Méthode d’essai biologique servant à mesurer des plantes terrestres exposées à des contaminants dans le sol : chapitre 3

Section 3 - Organismes d’essai

• 3.1 Installations et appareils
• 3.2 Essais initiaux et définitifs
  • 3.2.1 Essais initiaux
  • 3.2.2 Essais définitifs
• 3.3 Éclairage
• 3.4 Sol témoin négatif
  • 3.4.1 Sol naturel
  • 3.4.2 Sol artificiel
• 3.5 Sol témoin positif
• 3.6 Sol de référence
• 3.7 Sol d’essai

3.1 Installations et appareils

Les essais doivent être réalisés dans une chambre à atmosphère contrôlée ou une installation équivalente dans laquelle on peut commander adéquatement la température et l'éclairage (v. 4.3)^{Note de bas de page8}. L'installation d'essai devrait être ventilée convenablement afin d'éviter que le personnel ne soit exposé à des vapeurs nocives, et elle devrait être à l'abri de perturbations physiques ou de tous contaminants susceptibles d'avoir une incidence sur les organismes d'essai. L'endroit où sont préparés les sols d'essai devrait aussi être convenablement ventilé.

L'installation d'essai devrait être isolée de l'endroit où les échantillons sont entreposés ou préparés afin d'éviter tout risque de contamination des récipients d'essai et de leur contenu à partir de ces sources. Le système de ventilation devrait être conçu de telle sorte que l'air de la zone où sont manipulés et entreposés les échantillons, ou de la zone où les substances chimiques sont traitées ou étudiées, ne puisse pas contaminer la partie du laboratoire où les essais sont réalisés; son bon fonctionnement devrait aussi être vérifié.

La température moyenne de l'air dans l'installation d'essai doit être maintenue à 24 ± 3 °C. Cependant, dans les installations d'essai où les enceintes de croissance peuvent supporter un changement cyclique de température, il est recommandé de maintenir des températures moyennes de 24 ± 3 °C pendant la journée et de 15 ± 3 °C pendant la nuit. L'humidité relative de l'installation d'essai doit être maintenue à au moins 50 %^{Note de bas de page9}.

Tous les matériaux de construction susceptibles d'entrer en contact avec les organismes, l'eau ou les récipients d'essai à l'intérieur de l'installation d'essai doivent être non toxiques et devraient réduire au minimum la sorption de substances chimiques. Les matériaux conseillés pour réduire au minimum la sorption et la lixiviation de substances chimiques sont les suivants : verre borosilicaté, nylon, polyéthylène haute densité, polystyrène haute densité, plastiques fluorocarbonés, Téflon^MD, Nalgène^MD, porcelaine, fibre de verre, acier inoxydable de type 316. L'utilisation de matières toxiques, dont le cuivre, le zinc, le laiton, le métal galvanisé, le plomb et le caoutchouc naturel, doit être évitée.

L'installation d'essai doit être équipée des instruments de base requis pour surveiller la qualité (p. ex. température et pH) du sol d'essai et de l'eau d'essai (eau d'hydratation) associée. Le laboratoire devrait également être équipé du matériel nécessaire pour permettre une analyse rapide et précise de la teneur en humidité des sols d'essai. Le matériel requis comprend un four de séchage qui peut être réglé à 90 °C pour sécher les organismes d'essai et à 105 °C pour sécher les sols, une balance précise à 0,1 mg près, un luxmètre et un pH-mètre. Le matériel de protection comprend un respirateur avec filtre contre la poussière, des gants, des vêtements de laboratoire et des lunettes de protection et doit être porté lorsqu'on prépare les mélanges et les aliquotes de sol d'essai.

