Méthode d’essai biologique : essai sur la fécondation chez les échinides ou oursins globuleux et oursins plats, chapitre 4

Section 2 : Organismes d'essai

• 2.1 Espèces
• 2.2 Étapes du cycle biologique, taille et provenance des organismes
• 2.3 Maintien et acclimatation des adultes dans le laboratoire
  • 2.3.1 Généralités
  • 2.3.2 Réservoirs de maintien
  • 2.3.3 Éclairage
  • 2.3.4 Eau
  • 2.3.5 Température
  • 2.3.6 Oxygène dissous
  • 2.3.7 pH
  • 2.3.8 Alimentation
  • 2.3.9 Nettoyage des réservoirs
  • 2.3.10 Maladie et mortalité

2.1 Espèces

L’essai doit être mené avec une des espèces énumérées ci-dessous.

• Strongylocentrotus droebachiensis (O.F. Müller) - L’oursin vert est une espèce circumpolaire présente sur les côtes atlantique et pacifique du Canada ainsi que dans l’océan Arctique, jusqu’au 80^e parallèle.
• Strongylocentrotus purpuratus (Stimpson) - Cette espèce, appelée oursin violet du Pacifique dans le présent rapport (et communément appelé oursin violet), est présente sur la côte pacifique, du Canada jusqu’en Basse-Californie (Meinkoth, 1981).
• Dendraster excentricus (Eschscholtz) - Cette espèce d’oursin plat est présente sur la côte pacifique, du Canada en allant vers le sud. Dans le présent rapport, on utilise son nom commun courant, soit clypéastre excentrique (Meinkoth, 1981).
• Arbacia punctulata (Lamarck) - L’oursin violet de l’Atlantique (Mienkoth, 1981) est présent sur la côte atlantique des États-Unis, de Cape Cod jusqu’aux Caraïbes, de même que dans le golfe du Mexique.
• Lytechinus pictus (Verrill) - L’oursin blanc est présent sur la côte de la Californie jusqu’à Panama.

Les 4 premières espèces énumérées ici peuvent être prélevées sur une ou plusieurs côtes canadiennes. On peut se procurer les 5 espèces auprès de fournisseurs de matériel biologique, qui se chargeront de les expédier au laboratoire.

Toutes les espèces énumérées ci-dessus figurent sur la liste des échinides couramment utilisés en laboratoire (NRC, 1981), et la plupart ont été employées à maintes reprises dans les essais de toxicité (v. annexe D). D’après les renseignements reçus des laboratoires du Canada et des États-Unis en réponse au questionnaire distribué avant l’établissement de cette deuxième édition de la méthode (v. 1.1), l’oursin vert (S. droebachiensis) est, parmi les 5 espèces candidates incluses dans la première édition du rapport SPE 1/RM/27, celle qui a été le moins utilisée. Dans une perspective canadienne, il est cependant souhaitable d’utiliser l’oursin vert, étant donné qu’il s’agit de la seule des 5 espèces d’échinide mentionnées ci-dessus qui soit présente dans les océans Pacifique, Atlantique et Arctique. Des essais récents ont permis de confirmer que les œufs d’oursin vert sont relativement gros (3-4 fois plus gros que ceux des 4 autres espèces), possèdent des membranes de fécondation très visibles et affichent de bons taux de fécondation dans l’eau de mer non contaminée (Jackman, comm. pers., 2008). C’est pour ces raisons d’ordre géographique et biologique que l’oursin vert a été conservé comme espèce d’essai dans cette deuxième édition du rapport SPE 1/RM/27.

En général, les résultats des essais toxicologiques sur la fécondation chez les échinides semblent similaires, quelle que soit l’espèce étudiée (Kobayashi, 1984; Nacci et coll., 1986). On peut cependant observer de légers écarts sur le plan de la sensibilité, selon le toxique utilisé pour l’essai. Par exemple, le clypéastre excentrique semble ~1,4 fois plus sensible au dodécyl sulfate de sodium que l’oursin violet du Pacifique et 1,7 fois plus sensible aux effluents de fabriques de pâtes au sulfite blanchies que l’oursin vert (NCASI, 1992). Dans une étude plus récente portant sur 3 espèces d’oursin globuleux (oursin violet du Pacifique, oursin violet de l’Atlantique et oursin blanc) et 1 espèce d’oursin plat (clypéastre excentrique), on a constaté que l’oursin blanc et le clypéastre étaient les plus sensibles à des échantillons donnés d’eau de porosité de sédiments provenant des ports de Vancouver et d’Halifax, tandis que l’oursin violet de l’Atlantique était l’espèce la plus sensible à l’ammoniac. Dans cette même étude, l’oursin violet du Pacifique et le clypéastre excentrique étaient les plus sensibles au cuivre (Jackman et Doe, 2004).

L’oursin plat Echinarachnius parma (Lamark) n’a pas été souvent utilisé dans les essais toxicologiques et son rendement a été médiocre lors d’une évaluation interlaboratoire de l’essai sur la fécondation chez plusieurs espèces d’échinide (Miller et coll., 1992). Par conséquent, on ne recommande pas d’utiliser cette espèce, tant que la recherche n’aura pas montré qu’elle convient. La répartition circumpolaire de E. parma, y compris le long de la côte atlantique, du Canada jusqu’au Maryland (États-Unis), justifie une recherche plus poussée sur cette espèce. À Terre-Neuve, Osborne et Leeder (1989) ont eu recours à des spécimens adultes pour des essais toxicologiques étalés sur plusieurs mois. En outre, Karnofsky et Simmel (1963) et Meador et coll. (1990) ont respectivement étudié les effets de substances chimiques inhibant la croissance de cette espèce et les effets des contaminants présents dans les sédiments sur les premiers stades de son développement.

2.2 Étapes du cycle biologique, taille et provenance des organismes

On devrait se procurer des échinides matures (mâles laités et femelles œuvées) afin d’obtenir des gamètes. La taille des adultes est de ≥3 cm de diamètre, selon l’espèce (tableau 1); généralement, la taille des échinides utilisés en laboratoire est de 5-6 cm.

