Méthode d’essai biologique servant à mesurer des plantes terrestres exposées à des contaminants dans le sol : chapitre 4

Section 4 - Procédures d’essai universelles

• 4.1 Préparation des sols d’essai
  • 4.1.1 Essai préliminaire
• 4.2 Démarrage de l’essai
• 4.3 Conditions expérimentales
• 4.4 Critères de validité des essais
• 4.5 Hydratation des sols d’essai pendant l’essai
• 4.6 Observations et mesures en cours d’essai
• 4.7 Fin de l’essai
• 4.8 Paramètres de l’essai et calculs
  • 4.8.1 Taux de levée
  • 4.8.2 CE50
  • 4.8.3 CIp
    • 4.8.3.1 Utilisation des analyses de régression
    • 4.8.3.2 Interpolation linéaire à l’aide du programme ICPIN
• 4.9 Essais avec un toxique de référence

Procédures d'essai universelles

Les procédures et conditions générales décrites dans la présente section pour les essais toxicologiques sur des plantes terrestres s'appliquent aux essais visant à évaluer la toxicité d'échantillons de sol, de déchets particulaires (p. ex. des boues) ou de substances chimiques, de même qu'aux essais toxicologiques de référence connexes. Des procédures plus spécifiques applicables aux essais réalisés sur des échantillons de sol ou d'autres matières particulaires prélevés sur le terrain (p. ex. boues d'épuration, stériles miniers égouttés, résidus de boues de forage, compost, biosolides) sont décrites à la section 5. Des orientations et des procédures particulières pour la conduite d'essais avec un sol témoin négatif ou un autre sol enrichi (amendé) au laboratoire d'une substance ou d'un produit chimique ou plus sont présentées à la section 6.

Tous les aspects du système d'essai décrit à la section 3 doivent être incorporés dans ces procédures d'essai universelles. Les conditions et procédures indiquées à la section 2 pour l'entreposage, la manipulation et le tri des graines en vue des essais de toxicité d'un sol s'appliquent également. La liste de contrôle sommaire qui figure au tableau 2 énumère les conditions et procédures recommandées pour tous les essais réalisés avec des échantillons de sol contaminé ou susceptible d'être contaminé ainsi que pour les essais portant sur des types particuliers de matières ou de substances d'essai. Ces derniers pourraient comprendre des échantillons de sol de site, de biosolides (p. ex. matériaux de dragage, boues provenant d'une usine d'épuration des eaux usées, compost, fumier) ou de sol témoin négatif (ou d'un autre sol, contaminé ou non contaminé) enrichi au laboratoire d'une substance ou d'un produit chimique ou plus.

La présente méthode d'essai biologique utilise des plantes terrestres comme organismes d'essai et permet de mesurer l'inhibition de la levée et de la croissance des plantules (longueur et masse sèche des pousses et des racines) comme paramètres biologiques. Les organismes d'essai sont choisis parmi une liste de 12 espèces dont l'utilisation dans la présente méthode a été approuvée (v. 1.2). La durée de l'essai est de 14 ou 21 jours^{Note de bas de page21}, selon l'espèce choisie et la biomasserequise pour mesurer le ou les paramètres (v. 4.3). Les sols d'essai sont hydratés pendant l'essai, mais non renouvelés. Cette méthode d'essai définitif a été appliquée et validée par six laboratoires participants dans une série d'essais à concentrations multiples d'une durée de 14 jours réalisés en parallèle avec du trèfle violet (Trifolium pratense) dans un sol artificiel enrichi d'acide borique (EC, 2005a)^{Note de bas de page22}.

Tableau 2. Liste de contrôle des conditions et des procédures recommandées pour les essais définitifs de toxicité d'un sol sur des plantes terrestres

4.1 Préparation des sols d'essai

Chaque récipient d'essai (v. 3.2.2) placé dans l'installation d'essai doit être clairement codé ou étiqueté afin que l'on puisse facilement identifier l'échantillon et (si celui-ci est dilué) sa concentration. La date et l'heure de démarrage de l'essai doivent être consignées, soit directement sur les étiquettes, soit sur des feuilles de données réservées à l'essai. Les récipients d'essai devraient être disposés de manière à faciliter les observations et les mesures. Les traitements devraient être répartis au hasard dans l'installation d'essai (EC, 1997a,b, 2001, 2004b) et tournés régulièrement (p. ex. au moment de l'arrosage).

Le jour du démarrage de l'essai, c'est-à-dire le jour où les graines sont mises en contact avec les échantillons de matière ou de substance d'essai (jour 0), il est recommandé de mélanger soigneusement^{Note de bas de page23}(v. 5.3 et 6.2) chaque échantillon ou sous-échantillon de sol d'essai ou de matériau particulaire similaire, y compris le sol témoin négatif et, le cas échéant, le sol de référence, afin d'obtenir un mélange homogène des points de vue de la couleur, de la texture et de l'humidité. Si l'essai est réalisé avec des échantillons de sol de site prélevés sur le terrain, il est recommandé d'éliminer les grosses particules (cailloux, chaume, bouts de bois, débris) avant le mélange, de même que toute végétation ou tout macro-invertébré observés (v. 5.3).

Les sols d'essai destinés aux essais sur des plantes terrestres sont préparés le jour où l'essai est mis en route (jour 0). Lorsqu'on prépare un lot avec un sol d'essai donné, il est recommandé de mélanger une quantité suffisante de sol d'essai pour obtenir les répétitions du traitement en question (v. tableau 2), plus une quantité additionnelle pour les analyses physicochimiques nécessaires (v. 4.6) et un surplus afin de compenser le sol inutilisé qui adhère aux parois du bol de mélange. La teneur en humidité (%) de chaque sol d'essai devrait être connue ou déterminée; pour ajuster la teneur en humidité, il est recommandé d'ajouter de l'eau d'essai et de mélanger (ou, au besoin, de déshydrater l'échantillon) jusqu'à obtention du taux d'humidité désiré (v. 5.3 et 6.2). Pour évaluer quantitativement l'homogénéité d'un lot, on peut prélever des aliquotes du mélange et déterminer, par exemple, la composition granulométrique, la teneur en carbone organiquetotal (%), la teneur en matière organique (%), la teneur en humidité (%) et la concentration d'une ou de plusieurs substances chimiques particulières.

Dès que le lot est préparé, une masse humide identique de sol d'essai équivalant à un volume de ~500 mL devrait être transférée dans chaque récipient de répétition^{Note de bas de page24}. Pour égaliser le sol ajouté à chaque récipient d'essai (sans le tasser), il est recommandé d'utiliser une spatule et de secouer doucement le récipient, à l'horizontale, ou de le tapoter plusieurs fois (≥3 fois) sur la table de travail ou avec la paume de la main.

Pour un essai à concentration unique [p. ex. essai sur un sol de site avec une concentration de 100 % seulement, sur une concentration particulière de sol d'essai ou sur une substance chimique à une concentration donnée (p. ex. dose maximale indiquée sur l'étiquette)], on doit préparer au moins cinq récipients de répétition et cinq récipients témoins négatifs de répétition en ajoutant une masse humide identique (équivalant à un volume de ~500 mL) du même lot à chaque récipient de répétition. Pour un essai à concentrations multiples, on peut utiliser soit un nombre égal, soit un nombre inégal de répétitions pour les différents traitements. Si l'on utilise un nombre égal de répétitions pour les différents traitements, il faut préparer au moins quatre récipients de répétition par traitement. Si le nombre de répétitions est inégal pour les différents traitements (v. 4.8), il est recommandé de préparer six récipients de répétition pour le sol témoin négatif, quatre pour les quatre à six concentrations d'essai les plus basses et trois pour les cinq concentrations d'essai les plus élevées^{Note de bas de page25}. Pour tout essai servant à estimer la CI_pdans un essai définitif sur un sol (v. 4.8), on doit préparer au moins neuf concentrations et un sol témoin négatif, mais il est recommandé d'en prévoir un plus grand nombre (≥11) pour améliorer la probabilité d'encadrer chaque paramètre examiné^{Note de bas de page26}.

Il est conseillé de choisir une large gamme de concentrations, depuis une faible concentration qui produit des effets similaires à ceux du témoin négatif, jusqu'à une concentration élevée pour laquelle l'effet est « total » ou grave. On commet souvent l'erreur d'anticiper le paramètre et de l'encadrer avec une série de concentrations très rapprochées qui peuvent se révéler toutes trop faibles ou trop élevées. Pour disposer d'une large gamme de concentrations tout en obtenant des effets importants au centre de la fourchette, il peut être nécessaire d'utiliser des traitements additionnels afin de subdiviser plus finement la fourchette choisie. Dans tous les cas, il est recommandé d'utiliser une série géométrique régulière. Pour de plus amples orientations sur le choix des concentrations d'essai aux fins de la présente méthode, le lecteur est invité à consulter EC (2005c).

4.1.1 Essai préliminaire

Lorsque l'incertitude au sujet de la toxicité d'un échantillon est appréciable, il est souvent avantageux de réaliser un essai préliminaire dans le seul but d'établir plus précisément les concentrations à utiliser dans l'essai définitif, ce qui permettrait de réduire le nombre de répétitions par concentration (v. 6.2). Les conditions et procédures de l'essai préliminaire sont semblables à celles de l'essai définitif (v. tableau 2), mais le plan expérimental est différent.

