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Méthode d’essai biologique servant à déterminer la létalité aiguë d’un sédiment pour des amphipodes : chapitre 4

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Section 4 : Mode opératoire de l’essai du sédiment

4.1 Prélèvement des échantillons

On consultera au préalable le § 5.1 d’Environnement Canada (1992), qui donne des conseils sur le prélèvement d’échantillons de sédiment marin ou estuarien en vue de l’évaluation de leur toxicité à l’aide d’amphipodes marins ou estuariens. On consultera aussi le guide d’Environnement Canada (1994), qui donne des orientations supplémentaires sur les plans d’échantillonnage sur le terrain et sur les techniques convenables de prélèvement.

Les modes opératoires et l’équipement servant aux prélèvements (par carottier, benne preneuse, drague) ou les techniques d’obtention d’échantillons composés (ou composites) dépendent des objectifs de l’étude et des exigences réglementaires ainsi que de la nature de la matière à prélever. On devrait prélever à toutes les profondeurs dignes d’intérêt les échantillons de déblais de dragage. Les échantillons de sédiment d’essai ou de référence prélevés sur le terrain, y compris de sédiment prélevé sur les lieux d’immersion en mer ou tout à côté, représentent souvent la couche supérieure de 2 cm d’épaisseur. Les lieux de prélèvement des sédiments de référence devraient être recherchés dans les endroits où les propriétés géochimiques du sédiment, y compris sa granulométrie, sont semblables à celles des lieux de prélèvement des sédiments d’essai. Idéalement, le sédiment de référence devrait provenir d’un lieu à la fois à l’abri de la source ou des sources de contamination et dans les parages du lieu de prélèvement des échantillons de sédiment. On recommande de collecter le sédiment de référence en plus d’un endroit, afin d’accroître la probabilité d’une bonne correspondance avec les caractéristiques granulométriques et physico-chimiques des sédiments d’essai. Normalement, les échantillons de sédiment témoin sont prélevés sur les lieux de capture des organismes d’essai.

Le nombre de lieux où on doit prélever un échantillon sur l’emplacement de l’étude et le nombre d’échantillons répétés à prélever chaque fois sont propres à chaque étude. La plupart du temps, il faut faire un compromis entre les contraintes logistiques et pratiques (p. ex. le temps et les coûts) et les considérations statistiques. On devrait consulter Environnement Canada (1994) pour obtenir des orientations sur le plan d’échantillonnage, y compris sur le nombre minimal recommandé d’échantillons répétés à prélever. On trouve des orientations supplémentaires sur l’échantillonnage dans Environnement Canada (1995), sur les applications relatives à l’immersion en mer. On incite les demandeurs à consulter leur bureau régional de l’immersion des déchets en mer d’Environnement Canada (v. annexes B et C pour obtenir des renseignements sur les contacts), avant le prélèvement et les essais.

Lorsque cela est pratique et conforme au plan d’expérience et aux objectifs de l’étude, on devrait prélever au moins cinq échantillons de sédiment en chaque lieu et à chaque profondeur d’échantillonnage auquel on s’intéresse. Lorsque cela est pratique et convenable (v. section 6), on devrait aussi prélever au moins cinq échantillons d’au moins un lieu de référence (c’est-à-dire en des emplacements où on peut trouver un sédiment non contaminé possédant des propriétés physico-chimiques semblables à celles des sédiments d’essai) proche. L’objectif du prélèvement d’échantillons répétés est de permettre des comparaisons statistiques quantitatives sur le même lieu et entre différents lieux (EC, 1994 et 1998a). Chacun de ces échantillons de sédiment, qui constituent de véritables répétitions, devrait être vérifié quant à sa toxicité aiguë pour les amphipodes, dans au moins cinq enceintes expérimentales par échantillon (c’est-à-dire des répétitions de laboratoire) [EC, 1992].

À l’égard de certains projets de dragage, il est souvent inutile de prélever des échantillons répétés en un lieu d’échantillonnage donné (EC, 1994). Si l’objectif est d’évaluer de façon efficiente la toxicité des échantillons dans le secteur où sera réalisé le projet, la solution la meilleure pourrait être d’échantillonner le plus grand nombre possible de lieux (sous réserve des contraintes de coûts) en prélevant un échantillon en chaque lieu. Dans ce cas, l’essai pourrait se limiter à cinq répétitions en laboratoire (c’est-à-dire cinq sous-échantillons) par échantillon (et aucune répétition des échantillons de chaque lieu), chacune des répétitions étant préparée au laboratoire (§ 4.3).