Tous les gamètes servant à l’essai devraient provenir d’adultes du même lot et de la même source. On peut prélever des spécimens des espèces indigènes dans des eaux marines côtières non contaminées, dont certaines en eau peu profonde à marée basse, ou plus au large (cueillette en plongée). Par ailleurs, des échinides de toutes les espèces peuvent être achetés auprès de fournisseurs de matériel biologique. Les échinides adultes doivent être identifiés positivement jusqu’à l’espèce. Lorsque les organismes sont achetés auprès d’un fournisseur commercial, ce dernier devrait fournir une attestation de l’identification de l’espèce, de même que la référence taxinomique ou le nom du ou des taxinomistes consultés. Après avoir obtenu du fournisseur l’identification taxinomique de chaque espèce, le laboratoire d’essai peut procéder à la confirmation de l’espèce à laquelle appartiennent les organismes d’essai inclus dans le même envoi. Toute l’information nécessaire à l’identification adéquate des échinides adultes expédiés à un laboratoire d’essai doit accompagner chaque envoi. Les documents relatifs à chaque lot d’organismes d’essai doivent inclure, à tout le moins, le nombre et la provenance des organismes de chaque envoi, le nom du fournisseur, la date d’expédition, la date d’arrivée au laboratoire d’essai, l’état des organismes à l’arrivée et l’identification des espèces. Pour que le transport n’ait pas d’effet nocif sur la santé des échinides, il faudrait maintenir le plus possible les conditions de température, d’oxygène dissous (OD) et de salinité qui conviennent. Les contenants d’expédition devraient être isolés afin de réduire au minimum les écarts de température pendant le transport. Si les organismes ne peuvent être livrés au laboratoire la journée même de leur expédition, les contenants de transport devraient être entreposés de telle sorte que la température des échinides reste constante le plus possible. La température devrait être consignée au moment du départ de chez le fournisseur et au moment de l’arrivée au laboratoire d’essai.

D’après les périodes du frai indiquées au tableau 1, il est possible de réaliser des essais presque toute l’année si les organismes sont recueillis au moment opportun.

On peut prolonger la période d’essai en maintenant les adultes à des températures plus élevées ou plus basses afin de déclencher ou de retarder le frai, selon le cas. L’oursin vert n’est en état de reproduction que pendant quelques mois au printemps (v. tableau 1), mais les laboratoires canadiens peuvent obtenir des gamètes de cette espèce pendant presque toute l’année, si ce n’est toute l’année, en modifiant les conditions de maintien des organismes (Wells, 1982, 1984). Il est aussi possible de se procurer des spécimens dont la période du frai coïncide avec la période à laquelle on souhaite faire l’essai. Il ne faudrait cependant pas oublier que la période et la durée du frai ainsi que la température optimale de provocation du frai ne sont pas nécessairement les mêmes chez les animaux d’origine et de milieux climatiques différents. Les oursins globuleux dont on provoque le frai au début de la période du frai peuvent parfois produire de nouveaux gamètes 4-6 semaines plus tard si on les alimente de façon appropriée (Dinnel et Stober, 1985). Il faudrait toutefois les maintenir dans un réservoir distinct après le premier frai.

2.3 Maintien et acclimatation des adultes dans le laboratoire

2.3.1 Généralités

On maintient les groupes d’échinides mâles et femelles dans des réservoirs afin d’obtenir les gamètes nécessaires aux essais. Il n’existe aucune restriction quant au temps pendant lequel les adultes peuvent ou doivent être maintenus à cette fin. Des laboratoires ont réussi à maintenir en état de reproduction des spécimens des 5 espèces pendant de longues périodes (3-12 mois). Il a toutefois été signalé que ce maintien était plus facile dans le cas de l’oursin violet de l’Atlantique et de l’oursin blanc. Les rapports concernant l’oursin violet du Pacifique et le clypéastre excentrique varient quant à la facilité avec laquelle les spécimens peuvent être maintenus pendant de longues périodes. De nombreux laboratoires du Canada ont opté pour l’achat de spécimens de ces 2 espèces d’essai auprès d’un fournisseur commercial lorsqu’ils doivent procéder à des essais, et ils provoquent le frai la journée même de l’arrivée des adultes au laboratoire ou quelques jours après (c.-à-d. sans véritable acclimatation). Les problèmes associés au maintien de ces espèces pendant une longue période incluent les suivants : les adultes fraient spontanément avant les essais ou seulement pendant une courte période après leur arrivée au laboratoire; il est difficile de les maintenir en santé ou vivants pendant >3 mois. En conséquence, cette deuxième édition du rapport SPE 1/RM/27 prévoit la possibilité de « maintenir des adultes pour utilisation immédiate » - en d’autres termes, les gamètes peuvent être recueillis à l’intérieur d’une courte période (≤3 jours) après l’arrivée des adultes au laboratoire^{Note de bas de page 1}.

Lorsqu’il faut provoquer le frai et soumettre les gamètes à l’essai dans les 3 jours suivant l’arrivée des adultes au laboratoire, on devrait au préalable obtenir du fournisseur la confirmation que les adultes sont matures et que les œufs sont viables. La température à laquelle les organismes d’essai sont expédiés devrait correspondre le plus possible à celle des conditions de l’essai, étant donné que le temps d’acclimatation en laboratoire sera très bref, sinon inexistant. Même s’ils sont « maintenus pour utilisation immédiate », les adultes devraient être acclimatés aux conditions de laboratoire le plus graduellement possible, afin que le stress que provoquerait un changement rapide de ces conditions chez les adultes ayant atteint la maturité sexuelle n’influe pas sur les résultats de l’essai portant sur leurs gamètes (v. le critère de validité de l’essai en 4.5.1). Il est recommandé d’exposer graduellement les échinides adultes à l’eau témoin/de dilution du laboratoire dans tous les cas, mais plus particulièrement lorsqu’il y a un écart marqué quant à la qualité (c.-à-d. la température, la salinité et le pH) des conditions d’acclimatation antérieures. Cette exposition graduelle devrait réduire au minimum le stress causé par des caractéristiques différentes dans la qualité de l’eau.

