite été choisi parmi les essais toxicologiques en milieu aquatique afin de satisfaire aux exigences d’Environnement Canada en matière d’essais.

Environnement Canada a publié la première édition de la présente méthode d’essai biologique en décembre 1992, le Rapport SPE 1/RM/27 (EC, 1992c), et l’a modifiée en novembre 1997. Après 15 ans d’application dans les laboratoires d’essai des secteurs public et privé, Environnement Canada a reconnu qu’il fallait modifier des aspects précis de la méthode. La révision a commencé par l’établissement d’un questionnaire et sa distribution aux laboratoires d’essais toxicologiques du Canada et des États-Unis ayant déjà mené des essais sur la fécondation chez les échinides. Le questionnaire avait pour but de recueillir des détails sur les espèces d’échinide utilisées pour les essais et sur les conditions de maintien et d’acclimatation des organismes, de même que sur les techniques de provocation du frai et de fécondation utilisées par les divers laboratoires utilisant la méthode biologique. Le cas échéant, les indications des laboratoires ayant répondu au questionnaire ont été intégrées dans la présente méthode. Les révisions apportées aux procédures d’essai sur sédiment (eau de porosité) sont principalement fondées sur les résultats d’une étude interlaboratoire sur l’amélioration (plus grande sensibilité de l’essai et réduction de l’influence des facteurs confusionnels sur les résultats) de la composante de l’essai sur l’eau de porosité (Miller, 2008).

La présente édition (la deuxième) comporte de nombreuses améliorations procédurales, des mises à jour et des conseils plus explicites, de même que des instructions sur les méthodes statistiques révisées (analyses de régression) à utiliser pour le calcul des effets sur la fécondation (inhibition), qui constituent un paramètre d’essai.

Le présent rapport décrit les méthodes universelles applicables à un essai sur la fécondation au moyen de gamètes d’échinides. Il décrit également des ensembles particuliers de conditions et de modes opératoires prescrits ou recommandés pour l’essai visant à évaluer différents types de substances ou de matières [p. ex., des échantillons de substance chimique, d’effluent, d’eau réceptrice, de lixiviat, d’élutriat ou d’eau interstitielle (eau de porosité) provenant d’un sédiment ou d’une autre matière solide semblable; v. figure 1]. Les méthodes et conditions applicables à la conduite de l’essai sont définies et, au besoin, expliquées dans des notes en bas de page.

En décrivant les conditions expérimentales et les méthodes figurant dans le présent document, on s’est efforcé de trouver le juste milieu entre les coûts et les considérations scientifiques et pratiques, tout en s’assurant que les résultats seront assez exacts et précis pour la plupart des situations auxquelles ils pourraient s’appliquer. Les auteurs supposent que l’utilisateur connaît dans une certaine mesure les essais de toxicité en milieu aquatique. Le présent document renferme des indications pour un certain nombre d’applications et d’options d’essais. Il ne renferme pas d’instructions explicites qui pourraient être exigées dans un protocole réglementaire ou une méthode de référence, bien qu’il soit conçu comme un guide utile pour des applications de ce type, notamment.

Pour obtenir des conseils sur la mise en œuvre de la présente méthode et d’autres essais biologiques et sur l’interprétation et l’application des données sur les paramètres, prière de consulter le rapport SPE 1/RM/34 (EC, 1999).

Figure 1 Éléments à prendre en compte dans la détermination des conditions et méthodes d’essai adaptées à différents types de matières ou de substances

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1.2 Caractéristiques générales et utilisation des échinides dans des essais

Les oursins globuleux et les oursins plats appartiennent à l’embranchement des échinodermes, sous-embranchement des échinozoaires et classe des échinidés, et c’est pourquoi on peut les désigner collectivement sous le nom d’« échinides ». Parmi les autres membres de cet embranchement (qui ne sont cependant pas utilisés pour cet essai), on compte les étoiles de mer, les ophiures, les fausses étoiles de mer, les holothuries, les crinoïdes ou lis de mer et les comatules. On trouve partout dans le monde des représentants de cet embranchement, qui compte ~6 000 espèces vivantes connues. Sept espèces d’oursin globuleux et trois espèces d’oursin plat vivent dans les eaux marines côtières du Canada.