Pour prélever le sédiment, on devrait utiliser une benne « benthique » (c’est-à-dire Smith-MacIntyre, Van Veen ou PONAR) ou un carottier, plutôt qu’une drague, pour perturber le moins possible l’échantillon. Il faut veiller au cours du prélèvement à réduire au minimum la perte de fines particules. Dans tous les lieux de prélèvement, on devrait utiliser la même méthode de prélèvement.

Le volume d’échantillon souvent nécessaire est d’au moins 5 à 7 L de sédiment entier par échantillon (EC, 1994), bien que ce volume dépende des objectifs de l’étude et du plan d’expérience ainsi que de la nature des analyses physico-chimiques à réaliser. Pour obtenir le volume souhaité d’échantillon, il est souvent nécessaire de combiner des sous-échantillons récupérés au moyen du préleveur. On devrait suivre les conseils donnés dans Environnement Canada (1994) sur l’obtention de sous-échantillons composés.

4.2 Étiquetage, transport et entreposage des échantillons

Les instructions et les conseils figurant au § 5.2 d’Environnement Canada (1992) et concernant l’étiquetage, le transport et l’entreposage des échantillons s’appliquent ici. On devrait les examiner et s’y conformer. On trouve des conseils supplémentaires à cet égard dans Environnement Canada (1994) et USEPA (1994a).

Les récipients servant au transport et à l’entreposage des échantillons doivent être neufs ou avoir été nettoyés à fond et rincés à l’eau propre. Il faudrait consulter Environnement Canada (1994), pour obtenir des conseils sur le choix des récipients convenables. On devrait remplir totalement chaque récipient de l’échantillon, afin d’en exclure l’air. Immédiatement après son remplissage, on doit le sceller puis l’étiqueter ou le coder. L’étiquetage et les enregistrements connexes alors créés doivent comprendre au moins un code d’identification de l’échantillon ou du sous-échantillon. Le personnel de terrain qui détermine la nature de l’échantillon (p. ex. prélevé par benne, par carottier ; échantillon composé ou composite), sa provenance, les coordonnées de son origine (p. ex. hydronyme, latitude, longitude, profondeur), le nombre de répétitions et la date du prélèvement doit créer un enregistrement à renvois croisés qui pourrait accompagner ou ne pas accompagner l’échantillon ou le sous-échantillon. Cet enregistrement devrait aussi mentionner le nom et porter la signature du ou des préposés au prélèvement. Ces derniers devraient aussi conserver des dossiers décrivant :

Dès le prélèvement, on devrait refroidir entre 1 et 7 °C les échantillons chauds (plus de 7 °C) au moyen de glace ordinaire ou de sachets réfrigérants congelés, puis les garder au frais (4 ± 3 °C), à l’obscurité, tout au long du transport (EC, 1994). Au besoin, on devrait utiliser des sachets réfrigérants, de la glace ordinaire ou tout autre moyen de réfrigération, pour maintenir la température des échantillons dans la gamme de 1 à 7 °C durant le transport.

À l’arrivée des échantillons au laboratoire, il faut en enregistrer la température et la date de réception. Il faut conserver dans des récipients fermés hermétiquement et à l’obscurité, à 4 ± 2 °C, les échantillons à conserver pour utilisation ultérieure (EC, 1992 et 1994). Avant de fermer hermétiquement le récipient, il faudrait en purger l’espace d’air par un courant d’azote (EC, 1994). Il ne faut pas congeler les échantillons, en totalité ou en partie, au cours du transport ou de l’entreposage et il ne faut pas les laisser sécher (EC, 1992 et 1994). Il est recommandé de soumettre à l’essai le plus tôt possible après le prélèvement les échantillons de sédiment ou de matières particulaires semblables. L’essai toxicologique du sédiment devrait débuter dans les deux semaines suivant le prélèvement, de préférence moins d’une semaine après ; l’essai ne doit pas débuter plus de six semaines après le prélèvement.