Dans le cas des adultes dont on provoque le frai le jour de leur arrivée au laboratoire, il faut prévoir une période de maintien de ≥3 h, période pendant laquelle on pourra observer leur état de santé en général et effectuer une transition entre les conditions d’expédition (température et eau) et les conditions d’essai. Si les adultes sont expédiés dans de l’eau, leur acclimatation peut se faire comme suit : maintien pendant 1-2 h dans un mélange constitué de 50 % d’eau d’expédition et de 50 % d’eau témoin/de dilution, puis pendant 1-2 h dans un mélange constitué de 25 % d’eau d’expédition et de 75 % d’eau témoin/de dilution, après quoi le maintien se fait dans une eau témoin/de dilution à 100 %, toujours pendant 1-2 h, avant la provocation du frai. Une autre méthode utile consiste à siphonner 20-30 % de l’eau d’expédition toutes les 1-2 h et à la remplacer par de l’eau témoin/de dilution jusqu’à ce qu’au moins 3 remplacements aient été effectués. Les adultes expédiés à l’état « sec » (c.-à-d. dans des essuie-tout humides ou des algues) n’ont pas besoin d’être placés dans l’eau témoin/de dilution avant la provocation du frai; il faut cependant prévoir une période d’observation de 3 h avant la provocation du frai. Pendant cette période, on devrait ajuster le plus graduellement possible leur température (c.-à-d. celle de l’air) par rapport à celle de l’essai, au besoin. La transition entre les conditions d’expédition et les conditions d’essai devrait commencer le plus tôt possible après l’arrivée au laboratoire des échinides adultes à maturité sexuelle.

Certains laboratoires du Canada et des États- Unis ont réussi à maintenir le clypéastre excentrique et l’oursin violet du Pacifique pendant de longues périodes. Leur succès est peut-être attribuable à l’utilisation de systèmes relativement simples faisant appel à beaucoup d’eau de mer naturelle non contaminée coulant en continu dans les réservoirs de maintien^{Note de bas de page 2}. Dans le cas de l’oursin violet du Pacifique, les conditions de maintien pourraient inclure des températures de <15 °C, une teneur élevée en OD, un pH >8, un bon écoulement d’eau, l’enlèvement rapide des matières fécales et le maintien des organismes dans l’obscurité (Bay et Greenstein, comm. pers., 2008; Buday, comm. pers., 2008). Les problèmes qu’ont éprouvés d’autres laboratoires pourraient être attribuables à une combinaison de conditions défavorables pendant le transport, à une circulation inadéquate de l’eau de mer dans les réservoirs de maintien et à une exposition prolongée à des sels de mer artificiels dont la source et le mélange sont étrangers aux échinides.

Il s’est avéré facile de maintenir en laboratoire l’oursin violet de l’Atlantique et l’oursin blanc pendant de longues périodes (>1 an), et le frai a pu être provoqué à répétition chez les 2 espèces (toutes les 4-6 semaines) pendant tout ce temps lorsque les conditions étaient adéquates (Doe et Jackman, comm. pers., 2008; Jonczyk et Holtze, comm. pers., 2008; Carr, Nipper et Biedenbach, comm. pers., 2008). Les 2 espèces peuvent être séparées par sexe et placées dans des aquariums distincts aux fins du prélèvement du nombre de mâles et de femelles dont on a besoin pour les essais. La plupart des laboratoires signalent que l’acclimatation et le maintien ont entraîné très peu de mortalité chez les 2 espèces, qu’il est par ailleurs facile d’acclimater et de maintenir dans des aquariums fermés à dispositif de recyclage et à température contrôlée.

Dans le cas des échinides adultes qui seront maintenus en laboratoire pendant des périodes prolongées (>3 jours), il est souhaitable de procéder graduellement à l’acclimatation pendant au moins 3-4 jours à la température et à la salinité de l’essai, dans l’eau qui sera utilisée pour les témoins et les dilutions, avant de procéder à la collecte des gamètes. L’acclimatation devrait commencer le plus tôt possible après l’arrivée des adultes au laboratoire. La nécessité de recourir à des méthodes convenant au « maintien pour utilisation immédiate » ou à l’acclimatation graduelle dans des conditions propices au maintien à long terme est fonction des exigences de l’essai concernant l’obtention de gamètes viables, conformes aux besoins et au critère de validité de l’essai (v. 4.5.1).

Il faut manipuler les échinides avec soin et éviter de leur imposer des chocs ou de changer les conditions de maintien. Les variations importantes de température ou de pression hydrostatique, en particulier, peuvent déclencher le frai à un moment qui ne convient pas au responsable de l’essai (Dinnel et Stober, 1985). Dans certains laboratoires utilisant de l’eau de mer naturelle n’ayant pas subi de microfiltration, on a constaté qu’un frai massif se produit chez les oursins globuleux au moment des efflorescences planctoniques, phénomène qui a pu être observé dans les eaux canadiennes (Starr, 1990; Starr et coll., 1990). De plus, le frai de certains spécimens étant susceptible de provoquer celui d’autres organismes, on devrait isoler immédiatement ces spécimens pour éviter un frai massif.

Dans le cas des échinides qui seront maintenus en laboratoire pendant des périodes prolongées (>3 jours), les recommandations concernant les conditions de maintien, décrites ci-dessous dans les sous-sections 2.3.2 à 2.3.10 et résumées dans les tableaux 1 et 2, ont été formulées de façon à permettre une certaine souplesse, tout en normalisant les conditions qui, si elles ne sont pas contrôlées, pourraient nuire à la santé des animaux ou à la viabilité de leurs gamètes. Le cas échéant, des conseils sur le « maintien pour utilisation immédiate » (c.-à-d. lorsque le frai est provoqué dans les 3 jours suivant l’arrivée des adultes au laboratoire) sont également fournis. Les conditions recommandées sont généralement tirées des documents listés à l’annexe D, de même que des avis et suggestions des laboratoires du Canada et des États-Unis ayant répondu au questionnaire (v. 1.1). On trouvera d’autres détails et justifications dans certains documents inclus dans l’annexe D et les Références, en particulier ASTM (1990), USEPA (1988, 1994, 1995, 2002) et NCASI (1991), ainsi que dans les articles de Dinnel et coll. mentionnés dans les Références et à l’annexe E. En outre, le site Web de l’université Stanford, présente des détails utiles sur les soins et l’embryologie des échinides.