On considère que les échinides et les autres représentants du même embranchement sont des invertébrés évolués et complexes sur le plan structural. Ils possèdent de nombreuses caractéristiques élaborées et beaucoup de points communs avec les cordés, notamment pour ce qui est du mode de développement embryonnaire et de certains processus biochimiques. Ils présentent une structure radiale apparente -- leur corps est composé de cinq parties disposées autour d’un axe central -- qui cache une symétrie bilatérale primaire. Les échinides possèdent un squelette interne véritable recouvert d’un mince épiderme. L’endosquelette est constitué de petites plaques calcaires unies les unes aux autres; chez l’oursin globuleux et l’oursin plat, ces plaques sont fusionnées et forment une enveloppe solide appelée « test ». Les échinides et les autres représentants de l’embranchement sont pourvus d’un cœlome (cavité corporelle) bien développé, dont la plus grande partie entoure les organes internes (figure 2). Le système aquifère (« hydraulique »), constitué de canaux en forme de tubes qui parcourent tout le corps, constitue une autre partie du cœlome; ce système sert au mouvement des tubes ambulacraires associés à la locomotion et à d’autres fonctions.

Les oursins globuleux sont de forme sphérique et recouverts d’épines, tandis que les oursins plats sont aplatis suivant l’axe dorso-ventral et ont généralement la forme d’un disque (figure 2). Ils reposent sur leur face ventrale (orale). La bouche de l’oursin globuleux est entourée d’une membrane péristomiale. Au cours de l’essai décrit ici, on doit injecter une solution chimique à travers cette membrane dans le cœlome. Chez l’oursin plat, on doit faire l’injection dans la bouche. L’anus de l’oursin globuleux est situé sur la face aborale (dirigée vers le haut), mais chez l’oursin plat, il est situé sur la même face que la bouche.

Les sexes sont séparés, mais aucune caractéristique externe ne les distingue. Les grosses gonades internes (v. figure 2) s’ouvrent, sur la face aborale, par 5 pores génitaux chez l’oursin globuleux et 4 chez l’oursin plat. Un des pores de l’oursin globuleux est situé sur la plaque madréporique, une large plaque visible du test où aboutit le système aquifère de l’animal.

Les gamètes (spermatozoïdes et œufs) sont rejetés à travers les pores génitaux dans la mer, où la fécondation a lieu.

Le développement de l’oursin globuleux, depuis l’œuf jusqu’au dernier stade larvaire (celui des « plutéus »), est d’un grand intérêt sur le plan embryologique : en 1980, plus de 5 000 articles avaient été publiés sur le sujet (NRC, 1981). C’est ce qui explique que, depuis de nombreuses décennies, on utilise des larves d’oursin globuleux dans les essais toxicologiques (Lillie, 1921; Drzewina et Bohn, 1926; Bougis, 1959). Une étude particulièrement élaborée a été réalisée au début du XX^e siècle sur les effets de la toxicité des métaux sur la fécondation chez l’oursin globuleux (Hoadley, 1923). L’oursin globuleux et l’oursin plat sont maintenant utilisés couramment comme organismes types dans les essais toxicologiques (Dinnel et coll., 1987, 1988) et un large bassin de données toxicologiques s’est constitué (Kobayashi, 1984).

