Méthode d’essai biologique servant à mesurer des plantes terrestres exposées à des contaminants dans le sol : chapitre 5

Section 5 - Procédures particulières pour la mesure de la toxicité d’un sol ou d’un matériau particulaire semblable prélevé sur le terrain

• 5.1 Prélèvements
• 5.2 Étiquetage, transport, entreposage et analyse des échantillons
• 5.3 Préparation de l'échantillon en vue des essais
• 5.4 Observations et mesures en cours d'essai
• 5.5 Paramètres de l'essai et calculs
  • 5.5.1 Variantes du plan d'étude et des analyses
  • 5.5.2 Analyse de puissance

La présente section contient des directives particulières sur la préparation et la mise à l'essai d'échantillons de sol ou de matériau particulaire semblable prélevé sur le terrain (site). Ces directives complètent celles énoncées à la section 4.

Des instructions détaillées sur le prélèvement, la manipulation, le transport, l'entreposage et l'analyse d'échantillons de sol prélevés sur le terrain sont données dans un certain nombre de rapports portant sur ces questions (p. ex. van Ee et coll., 1990; Webster et Oliver, 1990; USEPA, 1991; Keith, 1992; Klute, 1986; Carter, 1993; MAAAR, 1999). En l'absence d'instructions spécifiques d'Environnement Canada sur ces sujets, on devrait consulter ces rapports et s'y conformer (à titre de complément aux présentes) lorsqu'on veut prélever des échantillons de sol sur le terrain et les préparer en vue d'essais toxicologiques sur des plantes terrestres à l'aide de la méthode d'essai biologique décrite ici.

5.1 Prélèvements

Crépin et Johnson (1993) présentent une synthèse utile du plan d'échantillonnage et des techniques à utiliser pour le prélèvement sur le terrain. Les études sur le terrain de la toxicité d'un sol à l'aide d'essais biologiques sur des plantes terrestres et/ou d'autres organismes appropriés associés au sol (p. ex. EC, 2004b, 2006) font souvent partie d'études plus vastes (p. ex. Callahan et coll., 1991; Menzie et coll., 1992; Saterbak et coll., 2000) susceptibles d'inclure une batterie d'essais pour évaluer la toxicité du sol, accompagnée d'évaluations de la bioaccumulation des contaminants, d'analyses chimiques, d'études biologiques des organismes de l'épifaune et/ou de l'endofaune et, le cas échéant, d'une compilation de données géologiques et hydrographiques. On peut améliorer les corrélations statistiques et réduire les coûts en prélevant simultanément tous les échantillons requis pour ces divers essais, analyses et collectes de données.

On pourrait prélever les échantillons de sol qui seront utilisés dans la méthode d'essai biologique décrite ici (section 4) selon une fréquence régulière (trimestrielle, semestrielle ou annuelle) sur un certain nombre de sites contaminés ou susceptibles d'être contaminés, à des fins de surveillance et d'application d'une loi. Les échantillons pourraient aussi être prélevés une seule fois ou à plusieurs reprises, dans le cadre d'études sur le terrain, pour définir la qualité spatiale (horizontale ou verticale) ou temporelle du sol. Pour chaque prélèvement sur le terrain, on devrait également prendre, d'un ou de plusieurs sites, des échantillons de sol de référence (qu'on présume non contaminés)^{Note de bas de page62}.

Le nombre de stations d'échantillonnage et le nombre d'échantillons de répétition par station sont propres à chaque étude. Pour les déterminer, on devra dans la plupart des cas faire des compromis entre les diverses contraintes d'ordre logistique et pratique (comme le temps et le coût) et les exigences statistiques. Webster et Oliver (1990), Crépin et Johnson (1993) et MAAAR (1999) offrent des conseils au sujet du plan d'échantillonnage; van Ee et coll. (1990) et USEPA (1991) traitent des questions relatives à l'assurance de la qualité et au contrôle de la qualité.

