Méthode d’essai biologique servant à déterminer la létalité aiguë d’un sédiment pour des amphipodes : chapitre 5

Section 5 : Mode opératoire de l’essai d’un toxique de référence

L’emploi systématique d’un toxique de référence est nécessaire pour évaluer la sensibilité relative des populations d’amphipodes utilisés ainsi que la précision et la fiabilité des résultats obtenus par le personnel de laboratoire sur ce toxique de référence dans des conditions normalisées d’essai. Lorsque l’on détermine la toxicité d’échantillons de sédiment marin ou estuarien pour les amphipodes marins ou estuariens, selon la présente méthode de référence, il faut effectuer un essai toxicologique de référence, dans l’eau seulement, avec chaque lot d’organismes capturés sur le terrain qui serviront à l’essai. Environnement Canada (1990) a publié un guide de base, instructif et utile, sur la maîtrise de la précision des essais toxicologiques à l’aide d’essais toxicologiques de référence dans l’eau seulement.

L’essai toxicologique de référence à effectuer avec chaque lot d’amphipodes doit se dérouler en conditions statiques et déterminer la CL 50 après 96 heures au moyen de chlorure de cadmium de qualité « réactif ». On doit l’entreprendre moins d’une journée après le démarrage de l’essai toxicologique de 10 jours. Normalement, on l’entreprend la même journée (EC, 1992).

L’essai de référence exige au moins six variantes expérimentales (c’est-à-dire un témoin et cinq concentrations de cadmium dans l’eau) et au moins une répétition par variante (USEPA, 1994a). Il se déroule dans des bechers ou des bocaux de verre de 1 L, chacun d’eux renfermant au moins 800 mL de solution d’essai et un minimum de 10 amphipodes. Sauf indication du contraire, toutes les conditions et tous les modes opératoires qui s’appliquent à sa préparation et à sa réalisation doivent être identiques à ceux qui ont été définis dans les sections 2, 3 et 4 du présent document, sauf qu’il n’y a pas de sédiment dans les enceintes expérimentales et qu’il n’est pas nécessaire de faire correspondre des répétitions à chaque concentration. Autre différence : contrairement aux essais toxicologiques des sédiments qui exigent un éclairage vertical ininterrompu des enceintes expérimentales, l’essai de référence doit se dérouler dans l’obscurité (USEPA, 1994a). On recouvre alors les enceintes d’un matériau opaque (p. ex. aluminium en feuille) ou on réalise l’essai dans un local séparé, fermé, non éclairé. Autre distinction : les solutions de cadmium ou l’eau (témoin) dans les enceintes expérimentales ne sont pas aérées, l’oxygène dissous présent dans chaque solution (y compris les solutions témoins) suffisant aux besoins des organismes. On recouvre chaque enceinte pour réduire au minimum la contamination et les pertes dues à l’évaporation.

Lorsque l’on entreprend un essai toxicologique de référence, on devrait choisir une série de concentrations qui, d’après des essais préliminaires ou antérieurs effectués dans les mêmes conditions et suivant les mêmes modes opératoires, aboutiront à des taux de mortalité partielle à au moins deux concentrations et qui permettront le calcul de la CL 50 après 96 h dans des limites de confiance à 95 % suffisamment étroites pour être acceptables. Les concentrations choisies devraient englober la CL 50 prévue pour l’organisme d’essai (v. annexes D, E, F et G pour des indications spécifiques). On peut utiliser une série de dilutions convenables, dans laquelle chaque concentration successive de cadmium est au moins la moitié de la concentration antérieure. On peut aussi choisir les concentrations d’essai à partir d’autres séries de dilutions logarithmiques convenables (v. Environnement Canada, 1992 ; annexe L).

Pour chaque essai de référence effectué au laboratoire selon le présent mode opératoire, on devrait utiliser une seule espèce d’organisme et le même type d’eau témoin ou de dilution (c’est-à-dire, eau de mer naturelle ou reconstituée), de même origine et ayant subi le même traitement préalable. La salinité de cette eau doit être de 28 ± 2 ‰, et elle devrait être la même dans chaque essai toxicologique de référence effectué avec une espèce donnée dans chaque laboratoire. On doit régler la température de l’eau témoin ou de dilution (à 10 ± 2 °C, pour A. virginiana ; à 15 ± 2 °C, pour R. abronius, E. washingtonianus ou E. estuarius) et l’aérer au besoin, pour que la teneur en oxygène dissous soit de 90 à 100 % du degré de saturation, avant de préparer les solutions d’essai et avant d’y transvaser chaque groupe d’animaux. On devrait mesurer journellement la température de la solution dans chaque enceinte expérimentale et on doit la mesurer au début et à la fin de l’essai. La température journalière moyenne au cours de l’essai doit être de 15 ± 2 °C pour R. abronius, E. washingtonianus ou E. estuarius et de 10 ± 2 °C pour A. virginiana. Il faut mesurer la teneur en oxygène dissous, la salinité et le pH dans chaque enceinte expérimentale au début et à la fin de l’essai.