L’essai sur la fécondation chez les échinides est sensible. Ainsi, des effluents municipaux ont eu un effet très marqué sur la fécondation des œufs à des teneurs 10 fois moins élevées que celles ayant causé la mort de 50 % des têtes-de-boule lors d’un essai de 4 jours (Oshida et coll., 1981). Des 6 essais de toxicité sublétale (eau de mer et eau douce) réalisés dans le cadre d’une étude interlaboratoire sur la toxicité d’effluents en Californie, l’essai sur la fécondation chez les échinides se classait aux deuxième et troisième rangs pour ce qui est de la sensibilité (Anderson et coll., 1991). L’essai de 80 min était plus sensible aux effluents provenant d’une station municipale d’épuration des eaux usées que les essais de 48 h avec des embryons et des larves d’huître et de crabe (Dinnel et Stober, 1987). On a obtenu des résultats variables quant à la toxicité comparée de métaux et de composés organiques, selon qu’il s’agissait d’un essai sur la fécondation, d’un essai de luminescence bactérienne ou d’un essai de létalité aiguë avec des poissons et des crustacés. Les essais avec des échinides pouvaient être 10, 100 ou 1 000 fois plus sensibles que les autres et, dans certains cas, 10 fois moins sensibles (Nacci et coll., 1986). Les résultats des essais sur la fécondation chez les échinides indiquent que ces essais étaient aussi sensibles que ceux avec des embryons et des larves de crabe, de calmar et de poisson; comparativement aux essais de létalité aiguë avec des poissons de mer, ils étaient assez sensibles aux métaux, mais beaucoup moins aux pesticides (Dinnel et coll., 1989). Dans le cas d’effluents de fabriques de pâtes et papiers, le National Council of the Paper Industry for Air and Stream Improvement (NCASI, 1992) mentionne les résultats de travaux de Johnson et coll. (1990), qui indiquent que les essais avec des embryons et des larves d’huître étaient ~10 fois plus sensibles que les essais sur la fécondation chez les échinides. Par contre, ces derniers essais étaient au moins aussi sensibles que les essais sur la reproduction d’algues rouges et, souvent, jusqu’à 10 fois plus sensibles que les autres essais de toxicité sublétale en milieu marin sur la croissance et le développement de larves de poisson (capucette et méné tête-de-mouton) ou de mysis (crevette) juvénile (Schimmel et coll., 1989).

Figure 2 Aspect général des échinides

a. Vue en coupe d’un oursin globuleux type (Arbacia sp.), montrant les pores génitaux situés sur la face aborale. On n’a représenté que 2-3 piquants et pieds ambulacraires, qui sont très nombreux. b. Face orale (généralement dirigée vers le bas) d’un oursin plat type. c. Face aborale d’un oursin plat montrant les pores génitaux. [Dessins de M.A. White, d’après Storer et coll. (1979) et Barnes (1974).]

L’essai sur la fécondation est un essai sensible de toxicité sublétale. Les gamètes d’échinides correspondent à un des stades les plus vulnérables du développement, sinon au stade le plus vulnérable du cycle biologique, d’où leur grande sensibilité à différents toxiques (Koyabashi, 1980, 1984). Cependant, comme la durée de l’essai est très courte par rapport à la durée de vie des espèces (quelques années), il ne constitue pas un essai de toxicité chronique. L’essai sur la fécondation décrit dans le présent document ne remplace pas les essais de toxicité chronique avec des échinides, car il ne permet peut-être pas d’estimer les effets d’expositions de longue durée. On prévoit toutefois qu’il peut donner des résultats qui s’approchent davantage de ceux des essais de toxicité chronique que ne le ferait un essai de toxicité létale classique avec une espèce marine ou dulcicole (p. ex., EC, 1990a, 1990b, 1990c).