2.3.2 Réservoirs de maintien

On peut garder les organismes adultes dans des aquariums, des bassins ou des réservoirs faits de matériaux non toxiques comme le verre, l’acier inoxydable, la porcelaine, le polyester renforcé de fibre de verre, les plastiques de perfluorocarbone (Téflon^MC), l’acrylique, le polyéthylène ou le polypropylène. Les réservoirs d’une capacité de 50-150 L munis d’une colonne d’alimentation sont les plus courants. Ils devraient être placés à l’abri de perturbations physiques importantes et, de préférence, à l’écart de l’endroit où auront lieu les essais. De plus, de façon à prévenir un frai massif indésirable, les groupes ne devraient pas compter plus de 20 adultes.

La profondeur de l’eau des réservoirs contenant les oursins globuleux devrait être de ≥20 cm. Dans le cas des oursins plats, on utilise souvent des plateaux de 1 m × 2 m contenant 10 cm d’eau et 2-3 cm de sédiment ou de sable riche en détritus, notamment des cellules algales décantées.

2.3.3 Éclairage

Les conditions d’éclairage qu’utilisent actuellement les laboratoires du Canada et des États-Unis pour le maintien des échinides varient grandement : éclairage ambiant du laboratoire (100-500 lux), avec photopériode de 16 h de clarté et de 8 h d’obscurité; lumière naturelle extérieure et photopériode saisonnière (les réservoirs sont à l’extérieur du laboratoire); obscurité totale. Dans le cas des oursins globuleux, l’éclairage et la photopériode semblent peu importants, la pratique la plus courante étant l’éclairage normal de faible intensité du laboratoire. Quant aux oursins plats, un appareil fluorescent suspendu, fournissant un éclairage équivalant à celui d’un bureau bien éclairé, stimule la croissance des algues qui se trouvent dans le sédiment. De cette façon, les oursins plats peuvent devenir autosuffisants sur le plan alimentaire.

Pour les échinides adultes maintenus pendant une période prolongée (>3 jours) avant la collecte des gamètes utilisés dans l’essai, on recommande le niveau d’éclairage ambiant du laboratoire (100-500 lux), avec photopériode de 16 h de clarté et de 8 h d’obscurité. Quant aux réservoirs installés à l’extérieur, la lumière naturelle et la photopériode saisonnière sont recommandées.

Des laboratoires ont signalé que l’oursin violet du Pacifique a pu être maintenu avec succès dans l’obscurité totale pendant des périodes prolongées. Une obscurité constante pourrait perturber certains schémas saisonniers donnant le signal du frai et faire en sorte que les gonades des animaux resteront matures plus longtemps (Bay, comm. pers., 2008). Lorsque les adultes sont transférés à un laboratoire d’essai en vue de la collecte des gamètes la journée même ou dans les 3 jours qui suivent, il est recommandé de prévoir des conditions d’éclairage représentatives de celles utilisées pour l’essai.

2.3.4 Eau

On devrait renouveler continuellement ou périodiquement l’eau des réservoirs dans lesquels les adultes sont maintenus afin de prévenir l’accumulation de déchets métaboliques. On peut utiliser de l’eau de mer naturelle non contaminée ou de l’eau de mer reconstituée (artificielle) dont la salinité est ajustée conformément aux méthodes recommandées dans EC (2001). Il faudrait s’assurer au préalable que les sels de mer du commerce (p. ex., Instant Ocean^MC, Ocean Pure Sea Salt^MC, Red Sea Salt^MC) ou le mélange approprié de sels de qualité réactif (p. ex., GP2; v. Bidwell et Spotte, 1985, ou le tableau 2 dans USEPA, 1994 ou 1995) utilisés pour préparer l’eau de mer reconstituée assureront un bon taux de survie et le maintien en santé des échinides, et ce, de façon constante et fiable. L’approvisionnement en eau devrait être surveillé et évalué aussi souvent que possible pour en documenter la qualité. Il faudrait aussi mesurer, de préférence quotidiennement, la température, la salinité, l’OD, le pH et le débit de chaque réservoir. Les variables suivantes devraient également être mesurées aussi souvent que nécessaire pour documenter la qualité de l’eau : gaz dissous totaux, ammoniac, azote, nitrite, métaux, pesticides, solides en suspension totaux, carbone organique total.

Pour assurer le maintien optimal d’une eau de grande qualité, on devrait veiller à ce que le débit de l’eau dans les systèmes « sans recyclage » soit de ≥5-10 L par jour et par organisme et qu’il permette de renouveler la totalité de l’eau du réservoir en 6-12 h. Dans le cas des réservoirs sans renouvellement, le remplacement quotidien de la plus grande partie de l’eau constitue une méthode acceptable. D’après les méthodes utilisées (annexe D) et les réponses des laboratoires du Canada et des États-Unis à notre questionnaire (v. 1.1), il ne semble pas exister de consensus quant à la quantité optimale d’eau à utiliser, ni quant à la fréquence de renouvellement souhaitable^{Note de bas de page 3}. Le plus souvent, le débit n’est pas précisé et, dans les rares cas où on trouve des indications à ce sujet, ce débit varie de centaines de litres par jour et par animal, la totalité de l’eau du réservoir étant renouvelée en quelques minutes, à des débits beaucoup plus faibles correspondant à un renouvellement de l’eau du réservoir en ~5 h. Dans NCASI (1991, 1992), les débits d’eau de mer sont similaires à ceux recommandés ici, soit 7-14 L par jour et par oursin plat et le remplacement de toute l’eau du réservoir en 1,3-2,7 h.