Tous les récipients d'essai, appareils et fournitures susceptibles d'entrer en contact avec les sols de site, les sols d'essai, l'eau d'essai (eau d'hydratation), les solutions mères ou les solutions d'essai doivent être propres et rincés avec de l'eau désionisée ou de l'eau distillée (c.-à-d. de l'eau d'essai) avant d'être utilisés. Tout le matériel non jetable devrait être nettoyé après usage. On recommande d'utiliser la méthode de nettoyage suivante (EC, 1997a,b, 2001, 2004b) :

1. laisser tremper dans de l'eau du robinet (avec ou sans détergent) pendant 15 minutes, puis récurer avec un détergent ou laver dans un lave-vaisselle automatique;
2. rincer deux fois avec de l'eau du robinet;
3. rincer soigneusement avec de l'acide nitrique (HNO₃) ou de l'acide chlorhydrique (HCl) dilué (10 %, v/v^{Note de bas de page10}) fraîchement préparé (qualité sans métal) pour éliminer le tartre, les métaux et les bases;
4. rincer deux fois avec de l'eau désionisée (ou autre eau d'essai);
5. rincer une fois avec de l'acétone de qualité pesticide, non dilué, pour éliminer les composés organiques et avec de l'hexane de qualité réactif (p. ex. qualité CLHP, pureté ≥98,5 %) pour éliminer les résidus huileux (utiliser une hotte)^{Note de bas de page11};
6. laisser le solvant organique se volatiliser des récipients dans la hotte et laver de nouveau avec du détergent (récurer au besoin);
7. rincer trois fois avec de l'eau désionisée (ou autre eau d'essai).

Les récipients d'essai et le matériel susceptible d'être entré en contact avec le sol ou avec l'eau d'essai (eau d'hydratation) devraient être rincés avec de l'eau d'essai (eau d'hydratation) immédiatement avant d'être utilisés dans l'essai.

3.2 Essais initiaux et définitifs

3.2.1 Essais initiaux

Avant de procéder pour la première fois à des essais de toxicité définitifs sur des plantes, il est recommandé que le laboratoire d'essais effectue un minimum de cinq essais de comportement témoins avec un ou plusieurs échantillons de sol naturel non contaminé ou de sol artificiel qu'il prévoit utiliser (ou envisage d'utiliser) comme sol témoin négatif dans un ou plusieurs essais définitifs de toxicité d'un sol (v. 3.4). En outre, un minimum de cinq essais toxicologiques de référence devraient être effectués avec un ou plusieurs échantillons d'un sol témoin négatif artificiel ou naturel que l'on entend utiliser en parallèle avec les essais définitifs de toxicité d'un sol (v. 4.9). Ces essais initiaux sont recommandés pour confirmer que chaque espèce d'essai aura un comportement acceptable dans un sol témoin négatif naturel ou artificiel dans les essais réalisés par le laboratoire concerné, conformément aux procédures décrites dans le présent rapport.

Les conditions et procédures retenues pour effectuer ces essais initiaux avec un sol témoin négatif devraient être identiques et conformes à celles décrites à la section 4. Les conditions et procédures retenues pour effectuer ces essais initiaux avec un ou plusieurs toxiques de référence devraient être identiques et conformes à celles décrites en 4.9. Chaque série d'essais initiaux avec un sol témoin négatif ou un toxique de référence ou plus devrait être effectuée sur chaque espèce de plante terrestre que l'on entend utiliser dans les futurs essais de toxicité définitifs.

Les données des essais de comportement témoins (≥5) doivent montrer qu'il est possible de satisfaire aux critères de validité de l'essai (v. 4.4) pour les espèces d'essai prévues lorsqu'on utilise un sol naturel ou un sol artificiel dont on entend se servir comme sol témoin négatif dans un essai définitif de toxicité d'un sol. La méthode recommandée pour comparer les données des essais toxicologiques de référence initiaux (≥5) consiste à calculer et apprécier la grandeur du coefficient de variation pour les séries d'essais respectives et les valeurs des paramètres (v. 4.9).

3.2.2 Essais définitifs

Les récipients d'essai qui seront utilisés dans les essais définitifs doivent être inertes aux substances d'essai et de référence ou aux mélanges renfermant des contaminants (les substances d'essai ou de référence, ou les mélanges préparés avec ces substances, ne devraient pas adhérer aux récipients ou réagir de quelque façon que ce soit avec les récipients). Le récipient devrait être assez grand pour offrir un espace suffisant aux plantules pendant la durée de l'essai. Il est important d'utiliser un récipient de taille, de forme, de couleur et de composition appropriées à l'espèce végétale choisie. Les récipients devraient être dotés d'un couvercle fermant hermétiquement et ne devraient pas interférer avec la qualité de la lumière à l'intérieur. Le récipient d'essai recommandé pour les essais de levée et de croissance sur les plantes terrestres décrits dans le présent rapport est un contenant en polypropylène transparent de 1 L, doté d'un couvercle en polypropylène transparent lui aussi^{Note de bas de page12}.