La précision de cet essai semble satisfaisante. Selon l’U.S. Environmental Protection Agency (USEPA, 2002), les coefficients de variation (CV) intralaboratoire des CI₅₀ et des CI₂₅ des toxiques de référence utilisés lors d’essais avec une espèce d’échinide (Arbacia punctulata) étaient de 23-48 % et de 29-55 %, respectivement. En comparant les CI₅₀ du cuivre obtenues par 6 laboratoires lors d’essais sur 4 espèces d’échinide, menés dans le cadre d’un programme d’évaluation de la toxicité d’effluents, on obtenait un CV de 74 %, contre un CV de 29-38 % pour des essais de toxicité sublétale avec une seule espèce (reproduction de Ceriodaphnia et premiers stades de têtes-de-boule et d’huîtres; Anderson et Norberg-King, 1991). En comparant les CI₂₅ du cuivre au cours de 5 essais monospécifiques effectués par différents laboratoires canadiens, on a obtenu des CV de 62 %, 65 %, 75 %, 82 % et 110 % (oursins globuleux de 3 espèces exposés pendant 20 min). Les CV des CI₅₀ des mêmes essais étaient plus faibles, soit 23 %, 48 %, 57 %, 80 % et 94 % (Miller et coll., 1992). Ces CV interlaboratoire, dont la moyenne était de 79 % pour les CI₂₅ et de 63 % pour les CI₅₀, ont une précision comparable à celle des analyses chimiques, dont le CV moyen se situait entre 30 % et 60 % par suite d’une comparaison interlaboratoire des résultats d’analyses chimiques de polluants d’intérêt prioritaire (Rue et coll., 1988; Gosset et coll., 2003). Les résultats inédits d’essais comparatifs interlaboratoire commandités par l’USEPA semblent corroborer ces résultats : CV de 57 % pour les essais sur la fécondation de 40 min et CV de 86 % pour les essais de 80 min (NCASI, 1992).

Au Canada, avant 1992, l’essai sur la fécondation chez les échinides a été utilisé dans plusieurs laboratoires gouvernementaux et industriels effectuant des essais de toxicité en milieu aquatique. Des méthodes d’essai normalisées ont été décrites en Colombie- Britannique (MECB, 1990; van Aggelen, 1988) ainsi que par des sociétés d’experts-conseils (Beak, 1988; EVS, 1989). À l’échelle nationale, un groupe fédéral-provincial (GITA, 1991) a commandité une étude sur des méthodes d’essai, menée par certains laboratoires d’Environnement Canada (v. annexe C). D’autres études interlaboratoire ont été réalisées l’année suivante par des laboratoires fédéraux, provinciaux (ministère de l’Environnement de la Colombie-Britannique) et privés (Miller et coll., 1992). Les essais avec des échinides ont été étudiés et recommandés par un scientifique d’Environnement Canada (Wells, 1982, 1984), mais aucun organisme fédéral canadien n’a publié de méthode normalisée avant 1992.

Depuis sa parution en 1992 (et sa modification en 1997), l’Essai sur la fécondation chez les échinides (oursins verts et oursins plats) d’Environnement Canada (SPE 1/RM/27) a été utilisé couramment dans deux importants programmes découlant de la Loi canadienne sur la protection de l’environnement (LCPE); il a aussi été employé dans le cadre de deux règlements d’application de la Loi sur les pêches du Canada. Aux termes du Programme d’immersion en mer, l’essai de toxicité sublétale de l’eau de porosité d’un sédiment sur la fécondation chez les échinides sert à déterminer si des déblais de dragage peuvent être immergés en mer (LCPE, 1999; Gouvernement du Canada, 2001). Aux termes du Programme de suivi des effets sur l’environnement, l’essai sur la fécondation chez les échinides permet d’évaluer la toxicité sublétale d’effluents de fabriques de pâtes et papiers et de mines de métaux, rejetés dans le milieu marin (MPO, 1992, 2002).

Aux États-Unis, plusieurs groupes ont proposé des méthodes d’essai de toxicité sublétale avec des échinides. L’USEPA a mis au point une méthode qui fait autorité en ce qui a trait aux essais avec les espèces d’échinide indigènes de la côte atlantique (USEPA, 1988, 1994, 2002) et de la côte pacifique (Chapman, 1991, 1992a; USEPA, 1995). L’American Society for Testing and Materials a aussi mis au point des essais sur la fécondation (ASTM, 1990), mais seul l’essai avec des embryons d’échinide a été publié (ASTM, 2002). De plus, le NCASI (1992) a fait une critique des méthodes récentes applicables surtout aux essais sur des effluents de fabriques de pâtes et papiers. En outre, un certain nombre de sociétés d’experts-conseils et d’autres laboratoires de biologie marine ont mis par écrit leurs propres méthodes (v. annexe D).