On peut fixer des taux de renouvellement et des densités de charge « moins qu’optimaux » à la condition que le critère de survie dans les réservoirs de maintien (v. 2.3.10) et le critère de validité de l’essai (v. 4.5.1) soient respectés. Il est fortement conseillé de surveiller régulièrement la qualité de l’eau et de documenter ses variables (ammoniac et nitrite, en particulier) dans les réservoirs de maintien. Les valeurs obtenues devraient être comparées aux cibles recommandées afin de s’assurer que les déchets métaboliques n’atteignent pas des niveaux nocifs dans les réservoirs. Les valeurs cibles recommandées pour la protection des organismes aquatiques sont les suivantes : ≤0,02 mg/L pour l’ammoniac non ionisé et ≤0,06 mg/L pour le nitrite (CCMRE, 1987)^{Note de bas de page 4}.

La salinité moyenne de l’eau utilisée pour le maintien des organismes devrait être de 28-34 g/kg, de préférence 30-32 g/kg. Les valeurs extrêmes de la salinité ne doivent pas être de ≤25 g/kg ou de ≥36 g/kg dans les réservoirs de maintien des échinides^{Note de bas de page 5}. Pour les organismes devant être maintenus au laboratoire pendant une longue période, le taux d’ajustement de la salinité devrait être de ≤3 g/kg par jour et ne doit pas dépasser 5 g/kg par jour. Dans certains cas (p. ex., adultes dont le frai est provoqué pour les essais le jour de leur arrivée au laboratoire), ce taux peut être de ≥5 g/kg par jour. Bon nombre de laboratoires ont signalé que, pour les essais qui commencent la journée même ou le lendemain de l’arrivée des adultes au laboratoire, les changements rapides de la salinité, de l’ordre de 6-8 g/kg, n’ont eu aucun effet sur les gamètes des organismes d’essai. Néanmoins, pour les adultes « maintenus pour utilisation immédiate » (p. ex., dans les 3 jours suivant leur arrivée au laboratoire), les ajustements de la salinité devraient être le plus graduels possible. Toutefois, on peut procéder à un ajustement quotidien de >5 g/kg si le critère de validité de l’essai peut être satisfait (v. 4.5.1) et si la sensibilité des gamètes n’est pas touchée lors de l’essai sur le toxique de référence (v. 4.6).

Il existerait des différences spécifiques dans la tolérance à la salinité chez les échinides mentionnés dans le présent document. Au cours d’une enquête récente (v. 1.1), certains laboratoires du Canada et des États-Unis ont signalé que des salinités plus élevées (34-35 g/kg) conviennent mieux à l’oursin violet du Pacifique et à l’oursin blanc, tandis que d’autres ont indiqué qu’ils avaient pu maintenir sans difficulté ces espèces à des salinités de 28-30 g/kg. Dans le cas de l’oursin blanc, des salinités de <28 g/kg pourraient entraîner un stress et une mortalité élevée chez les animaux. Certains laboratoires ont constaté que le clypéastre excentrique est légèrement plus sensible à des changements marqués de la salinité ainsi qu’à des salinités de <32 g/kg.

L’eau qui pénètre dans les récipients ne devrait pas être sursaturée en gaz, ce qui peut se produire si l’eau est chauffée. Si ce phénomène risque de se produire, il vaudrait mieux vérifier régulièrement la pression totale des gaz (Bouck, 1982). Si la teneur en gaz dissous dépasse 100 % de saturation, on doit recourir à des mesures correctives (p. ex., utilisation de colonnes d’aération ou aération vigoureuse dans un réservoir ouvert).

Si on utilise de l’eau de mer reconstituée (artificielle) comme eau témoin et eau de dilution (v. 4.1.1 et 5.3) et que les adultes doivent être maintenus pendant >3 jours après leur arrivée au laboratoire, il faudrait laisser les adultes s’acclimater à cette eau pendant ≥3 jours avant de provoquer le frai. De plus, si on doit maintenir les échinides dans de l’eau de mer reconstituée ou si les réserves d’eau de mer sont limitées, il pourrait être nécessaire d’avoir recours à la filtration et à la recirculation de l’eau, ou encore de renouveler l’eau périodiquement dans les systèmes sans renouvellement. Il faudrait ensuite mesurer fréquemment la teneur de l’eau en ammoniac et en nitrite afin de s’assurer qu’elle n’atteint pas des niveaux nocifs.

Si de l’eau de mer reconstituée (artificielle) doit être utilisée, il faut la maintenir à la salinité souhaitée par l’ajout de saumure hypersaline (SHS) et/ou de sels de mer secs du commerce ou de sels de qualité réactif, à un volume approprié d’eau douce [v. EC (2001) pour des indications à cet égard]. La salinité de la SHS devrait être de 90 ± 1 g/kg. Toute eau de mer reconstituée préparée par ajout direct de sels secs doit être aérée vigoureusement pendant ≥24 h avant l’emploi (EC, 2001); toutefois, un vieillissement plus long (≥3 jours) avec aération est conseillé^{Note de bas de page 6}.