On peut aussi utiliser des bocaux en verre de 1 L dotés de couvercles transparents (p. ex. des couvercles en verre à charnière)^{Note de bas de page13}. Les récipients doivent être couverts pendant les sept premiers jours de l'essai ou jusqu'à ce que les plantes atteignent le haut du contenant, le premier des deux prévalant.

3.3 Éclairage

Les essais devraient être éclairés à l'aide d'une lumière fluorescente en spectre continu ou l'équivalent. Le débit de fluence photonique, mesuré au voisinage de la surface du sol, doit être de 300 ± 100 µmol/(m² · s) (ce qui équivaut à 18 750 ± 6 250 lux). Étant donné que l'intensité lumineuse a tendance à varier dans un espace donné, il est recommandé de la mesurer en plusieurs points dans la zone d'essai. Le débit de fluence photonique dans la zone d'essai ne devrait pas s'écarter de ±15 % du débit de fluence photonique choisi.^{Note de bas de page14}

3.4 Sol témoin négatif

Chaque essai de toxicité d'un sol doit comporter un sol témoin négatif parmi les traitements expérimentaux. Le sol témoin négatif est essentiellement exempt de tout contaminant qui pourrait nuire au comportement des plantes pendant l'essai. L'utilisation d'un sol témoin négatif fournit une mesure de l'acceptabilité de l'essai, une preuve de la santé et du comportement des organismes d'essai, l'assurance que les conditions et procédures d'essai sont appropriées et une base pour l'interprétation des données obtenues avec les sols d'essai.

Dans un essai de toxicité d'un sol, on peut utiliser un sol naturel non contaminé et/ou un sol artificiel comme sol témoin négatif. Les considérations à prendre en compte dans le choix d'un sol témoin négatif approprié comprennent notamment le plan de l'étude, les caractéristiques physicochimiques du ou des sols d'essai et la disponibilité d'un sol naturel non contaminé présentant des propriétés acceptables^{Note de bas de page15}. On devrait également posséder des preuves expérimentales que le sol choisi comme sol témoin négatif permettra une levée et une croissance des plantules qui satisferont de manière régulière et fiable aux critères de validité de l'essai définis dans le présent document (v. 4.4).

La méthode d'essai biologique décrite ici a été élaborée et mise à l'essai avec cinq sols témoins négatifs présentant diverses caractéristiques physicochimiques (Aquaterra Environmental, 1998a; Stephenson et coll., 1999a,b, 2000a; Aquaterra Environmental et ESG, 2000; ESG, 2000, 2001, 2002; ESG et Aquaterra Environmental, 2002; EC, 2005b). Ces sols non contaminés comprenaient un sol artificiel et quatre sols naturels (c.-à-d. des échantillons de sols agricoles sablo-loameux et limono-loameux du sud de l'Ontario, un sol de prairie argilo-loameux de l'Alberta et un sol forestier loameux du Bouclier canadien dans le nord de l'Ontario). Ces sols avaient des compositions différentes en regard des caractéristiques physicochimiques susceptibles d'avoir une incidence sur le devenir et les effets des contaminants. Tous les sols prélevés sur le terrain venaient de zones non contaminées qui n'avaient reçu aucune pulvérisation directe de pesticides au cours des années précédentes et, partant, étaient considérés comme « non contaminés ». L'origine et les caractéristiques physicochimiques de ces sols naturels sont décrites en détail à l'annexe G. Les critères de validité des essais pour les diverses espèces de plantes indiqués en 4.4 sont fondés sur des données relatives au comportement de ces plantes dans un sol témoin négatif qui ont été obtenues pour chacun de ces cinq sols (Aquaterra Environmental, 1998a; Stephenson et coll., 1999a,b, 2000a; Aquaterra Environmental et ESG, 2000; ESG, 2000, 2001, 2002; ESG et Aquaterra Environmental, 2002; EC, 2005b).