Pour certaines activités de surveillance et d'application réglementaire, on devrait prélever plusieurs répétitions (c.-à-d. des échantillons de carottes ou des échantillons ponctuels distincts pris au même site) à chaque station d'échantillonnage, y compris une ou plusieurs stations de référence. On devrait évaluer la toxicité de chacune de ces répétitions de terrain pour des plantes terrestres dans ≥5 récipients d'essai par répétition (v. 4.1). Le recours à l'analyse de puissance (v. 5.5.2) avec des valeurs des paramètres obtenues dans des essais antérieurs de même type effectués avec des échantillons provenant du même site ou de sites similaires aidera à déterminer s'il est nécessaire d'ajouter des répétitions au laboratoire pour chaque répétition de terrain. Certains tests statistiques requièrent de leur côté un nombre minimal de répétitions. Dans d'autres situations (p. ex. des études préliminaires ou exhaustives sur la répartition spatiale de la toxicité), le plan expérimental pourrait ne demander qu'un seul échantillon par station, auquel cas l'échantillon serait normalement homogénéisé et réparti dans cinq récipients de répétition. Cette dernière façon de procéder ne permet pas de déterminer la toxicité moyenne en un lieu d'échantillonnage (station) donné et il est alors impossible d'établir si une station est différente de la station témoin ou de la station de référence, ou de tout autre lieu d'échantillonnage. Cela dit, il demeure possible de comparer statistiquement la toxicité de l'échantillon en question à celle d'un échantillon témoin ou de l'échantillon de référence, ou à celle d'un ou de plusieurs échantillons provenant d'autres endroits. Il est important de retenir qu'une ou des conclusions éventuelles au sujet de possibles différences, découlant de l'évaluation d'échantillons de terrain sans répétitions, ne permettent pas de tirer de conclusions au sujet des lieux d'échantillonnage.

Les échantillons de sol de référence devraient être prélevés sur des sites où le sol présente des propriétés géochimiques semblables à celles du sol d'essai. Dans les cas où la pollution (p. ex. due à des boues d'épuration ou industrielles) est responsable de la teneur élevée des sols d'essai en carbone organique, il pourrait ne pas être indiqué d'apparier la teneur en carbone organique total ou la teneur en matière organique. Pour faciliter le choix des sites appropriés pour le prélèvement de sol de référence, il est utile de procéder à des études préliminaires afin d'évaluer la toxicité et les propriétés géochimiques du sol présent dans la ou les régions préoccupantes et aux alentours.

On peut prélever des échantillons de boues ménagères ou industrielles (p. ex. boues d'épuration, stériles miniers égouttés ou biosolides d'un clarificateur industriel ou d'un bassin de décantation) pour en évaluer les effets toxiques sur les plantes et effectuer des analyses des contaminants ou des propriétés géochimiques. On peut également prélever des échantillons d'autres déchets particulaires dont on envisage l'épandage sur le sol, afin d'en évaluer la toxicité et les propriétés physicochimiques.

Des conseils relatifs à divers plans et procédures d'échantillonnage du sol peuvent être trouvés dans la documentation technique (p. ex. Petersen et Calvin, 1986; Keith, 1992; Crépin et Johnson, 1993). Les modes opératoires pour prélever les échantillons (carottage, échantillonnage ponctuel, échantillons composites) dépendent des objectifs de l'étude et de la nature du sol ou des autres matériaux particulaires recueillis. On utilise fréquemment une pelle, une tarière ou un carottier (de préférence en acier inoxydable) pour prélever les échantillons de sol. La surface à l'endroit où l'échantillon de sol sera prélevé devrait être débarrassée des débris tels que brindilles, feuilles, cailloux, chaume et détritus. Si, à cet endroit, la surface est recouverte de graminées ou de plantes herbacées, celles-ci devraient être coupées au ras du sol et arrachées avant le prélèvement des échantillons. La végétation devrait être éliminée de manière à enlever le moins possible de particules du sol avec les racines. Dans le cas où la masse racinaire est dense (p. ex. en présence de graminées), il est conseillé d'arracher les racines et de les secouer vigoureusement afin de faire tomber les particules de sol qui adhèrent aux racines. Les échantillons de sol destinés à des essais toxicologiques et à des analyses chimiques devraient être prélevés à une ou plusieurs profondeurs représentatives de la ou des couches préoccupantes (p. ex. couche superficielle ou couches plus profondes de sol ou de sous-sol si l'on pense que d'anciens dépôts de contaminants peuvent poser des problèmes).