L'essai préliminaire est un essai à court terme (7 jours pour le blé dur, le concombre, la laitue, l'orge, le radis, la tomate et le trèfle violet; 10 jours pour l'agropyre du Nord, le boutelou gracieux, la carotte, la fétuque rouge et la luzerne), avec ≥6 concentrations de la substance chimique d'essai ou du sol d'essai^{Note de bas de page27}, et seulement deux récipients (c.-à-d. deux répétitions) par traitement. Les espèces d'essai doivent être les mêmes que celles utilisées dans l'essai définitif (v. 2.1) et le nombre de graines par répétition devrait être identique à celui utilisé dans l'essai définitif (v. tableau 2 et sous-section 4.2). Le sol témoin négatif, la température de l'air et l'éclairage, la teneur en humidité des sols, l'arrosage et les mesures pendant l'essai sont les mêmes que pour l'essai définitif (v. tableau 2). La longueur des pousses et des racines peut être utilisée pour prévoir où se situeront les paramètres sublétaux relatifs à la croissance dans l'essai définitif^{Note de bas de page28}. Dans la plupart des cas, les paramètres relatifs à la croissance dans l'essai définitif correspondront à des concentrations plus faibles que celles observées dans l'essai préliminaire en raison de la plus longue durée de l'essai définitif. Le nombre de plantules levées à la fin de l'essai préliminaire devrait aussi être consigné afin de déterminer si les critères de validité de l'essai pour la levée des plantules dans l'essai définitif ont des chances d'être satisfaits (v. 4.4).

4.2 Démarrage de l'essai

Une fois le sol d'essai préparé dans chaque récipient d'essai, on dépose 5 ou 10 graines triées, selon l'espèce (v. 2.1), dans chacun des récipients d'essai installés par ordre croissant de concentration d'essai. Pour les espèces nécessitant seulement 5 graines (agropyre du Nord, blé dur, concombre, fétuque rouge, laitue, orge, radis, tomate et trèfle violet), on place une graine au centre, entourée de 4 graines à égale distance dans chaque récipient d'essai. Pour le boutelou gracieux, la carotte et la luzerne, qui exigent 10 graines par récipient d'essai, on place une graine au centre, entourée de 9 graines à égale distance. À l'aide de pincettes, on enfonce la graine à une profondeur égale à deux fois le diamètre de la graine. Pour recouvrir les graines avec le substrat d'essai environnant, tapoter le substrat avec une spatule en acier inoxydable ou une tige de verre^{Note de bas de page29}. Une fois que les graines ont été déposées dans chaque récipient d'essai, on hydrate le sol en pulvérisant de l'eau d'hydratation sur la surface à l'aide d'un pulvérisateur à brouillard fin. Il faut ajouter suffisamment d'eau pour obtenir une teneur en humidité du sol proche de la saturation (v. 4.5). Après l'hydratation, les couvercles (v. 3.2.2) devraient être placés sur les récipients d'essai afin de réduire au minimum les pertes d'humidité.

4.3 Conditions expérimentales

• Il s'agit d'un essai de toxicité d'un sol de 14 ou 21 jours, pendant lequel le sol dans chaque récipient d'essai n'est pas renouvelé. La durée de l'essai est de 14 jours pour le blé dur, le concombre, la laitue, l'orge, le radis, la tomate et le trèfle violet, et de 21 jours pour l'agropyre du Nord, le boutelou gracieux, la carotte, la fétuque rouge et la luzerne (c.-à-d. pour les espèces qui produisent moins de phytomasse et/ou qui prennent plus de temps pour germer).
• Le récipient d'essai est un contenant en polypropylène transparent de 1 L. Son contenu (un volume de sol d'essaide 500 mL) est couvert avec un couvercle en polypropylène transparent (v. 3.2.2).
• Pour un essai à concentration unique, il faut préparer au moins cinq récipients de répétition pour chaque sol d'essai (c.-à-d. chaque traitement). Pour un essai à concentrations multiples, il est recommandé d'utiliser un nombre inégal de récipients de répétition pour chaque concentration d'essai et chaque témoin, selon la concentration et le traitement. On devrait préparer au moins six répétitions pour les témoins, quatre pour les quatre à six concentrations d'essai les plus basses et trois pour les cinq concentrations d'essai les plus élevées (v. 4.1).
• L'essai doit être réalisé à une température de l'air moyenne constante de 24 ± 3 °C ou bien à une température de l'air moyenne de 24 ± 3 °C durant le jour et de 15 ± 3 °C durant la nuit lorsqu'il est possible d'ajuster la température dans l'installation d'essai (v. 3.1).
• Les récipients d'essai doivent être éclairés selon une photopériode de 16 heures de clarté et 8 heures d'obscurité. Il est recommandé d'utiliser des lampes fluorescentes à spectre continu ou un éclairage équivalent qui reproduit le spectre de la lumière naturelle (p. ex. Vita Lite® de Duro-Test®). L'intensité lumineuse en un point adjacent à la surface du sol dans chaque récipient d'essai doit être de 300 ± 100 µmol/(m × s) (ce qui équivaut à 18 750 ± 6 250 lux) (v. 3.3).

4.4 Critères de validité des essais

Pour qu'un essai soit valide, il doit satisfaire aux cinq critères suivants^{Note de bas de page30}:

1. Le taux moyen de levée pour chaque espèce de plante cultivée dans un sol témoin négatif pour la durée de l'essai doit être :
   • ≥60 % pour la carotte, le concombre ou la tomate;
   • ≥70 % pour l'agropyre du Nord, le boutelou gracieux, la fétuque rouge, la laitue, la luzerne, l'orge ou le trèfle violet;
   • ≥80 % pour le blé dur;
   • ≥90 % pour le radis.
2. Le taux moyen de survie pour les plantules levées dans un sol témoin négatif pour la durée de l'essai doit être ≥90 %^{Note de bas de page31}.
3. Le taux moyen de plantules cultivées dans un sol témoin négatif pendant la durée de l'essai qui présentent des signes de phytotoxicité et/ou des anomalies du développement doit être ≤10 %^{Note de bas de page32}.
4. La longueur moyenne des racines pour chaque espèce de plante cultivée dans un sol témoin négatif pour la durée de l'essai doit être :
   • ≥40 mm pour la tomate;
   • ≥70 mm pour le boutelou gracieux, la fétuque rouge ou le trèfle violet;
   • ≥80 mm pour la carotte;
   • ≥100 mm pour la laitue;
   • ≥110 mm pour l'agropyre du Nord ou le radis;
   • ≥120 mm pour le concombre ou la luzerne;
   • ≥170 mm pour l'orge;
   • ≥200 mm pour le blé dur.
5. La longueur moyenne des pousses pour chaque espèce de plante cultivée dans un sol témoin négatif pour la durée de l'essai doit être :
   • ≥20 mm pour la laitue;
   • ≥30 mm pour le trèfle violet;
   • ≥40 mm pour la luzerne;
   • ≥45 mm pour la carotte;
   • ≥50 mm pour le boutelou gracieux, le radis ou la tomate;
   • ≥60 mm pour le concombre;
   • ≥80 mm pour la fétuque rouge;
   • ≥100 mm pour l'agropyre du Nord;
   • ≥150 mm pour l'orge;
   • ≥160 mm pour le blé dur.

4.5 Hydratation des sols d'essai pendant l'essai

Les sols d'essai sont hydratés jusqu'à « quasi-saturation » selon les besoins tout au long de l'essai. Par hydratation jusqu'à quasi-saturation, on entend l'ajout d'eau à la surface du sol jusqu'à ce que l'on observe une accumulation temporaire (≤1 h) de~0,5 cm d'eau au fond du récipient d'essai. L'eau d'hydratation, à 24 ± 3 °C, devrait être pulvérisée sur la surface du sol à l'aide d'un flacon pulvérisateur à brouillard fin le jour 0, immédiatement après le semis, puis toutes les 48 heures, ou selon les besoins, jusqu'à ce que les couvercles des récipients d'essai soient enlevés (v. 4.6). Par la suite, il est recommandé d'ajouter de l'eau, si besoin est, au moins toutes les 24 heures pour atteindre quotidiennement la quasi-saturation tout au long de l'essai^{Note de bas de page33}. Une solution nutritive faiblement concentrée [p. ex. une solution d'Hoagland à 50 % (Hoagland et Aaron, 1950)] devrait être employée pour arroser chaque récipient d'essai si l'on constate que le sol d'essai ne renferme pas suffisamment d'éléments nutritifs pour assurer la croissance de plantes saines dans le sol témoin négatif pendant la durée de l'expérience^{Note de bas de page34}.

Il est recommandé de déplacer de manière aléatoire les récipients d'essai dans la chambre à atmosphère contrôlée ou dans la zone d'essai chaque fois que de l'eau est ajoutée aux récipients d'essai afin que les organismes d'essai à l'intérieur de ces récipients soient exposés de manière aléatoire à toute variation légère des conditions expérimentales (éclairage, température, humidité ou ventilation) susceptible de survenir dans l'installation d'essai.

4.6 Observations et mesures en cours d'essai

Les paramètres biologiques pour l'essai sont la levéedes plantules, la longueur des racines et des pousses et la masse sèche des racines et des pousses à la fin de l'essai (jour 14 ou 21 selon l'espèce d'essai). La détermination du nombre de plantules levées dans chaque récipient d'essai le jour 7 est également utile et fréquemment effectuée (c.-à-d. le taux de levée au jour 7 pour un essai à concentration unique ou la CE₅₀ 7 jours pour un essai à concentrations multiples), mais de telles observations demeurent facultatives. Selon les objectifs de l'étude, on peut aussi déterminer la masse humide des racines et des pousses à la fin de l'essai; toutefois, ces paramètres sont aussi facultatifs. Tout au long de l'essai, il est recommandé d'observer et de consigner le nombre de plantes levées et l'état ou la condition des plantes levées chaque fois que les sols d'essai sont hydratés (v. 4.5).

On évalue visuellement la levée des plantules en comptant le nombre de plantules qui atteignent 3 mm hors du sol dans chaque récipient d'essai. Les couvercles doivent être retirés de tous les récipients d'essai pour le reste de l'essai le jour 7 ou juste avant que les plantules atteignent une hauteur suffisante pour entrer en contact avec le couvercle, le premier des deux prévalant.