4.3 Manipulation et caractérisation des échantillons

Il ne faut pas soumettre au tamisage hydraulique les échantillons de sédiment d’essai et de référence prélevés sur le terrain. On devrait retirer à l’aide de pincettes ou à la main (gantée) les gros débris ou les macro-organismes indigènes de grande taille. Si l’échantillon renferme un nombre important de macro-organismes indigènes impossibles à éliminer par ces moyens, on peut le passer, sous pression (et non en le lavant), au travers d’un ou de plusieurs tamis d’acier inoxydable à mailles de grandeur convenable (p. ex. 1 ou 2 mm). Il faut remêler au sédiment toute eau de porosité qui s’en est séparée au cours du transport et de l’entreposage. Pour homogénéiser l’échantillon, on le mélange soit dans le récipient de transport et d’entreposage ou on le transvase à cette fin dans un récipient propre. On devrait normalement employer un outil non toxique (p. ex. cuillère ou spatule d’acier inoxydable), jusqu’à l’obtention d’une texture et d’une couleur homogènes (EC, 1992). On peut aussi utiliser une méthode mécanique (USEPA, 1994a ; EC, 1994) pour homogénéiser l’échantillon. Pour chaque échantillon utilisé dans un essai, les conditions de mélange, notamment la durée et la température, doivent être aussi constantes que possible. Si on s’inquiète de l’efficacité du mélange de l’échantillon, on devrait prélever, après l’opération, des sous-échantillons du sédiment et les analyser séparément pour en déterminer l’homogénéité.

Il faut au préalable soumettre au tamisage hydraulique, sur un tamis d’acier inoxydable à mailles de 0,5 mm, la partie de l’échantillon témoin prélevée sur les lieux de capture des amphipodes et destinée à l’analyse granulométrique et chimique, afin d’en éliminer les petits amphipodes et d’autres organismes. On devrait suivre le mode opératoire décrit au § 3.4 d’Environnement Canada (1992). On devrait entreposer le sédiment témoin tamisé de la façon décrite dans le paragraphe précédent (4.2) jusqu’à son emploi.

Immédiatement après le mélange de l’échantillon, il faut en retirer les sous-échantillons exigés pour l’essai toxicologique et les analyses physico-chimiques et les déposer dans des enceintes expérimentales étiquetées ainsi que dans les récipients étiquetés exigés pour l’entreposage des échantillons destinés aux analyses physico-chimiques ultérieures. On devrait alors transvaser dans des récipients étiquetés toute portion résiduelle de l’échantillon homogénéisé qui pourrait être nécessaire à des essais toxicologiques supplémentaires à l’aide d’amphipodes ou d’autres organismes. On devrait conserver tous les sous-échantillons à entreposer dans des récipients fermant hermétiquement, d’où on aura éliminé tout espace d’air et il faut les conserver à l’obscurité, à 4 ± 2 °C, jusqu’à leur emploi ou à leur analyse. Immédiatement avant de l’analyser ou de l’utiliser dans l’essai toxicologique, il faut remélanger à fond tout sous-échantillon pour s’assurer de son homogénéité.

Il faut caractériser chaque échantillon (y compris tous les échantillons de sédiment témoin et de référence) par l’analyse, dans des sous-échantillons, des paramètres suivants au moins (EC, 1992 ; USEPA, 1994a) : dans le sédiment entier - le pourcentage de sédiment très grossier (c’est-à-dire des particules d’une taille de plus de 1,0 mm), de sables (> 0,063 à 2,0 mm), de limons (> 0,004 à 0,063 mm), d’argiles (< 0,004 mm), le pourcentage d’eau et la teneur en carbone organique total ; dans l’eau de porosité - la salinité, le pH et la teneur en ammoniaque totale et en ammoniac non ionisé. À ces analyses pourraient s’ajouter les suivantes : carbone inorganique total, matières volatiles totales, demande biochimique d’oxygène, demande chimique d’oxygène, capacité d’échange cationique, sulfures volatils acides, métaux, composés organiques de synthèse, huiles et graisses, hydrocarbures pétroliers et, dans l’eau de porosité, divers paramètres physico-chimiques tels que le sulfure d’hydrogène. Les modes opératoires recommandés pour le prélèvement de l’eau de porosité sont décrits dans Environnement Canada (1994). On devrait ici s’y conformer. Pour les besoins de l’immersion en mer, on explique les exigences minimales en matière d’information dans Environnement Canada (1995).