Avant d'entreprendre un programme d'échantillonnage, on devrait calculer le volume de sol requis par échantillon. Ce calcul devrait tenir compte des quantités exigées pour préparer les répétitions de laboratoire destinées aux essais de toxicité du sol et pour déterminer la composition granulométrique, la teneur en carbone organique total, la teneur en matière organique, la teneur en humidité et d'autres propriétés chimiques particulières. Normalement, il est nécessaire de prélever au moins 5 à 7 L de sol par échantillon, mais ce volume peut changer selon les objectifs et le plan de l'étude (p. ex. essai à concentration unique ou à concentrations multiples), selon le type des analyses chimiques à effectuer et aussi, éventuellement, selon la nature du sol (p. ex., s'il faut éliminer un excès d'eau et/ou des débris au laboratoire, le volume de l'échantillon risque d'être réduit). Pour obtenir le volume requis, il est souvent nécessaire de combiner des sous-échantillons prélevés à l'aide du dispositif d'échantillonnage choisi. On devrait employer la même méthode de prélèvement à tous les sites d'échantillonnage.

5.2 Étiquetage, transport, entreposage et analyse des échantillons

Les contenants choisis pour transporter et entreposer les échantillons de sol ou d'autre matériau particulaire prélevé sur le terrain doivent être faits d'une matière non toxique. Le choix du contenant dépend à la fois du volume de l'échantillon et de l'usage qu'on prévoit en faire. Ces contenants doivent être neufs ou nettoyés en profondeur, ou encore doublés à l'intérieur avec une feuille de plastique de haute qualité. On emploie habituellement des sacs en plastique épais (p. ex. 4 millièmes de pouce) pour le transport et l'entreposage des échantillons. Si l'on utilise des sacs en plastique, il est recommandé de placer chaque sac dans un second contenant opaque propre (p. ex. une glacière ou un seau en plastique muni d'un couvercle) afin d'éviter que le sac ne se déchire ou n'éclate sous l'effet du poids et pour garder l'échantillon dans l'obscurité durant le transport (ASTM, 1999b). Les contenants ou doublures en plastique ne devraient pas être utilisés s'il y a des risques que le plastique ait une incidence sur les caractéristiques du sol (p. ex. risques de lixiviation de composants de la matière plastique dans le sol).

L'espace occupé par l'air dans le contenant utilisé pour le transport et l'entreposage de l'échantillon doit être réduit au minimum (p. ex. en comprimant le sac rempli ou partiellement rempli et en le fermant avec un ruban adhésif). Tout de suite après avoir rempli les contenants, on doit les sceller et les étiqueter ou les coder. Les étiquettes et les registres préparés à ce moment-là doivent indiquer au moins le type de prélèvement (p. ex. échantillon ponctuel, carotte, échantillon composite), l'origine de l'échantillon, l'emplacement exact, l'utilisation des terres, le nombre de répétitions et la date de prélèvement; le nom et la signature du ou des préleveurs doivent également figurer sur les étiquettes et les registres. On recommande également que les éléments ci-dessous soient consignés en détail par les personnes chargées du prélèvement :

• la nature, l'aspect et le volume de chaque échantillon;
• le dispositif et la méthode de prélèvement;
• les méthodes utilisées pour préparer des échantillons composites ou des sous-échantillons des échantillons prélevés sur le terrain par carottage ou par échantillonnage ponctuel;
• le nombre de répétitions prises à chaque station d'échantillonnage;
• le calendrier des prélèvements;
• le type et le nombre de contenants utilisés pour transporter les échantillons;
• toute mesure prise sur le terrain (p. ex. température, pH, teneur en humidité) relativement au sol;
• les conditions et les modes opératoires utilisés pour refroidir et transporter les échantillons;
• des observations relatives aux conditions environnementales au moment du prélèvement (p. ex. pluie);
• des observations relatives à la faune endogène et à la végétation au lieu du prélèvement.