Une évaluation visuelle de la santé et de la condition des plantes (p. ex. signes de phytotoxicité) devrait également être effectuée et consignée lorsque les plantules apparaissent et, par la suite, chaque fois que le récipient d'essai est arrosé^{Note35de bas de page35}. On pourra ainsi noter les symptômes suivants :

• chlorose (perte de pigments),
• nécrose (tissu mort localisé),
• défoliation (perte de feuilles),
• dessiccation (feuilles ou tiges desséchées),
• malformation (défauts structuraux),
• marbrure (taches ou stries),
• coloration anormale (décoloration),
• flétrissement (perte de forme),
• dépérissement (dans le processus d'assèchement),
• feuilles ou tige décolorées ou déformées,
• signes évidents de retard dans la levée,
• perturbation du développement et/ou de la croissance.

Il est conseillé de compter le nombre de plantules qui sont en vie à la fin de l'essai dans les récipients d'essai témoins afin de déterminer si le critère de validité relatif au taux de survie des plantes levées dans un sol témoin négatif a été respecté (v. 4.4).

La température de l'air dans l'installation d'essai (v. 3.1) doit être mesurée quotidiennement (p. ex. à l'aide d'un thermomètre maxima/minima) ou en continu (p. ex. à l'aide d'un enregistreur graphique continu). Le taux d'humidité devrait être mesuré périodiquement (v. 3.1).

Le taux de fluence photonique doit être mesuré au moins une fois au cours de l'essai en plusieurs endroits dans la zone d'essai, en des points situés approximativement à la même distance de la source de lumière que la surface du sol (v. 3.3).

Dans au moins une répétition de chaque traitement(y compris le sol témoin négatif et, le cas échéant, le sol de référence), il faut mesurer et consigner le pH au début et à la fin de l'essai, de même que la teneur en humidité au début de l'essai seulement^{Note de bas de page36}. Les mesures initiales (jour 0) devraient être effectuées avec des sous-échantillons de chaque lot du sol d'essai utilisé pour préparer les répétitions d'un traitement donné (v. 4.1)^{Note de bas de page37}. Les mesures finales (jour 14 ou 21) devraient être effectuées avec des sous-échantillons des répétitions de chaque traitement auquel les plantes ont été exposées, après les observations de fin d'essai de la levée, de la condition et de la croissance des plantes.

Le pH du sol devrait être mesuré à l'aide d'une méthode utilisant une suspension dans une solution de chlorure de calcium (CaCl₂) (variante d'une méthode décrite dans Hendershot et coll., 1993)^{Note de bas de page38}. Pour ces analyses, on dépose 4 g de sol hydraté^{Note de bas de page39}dans un bécher en verre de 30 mL (~3 cm de diamètre et ~7 cm de hauteur) et on ajoute 20 mL de solution deCaCl2­ 0,01 M^{Note de bas de page40}. La suspension devrait être brassée par intermittence pendant 30 min (p. ex. toutes les 6 min), puis laissée au repos pendant ~1 h. On plonge ensuite une sonde à pH dans le liquide surnageant et on consigne la valeur du pH une fois que la valeur indiquée ne change plus.

Pour mesurer la teneur en humidité de chaque sol d'essai, on dépose un sous-échantillon de 3-5 g de chaque sol d'essai dans un plateau en aluminium préalablement pesé, puis on mesure et consigne la masse humide du sous-échantillon. Chaque sous-échantillon devrait ensuite être placé dans un four de séchage à 105 °C jusqu'à obtention d'une masse constante, ce qui demande habituellement au moins 24 heures. La masse sèche de chaque sous-échantillon devrait ensuite être mesurée et consignée. La teneur en humidité du sol doit être calculée, sous forme de pourcentage de la masse sèche du sol, à l'aide de la formule suivante :

Teneur en humidité (%) = masse humide (g) - masse sèche (g) × 100 masse sèche (g)

Il est important que la teneur en humidité (%) soit calculée en fonction de la masse sèche (et non de la masse humide) puisque les résultats de ces calculs sont utilisés avec les calculs de la CRE d'eau (également déterminée en fonction de la masse sèche) pour exprimer la teneur en humidité optimale des sols d'essai (v. 5.3).

Selon la nature de l'essai et le plan de l'étude, les concentrations de la ou des substances chimiques ou du ou des produits chimiques pourront être mesurées pour les sols d'essai ou pour des concentrations choisies des sols d'essai au début et à la fin de l'essai. Pour un essai utilisant un échantillon de sol de site, la ou les substances chimiques ou le ou les produits chimiques faisant l'objet des mesures dépendront du ou des contaminants préoccupants (v. 5.4). Pour un essai à concentrations multiples avec un sol enrichi d'une substance chimique, de telles mesures devraient être effectuées, au minimum, pour les concentrations élevées, moyennes et faibles soumises à l'essai (v. 6.3). Des aliquotes devraient être prélevées en vue de ces analyses, comme il a été expliqué précédemment pour le pH et la teneur en humidité, et les analyses devraient être effectuées selon des techniques éprouvées et reconnues (p. ex. SAH, 1992; Carter, 1993).

4.7 Fin de l'essai

L'essai prend fin après 14 jours d'exposition pour le blé dur, le concombre, la laitue, l'orge, le radis, la tomate et le trèfle violet, et après 21 jours d'exposition pour l'agropyre du Nord, le boutelou gracieux, la carotte, la fétuque rouge et la luzerne. À ce moment-là, le nombre de plantes vivantes ou apparemment mortes dans chaque récipient d'essai devrait être déterminé et consigné, de même que tout aspect anormal dans la morphologie, la croissance et le développement (par comparaison avec les plantes dans le sol témoin négatif). On peut prendre des photographies pour avoir une représentation visuelle de la relation concentration-réponse dans la phytomasse aérienne. Même si aucune plantule n'est visible hors du sol, il est recommandé de vérifier la présence éventuelle de matière racinaire dans le sol, au cas où des racines se seraient formées, sans production de pousses. Ces observations sont consignées à des fins qualitatives seulement (dans la présente méthode d'essai, on considère qu'il y a « levée » lorsque la plantule atteint 3 mm hors du sol) et, si des racines se forment sans qu'il y ait production de pousses, cela devrait être pris en note. Une fois ces observations effectuées, chaque récipient d'essai doit être traité séparément afin d'éviter tout contact entre les plantules des diverses répétitions.

Les plantes doivent être séparées avec précaution du sol d'essai et des racines des autres plantes. Pour cela, dégager délicatement le sol et la masse racinaire du récipient d'essai et éliminer tout le sol qui peut l'être facilement sans perturber la masse racinaire. Dans certains cas, pour faciliter la séparation des racines, on peut ajouter de l'eau jusqu'à saturation et laisser le sol s'imbiber pendant plusieurs minutes. Le sol restant et la masse de la plante sont déposés dans une cuvette contenant de l'eau. On peut alors rincer les racines sous un jet d'eau du robinet de faible puissance ou utiliser un pulvérisateur d'eau pour déloger doucement le plus possible de particules de sol restantes. Cela facilite également la séparation des racines entre elles. Les plantes sont ensuite déposées sur une feuille d'essuie-tout humide étiquetée, à raison d'une feuille par récipient d'essai, et recouvertes d'une feuille de plastique pour réduire au minimum la perte d'eau jusqu'à ce que les mesures puissent être effectuées et consignées. La longueur des pousses et des racines est mesurée à partir du point de transition entre l'hypocotyle et la racine jusqu'à l'extrémité de la feuille la plus longue lorsque les feuilles sont soigneusement aplaties, et jusqu'à l'extrémité de la plus longue racine lorsque les racines sont délicatement étirées. La longueur des pousses et des racines de chaque plante de chaque répétition est mesurée avec une règle, en millimètres, et consignée.

Les pousses et les racines sont ensuite séparées les unes des autres au point où l'on peut discerner une transition entre le tissu de la racine et le tissu de la pousse, de même que de la graine elle-même à l'aide d'un scalpel. La graine restante est éliminée. Les pousses et les racines de chaque récipient d'essai de répétition sont pesées séparément, en groupe (les pousses formant un groupe et les racines un autre groupe). L'ensemble de la biomasse des racines rincées provenant de chaque récipient d'essai doit être transféré, en tant que groupe, sur un essuie-tout ou un papier buvard humide. Ces racines devraient ensuite être déposées sur un plateau de pesée propre en aluminium (1-2,5 g) qui a été au préalable numéroté, pesé et séché au dessiccateur^{Note de bas de page41}. Ce processus est répété avec l'ensemble de la biomasse de racines rincées provenant de chaque récipient d'essai. Si l'on détermine la masse humide, les plateaux en aluminium contenant les pousses et les racines sont pesés immédiatement à l'aide d'une balance analytique qui mesure de façon constante à 0,1 mg près. La masse sèche doit être déterminée et ce, de façon similaire après séchage des plantes dans un four à 90 °C jusqu'à obtention d'une masse constante (il faut compter habituellement au moins 24 h) (Aquaterra Environmental et ESG, 2000). À la sortie du four, les plateaux de pesée sont placés immédiatement dans un dessiccateur. Une fois refroidis, les plateaux de pesée devraient être retirés un par un, au hasard, du dessiccateur et pesés immédiatement^{Note de bas de page42} à 0,1 mg près sur une balance qui fournit des mesures exactes avec cette précision. La masse sèche moyenne par plante qui a survécu est calculée pour chaque répétition (v. 4.8.3).