De nombreux auteurs et groupes d’auteurs ont publié des articles présentant des méthodes normalisées. Parmi ceux-ci, on note les articles de Kobayashi, Dinnel et coll., et Pagano et coll. Certains de ces articles apparaissent dans les Références et de nombreux autres figurent dans la Bibliographie (v. annexe E).

De nombreuses raisons motivent l’utilisation d’un essai sur la fécondation chez les échinides comme méthode d’évaluation de la toxicité sublétale dans les milieux marins au Canada. En règle générale, l’essai est rapide, sensible et relativement simple. Il présente notamment les avantages suivants (NRC, 1981; Dinnel et Stober, 1985; Esposito et coll., 1986; Dinnel et coll., 1987) :

• la biologie et le cycle biologique des principales espèces sont bien documentés;
• ces organismes sont présents en grand nombre sur les trois côtes canadiennes;
• la récolte d’oursins globuleux et d’oursins plats adultes en eau peu profonde ne présente aucune difficulté;
• le maintien des organismes adultes en laboratoire est simple, et les conditions peuvent aisément être modifiées de façon à prolonger la période du frai;
• des gamètes de qualité et de sensibilité uniformes peuvent être obtenus;
• le succès de la fécondation est un indicateur sensible et fondamental de la sublétalité;
• l’essai sur la fécondation est rapide et économique, car il est de peu d’envergure et facile à réaliser, et il ne nécessite que des installations et de l’équipement ordinaires;
• les œufs d’échinides sont déjà haploïdes au moment de leur libération, contrairement à ceux de la plupart des animaux, et c’est pourquoi il n’y a pas de délais;
• le paramètre de l’essai est relativement simple et objectif;
• on trouve des échinides partout dans le monde, et ils sont fréquemment utilisés comme espèces marines types à des fins de réglementation et de recherche. On peut facilement les expédier et les utiliser dans des laboratoires éloignés des océans.

En plus de servir aux études de la toxicité générale en milieu marin, l’essai sur la fécondation chez les échinides semble convenir à l’identification de constituants sublétaux d’effluents complexes à l’aide de la méthode d’identification et d’évaluation de la toxicité (IET) décrite dans USEPA (1991a, 1991b).

Le présent rapport « générique » a pour objet de fournir des méthodes d’essai canadiennes normalisées pour l’évaluation de la toxicité sublétale de diverses substances ou matières sur les gamètes d’échinides. Il privilégie certaines options parmi celles que renferme un cadre normalisé, notamment le choix des espèces, la durée de l’exposition, le type d’essai (une seule concentration de la substance ou de la matière à l’étude, à résultat unique, ou plusieurs concentrations), les volumes d’essai et le type d’eau utilisée pour la dilution et les témoins. Les méthodes d’essai avec des échinides déjà publiées n’ont pas les mêmes paramètres et n’abordent pas de la même façon les questions telles que l’ajustement du pH, l’adaptation des modes opératoires aux objectifs, le choix de l’eau témoin/de dilution et le traitement des échantillons contenant une quantité appréciable de solides ou de matière flottante. Le rapport est censé servir à l’évaluation de la toxicité sublétale d’échantillons de substance chimique, d’effluent, de lixiviat, d’élutriat, d’eau réceptrice et de liquide provenant de sédiments et de matières solides semblables. On y justifie également les démarches choisies.

La méthode préconise l’utilisation d’animaux acclimatés à l’eau de mer, de même que l’emploi d’eau de mer comme eau de dilution et eau témoin. Selon les objectifs de l’essai, l’eau de mer peut être reconstituée ou naturelle, mais sa salinité devrait être voisine de celle de l’eau de mer naturelle. Pour évaluer la toxicité létale et sublétale de substances chimiques ou d’eaux usées qui sont ou qui doivent être rejetées dans les milieux d’eau douce ou qui s’y trouvent déjà, il existe d’autres essais avec des poissons acclimatés à l’eau douce ou avec d’autres organismes dulcicoles sensibles (v. annexe A).