Les échantillons de sol ne devraient pas être exposés au gel ou à une chaleur excessive pendant le transport ou l'entreposage. Il est recommandé de conserver les échantillons dans l'obscurité (dans des contenants opaques étanches à la lumière tels que des glacières ou des seaux en plastique munis d'un couvercle) durant le transport, surtout s'ils risquent de contenir des HAP ou d'autres substances ou produits chimiques susceptibles de réagir à la lumière ou d'être altérés s'ils sont exposés à la lumière solaire. On devrait utiliser au besoin des sachets réfrigérants, de la glace ou tout autre moyen de réfrigération pour faire en sorte que l'échantillon ou les échantillons soient maintenus au frais (p. ex. 7 ± 3 °C) durant le transport.

La date de réception du ou des échantillons au laboratoire doit être consignée. La température de l'échantillon à l'arrivée au laboratoire devrait également être mesurée et consignée. Les échantillons qu'on prévoit entreposer pour un usage ultérieur doivent être conservés dans des contenants étanches. Si le sol renferme des contaminants volatils ou que ceux-ci soulèvent des préoccupations particulières, on devrait purger tout espace libre du contenant au moyen d'azote gazeux avant de sceller le contenant. Les échantillons ne doivent pas geler, ni complètement ni partiellement, pendant le transport ou l'entreposage (sauf si on les a prélevés à l'état congelé) et on ne doit pas les laisser se déshydrater. Cela dit, si un ou plusieurs échantillons sont saturés d'eau en excès lorsqu'ils arrivent au laboratoire (p. ex. s'ils ont été prélevés pendant une forte pluie), ils peuvent être transférés dans une feuille de plastique pendant un court laps de temps (p. ex. une heure ou plus) afin de permettre à l'eau en excès de s'écouler ou de s'évaporer. Ils devraient ensuite être transférés de nouveau dans le ou les contenants de transport ou dans un ou plusieurs contenants plus étanches avant d'être entreposés.

Il est recommandé d'entreposer les échantillons dans l'obscurité à une température de 4 ± 2 °C. Ces conditions d'entreposage sont obligatoires lorsque le sol renferme des HAP ou d'autres contaminants photosensibles, ou si l'on sait que les échantillons contiennent des composés volatils instables préoccupants. On recommande également de procéder aux essais sur les échantillons de sol ou de matériau particulaire semblable le plus rapidement possible après le prélèvement. Les essais toxicologiques devraient débuter dans les deux semaines après le prélèvement, de préférence dans la première. Les essais doivent être entrepris au plus tard dans les six semaines, à moins qu'il n'ait été établi que les contaminants du sol sont anciens et/ou qu'ils ont été altérés par le temps et que, partant, ils soient jugés stables.

Il est conseillé de procéder à un tamisage par voie sèche (tamisage avec pressage manuel) des échantillons à travers un tamis à grosses mailles afin d'éliminer les grosses particules (v. 5.3). Ce tamisage peut être effectué sur le terrain. On peut également éliminer les matières grossières indésirables (p. ex. gros graviers ou cailloux, débris importants, gros macro-invertébrés indigènes ou matière végétale de grande dimension) sur le terrain avant le transport de l'échantillon.

Au laboratoire, chaque échantillon de sol prélevé sur le terrain (y compris les échantillons de sol témoin négatif et de sol de référence) devrait être soigneusement mélangé (v. 5.3) puis réparti en sous-échantillons en vue de sa caractérisation physicochimique, qui doit comporter l'analyse des paramètres suivants :

• composition granulométrique (pourcentage de sable, de limon et d'argile),
• teneur en carbone organique total (%),
• teneur en matière organique (%),
• teneur en humidité (%),
• CRE (pourcentage en fonction de la masse sèche de sol),
• azote total,
• phosphore total,
• pH,
• conductivité.