Bien qu'Environnement Canada se propose d'utiliser la masse sèche moyenne des pousses et la masse sèche moyenne des racines comme critères additionnels de validité de l'essai pour les essais définitifs, les données sont insuffisantes actuellement pour établir des exigences minimales relatives à la masse des plantes témoins. Cependant, dans les essais définitifs, il est recommandé de respecter les exigences suivantes :

• À la fin de l'essai, la masse sèche moyenne des pousses par plante survivante, pour les espèces végétales individuelles cultivées dans un sol témoin négatif, devrait être :
  • ≥1,0 mg pour la fétuque rouge;
  • ≥1,5 mg pour le boutelou gracieux;
  • ≥2,0 mg pour la carotte;
  • ≥2,5 mg pour la laitue;
  • ≥4,0 mg pour le trèfle violet;
  • ≥5,0 mg pour la tomate;
  • ≥7,0 mg pour l'agropyre du Nord;
  • ≥8,0 mg pour la luzerne;
  • ≥20 mg pour le radis;
  • ≥25 mg pour le blé dur;
  • ≥35 mg pour l'orge;
  • ≥40 mg pour le concombre.
• À la fin de l'essai, la masse sèche moyenne des racines par plante survivante, pour les espèces individuelles cultivées dans un sol témoin négatif, devrait être :
  • ≥0,2 mg pour la tomate;
  • ≥0,5 mg pour le boutelou gracieux, la carotte ou la fétuque rouge;
  • ≥1,0 mg pour la laitue ou le trèfle violet;
  • ≥3,0 mg pour l'agropyre du Nord ou le radis;
  • ≥4,0 mg pour la luzerne;
  • ≥7,0 mg pour le concombre;
  • ≥25,0 mg pour le blé dur ou l'orge.

Pendant la série de déterminations de la masse sèche pour les groupes de plantes d'un essai, le premier plateau de pesée devrait être replacé dans le dessiccateur et pesé de nouveau à la fin de toutes les pesées. Cela permet de vérifier s'il y a gain séquentiel d'eau pour les plateaux de pesée dans le dessiccateur au fil du temps, ce qui peut se produire lorsque chaque plateau est retiré du dessiccateur pour la pesée. L'écart avec la première masse obtenue ne devrait pas dépasser 5 %; si l'écart est supérieur à 5 %, tous les plateaux devraient être séchés de nouveau pendant ≥2 h, puis pesés de nouveau.

Une fois les plantes retirées de chaque récipient d'essai, des sous-échantillons de chaque sol d'essai (y compris le sol témoin négatif et, le cas échéant, le sol de référence) devraient être prélevés pour une détermination du pH (v. 4.6). Il est également recommandé, à ce moment-là, d'effectuer des analyses afin de déterminer les concentrations d'autres composants chimiques (concentrations de contaminants) en utilisant des sous-échantillons représentatifs de chaque sol d'essai (v. 4.6)^{Note de bas de page43}.

4.8 Paramètres de l'essai et calculs

Le taux de levée dans chaque récipient d'essai à la fin de l'essai (jour 14 pour le blé dur, le concombre, la laitue, l'orge, le radis, la tomate et le trèfle violet; jour 21 pour l'agropyre du Nord, le boutelou gracieux, la carotte, la fétuque rouge et la luzerne) doit être calculé et consigné pour chaque essai. Il faut également calculer et consigner le taux de levée moyen (± ET) pour tous les groupes de plantes de répétition exposés à chaque traitement pendant les 14 ou 21 jours. Si des observations facultatives ont été faites le jour 7 (v. 4.6), il convient de calculer et de consigner également le taux de levée correspondant dans chaque récipient d'essai, de même que le taux de levée moyen (± ET) pour chaque traitement.

Dans le cas d'un essai à concentration unique (v. 4.1), la valeur moyenne (± ET) du taux de levée des plantes à la fin de l'essai, déterminée pour chaque traitement, est comparée à celle de l'échantillon ou des échantillons de sol de référence ou, s'il y a lieu, à celle du soltémoin négatif (v. 5.5). Dans le cas d'un essai à concentrations multiples (v. 4.1, 5.3 et 6.2), on doit calculer et consigner la CE₅₀ 14 ou 21 jours pour la levée (si les données le permettent)^{Note de bas de page44}. Si l'on a observé le taux de levée après 7 jours dans chaque concentration durant un essai à concentrations multiples, il est recommandé de calculer et de consigner également la CE₅₀ 7 jours pour la levée (si les données le permettent). Le document d'orientation d'Environnement Canada sur les méthodes statistiques pour l'estimation des paramètres dans des essais toxicologiques (EC, 2005c) fournit des instructions et des conseils précis, qu'il est recommandé de suivre, pour le calcul des CE₅₀ (v. 4.8.2 plus loin).

Les paramètres relatifs à la croissance pour cet essai sont fondés sur la longueur des pousses et des racines ainsi que sur la masse sèche des pousses et des racines des plantes qui ont survécu dans chaque répétition et chaque traitement, mesurées à la fin de la période d'essai de 14 ou 21 jours. Les masses humides des pousses et des racines constituent des paramètres additionnels (facultatifs, mais recommandés). Une réduction importante de la longueur ou de la masse des plantes est considérée comme indicative d'un effet toxique néfaste du traitement sur la croissance des plantes d'essai. Dans le cas d'un essai à concentration unique (v. 5.3 et 6.2), les valeurs moyennes (± ET) de la longueur des pousses et des racines ainsi que de la masse sèche des pousses et des racines des plantes qui ont survécu dans le sol d'essai à la fin de l'essai sont déterminées et comparées aux valeurs correspondantes pour l'échantillon ou les échantillons de sol de référence ou, s'il y a lieu, aux valeurs correspondantes pour le sol témoin négatif. Un test t de Student ou toute autre méthode statistique appropriée (EC, 2005c) devrait être utilisé pour cette comparaison. Dans le cas d'un essai à concentrations multiples (v. 5.3 et 6.2), la CI_p 14 ou 21 jours pour l'inhibition de la croissance représentée par chaque mesure de paramètre (c.-à-d. la longueur moyenne réduite des pousses et des racines des plantes individuelles, et la masse sèche moyenne réduite des pousses et des racines des plantes individuelles) doit être calculée et consignée (si les données le permettent)^{Note de bas de page45}.

Il est recommandé de suivre les explications et les conseils fournis dans EC (2005c) pour le calcul des CI_p; des orientations supplémentaires à ce sujet sont données en 4.8.3 (et à l'annexe I). Au départ, des techniques de régression (v. 4.8.3.1) doivent être appliquées aux données correspondant aux concentrations multiples utilisées pour le calcul d'une CI_p^{Note de bas de page46}. Dans le cas où les données ne se prêtent pas au calcul des CI_p 14 ou 21 jours pour l'inhibition de la croissance à l'aide de l'analyse de régression appropriée (v. annexe I), il est recommandé de recourir à une interpolation linéaire de ces données à l'aide du programme ICPIN pour tenter d'obtenir une CI_p (v. 4.8.3.2).

4.8.1 Taux de levée

L'écart moyen et l'écart-type du taux de levée des plantules sont calculés pour chaque concentration d'essai. Le pourcentage d'effet est ensuite déterminé pour chaque traitement à l'aide de la formule suivante :

Pourcentage d’effect = ((% de levee moyen [traitement] - % de levee moyen [temoin]) ÷ % de levee moyen [temoin]) x 100

Le pourcentage d'effet est alors porté sur un histogramme en fonction de la concentration d'essai, la ligne médiane représentant la réponse du témoin, ou le pourcentage d'effet nul (0 %). Toutes les barres de l'histogramme situées au-dessus de la ligne médiane (pourcentage d'effet positif) indiquent une amélioration de la levée par rapport au témoin, tandis que les barres situées sous la ligne médiane (pourcentage d'effet négatif) indiquent une inhibition de la levée par rapport au témoin. L'ampleur et l'uniformité du pourcentage d'effet parmi les traitements révèlent l'existence ou l'absence d'une relation concentration-réponse. Si l'on observe un effet néfaste évident qui dépend de l'exposition (c.-à-d. une relation concentration-réponse visible), il faut alors calculer et consigner la CE₅₀ 14 ou 21 jours (si les données le permettent).

4.8.2 CE₅₀

Lorsqu'on effectue un essai à concentrations multiples avec des mélanges de sols (v. 6.2), il faut utiliser les données quantiques de levée des plantules correspondant à une période d'exposition donnée pour calculer (si les données le permettent) la concentration efficace médiane(CE₅₀) appropriée pour l'inhibition de la levée, avec ses limites de confiance à 95 %. Pour le blé dur, le concombre, la laitue, l'orge, le radis, la tomate et le trèfle violet, un essai à concentrations multiples doit établir la CE₅₀14 jours pour l'inhibition de la levée (à la fin de l'essai); pour l'agropyre du Nord, le boutelou gracieux, la carotte, la fétuque rouge et la luzerne, c'est la CE₅₀21 jours qui doit être déterminée (à la fin de l'essai). La CE₅₀7 jours (fondée sur les données de levée recueillies le jour 7 de l'essai) pour l'inhibition de la levée peut aussi être déterminée et consignée, si les données le permettent (v. 4.6).

Pour estimer une CE₅₀, on combine les données de levée correspondant à la durée d'exposition spécifiée pour toutes les répétitions à chaque concentration (y compris les groupes témoins de répétition). Si le taux de levée n'est pas ≥50 % dans au moins une concentration, la CE₅₀ ne peut pas être estimée. Si l'on observe une levée complète à une concentration donnée, on considère que celle-ci correspond à un taux d'effet de 0 % sur la levée. Toutefois, si des concentrations successives donnent une série de taux de levée de 100 %, seule la concentration la plus élevée de la série devrait être utilisée pour estimer la CE₅₀ (c.-à-d. l'effet nul situé « le plus près du centre » de la distribution des données). De même, si l'on observe une série d'inhibitions complètes successives de la levée aux concentrations élevées dans l'essai, une seule valeur du pourcentage d'effet de 100 % devrait être incluse dans l'analyse, soit celle correspondant à la concentration la plus faible. Cette restriction qui consiste à inclure un seul pourcentage d'effet de 0 % et un seul pourcentage d'effet de 100 % s'applique à toutes les formes d'analyse statistique et de représentation graphique.