Il faut entreprendre le plus tôt possible après le prélèvement des échantillons l’analyse granulométrique et celle de la salinité de l’eau de porosité, pour s’assurer que ces caractéristiques se situent dans les limites d’emploi des organismes d’essai (v. § 2.6 ainsi que les annexes D [R. abronius], E [E. washingtonianus], F [E. estuarius] et G [A. virginiana]). On doit mesurer le pH et la salinité et doser l’ammoniaque de l’eau de porosité dans les 24 heures suivant le début de l’essai, et on devrait commencer ces mesures au début de l’essai, afin de déterminer les concentrations initiales d’ammoniaque totale et d’ammoniac non ionisé auxquelles les organismes sont exposés au début de l’essai. Le dosage de l’ammoniaque doit employer une méthode reconnue et normalisée (p. ex., APHA et al., 1995 ; Standard Methods). Le calcul des concentrations d’ammoniac non ionisé doit tenir compte de la température à laquelle se déroule l’essai, du pH de l’eau de porosité et de la salinité de l’échantillon (Trussell, 1972 ; Bower et Bidwell, 1978 ; USEPA, 1985).

4.4 Eau d’essai

Cette eau doit être celle qui a servi à l’acclimatation des organismes d’essai (v. § 2.4). Ce peut être de l’eau de mer reconstituée ou de l’eau de mer naturelle provenant d’une source non contaminée. On peut ajuster la salinité de l’eau de mer naturelle ou reconstituée à la valeur requise (c’est-à-dire celle à laquelle les amphipodes ont été acclimatés ; v. § 2.4), par l’ajout de sels de mer (à l’état solide) ou de saumure (si l’eau est trop saumâtre), ou de l’eau distillée (si l’eau est trop salée). On devrait suivre les conseils fournis dans Environnement Canada (1992 ; § 2.5.4) concernant la préparation et l’entreposage de l’eau d’essai.

Il faut régler la température de l’eau d’essai à celle qui est nécessaire au déroulement de l’essai (c’est-à-dire 15 ± 2 °C si on utilise R. abronius, E. washingtonianus ou E. estuarius ; 10 ± 2 °C, si c’est A. virginiana) et sa salinité, avant l’emploi ; la concentration en oxygène dissous doit être de 90 à 100 % de la valeur de saturation en air, à cette température et à cette salinité. Au besoin, on devrait aérer le volume nécessaire d’eau, vigoureusement (à l’air comprimé, exempt d’huile, diffusé au travers d’une ou de plusieurs pierres poreuses pour aquarium) immédiatement avant de l’utiliser, et on devrait en vérifier la teneur en oxygène dissous pour confirmer que l’on a atteint ce taux de 90 à 100 % de saturation.

4.5 Conditions de l’essai

4.6 Critères de validité de l’essai

4.7 Mise en route de l’essai

Les détails concernant les préparatifs et la mise en route de l’essai sont fournis dans le § 4.1 d’Environnement Canada (1992) ; on devrait en suivre les instructions quand on entreprend la présente méthode de référence.

Chaque enceinte expérimentale du laboratoire doit être clairement codée et étiquetée pour permettre l’identification de l’échantillon. Il faut enregistrer la date et l’heure du démarrage de l’essai, soit directement sur les étiquettes ou sur des feuilles séparées, qui se rapportent précisément à l’essai. Il faudrait classer les enceintes expérimentales de façon à faciliter l’observation et la prise de mesures. Il faudrait compter au moins cinq répétitions par concentration, y compris au moins cinq échantillons ou sous-échantillons de sédiment témoin, dans chaque essai (v. § 4.1). Il faudrait disposer chaque ensemble de répétitions au hasard dans le laboratoire.