Les caractéristiques suivantes devraient également être analysées :

• texture,
• fertilité,
• rapport C/N,
• capacité d'échange cationique,
• principaux cations,
• insecticides organophosphorés,
• insecticides organochlorés,
• divers herbicides.

D'autres analyses pourraient être effectuées :

• masse volumique apparente,
• carbone inorganique total,
• solides volatils totaux,
• demande biochimique en oxygène,
• demande chimique en oxygène,
• potentiel d'oxydoréduction,
• métaux,
• hydrocarbures pétroliers (y compris les HAP).

À moins d'indication contraire, on devrait procéder aux mêmes analyses chimiques, physiques et toxicologiques sur les sous-échantillons représentatifs de chaque répétition de sol prélevé sur le terrain (y compris le sol de référence) préparée en vue d'une étude donnée de la qualité du sol, de même que sur un ou plusieurs sous-échantillons de sol témoin négatif.

5.3 Préparation de l'échantillon en vue des essais

Les échantillons de sol ou de déchets particulaires prélevés sur le terrain ne doivent jamais être tamisés avec de l'eau, car on éliminerait ainsi les contaminants qui sont présents dans l'eau de porosité ou dont la sorption sur la matière particulaire est faible. Les gros graviers ou cailloux, les débris, les macro-invertébrés indigènes ou la matière végétale devraient normalement être extirpés au moyen de pincettes ou avec les doigts gantés. Si un échantillon donné contient beaucoup de ces débris (p. ex. matière végétale, copeaux de bois, verre, plastique, gros graviers) ou de gros macro-invertébrés, on peut les retirer en pressant le sol à travers un tamis grossier (mailles de 4-9 mm; EC, 2000).

Les descriptions qualitatives de chaque échantillon de sol d'essai prélevé sur le terrain devraient être consignées au laboratoire où les essais sont réalisés. On devrait ainsi décrire la couleur de l'échantillon, la texture ainsi que les racines, les feuilles et les organismes endogènes macroscopiques éventuellement présents dans l'échantillon. À moins d'indication contraire dictée par les objectifs particuliers de la recherche ou de l'étude, tous les échantillons d'un matériau prélevé sur le terrain devraient être homogénéisés au laboratoire avant de servir aux essais (USEPA, 1989)^{Note de bas de page63}. Le fait de mélanger le sol peut cependant avoir une incidence sur la concentration et la biodisponibilité des contaminants présents dans le sol et, partant, l'homogénéisation pourrait ne pas être souhaitable dans tous les cas.

Comme il est indiqué en 3.7, un ou plusieurs échantillons de sol d'essai prélevé sur le terrain pourraient être soumis à des essais toxicologiques réalisés avec une seule concentration (habituellement 100 %) ou avec des concentrations multiples. Dans ce dernier cas, les concentrations sont préparées en mélangeant des quantités mesurées du sol d'essai avec un sol témoin négatif ou un sol de référence. Dans un essai à concentrations multiples, il pourrait être approprié de mélanger le sol d'essai avec un sol témoin négatif ou un sol de référence de manière à obtenir 9 concentrations couvrant la gamme de 100-1 %, comme suit : 100 %, 80 %, 65 %, 50 %, 30 %, 15 %, 7,5 %, 3 %, 1 % et 0 %. Des conseils sur d'autres séries de concentrations susceptibles d'être aussi ou plus appropriées sont donnés en 6.2, où sont également présentées des explications au sujet de la préparation de mélanges qui pourraient en outre être utilisés dans des essais à concentrations multiples sur un ou plusieurs échantillons de sol prélevés sur le terrain. Le lecteur est invité à consulter la sous-section 4.1 pour des conseils additionnels au sujet du choix des concentrations d'essai. Dans tous les cas, l'essai doit comprendre un traitement contenant seulement un sol témoin négatif (v. 3.4).