Il est recommandé d’utiliser une SHS provenant d’une source d’eau de mer naturelle non contaminée et de grande qualité (EC, 2001), mais on peut aussi préparer une SHS artificielle au moyen de sels de mer secs du commerce (p. ex., Instant Ocean^MC) ou de sels de qualité réactif (« GP2 modifié »; voir Bidwell et Spotte, 1985, ou le tableau 2 dans USEPA, 1994 ou 1995). Cependant, toute SHS préparée au moyen de sels de mer secs du commerce ou de sels de qualité réactif doit être passée à travers un filtre à pores de ≤1 µm et aérée pendant ≥24 h avant l’emploi; des périodes plus longues de vieillissement (≥3 jours) avec aération sont cependant recommandées^{Note de bas de page 6}. Une fois filtrée, la SHS préparée à partir d’eau de mer naturelle peut servir immédiatement pour ajuster la salinité. Les portions non utilisées de la SHS (naturelle ou artificielle) devraient être conservées dans des récipients fermés entreposés dans l’obscurité à 4 ± 2 °C (EC, 2001). En outre, les laboratoires d’essai devraient se procurer des sels de mer du commerce de la « meilleure qualité » (p. ex., Forty Fathoms^MC pour essais toxicologiques) auprès de leur fournisseur. Avant d’utiliser de l’eau de mer artificielle pour préparer la SHS ou l’eau témoin/de dilution, il faudrait évaluer l’adéquation et l’uniformité de tout nouveau produit ou lot de produits pour déterminer lequel permet de satisfaire au critère de validité de l’essai (v. 4.5.1) (EC, 2001). Ainsi, des responsables d’essai sont d’avis que certains types et/ou lots de sels de mer peuvent provoquer une réduction du taux de fécondation chez les témoins, avoir des effets toxiques indésirables et/ou emprisonner les substances d’essai. Si la SHS ou l’eau témoin/de dilution est préparée avec des sels de mer, on devrait en vérifier l’adéquation et l’uniformité au moyen de tests.

La SHS provenant d’une eau de mer naturelle peut être préparée en concentrant de l’eau de mer (naturelle ou artificielle, cette dernière étant moins souhaitable) par congélation ou évaporation. On devrait passer l’eau de mer à travers un filtre à pores de ≥10 µm avant de la mettre au congélateur ou dans l’enceinte d’évaporation. La salinité de la saumure ainsi préparée devrait être de 90 ± 1 g/kg (EC, 2001). Si la saumure est préparée par congélation, il faut congeler l’eau de mer à une température allant de -10 °C à -20 °C pendant ≥6 h, puis recueillir la SHS sous la glace lorsque la salinité a atteint 90 ± 1 g/kg. Si la SHS est obtenue par évaporation, il faut chauffer l’eau de mer à ≤40 °C dans un contenant résistant à la corrosion et fait d’un matériau non toxique, tout en l’aérant, jusqu’à la salinité souhaitée (90 ± 1 g/kg) (USEPA, 1994, 1995; EC, 2001). Peu importe la technique utilisée (congélation ou évaporation), la salinité de la saumure devrait être surveillée pendant la préparation - elle ne doit pas excéder 100 g/kg. La SHS peut être ajoutée à de l’eau de mer naturelle, à de l’eau douce, à de l’eau distillée, à de l’eau désionisée ou aux échantillons d’essai, pour porter la salinité au taux souhaité pour les essais. EC (2001) donne la marche à suivre pour la préparation, le vieillissement et l’entreposage de la SHS. Si on utilise de la saumure dont la salinité est de 90 g/kg pour préparer l’eau témoin/de dilution à une salinité de 30 g/kg (v. 3.4 et 4.1.1), la concentration d’effluent (ou autre échantillon d’eau douce) qu’il est possible d’obtenir dans la solution d’essai ne pourra être supérieure à 67 %^{Note de bas de page 7}. Cependant, si on ajuste la salinité de l’échantillon par ajout direct de sels secs à l’échantillon d’eau douce, alors la toxicité peut être déterminée à une concentration d’essai de 100 %.

Pour préparer de l’eau de mer reconstituée, on peut se servir d’eau désionisée, d’eau distillée, d’eau de surface ou d’eau souterraine non contaminée ou d’eau potable municipale déchlorée. Si on se sert d’eau municipale ou d’eau douce naturelle, on devrait en déterminer la teneur en substances chimiques, comme celles dont il est question au début de la présente sous-section (2.3.4), afin d’évaluer la qualité de cette eau.

S’il faut utiliser de l’eau potable municipale pour préparer de l’eau de mer reconstituée, on doit assurer une déchloration efficace de l’eau, de sorte qu’elle soit exempte de toute concentration nocive de chlore. La teneur en chlore résiduel total de l’eau dans les réservoirs de maintien et de l’eau témoin/de dilution est de ≤0,002 mg/L (CCMRE, 1987). Le chlore disponible, même à des concentrations aussi faibles que 0,05 mg/L, possède une puissante action spermicide chez les échinides (Muchmore et Epel, 1973). Il est possible d’éliminer le chlore volatil de l’eau en aérant cette dernière vigoureusement. Il est recommandé d’utiliser des filtres au charbon activé (charbon d’os) et, ensuite, le rayonnement ultraviolet (Armstrong et Scott, 1974) pour éliminer la chloramine résiduelle et les autres composés organiques chlorés^{Note de bas de page 8}.

2.3.5 Température

Les échinides peuvent être maintenus en laboratoire dans la gamme optimale des températures indiquées au tableau 1, mais on peut également les maintenir à la température saisonnière normale (celle de l’eau de mer naturelle fournie au laboratoire). Il faudrait maintenir la température optimale pré-frai à 12 ± 2 °C pour l’oursin vert, 10 ± 2 °C pour l’oursin violet du Pacifique, 13 ± 2 °C pour le clypéastre excentrique, 17 ± 2 °C pour l’oursin violet de l’Atlantique et 13 ± 2 °C pour l’oursin blanc^{Note de bas de page 9}.

On peut maintenir des groupes d’adultes en vue d’un frai différé à des températures inférieures aux normales saisonnières de leur habitat; les valeurs précises varient selon l’espèce et la longueur du report prévu. Des laboratoires ayant répondu au questionnaire ont toutefois indiqué qu’ils maintenaient rarement les adultes à des températures inférieures, car cela n’est généralement pas nécessaire pour retarder le frai. L’oursin violet de l’Atlantique et l’oursin blanc peuvent être maintenus au laboratoire pendant de longues périodes, de sorte qu’il est inutile d’abaisser la température pour retarder le frai. Cependant, on a signalé que l’oursin violet de l’Atlantique s’alimente et se régénère plus rapidement si la température de maintien est de 15 °C après le frai. Il est également possible d’élever la température pour stimuler le développement hâtif des gamètes. On devrait cependant éviter les températures excessivement élevées afin de prévenir un frai spontané et de ne pas imposer un stress aux animaux. On recommande de ne pas dépasser 15 °C pour l’oursin vert, 17 °C pour l’oursin violet du Pacifique et le clypéastre excentrique, 22 °C pour l’oursin violet de l’Atlantique et 17 °C pour l’oursin blanc. Cette dernière espèce ne devrait pas être maintenue à des températures inférieures à 8 °C.