La veille du démarrage de l’essai (c’est-à-dire au jour j - 1), on devrait homogénéiser chaque échantillon de sédiment d’essai à évaluer (§ 4.3). Ensuite, on doit porter dans une enceinte expérimentale séparée 175 mL d’échantillon ou de sous-échantillon. On devrait égaliser cette quantité de matière pour qu’elle forme une couche d’environ 2 cm d’épaisseur sur le fond de l’enceinte expérimentale, soit en tapotant les parois avec le tranchant de la main, soit en la lissant avec une spatule propre de plastique ou d’acier inoxydable. Si le sédiment est fortement contaminé, on devrait le déposer dans les enceintes expérimentales sous une hotte homologuée. Ensuite, on devrait ajouter l’eau d’essai (v. § 4.4), sans perturber l’échantillon (v. EC, 1992, § 4.1), jusqu’à une hauteur constante, indiquée sur la paroi de l’enceinte. Le volume (identique) d’eau ajoutée à chaque enceinte devrait approcher la marque de 950 mL (c’est-à-dire le total du volume de sédiment et de l’eau surnageante dans l’enceinte au début de l’essai), mais en prévoyant un certain volume pour le transfert des organismes d’essai (dans un peu d’eau d’essai), le lendemain (c’est-à-dire au jour J). On devrait ensuite couvrir chaque enceinte, la disposer dans l’installation expérimentale thermostatée et entreprendre l’aération de l’eau surnageante à débit lent. Il ne faut pas agiter le sédiment des enceintes expérimentales avec l’eau surnageante ni autrement, en aucun moment, avant (c’est-à-dire au jour j - 1) ou durant l’essai.

Il faut aérer sans interruption l’eau surnageante de chaque enceinte expérimentale dès qu’elle y est ajoutée (c’est-à-dire des jours j - 1 à j + 10) ; sauf peut-être pendant la courte période où l’on ajoute les organismes d’essai et lorsque l’on effectue les observations et les mesures. On devrait faire barboter l’air comprimé, préalablement filtré et exempt d’huile au travers d’une pipette de verre ou de plastique et d’un tube de plastique qui lui est connecté (fournitures d’aquarium). L’extrémité de la pipette devrait être suspendue à 2 à 4 cm au-dessus de la surface du sédiment. Le débit de l’air dans chaque enceinte doit être lent (p. ex. 2 à 3 bulles par seconde) et il ne devrait pas perturber la surface du sédiment. On devrait régler ce débit, au besoin, de façon à maintenir la concentration d’oxygène dissous dans l’eau surnageante à au moins 90 % de saturation (EC, 1992 ; USEPA, 1994a).

On devrait suivre les instructions fournies dans le § 4.1 d’Environnement Canada (1992), lorsque l’on transfère les amphipodes vers les enceintes expérimentales, le lendemain (c’est-à-dire au jour J). On doit retirer les organismes d’essai de leur(s) aquarium(s) d’acclimatation, au moyen d’un tamis (v. § 2.4 et 2.5 ci-dessus) la journée même et transférer au hasard 20 amphipodes dans chaque enceinte expérimentale. Tout sujet à l’allure atypique ou qui tombe du tamis ou qui est blessé au cours du tamisage et du transfert doit être écarté. Après le transfert des organismes, il faut régler le niveau de l’eau dans l’enceinte expérimentale à la marque de 950 mL, après quoi on couvre l’enceinte et on reprend l’aération de l’eau, après une heure d’interruption, à débit lent.

Dans la première heure de l’essai, il faut examiner chaque enceinte pour vérifier si les amphipodes ont foui le sédiment. À l’exception d’A. virginiana (v. EC, 1992 ; note 18), il faut remplacer les sujets qui ne s’enfouissent pas dans l’heure par des sujets de la même population récupérée par tamisage, à moins qu’on n’observe qu’ils fouissent sans cesse l’échantillon et en émergent immédiatement en semblant vouloir l’éviter ou à moins qu’il n’y ait une différence évidente entre les sédiments témoin et d’essai. Cela indiquerait une réaction reliée à la présence d’un contaminant, auquel cas les sujets d’une enceinte donnée ne sont pas remplacés. Les amphipodes présentant un comportement d’évitement au cours de la première heure de l’essai ne doivent pas être remplacés : ils doivent comprendre les 20 sujets qui se trouvent dans l’enceinte expérimentale. Il faut enregistrer les comportements apparents d’évitement.