Il convient de consulter le guide publié par Environnement Canada (2005c) sur le choix des méthodes statistiques à appliquer aux données quantiques (p. ex. la CE₅₀) lorsque vient le moment de choisir un test statistique pour de telles données obtenues dans des essais toxicologiques sur des plantes. Les régressions probit et/ou logit sont les méthodes « privilégiées » (EC, 2005c), à condition qu'au moins deux concentrations pour lesquelles on observe des effets partiels soient incluses dans les données. L'analyse par la méthode des probits fournit également la pente de la droite, qui devrait être consignée. Si ces méthodes ne peuvent pas être utilisées parce qu'on observe un seul effet partiel, il convient de faire appel à la méthode de Spearman-Kärber sans équeutage. Si aucun effet partiel n'est évident, on utilisera la méthode binomiale. Celle-ci peut fournir une estimation quelque peu différente de celle obtenue par les autres méthodes et elle doit être utilisée seulement en dernier recours. La méthode binomiale ne permet pas d'estimer l'intervalle de confiance proprement dit; on obtient plutôt les limites extérieures d'une fourchette dans laquelle se situent la CE₅₀­ et ses véritables limites de confiance.

Plusieurs programmes informatiques peuvent être utilisés pour le calcul de la CE₅₀. Stephan (1977) a mis au point un programme qui permet d'estimer les CE₅₀ à l'aide des méthodes des probits, des moyennes mobiles et des valeurs binomiales, lequel est adapté aux ordinateurs personnels compatibles IBM. Ce programme, qui a été modifié en 1989 afin d'inclure les estimations obtenues à l'aide de la méthode de Spearman-Kärber sans « équeutage » (c.-à-d. sans suppression de données calculées), est disponible sur disquette^{Note de bas de page47} auprès d'Environnement Canada (voir l'adresse à l'annexe B). Son utilisation est recommandée. Il existe également d'autres méthodes informatiques et manuelles satisfaisantes (p. ex. SAS, 1988, ou la version 3.5 de TOXSTAT, 1996; voir EC, 2005c, pour de plus amples renseignements). Des programmes utilisant la méthode de Spearman-Kärber avec équeutage sont aussi disponibles pour les ordinateurs personnels; toutefois, selon EC (2005c), il convient de faire preuve de prudence lorsqu'on utilise cette méthode (avec équeutage) pour estimer la CE₅₀, car on risque d'obtenir des résultats divergents si l'on ne connaît pas bien les conséquences de la suppression de données aux extrémités de la courbe concentration-réponse. Néanmoins, il existe des situations dans lesquelles il est justifié d'utiliser la méthode de Spearman-Kärber avec équeutage (v. EC, 2005c).

Il est recommandé de vérifier toute valeur de la CE₅₀ obtenue à l'aide d'un programme informatique en portant sur un graphique à échelles log-probabilités les taux de levée correspondant à une période d'exposition définie pour les diverses concentrations d'essai (EC, 2005c). Tout écart important entre la CE₅₀ estimée à partir de ce graphique et la CE₅₀ obtenue à l'aide du programme informatique doit être expliqué. Il est recommandé d'utiliser un graphique tracé à la main pour cette vérification (EC, 2005c). On peut éventuellement utiliser un graphique obtenu par ordinateur (p. ex. à l'aide du programme SigmaPlotMD, version 8.0.2 ou plus récente)^{Note de bas de page48}si ce graphique est construit avec des échelles log-probabilités. Toutefois, si une erreur a été commise dans la saisie des données, l'erreur dans le graphique obtenu par ordinateur se répercutera dans l'analyse mathématique et, partant, il importe de vérifier avec soin les coordonnées des points sur le graphique obtenu par ordinateur (EC, 2005c).

La figure 2 représente un graphique tracé à la main des données de levée (mortalité) en fonction de la concentration qui peut être utilisé pour estimer la CE₅₀. Dans ce cas hypothétique, des concentrations d'essai de 1,8, 3,2, 5,6, 10 et 18 mg de substance chimique par kilogramme de sol (masse sèche) provoquent des taux d'inhibition de 0, 20, 40, 90 et 100 %, respectivement, de la levée des plantules exposées à ces concentrations pendant une période précise. Pour déterminer la concentration qui devrait inhiber la levée de 50 % des plantules, on trace une ligne horizontale (ligne discontinue sur le graphique) à partir du point correspondant à 50 % sur l'axe des ordonnées jusqu'à ce qu'elle intercepte la courbe de lissage puis, à partir de ce point, une ligne verticale jusqu'à l'axe des abscisses où l'on peut lire la valeur estimative de la CE₅₀ (5,6 mg/kg, masse sèche).

Lorsqu'on ajuste une courbe de lissage telle que celle illustrée à la figure 2, il convient d'accorder une plus grande attention aux points situés près du taux d'inhibition de la levée de 50 %. On peut se procurer du papier à échelles log-probabilités (log-probit, comme dans la figure 2) dans les bonnes librairies techniques ou bien photocopier l'exemplaire vierge que l'on peut trouver dans EC (2005c).

Pour l'ensemble régulier de données de la figure 2, les programmes informatiques ont fourni des estimations très semblables à celles obtenues à partir du graphique. Voici quelques-unes des valeurs de CE₅₀ ainsi obtenues, avec leurs limites de confiance à 95 % :

Méthode de Stephan (1977) :

• probit :                                   5,58 (4,24 et 7,37)
• moyenne mobile :                    5,58 (4,24 et 7,33)
• valeur binomiale :                 6,22 (entre 1,8 et 10)

SAS (1988), analyse des probits :   5,58 (4,26 et 7,40)

Méthode TOXSTAT (1996) (version 3,5)

• probit :                                   5,58 (4,38 et 7,12)
• Spearman-Kärber, sans équeutage : 4,64 (4,40 et 7,23)
• logit :                                    5,63 (4,39 et 7,22)

Le tableau 4.2 dans EC (2005c) fournit des exemples supplémentaires de données obtenues à l'aide de divers programmes informatiques pour des essais quantiques de toxicité aiguë.

4.8.3 CIp

Dans le cas d'un essai à concentrations multiples réalisé pour déterminer les effets de l'exposition de plantes terrestres à des mélanges de sol enrichi, les données continues quantitatives représentant l'inhibition de la croissance (longueur des pousses et des racines, masse sèche des pousses et des racines) doivent être utilisées pour calculer une CI_p (concentration inhibitrice correspondant à un pourcentage d'effet précisé) pour chacun de ces quatre paramètres, si les données le permettent (v. paragraphes d'introduction des sous-sections 4.8 et 6.2). La CI_p correspond à la valeur quantitative estimative de l'une des concentrations suivantes :

1. concentration causant un taux de réduction déterminé de la longueur moyenne des pousses individuelles à la fin de l'essai;
2. concentration causant un taux de réduction déterminé de la longueur moyenne des racines individuelles à la fin de l'essai;
3. concentration causant un taux de réduction déterminé de la masse sèche moyenne des pousses individuelles à la fin de l'essai;
4. concentration causant un taux de réduction déterminé de la masse sèche moyenne des racines individuelles à la fin de l'essai.

Figure 2.  Estimation d'une concentration efficace médiane à partir d'un graphique du taux de levée sur un papier à échelles log-probabilités

La CI_p est calculée sous la forme d'un taux de réduction déterminé pour chaque paramètre (p. ex. la CI₂₅ et/ou CI²⁰, correspondant à des taux de réduction de 25 % et/ou 20 %, respectivement). La valeur de p est choisie par le chercheur, mais on privilégie présentement les taux de 25 % ou 20 %. On doit également calculer les limites de confiance à 95 % de toute CI_pcalculée et consignée.

Dans les analyses de la croissance, on rassemble les mesures respectives de la longueur et de la masse des pousses ou des racines individuelles dans chaque répétition (récipient d'essai) afin de calculer les moyennes de ces longueurs et de ces masses qui seront utilisées dans les analyses. Pour les mesures de la longueur, on calcule la longueur moyenne des pousses (ou des racines) individuelles dans chaque répétition. Pour les mesures de la masse sèche, on calcule la masse moyenne des pousses (ou des racines) individuelles dans chaque répétition en additionnant la masse sèche de toutes les pousses (ou racines) des plantes qui ont survécu dans le récipient d'essai et en divisant cette valeur par le nombre de plantes survivantes dans ce récipient à la fin de l'essai^{Note de bas de page49, Note de bas de page50}.

Les longueurs et masses moyennes de toutes les répétitions d'un traitement (concentration) donné sont utilisées pour calculer la moyenne correspondant à ce traitement; ces valeurs représentent la longueur moyenne et la masse sèche moyenne des pousses et des racines individuelles des plantes survivantes par concentration. Ces données sont comparées à la longueur moyenne et à la masse sèche moyenne des pousses et des racines individuelles dans le témoin négatif, obtenues de la même manière. Si aucune plante n'a levé dans une répétition (récipient d'essai), cette répétition n'est pas prise en compte dans le calcul de la moyenne pour le traitement. Si aucune plante n'a levé dans toutes les répétitions correspondant à une concentration donnée, aucune longueur ou masse moyenne ne peut être calculée pour cette concentration et celle-ci doit être exclue de l'analyse en vue de la comparaison avec la longueur ou la masse moyenne dans le témoin négatif.

Comme il est indiqué dans les paragraphes d'introduction de la sous-section 4.8, les valeurs des CI_p pour les longueurs des pousses et des racines individuelles et pour les masses sèches des pousses et des racines individuelles doivent être calculées et consignées séparément (si les données le permettent) une fois l'essai terminé. Ces calculs doivent être effectués à l'aide d'analyses de régression linéaire et non linéaire appropriées (v. 4.8.3.1). Toutefois, si les analyses de régression fournissent des valeurs inacceptables des CI_p pour la longueur ou la masse sèche des pousses et des racines, il est recommandé d'utiliser le programme ICPIN décrit en 4.8.3.2.