À la fin des 96 h d’exposition, on détermine le nombre d’amphipodes vivants et morts (v. § 4.9) et on l’enregistre en regard de chaque variante expérimentale (concentration), y compris le groupe témoin. Les paramètres biologiques de mesure sont le taux de survie correspondant à chaque variante, ainsi que la CL 50 après 96 h. Environnement Canada (1998a) donne des précisions et des conseils définitifs sur le calcul des CL 50, méthodes qui devraient être suivies. Il faut calculer les résultats et les signaler en mg de Cd/L.

Les résultats de l’essai de référence employant R. abronius, E. estuarius ou A. virginiana ne sont valides et acceptables que si le taux de survie des témoins à 96 h est d’au moins 90 % (EC, 1992 ; USEPA, 1994a). Ceux qui ont été obtenus avec E. washingtonianus ne sont valides et acceptables que si le taux de survie des témoins, à 96 h, est d’au moins 85 % (v. annexe E).

Il incombe au personnel du laboratoire de montrer qu’il est capable d’obtenir des résultats cohérents et précis avec le toxique de référence avant d’effectuer les essais définitifs avec le sédiment à l’aide de la présente méthode de référence. À cette fin, il devrait commencer par déterminer la précision intralaboratoire, exprimée en pourcentage du coefficient de variation (% CV), en effectuant au moins cinq essais de référence avec différents lots de la même espèce, avec du chlorure de cadmium et selon les modes opératoires et les conditions définis dans le présent document. Ces essais devraient viser à acquérir de l’expérience avec le mode opératoire et pour établir un point de comparaison pour les essais à venir. (USEPA, 1994a).

Dans l’application usuelle de cet essai toxicologique de référence à chaque lot d’amphipodes de la même espèce capturés sur le terrain, le personnel de laboratoire devrait continuer de suivre ce même mode opératoire. Lorsque l’on possède suffisamment de résultats (EC, 1990), on doit reporter successivement les CL 50 calculées à partir de ces essais sur une carte de contrôle établie sur chaque espèce et déterminer chaque fois si elles s’écartent ou non de ± 2 σ des valeurs obtenues au cours des essais antérieurs avec la même espèce, le même toxique de référence (c’est-à-dire le chlorure de cadmium) et le même mode opératoire. On doit établir une carte de contrôle séparée et l’actualiser pour chaque espèce d’amphipode marin ou estuarien utilisée avec la méthode de référence. Cette carte de contrôle devrait représenter le logarithme de la concentration, sur l’axe vertical, en fonction de la date ou du numéro de l’essai, sur l’axe horizontal. On doit comparer chaque nouvelle CL 50 du toxique de référence avec les limites établies sur la carte de contrôle ; la CL 50 est acceptable si elle se situe dans la zone de confiance. Tous les calculs de la moyenne et de l’écart-type devraient être effectués à partir du logarithme de la CL 50.

Dans tous les calculs de la moyenne et de l’écart-type ainsi que sur tous les graphiques, on devrait utiliser le logarithme de la concentration (y compris de la CL 50) . De la sorte, on montre simplement qu’on continue d’adhérer à l’hypothèse selon laquelle chaque CL 50 a été estimée à partir du logarithme de la concentration. On peut construire la carte de contrôle en reportant les valeurs logarithmiques de la moyenne et de ± 2 σ sur du papier graphique arithmétique ou en convertissant ces valeurs en valeurs arithmétiques et en les reportant sur l’échelle logarithmique du papier semi-logarithmique. S’il était démontré que les CL 50 n’épousent pas une distribution log-normale, la valeur arithmétique et l’écart-type pourraient se révéler mieux adaptés à cette fin. On devrait recalculer la moyenne des valeurs connues de log (CL 50) ainsi que les valeurs supérieure et inférieure de la zone de confiance (± 2 o) avec chaque CL 50 successive au moyen de chaque CL 50 successive jusqu’à ce que les statistiques se stabilisent (EC, 1990 et 1998a ; USEPA, 1994a).

Si une valeur de la CL 50 se situe à l’extérieur de la zone de confiance, on peut douter de la sensibilité des organismes d’essai ainsi que l’exécution et la précision de l’essai. Comme le phénomène pourrait survenir 5 % du temps, par le seul jeu du hasard, une CL 50 aberrante ne signifierait pas nécessairement que le lot d’organismes d’essai est anormalement sensible ou que la précision des données toxicologiques est insatisfaisante. Ce serait plutôt un avertissement qu’il pourrait y avoir problème. On devrait vérifier en profondeur toutes les conditions et de tous les modes opératoires correspondant à l’acclimatation et à la réalisation de l’essai. Selon les conclusions auxquelles mènera cette vérification, il pourrait être nécessaire de répéter l’essai toxicologique de référence ou d’obtenir un nouveau lot d’organismes capturés sur le terrain pour évaluer la toxicité des échantillons de la matière d’essai (par lequel on effectuera un nouvel essai toxicologique de référence).

Les résultats qui se maintiennent dans la zone de confiance pourraient ne pas nécessairement indiquer qu’un laboratoire obtient des résultats constants. Si les données relatives à un toxique de référence étaient extrêmement variables, la zone de confiance serait large ; une nouvelle donnée pourrait, tout en situant dans cette zone représenter une variation indésirable des résultats de l’essai. Environnement Canada (1990) propose comme limite raisonnable un coefficient de variation de pas plus de 30 % et, de préférence, de 20 % ou moins.