3.4.1 Sol naturel

Le sol témoin négatif peut être un sol naturel prélevé sur un site non contaminé dont on sait qu'il n'a reçu aucune pulvérisation de pesticides ou aucun engrais depuis au moins cinq ans. Avant d'utiliser un échantillon de sol non contaminé prélevé sur le terrain comme sol témoin négatif dans un essai de toxicité définitif, le laboratoire d'essai doit posséder des preuves expérimentales que le sol naturel provenant de cette source peut satisfaire aux critères qui doivent être respectés pour que les résultats d'un essai de toxicité soient considérés comme acceptables (v. 4.4).

En conséquence, des essais initiaux avec un échantillon de ce sol doivent être effectués sur les espèces d'essai prévues afin de confirmer que les organismes d'essai peuvent satisfaire aux critères de validité de l'essai (v. 3.2.1). Par la suite, en supposant que les résultats de ces essais initiaux soient satisfaisants, il est recommandé que les échantillons de sol naturel choisis pour être éventuellement utilisés comme sol témoin négatif dans des essais de toxicité d'un sol (ainsi que des échantillons de sol de référence possible) soient analysés en regard des caractéristiques physicochimiques suivantes :

• pH
• composition granulométrique
• conductivité
• texture
• fertilité
• teneur en carbone organique total (%)
• teneur en matière organique (%)
• capacité d'échange cationique
• principaux cations
• azote total
• phosphore total
• masse volumique apparente
• CRE
• métaux
• hydrocarbures pétroliers (y compris les HAP)
• insecticides organophosphorés
• insecticides organochlorés
• une série d'herbicides (p. ex. atrazine et autres herbicides à base de triazine, piclorame, acroléine et sulfonylurés).

Les concentrations des pesticides et des métaux ne devraient pas excéder celles établies dans les Recommandations canadiennes pour la qualité des sols, le cas échéant (v. note 15). Si les graines provenant d'une banque de semences naturelles germent dans l'échantillon ou les échantillons de sol naturel à un moment quelconque (c.-à-d. pendant l'entreposage ou les essais), les plantules correspondantes doivent être éliminées. Si les résultats des essais biologiques initiaux et des analyses physicochimiques sont satisfaisants, on peut prélever un plus gros échantillon de ce sol naturel, le laisser sécher à l'air jusqu'à ce qu'il ait une teneur en humidité comprise entre 10 % et 20 %, le tamiser avec un tamis à grosses mailles (4-6 mm), le transférer dans des seaux en plastique propres, soigneusement rincés, et l'entreposer dans l'obscurité à 4 ± 2 °C jusqu'à ce qu'on en ait besoin. Il est recommandé de ne pas utiliser de seaux en plastique pour le prélèvement et l'entreposage des échantillons de sol s'il y a un risque de lixiviation des composantes chimiques du plastique dans le sol.

3.4.2 Sol artificiel

Le sol témoin négatif peut être un sol artificiel préparé en laboratoire. L'utilisation d'un sol artificiel permet de travailler avec un matériel uniforme et normalisé; cette façon de procéder est également avantageuse dans les essais de toxicité de substances ou de produits chimiques ajoutés à un sol témoin négatif (section 6).

Conformément aux recommandations de l'OCDE (1984b, 2000b), de l'USEPA (1989), de l'ISO (1991, 1993b, 1998) et de l'ASTM (1999c) relatives à la préparation d'un sol artificiel pour les essais sur des vers de terre, et aux recommandations d'Environnement Canada relatives aux essais visant à évaluer la toxicité d'un sol pour les vers de terre et les collemboles (EC, 2004b, 2006), il est recommandé d'utiliser les ingrédients suivants pour préparer un sol artificiel qui sera utilisé dans la méthode d'essai biologique décrite dans le présent document :

• 10 % de tourbe (Sphagnum sp.) séchée à l'air et tamisée avec un tamis à mailles de 2 mm (ASTM, 1999c);
• 20 % de kaolin (argile) avec des particules de <40 µm (ASTM, 1999c);
• 70 % de sable siliceux de « qualité 70 » (USEPA, 1989; ASTM, 1999c).