4.8.3.1 Utilisation des analyses de régression.

Une fois l'essai définitif à concentrations multiples de 14 ou 21 jours terminé, les CI_p (et leurs limites de confiance à 95 % respectives) pour les longueurs et les masses sèches moyennes individuelles des pousses et des racines doivent être calculées séparément par des techniques de régression linéaire et/ou non linéaire. Ces valeurs peuvent être déterminées à l'aide d'une série de modèles de régression linéaire et non linéaire (si les données le permettent) proposés par Stephenson et coll. (2000b), qui ont été reparamétrés selon des techniques appliquées par van Ewijk et Hoekstra (1993), pour produire automatiquement la CI_p et ses limites de confiance à 95 % pour toute valeur de « p » (p. ex. CI₂₅ ou CI₅₀). Les modèles proposés comprennent un modèle linéaire et les quatre modèles de régression non linéaire suivants : modèle exponentiel, modèle de Gompertz, modèle logistique et modèle logistique adapté pour tenir compte du phénomène d'hormèse^{Note de bas de page51}. Pour de plus amples explications sur l'utilisation de ces modèles de régression linéaire et non linéaire pour le calcul des CI_p, le lecteur est invité à consulter Stephenson (2003a) et Stephenson et coll. (2000b). Il est également fortement conseillé de consulter EC (2005c) pour des orientations additionnelles au sujet de l'application générale des techniques de régression linéaire et non linéaire à l'analyse des données toxicologiques quantitatives. Des explications concernant l'utilisation appropriée des techniques de régression linéaire et non linéaire à l'aide de la version 11.0 du programme statistique SYSTAT^{Note de bas de page52}, sont fournies à l'annexe I. Cela dit, on peut utiliser n'importe quel logiciel capable d'effectuer une régression linéaire et non linéaire pour calculer les CI_p respectives et leurs limites de confiance à 95 %. L'annexe I fournit des explications sur l'utilisation de modèles de régression afin d'obtenir les CI_p les plus appropriées pour la réduction de la croissance des plantes, évaluée à partir des mesures de la longueur et de la masse sèche des pousses et des racines.

Voici les cinq modèles recommandés. Des renseignements complémentaires au sujet de ces modèles particuliers sont fournis à l'annexe I.

Modèle exponentiel :
    Y = a × (1 - p)^{(C ÷ CIp)}

où :
Y = longueur ou masse sèche de la racine ou de la pousse
a      = ordonnée à l'origine (réponse dans le témoin)
p = valeur de « p » choisie (p. ex. 0,25 pour un taux d'inhibition de 25 %)
C = concentration d'essai exprimée sous forme de logarithme
CI_p = valeur de la CI_p pour l'ensemble de données

Modèle de Gompertz :
    Y = t × exp[log(1 - p) × (C ÷ CIp)^b]

où :
Y = longueur ou masse sèche de la racine ou de la pousse
t   = ordonnée à l'origine (réponse dans le témoin)
exp  = exposant de la base du logarithme naturel
p = valeur de « p » choisie (p. ex. 0,25 pour un taux d'inhibition de 25 %)
C     = concentration d'essai exprimée sous forme de logarithme
CI_p  = valeur de la CI_p pour l'ensemble de données
b = paramètre d'échelle (estimé entre 1 et 4) qui définit la forme de l'équation

Modèle d'hormèse :
Y = t × [1 + (h × C)] ÷ {1 + [(p + ( h × C)) ÷ (1 - p)] × (C ÷ CIp)^b}

où :
Y = longueur ou masse sèche de la racine ou de la pousse
t   = ordonnée à l'origine (réponse dans le témoin)
h = effet hormétique (faible valeur estimée habituellement entre 0,1 et 1)
C     = concentration d'essai exprimée sous forme de logarithme
p = valeur de « p » choisie (p. ex. 0,25 pour un taux d'inhibition de 25 %)
CI_p  = valeur de la CI_p pour l'ensemble de données
b = paramètre d'échelle (estimé entre 1 et 4) qui définit la forme de l'équation

Modèle linéaire :

Y = [(-b × p) ÷ CIp] × C + b

où :
Y = longueur ou masse sèche de la racine ou de la pousse
b = ordonnée à l'origine (réponse dans le témoin)
p = valeur de « p » choisie (p. ex. 0,25 pour un taux d'inhibition de 25 %)
CI_p   = valeur de la CI_p pour l'ensemble de données
C = concentration d'essai exprimée sous la forme de logarithme

Modèle logistique :
    Y = t ÷ {1 + [p ÷ (1 - p)] × (C ÷ CIp)^b}

où : Y = longueur ou masse sèche de la racine ou de la pousse
t   = ordonnée à l'origine (réponse dans le témoin)
p = valeur de « p » choisie (p. ex. 0,25 pour un taux d'inhibition de 25 %)
C = concentration d'essai exprimée sous forme de logarithme
CI_p   = valeur de la CI_p pour l'ensemble de données
b = paramètre d'échelle (estimé entre 1 et 4) qui définit la forme de l'équation

Le processus général pour l'analyse statistique et le choix du modèle de régression le plus approprié (linéaire ou non linéaire) pour des données toxicologiques quantitativesest présenté sous forme de logigramme à la figure 3. Le processus de sélection commence par un examen d'un diagramme de dispersion ou d'un graphique linéaire des données d'essai afin de déterminer la forme de la courbe réponse-concentration. On compare ensuite la forme de la courbe aux modèles disponibles afin de choisir un ou plusieurs modèles convenant le mieux aux données. Ce ou ces modèles sont ensuite examinés plus en détail (v. figure I.1, annexe I, pour un exemple de cinq modèles potentiels).

Une fois le ou les modèles appropriés choisis en vue d'un examen plus approfondi, on vérifie les hypothèses de normalité et d'homoscédasticité des résidus. Si les résultats de l'application de la technique de régression à un ou plusieurs des modèles examinés satisfont aux hypothèses, on examine les données (et la régression) afin de détecter la présence éventuelle de valeurs aberrantes. Si l'on constate la présence d'une valeur aberrante, on devrait examiner soigneusement les conditions expérimentales et les notes prises durant l'essai, à la recherche d'une erreur humaine éventuelle. Si une ou plusieurs valeurs aberrantes sont présentes, on devrait effectuer l'analyse avec et sans ces valeurs et comparer les résultats des deux analyses afin d'évaluer l'effet de ces valeurs aberrantes sur la régression. On doit ensuite décider s'il convient d'exclure les valeurs aberrantes de l'analyse finale. La décision devrait être fondée sur un examen de la variation biologique naturelle et des phénomènes biologiques susceptibles d'être à l'origine de l'apparente anomalie. Pour en savoir plus sur les valeurs aberrantes et les observations inhabituelles, on devrait consulter l'annexe I (v. I.2.4) et EC (2005c). En l'absence de valeurs aberrantes ou si aucune valeur aberrante n'a été exclue de l'analyse finale, le modèle à privilégier est celui qui présente la plus faible erreur quadratique moyenne résiduelle. Il est conseillé de demander l'avis d'un statisticien qui connaît bien la question des données aberrantes.

La normalité devrait être évaluée à l'aide du test de Shapiro-Wilk, comme il est expliqué dans EC (2005c). On peut aussi tracer un diagramme de probabilité normale des résidus pendant la procédure de régression, mais il n'est pas recommandé d'utiliser cette méthode en guise d'essai de normalité autonome, car la détection d'une distribution « normale » ou « non normale » fait intervenir une évaluation subjective de la part de l'utilisateur. Si les données ne sont pas distribuées normalement, il est conseillé d'utiliser un autre modèle, de demander l'avis d'un statisticien au sujet du choix du modèle ou d'utiliser la méthode d'analyse par interpolation linéaire (à l'aide du programme ICPIN, v. 4.8.3.2), qui est moins souhaitable.

L'homoscédasticité des résidus devrait être évaluée à l'aide du test de Levene, comme il est expliqué dans EC (2005c), et en examinant les graphiques des résidus par rapport aux valeurs réelles et prévues (estimées). Le test de Levene indique avec certitude si les données sont homogènes (p. ex. comme dans la figure I.2A de l'annexe I) ou pas. Si les données (selon le test de Levene) présentent une hétéroscédasticité (c.-à-d. si elles ne sont pas homogènes), il convient alors d'examiner les graphiques des résidus. Si l'on observe un changement important dans la variance et si les graphiques des résidus sont incontestablement en forme d'éventail ou de « V » (on trouvera un exemple à la figure I.2B, annexe I), il est recommandé de répéter l'analyse des données à l'aide de la méthode de régression pondérée. Avant de choisir la régression pondérée, on compare l'erreur type de la CI_p à celle obtenue par la méthode de la régression non pondérée. Si la différence entre les deux erreurs types^{Note de bas de page53} est supérieure à 10 %, la régression pondérée est à privilégier. Toutefois, si la différence entre les erreurs types obtenues par les méthodes de régression pondérée et non pondérée est inférieure à 10 %, il convient de demander l'avis d'un statisticien au sujet de l'utilisation d'autres modèles, compte tenu des données d'essai. On pourrait aussi analyser de nouveau les données par la méthode d'interpolation linéaire (à l'aide du programme ICPIN, v. 4.8.3.2), qui est moins souhaitable. On procède à cette comparaison entre les régressions pondérée et non pondérée pour chacun des modèles retenus, jusqu'au choix final du modèle (modèle et régression correspondant au meilleur choix). L'absence de divergence peut parfois indiquer que le modèle est incorrect ou inapproprié (on trouvera un exemple à la figure I.2C, annexe I). Il est fortement conseillé de demander l'avis d'un statisticien au sujet de l'utilisation de modèles additionnels.