Il est conseillé d’acclimater graduellement les animaux à la température d’essai avant la collecte des gamètes, même si cette collecte a lieu le jour même ou le lendemain de l’arrivée des adultes reproducteurs au laboratoire. La température de l’eau devrait être portée à la valeur souhaitée à raison de ≤5 °C par jour. Dans certains cas (p. ex., adultes dont le frai est provoqué pour les essais le jour de leur arrivée au laboratoire), ce taux peut être de ≥5 °C. Pour ajuster rapidement la température corporelle des adultes maintenus pendant ≤3 jours avant la provocation du frai, il faudrait utiliser la méthode décrite en 2.3.1 pour le mélange de l’eau de maintien (ou de l’eau d’expédition) et de l’eau témoin/de dilution^{Note de bas de page 10}.

2.3.6 Oxygène dissous

La teneur en OD de l’eau des réservoirs de maintien devrait se situer entre 80 % et 100 % de saturation en air. Au besoin, on peut assurer une légère aération de l’eau au moyen d’air comprimé filtré et exempt d’huile pour atteindre cette teneur. L’aération à l’aide de pierres de barbotage d’aquarium du commerce facilite le mélange. On devrait éviter une agitation trop vigoureuse.

2.3.7 pH

Le pH de l’eau de maintien des adultes devrait normalement être de 8,0 ± 0,2 et ne doit pas être inférieur à 7,5 ni supérieur à 8,5^{Note de bas de page 11}. L’eau de mer, dont le pH moyen est de 8,1 (Thurman, 1975), possède un pouvoir tampon considérable. Dans les eaux côtières marines, la salinité est toutefois moins élevée qu’en pleine mer et varie en fonction des eaux de ruissellement. Le pH de l’eau de mer non contaminée se situe normalement entre 7,5 et 8,5, qu’elle soit diluée ou à sa concentration maximale, mais atteint rarement ces valeurs extrêmes. Dans les méthodes actuelles d’essai de toxicité avec des échinides, aucune recommandation n’est formulée quant au pH de l’eau utilisée pour le maintien des adultes (v. annexe D). La plupart des laboratoires ayant répondu au questionnaire (v. 1.1) ont indiqué que la plage de pH précisée ici ne posait pas de problème en regard du maintien, de l’acclimatation ou du frai des espèces d’échinide mentionnées dans la présente méthode d’essai biologique. On a toutefois signalé que l’oursin violet du Pacifique s’acclimatait difficilement à des eaux à pH >8,1 et que des taux de mortalité élevés pourraient être observés si les adultes devaient être maintenus à un pH de cette valeur pendant plus de quelques jours (Carr, Nipper et Biedenbach, comm. pers., 2008).

2.3.8 Alimentation

Il n’est pas nécessaire de nourrir les échinides adultes dont le frai sera provoqué aux fins des essais dans les 3 jours suivant leur arrivée au laboratoire.

Les oursins globuleux maintenus en laboratoire pendant une période prolongée (>3 jours) devraient être nourris de varech ou de macroalgues (Laminaria, Nereocystis, Macrocystis, Egregia, Hedophyllum), ou encore de laitue romaine. Au cours d’une enquête récente (v. 1.1), des laboratoires du Canada et des États-Unis ont fait part de leur expérience quant à l’influence du régime alimentaire sur la survie, la santé et le succès du frai des adultes. La plupart des laboratoires ont nourri les oursins globuleux de légumes-feuilles (laitue romaine, épinards) et de macroalgues, auxquels ils ont ajouté des carottes et/ou des boulettes d’algues. Un laboratoire a souligné que l’état nutritionnel des adultes peut influer sur la sensibilité de leurs gamètes aux contaminants et que la laitue romaine, à elle seule, n’apportait pas une nutrition appropriée. Les chercheurs de ce laboratoire ont constaté que la laitue romaine à laquelle ils ont ajouté des épinards et des carottes suscitait une meilleure réaction (Carr, Nipper et Biedenbach, comm. pers., 2008). Dans une autre réponse à l’enquête, on a indiqué que les carottes étaient un élément essentiel du régime alimentaire des organismes d’essai et qu’elles avaient permis de maintenir les adultes pendant longtemps, tout en assurant la viabilité des gamètes (Agius, comm. pers., 2008).

L’ajout de nourriture devrait être assez fréquent (chaque semaine ou chaque jour) pour que les oursins puissent toujours se nourrir à volonté; il convient de retirer les vieux aliments ou ceux qui sont décomposés. Un régime alimentaire restreint serait susceptible de réduire le temps de maintien des animaux en bon état de frai (Bay et Greenstein, comm. pers., 2008). On a pu maintenir des oursins globuleux en laboratoire pendant des années en les nourrissant de macroalgues. Le fucus a été à la fois recommandé (EVS, 1989) et déconseillé (Dinnel et coll., 1987). Le fucus et d’autres algues brunes, comme Alaria esculenta, jouent un rôle important dans l’alimentation de l’oursin vert de Terre-Neuve (Himmelman et Steele, 1971). Au moment de déterminer s’il est préférable de choisir le fucus ou un autre type d’aliment, le responsable de l’essai devrait se laisser guider par les préférences apparentes des animaux.