Pour homogénéiser l'échantillon, on conseille de le transvaser dans un contenant rigide propre (p. ex. un gros bol en acier inoxydable ou en plastique) ou, pour de plus grandes quantités de sol, sur des feuilles de plastique propres étalées sur le sol. L'échantillon devrait être mélangé manuellement (il faut alors porter des gants ou bien on peut se servir d'un ustensile non toxique comme une cuillère en acier inoxydable) ou mécaniquement (p. ex. avec un malaxeur portatif ménager réglé sur basse vitesse ou un fouet utilisé pour battre les œufs) jusqu'à obtention d'une texture et d'une couleur uniformes. Pendant l'homogénéisation, il faudrait veiller à réduire au minimum l'impact du mélange sur la structure du sol et à ne pas détruire complètement cette structure. Il est conseillé d'arrêter de mélanger dès que l'échantillon semble avoir une couleur et une texture uniformes.

Les conditions de mélange, incluant la durée et la température, doivent être aussi semblables que possible pour tous les échantillons d'un essai donné. Si l'on doute de l'efficacité de la méthode utilisée, il est recommandé de prélever des sous-échantillons du sol mélangé afin de déterminer leur homogénéité individuelle (granulométrie, substances chimiques étudiées et autres caractéristiques). Tout liquide séparé de l'échantillon pendant son transport et/ou son entreposage doit, si possible, lui être réincorporé.

La teneur en humidité d'un échantillon donné de sol d'essai prélevé sur le terrain devrait être déterminée pendant la préparation de l'échantillon, puis uniformisée par hydratation du sol jusqu'à obtention d'une teneur en humidité optimale correspondant à un pourcentage de la valeur préalablement établie de la CRE du sol. Le pourcentage optimal de la CRE pour chaque échantillon de sol prélevé sur le terrain doit être déterminé avant la préparation de l'échantillon et le démarrage de l'essai. Pour ce faire, il faut déterminer la teneur en humidité de chaque échantillon homogénéisé (c.-à-d. chaque échantillon de sol d'essai, y compris le sol témoin négatif) (v. 4.1 et 4.6). On doit ensuite établir la CRE de chaque échantillon en appliquant une méthode normalisée reconnue (des explications sont données dans les trois paragraphes suivants). On hydrate ensuite un sous-échantillon de chaque échantillon de sol jusqu'à obtention d'une consistance grumeleuse homogène, avec des grumeaux d'approximativement 3-5 mm de diamètre^{Note de bas de page64}. À partir de la teneur en humidité initiale de l'échantillon, de la CRE de l'échantillon et du volume d'eau ajouté pour obtenir la consistance voulue du sol, on peut calculer la teneur en humidité optimale de l'échantillon et l'exprimer sous la forme d'un pourcentage de la CRE pour chaque sol. Une fois ce pourcentage cible (ou optimal) de la CRE déterminé, on peut normaliser la teneur en humidité de chaque échantillon de sol d'essai (y compris le sol témoin négatif) selon la teneur en humidité choisie (particulière à l'échantillon). On devrait ajouter de l'eau d'essai (eau désionisée ou distillée) à chaque échantillon dont la teneur en humidité est inférieure au pourcentage optimal de sa CRE préalablement établi, jusqu'à obtention de cette teneur en humidité^{Note de bas de page65} (Aquaterra Environmental, 1998a). Si l'échantillon est trop humide, il devrait être étalé en une couche fine sur une feuille de plastique propre (p. ex. un sac à déchets neuf en plastique) ou sur un plateau propre fait d'une matière non réactive (p. ex. en acier inoxydable ou en plastique) et laissé à sécher par évaporation à la température ambiante (~20 °C). Il faudra peut-être réhydrater l'échantillon jusqu'à obtention du pourcentage optimal de sa CRE prédéterminée. Une fois la teneur en humidité de l'échantillon ajustée au pourcentage désiré de sa CRE, la teneur en humidité (%) de l'échantillon doit être déterminée et cette valeur ainsi que le pourcentage de la CRE doivent être consignés.