Figure 3.  Logigramme du processus d'analyse statistique et de choix du modèle le plus approprié pour des données toxicologiques quantitatives (adaptation du logigramme présenté dans Stephenson et coll., 2000b)

4.8.3.2 Interpolation linéaire à l'aide du programme ICPIN.

Si l'on ne réussit pas à obtenir une valeur acceptable de la CI_p pour la croissance à l'aide des analyses de régression des valeurs des paramètres (v. 4.8.3.1), on devrait appliquer la technique de l'interpolation linéaire à l'aide du programme informatique ICPIN. Ce programme public (Norberg-King, 1993; USEPA, 1994b, 1995) peut être obtenu auprès de l'USEPA et fait partie de la plupart des progiciels utilisés en toxicologie environnementale, y compris TOXSTAT. L'USEPA fournit également un mode d'emploi clair qui facilite l'utilisation du programme (Norberg-King, 1993) ^{Note de54bas de page54}. Le programme ICPIN était autrefois connu sous le nom de BOOTSTR5P.

Pour procéder aux analyses à l'aide du programme ICPIN, on ne doit pas nécessairement faire appel à un nombre égal de répétitions par concentration. On estime la CI_p en lissant au besoin les données, puis en se servant des deux points voisins de la CI_p choisie (USEPA, 1994b, annexe L; USEPA, 1995, annexe L). Il est impossible de déterminer la CI_p sans avoir une concentration d'essai plus faible et une autre plus élevée qu'elle; ces deux concentrations devraient produire des effets suffisamment rapprochés de la valeur choisie de « p », de préférence avec un écart inférieur à 20 %. Le programme actuel ne comportant pas d'échelle logarithmique pour les concentrations, les utilisateurs canadiens doivent saisir les concentrations sous forme de logarithmes. Certains progiciels du commerce effectuent cette transformation, mais on devrait s'assurer que les données conservent leur forme logarithmique quand on passe au programme ICPIN. Étant donné que les méthodes habituelles ne seraient pas valides, le programme ICPIN estime les limites de confiance au moyen d'une technique « bootstrap » particulière qui permet à l'ordinateur d'effectuer un grand nombre de rééchantillonnages à partir des mesures originelles. Le chercheur doit préciser ce nombre, qui peut être compris entre 80 et 1 000. On recommande ici qu'il soit au moins de 400, mais 1 000 serait encore plus avantageux^{Note de55bas de page55}.

Si l'on observe une absence de levée pour plusieurs concentrations élevées adjacentes, seule la concentration la plus faible de cette suite devrait être utilisée dans l'analyse (c.-à-d. la concentration la plus proche de la médiane de la série de concentrations utilisée dans l'essai). Normalement, la prise en compte des concentrations additionnelles ne présente aucun intérêt particulier puisque ces concentrations n'apportent rien à l'analyse (les données consistent seulement en des masses moyennes et des longueurs moyennes nulles).

En plus de déterminer et de consigner les valeurs des CI_p obtenues par ordinateur pour la longueur et la masse des plantes individuelles à la fin de l'essai, le chercheur devrait construire des graphiques séparés du pourcentage de réduction de chacune des longueurs des pousses et des racines et de chacune des masses sèches des pousses et des racines en fonction du logarithme de la concentration afin de vérifier les estimations mathématiques et de fournir une évaluation visuelle de la nature des données (EC, 2005c).

Si le programme ICPIN est utilisé lorsqu'il y a un effet hormétique, une procédure de lissage inhérente au programme pourrait changer la valeur témoin et fausser l'estimation de la CI_p. En conséquence, avant de procéder à l'analyse statistique, il est recommandé de remplacer arbitrairement les valeurs hormétiques aux faibles concentrations par la valeur témoin. Cette façon de faire est considérée comme un expédient provisoire, jusqu'à ce que le programme soit amélioré (EC, 2005c). La correction est apportée pour toute concentration d'essai dans laquelle l'effet moyen (c.-à-d. la moyenne géométrique des moyennes des répétitions) est plus grand (« meilleur ») que la moyenne pour le témoin. Pour apporter cette correction, on remplace les masses moyennes (ou les longueurs moyennes) observées des répétitions dans la ou les concentrations hormétiques par la moyenne des répétitions dans le témoin. La moyenne géométrique pour cette ou ces concentrations sera alors identique à celle obtenue pour le témoin.

4.9 Essais avec un toxique de référence

Le tableau 13 de l'annexe E résume les indications relatives à l'exécution d'essais toxicologiques de référence fournies dans d'autres documents décrivant les procédures et conditions recommandées pour réaliser des essais de levée et de croissance de plantes dans un sol. La présente sous-section traite des procédures et des conditions à observer lorsqu'on effectue des essais toxicologiques de référence dans le cadre d'un essai de 14 ou 21 jours visant à évaluer la levée et la croissance de plantes. Les procédures décrites ici s'appliquent également à des essais qui servent à évaluer l'acceptabilité et la fiabilité de lots de graines destinés à des essais de toxicité d'un sol. Enfin, ces procédures devraient être utilisées pour évaluer la précisionintralaboratoire lorsqu'un laboratoire sans expérience dans ce domaine s'apprête à appliquer la méthode d'essai biologique décrite dans le présent document (v. 2.5 et 3.2.1).

Il est nécessaire d'utiliser systématiquement un toxique de référence pour évaluer, dans des conditions d'essai normalisées, la sensibilité relative d'un lot de graines de plantes terrestres destiné à des essais toxicologiques. Les essais avec un toxique de référence servent également à démontrer la précision et la fiabilité des données obtenues par le personnel du laboratoire pour le toxique de référence en question, dans des conditions d'essai normalisées. Un essai toxicologique de référence, réalisé conformément aux procédures et conditions décrites ici, doit être effectué selon l'une ou l'autre des fréquences suivantes :

1. au moins une fois tous les deux mois à l'aide du même lot de graines que celui utilisé pour des essais de toxicité de sols sur une longue période (≥2 mois);
2. au moment du ou des essais définitifs de toxicité d'un sol, à l'aide de graines provenant du même lot que celui utilisé pour l'essai ou les essais définitifs (v. 2.5).

Un laboratoire qui effectue souvent des essais de toxicité de sols sur des plantes terrestres peut choisir de vérifier régulièrement (p. ex. tous les deux mois) la sensibilité des graines utilisées à un ou plusieurs toxiques de référence; il inclura alors un essai toxicologique de référence dans lequel il utilisera une partie du lot de graines qui servira à démarrer un essai toxicologique définitif. Un autre laboratoire peut choisir de vérifier moins fréquemment la sensibilité de ses graines à un toxique de référence et d'effectuer un essai toxicologique de référence en même temps que chaque essai définitif.

Tout essai toxicologique de référence effectué en concomitance avec l'essai définitif de toxicité d'un sol doit prendre la forme d'un essai de croissance à concentrations multiples sans renouvellement. La durée de l'essai de référence est de 7 jours pour le blé dur, le concombre, la laitue, la luzerne, l'orge, le radis, la tomate ou le trèfle violet. Elle est de 10 jours pour l'agropyre du Nord, le boutelou gracieux, la carotte et la fétuque rouge. Dans chaque cas, la CI_p pour la longueur des pousses est déterminée à la fin de l'essai. La liste de contrôle figurant au tableau 3 résume les conditions et les procédures applicables à tout essai toxicologique de référence. Les conditions et procédures additionnelles décrites à la section 4 pour les essais à concentrations multiples sur des échantillons de sol d'essai s'appliquent également aux essais toxicologiques de référence, tout comme les procédures de préparation et d'essai indiquées à la section 6 pour les sols témoins négatifs enrichis d'une ou de plusieurs substances chimiques. Pour de plus amples renseignements, le lecteur est invité à consulter ces sections. Le document d'orientation d'Environnement Canada sur l'utilisation d'un sédiment témoin enrichi d'un toxique de référence (EC, 1995) fournit des renseignements utiles qui s'appliquent également aux essais toxicologiques de référence avec un sol témoin négatif enrichi d'un toxique de référence.

L'essai toxicologique de référence devrait être effectué à l'aide de récipients en polypropylène de 1 L (v. 3.2.2) et d'une aliquote de 500 mL de sol d'essai représentant chaque traitement (concentration) dans chaque récipient d'essai. Le nombre de répétitions par concentration doit être ≥3. Le nombre de graines par récipient dépend de l'espèce et diffère légèrement du nombre spécifié pour les essais définitifs. On doit semer 5 graines par récipient pour le blé dur, le concombre, la fétuque rouge, la laitue, l'orge, le radis, la tomate et le trèfle violet, et 10 graines par récipient pour l'agropyre du Nord, le boutelou gracieux, la carotte et la luzerne (v. tableau 3).

Les procédures de démarrage et de fin d'un essai toxicologique de référence devraient être conformes à celles décrites en 4.2 et 4.7. Les conditions d'essai relatives à la température et à l'éclairage prescrites en 4.3 s'appliquent également. Les observations et les mesures sont les mêmes que celles décrites en 4.6, mais seuls le taux de levée et la longueur des pousses individuelles devraient être déterminés à la fin de l'essai.

Pour être valide, l'essai toxicologique de référence doit se solder par un taux moyen de levée dans le traitement témoin présentant les valeurs suivantes :

• ≥60 % pour la tomate;
• ≥70 % pour l'agropyre du Nord, le boutelou gracieux, la carotte, la fétuque rouge, la laitue ou le trèfle violet;
• ≥80 % pour le blé dur, le concombre, la luzerne ou l'orge;
• ≥90 % pour le radis.