Les oursins plats se nourrissent généralement de façon sélective des particules qui gisent au fond de l’eau, de même que de différents déchets organiques, dont les microalgues. C’est pourquoi un sédiment naturel non contaminé déposé au fond des réservoirs de maintien des oursins plats devrait contenir de tels déchets et, surtout, des dépôts de plancton. Selon certains, les oursins plats tirent leur subsistance de microalgues, comme les diatomées, qui croissent à la surface des particules sédimentaires; un éclairage propice à la croissance de ces algues sur les sédiments peut donc favoriser le maintien à long terme des animaux. On peut également ajouter des algues de culture ou de la pâte d’algue, au besoin (ASTM, 1990).

Il existe d’autres façons pratiques de nourrir les oursins plats. Ainsi, on pourrait ajouter de la zostère marine déchiquetée (Zostera sp.) ou même des épinards, une fois par semaine, pour que les animaux puissent se nourrir des détritus de ces plantes (EVS, 1989). Les aliments en flocons pour poissons peuvent être utilisés comme supplément (NCASI, 1991). On devrait toutefois éviter de laisser des aliments en décomposition dans les réservoirs.

2.3.9 Nettoyage des réservoirs

Il faudrait brosser et rincer les réservoirs avant d’y déposer un nouveau lot d’adultes. On peut aussi utiliser des désinfectants si on désire réduire les risques de transmission de maladies. Les désinfectants qui contiennent des composés chlorés ou iodophores, ou encore du chlorure de n-alkyl diméthyl benzyl ammonium (p. ex., Comet^MC, Ovidine^MC, Argentyne^MC, Roccal^MC), conviennent à cet usage. Les désinfectants sont toxiques pour les organismes aquatiques, et même une infime quantité pourrait se disperser dans le réservoir et se révéler nocive pour les échinides. Après désinfection, on doit rincer abondamment chaque réservoir avec l’eau utilisée pour le maintien des organismes.

Les réservoirs de maintien des adultes devraient toujours être raisonnablement propres. Chaque jour ou selon les besoins, on devrait éliminer les macroalgues qui n’ont pas été consommées. On peut nettoyer périodiquement les réservoirs d’oursins globuleux à l’aide d’un siphon; on peut faire de même pour les récipients d’oursins plats afin d’éliminer les déchets en suspension et les matières fécales ou encore de remplacer les sédiments. Par ailleurs, on pourrait laisser des morceaux de tests dans les réservoirs des oursins globuleux, car, lorsqu’ils sont en bonne santé, ces animaux ont l’habitude de se couvrir de ces fragments.

2.3.10 Maladie et mortalité

La mortalité des adultes devrait être peu élevée si les organismes sont acclimatés adéquatement aux conditions de laboratoire. À l’occasion, des mortalités surviennent dans la première ou la deuxième semaine suivant l’arrivée des adultes ou lorsque les gonades des adultes reçus sont très mûres et qu’il y a un frai spontané. Des laboratoires ont également signalé une mortalité accrue après avoir provoqué le frai d’organismes prélevés tard dans la période du frai (à compter de septembre pour le clypéastre excentrique et à compter d’avril pour l’oursin violet du Pacifique). De plus, certaines espèces et/ou certains lots d’organismes affichent un taux élevé de mortalité après le frai.

On devrait examiner les adultes dès leur arrivée au laboratoire, puis quotidiennement par la suite, afin de détecter les signes de maladie; les organismes morts devraient être éliminés immédiatement. Le taux de mortalité dans les groupes d’animaux maintenus pendant une période prolongée (>3 jours) avant la collecte des gamètes aux fins de l’essai ne devrait pas dépasser 2 % par jour en moyenne pendant les 7 jours précédant cette collecte. Le taux de mortalité cumulé pendant ces 7 jours ne doit pas dépasser 20 %. Si des organismes d’un lot donné meurent après la provocation du frai aux fins de l’essai, ils peuvent être exclus du calcul de la mortalité quotidienne ou hebdomadaire. On peut séparer du reste du lot les adultes dont on a provoqué le frai en vue de l’essai et les exclure du calcul de la mortalité, à moins qu’ils ne servent pour d’autres essais.

Dans le cas des adultes dont le frai sera provoqué dans les 3 jours suivant leur arrivée au laboratoire, il faudrait obtenir du fournisseur des données sur le taux de mortalité cumulé pendant les 7 jours précédant l’expédition, et celui-ci ne devrait pas dépasser 20 %. Si ce taux est supérieur à 20 %, aucun adulte du lot ne doit servir à la collecte des gamètes la journée même de son arrivée au laboratoire. Ce même critère s’applique lorsque les adultes sont maintenus pour une brève période (≤3 jours) avant la provocation du frai. En d’autres termes, le taux de mortalité cumulé à l’arrivée et pendant les 3 jours précédant la provocation du frai doit être de <20 %.

Quant aux groupes d’adultes dont le taux de mortalité est élevé (c.-à-d. supérieur à l’un ou l’autre des critères précisés ici), les échinides survivants devraient être soit éliminés, soit maintenus jusqu’à ce que le taux de mortalité soit acceptable.

Il faut également se débarrasser des animaux moribonds, des oursins globuleux qui présentent une perte importante de piquants et des oursins plats qui portent des plaques de champignons. On reconnaît généralement les oursins globuleux moribonds à l’absence d’activité des pieds ambulacraires, à leur incapacité à se retourner lorsqu’on les place sur le dos et, en particulier, à l’absence d’adhérence au substrat.

Dans le cas des oursins plats, les signes d’agonie se manifestent habituellement dans leur aspect extérieur et leur niveau d’activité : lorsque l’épiderme se désintègre, tout le test affiche une décoloration ou des taches claires et les animaux cessent de se recouvrir de sédiments. De plus, seul un examen attentif (à la loupe ou au microscope à dissection) permet de détecter la faible activité des pieds ambulacraires combinée à un amollissement des piquants et des pédicellaires (petits appendices en forme de pince situés parmi les pieds ambulacraires). Le test des oursins plats morts se couvre d’une couche visqueuse et tend à noircir.

On ne devrait pas tenter de traiter les adultes malades avec des produits chimiques; il est fortement recommandé de se départir des groupes d’animaux qui présentent un taux de morbidité élevé.