4.8 Mesures et observations

Il faut effectuer les mesures dans au moins une enceinte expérimentale représentative de chaque variante expérimentale. Il faut mesurer la température de l’eau surnageante au début de l’essai, puis, au moins trois fois par semaine, en des journées non consécutives (p. ex. le lundi, le mercredi, le vendredi) jusqu’à la fin de l’essai. Des mesures plus fréquentes (c’est-à-dire journalières) de la température sont recommandées. En outre, il est recommandé d’enregistrer en continu la température de tout bain d’eau utilisé, de l’air dans une pièce ou enceinte thermostatée ou les deux, également utilisées pour l’essai.

Il faut mesurer au début de l’essai, puis au moins trois fois par semaine, en des journées non consécutives (p. ex. le lundi, le mercredi, le vendredi) jusqu’à la fin de l’essai, dans au moins une enceinte expérimentale représentative de chaque variante expérimentale. la concentration d’oxygène dissous dans l’eau surnageante. On recommande des mesures plus fréquentes (p. ex. journalières ; USEPA, 1994a) sur les sédiments exerçant une forte demande d’oxygène qui abaisse la concentration de l’oxygène dissous dans l’eau surnageante sous le taux de 90 % de saturation. On recommande pour ces mesures une sonde et un oxymètre étalonné. Il faut inspecter la sonde soigneusement après chaque lecture pour s’assurer qu’aucun organisme n’y adhère et la rincer dans l’eau désionisée ou distillée, avant de l’utiliser dans un autre échantillon, afin de réduire au minimum le risque de contamination croisée. Il faudrait vérifier fréquemment et systématiquement (p. ex. journellement) tout au long de l’essai la position de l’extrémité de la pipette dans chaque enceinte expérimentale et le débit d’aération et, si nécessaire, apporter les correctifs pour maintenir un lent débit d’aération (p. ex. 2 à 3 bulles à la seconde).

Si, en quelque moment au cours de l’essai, on constate l’interruption de l’aération d’au moins une enceinte expérimentale, il faut doser l’oxygène dissous dans l’eau surnageante, puis rétablir l’aération lente. Il faut signaler dans le procès-verbal (§ 7.1.6) toute concentration de l’oxygène dissous inférieure au taux de saturation de 60 % (USEPA, 1994a) et tenir compte de l’incident dans l’interprétation des résultats (§ 6.2).

Il faut mesurer la salinité et le pH de l’eau surnageante au début et à la fin de l’essai dans au moins une enceinte expérimentale représentative de chaque variante expérimentale. En outre, il faut doser l’ammoniaque totale de l’eau surnageante (v. p. ex. APHA et al., 1995) et calculer la teneur en ammoniac non ionisé (Trussell, 1972 ; Bower et Bidwell, 1978 ; USEPA, 1985) au début et à la fin de l’essai, dans au moins une enceinte expérimentale représentative de chaque variante expérimentale. On peut mesurer la salinité et le pH à l’aide de sondes et d’appareils étalonnés. À cette fin, on peut doser l’ammoniaque à l’aide d’une électrode spécifique ou prélever une partie aliquote de l’eau surnageante. Comme en oxymétrie, il faut, immédiatement après chaque lecture, inspecter soigneusement la sonde qu’on a plongée dans le milieu expérimental, puis la rincer dans l’eau désionisée ou distillée, avant de passer à l’échantillon suivant. Pour les dosages de l’ammoniaque exigeant des parties aliquotes d’échantillon, il faut prélever les échantillons d’eau surnageante immédiatement avant l’ajout des organismes d’essai et à la fin de l’essai. Chaque fois, on devrait prélever à cette fin pas plus de 10 % du volume de l’eau surnageante dans l’enceinte expérimentale. On devrait utiliser une pipette pour prélever soigneusement l’eau à une profondeur d’environ 1 à 2 cm au-dessus de la surface des sédiments. On devrait vérifier la pipette pour s’assurer qu’aucun amphipode n’a été entraîné au cours du prélèvement.