Les ingrédients devraient être mélangés soigneusement, à sec, à l'aide d'un agitateur mécanique et/ou manuellement (porter des gants)^{Note de bas de page16}. On recommande d'ajouter du carbonate de calcium de qualité réactif au mélange sec, en quantité suffisante pour que le pH du sol artificiel, une fois hydraté, se situe entre 6,5 et 7,5^{Note de bas de page17}. On hydrate ensuite le mélange, graduellement, à l'aide d'eau d'essai (eau désionisée ou distillée) jusqu'à ce que sa teneur en humidité soit d'environ 20 % (~28 % de la CRE du sol), tout en continuant de mélanger jusqu'à obtention d'une couleur et d'une texture uniformes. Au besoin, on ajoutera du carbonate de calcium de qualité réactif au mélange hydraté en quantité suffisante pour maintenir le pH dans la fourchette 6,5-7,5. Il est recommandé d'entreposer le sol artificiel de pH voulu dans l'obscurité, à une température de 20 ± 2 °C, pendant au moins trois jours avant de l'utiliser dans un essai de toxicité afin que le pH ait le temps de s'équilibrer^{Note de bas de page17}. Ensuite, le sol artificiel peut être entreposé à une température de 4 ± 2 °C. Lorsque le sol doit être utilisé pour un essai de toxicité, on recommande d'hydrater de nouveau la quantité appropriée de sol artificiel entreposé, à l'aide d'eau d'essai, jusqu'à obtention d'une teneur en humidité équivalant à environ 70 % de la CRE.

3.5 Sol témoin positif

Il est recommandé d'inclure un ou plusieurs échantillons de sol témoin positif dans chaque série d'essais de toxicité d'un sol sur des plantes terrestres, afin de faciliter l'interprétation des résultats des essais. Dans le choix d'un sol témoin positif, on s'efforcera de choisir un sol toxique qui provoquera chez les organismes d'essai une réponse prévisible, observée dans des essais de toxicité antérieurs réalisés avec ce matériel. Le sol témoin positif peut être un échantillon de sol témoin négatif enrichi d'un toxique de référence pour lequel on dispose de données historiques concernant sa toxicité pour des plantes, mesurée dans des conditions et selon des procédures d'essai particulières. Aux fins de la méthode d'essai décrite dans le présent document, on doit utiliser un ou plusieurs toxiques de référence comme sol témoin positif lorsqu'on évalue la sensibilité des organismes d'essai ainsi que la précision et la fiabilité des résultats obtenus par le laboratoire avec ce matériel (v. 4.9). On peut également inclure dans un essai un échantillon de sol témoin négatif (naturel ou artificiel; v. 3.4) qui a été enrichi expérimentalement (section 6) d'une substance ou d'un produit chimique toxique préoccupant ou plus lorsqu'on évalue l'échantillon ou les échantillons de sol d'essai, à une concentration toxique pour l'espèce végétale utilisée conformément à la méthode d'essai biologique décrite ici. Dans certains cas, l'essai pourra inclure un sol témoin positif composé d'un échantillon fortement contaminé de sol ou de boue prélevé sur le terrain, qui s'est révélé systématiquement toxique pour des plantes terrestres dans des essais conduits selon la méthode d'essai biologique décrite dans le présent rapport^{Note de bas de page18}.