En outre, la longueur moyenne des pousses pour les différentes espèces cultivées dans un sol témoin négatif pendant la durée de l'essai doit présenter les valeurs suivantes :

• ≥10 mm pour la laitue ou le trèfle violet;
• ≥20 mm pour le boutelou gracieux, la luzerne ou la tomate;
• ≥40 mm pour la carotte, le concombre, la fétuque rouge ou le radis;
• ≥50 mm pour l'agropyre du Nord;
• ≥100 mm pour l'orge;
• ≥120 mm pour le blé dur.

Par ailleurs, pour que les résultats d'un essai toxicologique de référence soient déclarés valides, le taux moyen de survie des plantules levées dans le sol témoin négatif doit être ≥90 % à la fin de l'essai et le pourcentage moyen de plantules cultivées dans le sol témoin négatif qui présentent des indices de phytotoxicité et/ou des anomalies du développement doit être ≤10 %.

Les paramètres d'essai à calculer et à consigner sont le taux moyen de levée dans chaque traitement le jour 7 ou 10, selon l'espèce. La CI_p 7 ou 10 jours pour la longueur des pousses doit aussi être calculée (avec ses limites de confiance à 95 %). Les résultats d'un essai toxicologique de référence devraient être exprimés en milligramme de substance chimique de référence par kilogramme de sol (masse sèche).

Pour choisir le toxique de référence qui sera utilisé dans le cadre d'un essai définitif de toxicité d'un sol, on pourrait notamment considérer les critères suivants (EC, 1995) :

• la disponibilité de la substance chimique à l'état pur;
• la durée utile (stabilité) de la substance à long terme;
• la possibilité de répartir uniformément la substance dans un substrat non contaminé;
• une bonne relation entre la concentration et la réponse de l'organisme d'essai;
• la stabilité de la substance dans une solution aqueuse et dans le sol;
• le peu de dangers auxquels la substance expose ses utilisateurs;
• la facilité de doser le produit avec précision.

L'essai toxicologique de référence exige un minimum de 6 traitements (un sol témoin négatif et 5 concentrations du toxique de référence). Il est recommandé d'utiliser de l'acide borique (H₃BO₃)^{Note de bas de page56} de qualité réactif comme toxique de référence lorsqu'on effectue des essais de toxicité d'un sol sur des plantes, mais on peut aussi avoir recours à d'autres substances chimiques dont il est prouvé qu'elles sont appropriées^{Note de bas de page57}. Chaque concentration d'essai devrait être préparée conformément aux instructions données en 4.1 et 6.2, en utilisant un sol artificiel (v. 3.4.2) comme substrat.

Il est recommandé d'utiliser les conditions et les procédures décrites ici dans tous les essais toxicologiques de référence (p. ex. ceux effectués tous les deux mois ou ceux effectués en concomitance avec un essai définitif de toxicité d'un sol) réalisés avec un sol témoin négatif enrichi d'acide borique [ou de toute autre substance chimique de référence appropriée telle que le sulfate de cuivre (CuSO₄)]. Il est conseillé d'effectuer des essais préliminaires pour choisir une série de concentrations d'essai^{Note de bas de page58}qui encadre la CI_p et qui permet de calculer la CI_p 7 ou 10 jours pour la longueur des pousses.

Quand on dispose d'un nombre suffisant de données (EC, 1995), on doit porter successivement sur une carte de contrôletoutes les CI_p comparables obtenues à partir de ces essais toxicologiques pour un toxique de référencedonné. On doit ainsi préparer une carte de contrôle pour chaque espèce végétale utilisée dans les essais de toxicité définitifs. Chaque nouvelle CI_p relative au même toxique de référence devrait être examinée afin de déterminer si elle se situe dans l'intervalle correspondant à ±2 ET des valeurs obtenues dans des essais antérieurs employant le même toxique de référence et la même procédure d'essai (EC, 1997a,b, 2001). On doit préparer et mettre à jour une carte de contrôle pour chaque procédure différente (p. ex. espèces végétales différentes ou toxiques de référence différents). Sur ces cartes de contrôle, le logarithme de la concentration est porté sur l'axe vertical et la date de l'essai ou le numéro de l'essai, sur l'axe horizontal. Chaque nouvelle CI_p pour le toxique de référence devrait être comparée aux limites établies sur la carte; la CI_p est jugée acceptable si elle se trouve à l'intérieur des limites de contrôle.

On devrait se servir du logarithme de la concentration (y compris de la CI_p) dans tous les calculs de moyennes et d'écarts-types ainsi que dans toutes les constructions graphiques. Cette pratique reflète simplement une adhésion à l'hypothèse selon laquelle chaque paramètre est estimé en fonction des logarithmes des concentrations. On peut construire la carte de contrôle en reportant les valeurs logarithmiques de la moyenne et de ±2 ET sur du papier graphique à échelle arithmétique, ou en convertissant ces données en valeurs arithmétiques et en les reportant sur un papier graphique à échelle logarithmique ou semi-logarithmique. Si les CI_p n'obéissent pas à une distribution log-normale, il pourrait s'avérer préférable d'opter pour une moyenne et un écart-type arithmétiques.

Pour chaque CI_p successive du toxique de référence, on devrait recalculer la moyenne des valeurs de log (CI_p) connues ainsi que les limites de contrôle supérieure et inférieure (±2 ET) jusqu'à ce que les statistiques se stabilisent (EC, 1995, 1997a,b, 2001). Si une CI_p particulière tombe à l'extérieur de ces limites, il convient de mettre en doute la sensibilité des organismes d'essai de même que la performance et la précision de l'essai. Étant donné que de tels résultats peuvent se produire dans 5 % des cas par le simple jeu du hasard, l'obtention d'une seule valeur aberrante de la CI_p n'est pas nécessairement un signe de sensibilité anormale de la graine ou de précision insatisfaisante des résultats toxicologiques; c'est seulement un avertissement. Si le cas se produisait, on devrait alors procéder à un examen approfondi de toutes les conditions et procédures d'essai. Selon les résultats de cet examen, il pourrait s'avérer nécessaire de reprendre l'essai de référence ou de se procurer de nouvelles graines avant d'entreprendre d'autres essais de toxicité de sols.

Par ailleurs, le fait que les résultats soient tous à l'intérieur des limites de contrôle n'est pas nécessairement un gage de la cohérence des résultats obtenus par le laboratoire. Des données historiques extrêmement variables pour un toxique de référence donné élargiraient les limites de contrôle de 95 % à un point tel qu'un nouveau résultat d'essai pourrait se trouver à l'intérieur des limites, mais quand même représenter un écart-type indésirable. C'est pourquoi Environnement Canada (EC, 1995, 2005c) propose comme limite raisonnable un coefficient de variation (CV) de moins de 30 %, et de préférence de 20 % ou moins, pour la moyenne des valeurs de log(CI_p) connues (v. paragraphe précédent). Aux fins de la présente méthode d'essai biologique, on recommande donc d'adopter un CV inférieur à 30 % pour les données historiques moyennes dérivées d'essais toxicologiques de référence effectués avec de l'acide borique.

Les concentrations du toxique de référence dans toutes les solutions mères devraient être mesurées par des méthodes d'analyse chimique appropriées [p. ex. méthodes d'analyse faisant intervenir la spectrophotométrie d'émission atomique à l'aide d'un plasma induit par haute fréquence (SEA/PIHF), pour la concentration du bore]. Pour préparer les concentrations d'essai du toxique de référence dans un sol, on ajoute une quantité mesurée de solution mère au sol témoin négatif^{Note de bas de page59}et on mélange soigneusement^{Note de bas de page60}. Une fois les mélanges de toxique de référence et de sol préparés, il est recommandé de prélever au moins des aliquotes du sol témoin négatif et des traitements représentatifs des concentrations faibles, moyennes et élevées^{Note de bas de page61}. Chaque aliquote devrait être soit analysée immédiatement, soit conservée en vue d'une analyse ultérieure (à la fin de l'essai) si la CI_p pour la longueur des pousses, calculée en fonction des concentrations nominales, se situe en dehors des limites de contrôle. Les aliquotes doivent être entreposées dans l'obscurité à 4 ± 2 °C. Les aliquotes conservées en vue d'une analyse chimique ultérieure devraient être analysées peu de temps après la fin de l'essai toxicologique de référence. Le calcul de la CI_p 7 ou 10 jours pour la longueur des pousses devrait se fonder sur les concentrations mesurées si celles-ci sont passablement différentes (soit ≥20 %) des valeurs nominales et si l'exactitude des analyses chimiques est satisfaisante.

Si l'on utilise de l'acide borique comme toxique de référence, la méthode d'analyse décrite ci-après s'applique (MEEO, 1996). Un sous-échantillon de 1 à 5 g de sol enrichi d'acide borique est séché à 105 °C jusqu'à obtention d'une masse constante. On extrait ensuite une aliquote de 1 g à l'aide d'une solution de CaCl₂ 0,01 M en faisant bouillir une suspension de sol dans 50 mL de cette solution d'extraction et en ajoutant une quantité supplémentaire de cette solution pour rajuster le volume final à 50 mL. L'extrait de 50 mL est ensuite filtré à travers un filtre Whatman^MD no 4, puis dilué jusqu'à obtention d'un volume final de 100 mL. Un échantillon témoin est préparé de la même manière. On analyse ensuite le filtrat par la méthode SEA/PIHF afin de déterminer la concentration de bore élémentaire. La concentration d'acide borique dans le sol est calculée à l'aide de l'équation suivante :

acide borique =  µg B/mL (mesuré) × volume final (mL) (mg/kg, × MMacide borique/MMbore × 106 masse sèche)  1000 (µg) × masse de l'échantillon (mg, masse sèche)

Il a été démontré que, dans la plupart des cas, le seuil de détection pour l'acide borique dans le sol est de 1 mg d'acide borique par kilogramme de sol (masse sèche) (Stephenson, 2003b).