Il faut examiner chaque enceinte expérimentale, fréquemment et systématiquement au cours de l’essai (c’est-à-dire au moins trois fois par semaine, en des journées non consécutives et, de préférence, journellement) pour déterminer si des amphipodes sont sortis du sédiment ou s’ils nagent dans l’eau, au-dessus du sédiment ou flottent à la surface. Chaque fois, on devrait noter le nombre de sujets nageant dans l’eau, flottant à sa surface, se déplaçant à la surface du sédiment ou sortis de ce dernier, mais apparemment morts. On devrait repousser doucement vers le fond, à l’aide d’une tige ou d’une pipette de verre les amphipodes aperçus dans la pellicule superficielle de l’eau. On ne devrait pas retirer les sujets qui semblent morts.

4.9 Fin de l’essai

L’essai se termine après 10 jours d’exposition. À ce moment, il faut effectuer l’ensemble final d’observations du nombre d’amphipodes aperçus flottant à la surface de l’eau, nageant dans cette dernière, se déplaçant à la surface du sédiment ou sortis de ce dernier, mais apparemment morts. Immédiatement avant le tamisage du contenu de l’enceinte expérimentale, on devrait prélever à la pipette tous les amphipodes vivants et apparemment morts qui se trouvent dans la colonne d’eau ou à la surface du sédiment. On devrait garder dans de l’eau d’essai contenue dans une boîte de Petri ou dans un autre récipient convenable les sujets inactifs qui ne sont pas manifestement morts (p. ex. non en état de décomposition), puis les examiner de près, au microscope de faible puissance ou à la loupe. On devrait les pousser doucement au moyen d’une fine pointe pour confirmer l’absence de signes vitaux (comme la contraction d’un pléopode). Il faut compter comme morts les animaux qui ne présentent aucun signe de vie avant et après ce petit test.

Pour récupérer les organismes vivants ou morts, on devrait prendre à peu près le même temps pour tamiser le contenu de chaque enceinte expérimentale. Pour s’assurer du caractère convenable du mode opératoire utilisé pour récupérer les amphipodes, il est recommandé que le personnel de laboratoire préposé au tamisage du contenu des enceintes expérimentales prouve qu’il peut récupérer au moins 90 % en moyenne des organismes du sédiment témoin. Par exemple, on pourrait ajouter au sédiment témoin des organismes d’essai et on pourrait déterminer le taux de récupération après une heure (USEPA, 1994a ; Tomasovic et al., 1995).

Il faut passer le contenu de chaque enceinte expérimentale sur un tamis à ouvertures d’au plus 1,0 mm, pour récupérer tous les organismes qui y subsistent et pour déterminer s’ils sont morts ou vivants. On devrait utiliser pour l’opération de l’eau d’essai dont on aura réglé la salinité et la température aux valeurs existant dans les enceintes expérimentales. On devrait laver les matières retenues sur le tamis en les entraînant dans un bac de triage, au moyen d’eau d’essai propre. On devrait trier un peu des matières à la fois, en récupérant les amphipodes à mesure qu’on les trouve (USEPA, 1994a). On devrait examiner de près, de la façon qui vient d’être décrite, les amphipodes inactifs mais qui ne sont pas manifestement morts et les compter pour morts s’ils ne présentent aucun signe de vie. Les sujets manquants sont présumés morts et sont comptés comme morts dans les calculs (§ 4.10).

4.10 Paramètres ultimes de mesure et calculs

Le paramètre biologique que mesure cet essai toxicologique d’un sédiment entier d’une durée de 10 jours est le taux de survie. On calcule le pourcentage moyen (± σ) des amphipodes ayant survécu à chaque concentration (c’est-à-dire dans chaque ensemble de répétitions de sédiment d’essai). Ce calcul se fonde ordinairement sur 100 organismes par concentration (c’est-à-dire 20 amphipodes exposés à chacun des cinq échantillons répétés ou sous-échantillons ; § 4.1 et 4.7).

Pour permettre ce calcul, on détermine et on note le nombre d’amphipodes qui se sont révélés vivants, morts ou manquants, dans chaque enceinte expérimentale à la dixième journée (§ 4.9). On compte comme morts et désintégrés au cours de l’essai les sujets manquants et on doit les englober dans le nombre de morts par enceinte. On calcule ensuite le taux moyen de survie (± σ) des répétitions correspondant à une variante ou concentration donnée. On compare cette moyenne (± σ) au taux de survie dans le sédiment de référence ou, au besoin, au taux moyen de survie dans le sédiment témoin (consulter à cette fin la section 6).

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