3.6 Sol de référence

Un ou plusieurs échantillons de sol de référence pourraient être inclus dans un essai visant à évaluer la toxicité d'un sol pour des plantes terrestres^{Note de bas de page19}. Le type et la nature de l'échantillon ou des échantillons de sol utilisés comme sol de référence dans une étude donnée dépendent du cadre expérimental et des objectifs de l'étude. Si l'étude porte sur la toxicité d'échantillons de sol prélevés sur un site contaminé ou susceptible d'être contaminé, on pourrait utiliser, comme sol de référence, un ou plusieurs échantillons de sol prélevés sur un site non contaminé, dont les propriétés physicochimiques (p. ex. teneur en carbone organique, teneur en matière organique, composition granulométrique, texture, pH) concordent le plus possible avec les propriétés de l'échantillon ou des échantillons de sol d'essai (contaminé). Idéalement, le sol de référence est prélevé près du ou des sites où les échantillons de sol d'essai ont été recueillis, mais il est éloigné de la ou des sources de contamination. On pourrait également choisir un ou plusieurs échantillons de sol de référence non contaminé prélevé sur des sites éloignés du ou des sites d'essai, en raison de son absence de toxicité mise en évidence dans des essais antérieurs sur des plantes et du fait qu'il possède des caractéristiques physicochimiques comparables à celles du sol d'essai. On pourrait éventuellement procéder à des essais sur l'échantillon ou les échantillons de sol de référence prélevés sur le terrain en vue d'une étude afin d'évaluer les effets toxiques, en utilisant ce sol pur seulement, ou en le mélangeant avec l'échantillon ou les échantillons de sol d'essai pour préparer une gamme de concentrations en vue d'un essai à concentrations multiples^{Note de bas de page20}(v. 3.7 et 5.5, de même que l'introduction de la section 4). Il est recommandé de ne pas prélever les échantillons de sol de référence sur des sites dont on sait qu'ils ont reçu des pulvérisations de pesticides ou d'engrais au cours des cinq dernières années ou plus.

Le chercheur pourrait choisir d'inclure un ou plusieurs échantillons de sol artificiel comme sol de référence dans un essai particulier. Par exemple, il pourrait utiliser ces échantillons dans des essais à concentrations multiples avec des sols de site ou des sols enrichis d'une substance chimique pour étudier l'effet de certaines caractéristiques physicochimiques (p. ex. un certain nombre de sols de référence artificiels préparés pour fournir une gamme de valeurs en regard de la texture et/ou de la teneur en matière organique; Sheppard et Evenden, 1998; Stephenson et coll., 2002) sur la toxicité d'un sol de site contaminé ou d'un sol enrichi d'une substance chimique. Des échantillons multiples de sol non contaminé prélevé sur le terrain, recueillis sur divers sites, présentant une ou plusieurs caractéristiques physicochimiques très différentes, pourraient aussi être utilisés à cette fin. Dans une telle étude, il est recommandé d'inclure dans l'essai une portion non diluée (pure à 100 %) de chaque sol de référence utilisé pour préparer une série de concentrations du sol d'essai.

Chaque essai comportant un ou plusieurs échantillons de sol de référence doit inclure un échantillon de sol témoin négatif (v. 3.4). Par contre, avec certains essais (p. ex. un essai comportant une série de concentrations de sol enrichi d'une substance chimique préparé avec un sol témoin négatif artificiel ou naturel), il n'est pas nécessaire d'inclure un échantillon de sol de référence. Pour les essais avec un sol prélevé sur le site, il est préférable d'inclure un ou plusieurs échantillons de sol de référence provenant d'un site voisin à des fins de comparaison (v. 5.5); selon les objectifs de l'étude, on décidera s'il faut diluer le sol du site avec un sol de référence (plutôt qu'un sol témoin négatif) dans la préparation de la série de concentrations en vue d'un essai à concentrations multiples.

3.7 Sol d'essai

La présente méthode d'essai biologique a été conçue pour mesurer la toxicité d'un ou de plusieurs échantillons ou mélanges de sol contaminé ou susceptible d'être contaminé (sol d'essai) à l'aide de plantes terrestres utilisées comme organismes d'essai. L'échantillon ou les échantillons de sol d'essai peuvent être constitués soit de sol prélevé sur un site industriel ou autre site préoccupant, soit de biosolides industriels ou urbains (p. ex. matériau de dragage, boues provenant d'une usine d'épuration des eaux usées urbaines, compost, fumier) que l'on envisage d'épandre sur le sol. Un échantillon de sol d'essai recueilli sur le terrain pourra être soumis à un essai à concentration unique (habituellement pure à 100 %) ou à un essai de toxicité à concentrations multiples dans lequel une série de concentrations sera préparée en mélangeant des quantités mesurées avec soit un sol témoin négatif, soit un sol de référence (v. section 5).

Le sol d'essai pourrait aussi être constitué d'une ou de plusieurs concentrations d'un sol enrichi d'une substance chimique, préparé en laboratoire en mélangeant une substance ou un produit chimique ou plus avec un sol témoin négatif, un sol de référence ou un sol de site (v. section 6).