La CRE (et le pourcentage de la CRE optimal pour les essais biologiques) d'un sol donné est généralement caractéristique du type de sol. En dernière analyse, elle est le résultat de l'interaction de nombreuses variables associées à la structure du sol (p. ex., micro/macro-agrégation, porosité, masse volumique apparente, texture, teneur en matière organique). Il existe un certain nombre de méthodes pour déterminer la CRE, mais la plupart de ces méthodes exigent que les mesures soient effectuées sur un échantillon de sol intact (p. ex. sur une carotte de sol) prélevé de telle sorte que les caractéristiques du sol (agrégations structurales, porosité, masse volumique apparente, texture et teneur en matière organique) soient préservées. L'USEPA (1989) a établi une méthode qui convient aux essais toxicologiques sur des matériaux non consolidés (comme les échantillons de sol prélevés sur le terrain qui ont été séchés, tamisés et homogénéisés ou les échantillons de sol préparés au laboratoire à partir des constituants)^{Note de bas de page66}. Cette méthode est résumée ci-après.

Dans cette méthode, on dépose ~130 g (masse humide) de l'échantillon sur un plateau en aluminium ou une boîte de Petri (15 × 1 cm) et on fait sécher à 105 °C jusqu'à obtention d'une masse constante (il faut compter habituellement au moins 24 h). On place ensuite 100 g du sol séché au four dans un bécher en verre de 250 mL et on ajoute 100 mL d'eau distillée ou désionisée. Il faut ensuite brasser soigneusement la suspension avec une tige de verre. On plie ensuite un papier filtre (papier crêpé de marque Fisherbrand, de porosité grossière P8 et de 185 mm de diamètre, no de catalogue 09-790-12G) que l'on place dans un entonnoir en verre (diamètre supérieur intérieur de 100 mm et longueur de tige de 95 mm) de telle sorte que le papier filtre plié coïncide avec le bord supérieur de l'entonnoir. À l'aide d'une pipette, on mouille le papier filtre sur toute sa surface en ajoutant lentement 9 mL d'eau distillée ou désionisée, après quoi on pèse l'entonnoir et le papier filtre mouillé. Pour obtenir la masse initiale de l'ensemble entonnoir, papier filtre mouillé et sol sec (« I » dans l'équation 1 ci-dessous), on ajoute la masse du sol sec (100 g) à la masse de l'entonnoir et du papier filtre mouillé.

On place ensuite l'entonnoir dans un flacon Erlenmeyer de 500 mL et on verse lentement la suspension de sol sur le papier filtre mouillé. Tout sol restant sur les parois du bécher ou sur la tige de verre est rincé dans l'entonnoir avec la plus petite quantité d'eau nécessaire pour que toute la matière solide soit entraînée sur le filtre. Il faut ensuite bien couvrir l'entonnoir avec une feuille d'aluminium et laisser l'eau s'écouler pendant trois heures à la température ambiante. Après trois heures, on pèse l'entonnoir contenant le papier filtre mouillé et le sol humide. La masse obtenue représente la masse finale de l'ensemble entonnoir, papier filtre mouillé et sol (humide) (« F » dans l'équation 1).

La CRE du sous-échantillon de sol contenu dans l'entonnoir, exprimée sous la forme d'un pourcentage de la masse sèche du sol, est calculée à l'aide de l'équation suivante :

CRE = ([F - I] ÷ S) x 100

où :

CRE = capacité de rétention d'eau (%)
F = masse de l'ensemble entonnoir, papier filtre mouillé et masse humide du sol
I = masse de l'ensemble entonnoir, papier filtre mouillé et masse sèche du sol
S = 100 g (masse sèche du sol)

La CRE de chaque échantillon de sol d'essai devrait faire l'objet d'une triple détermination, à l'aide de trois sous-échantillons.

Le pourcentage d'eau (P_E) ajouté à un échantillon de sol prélevé sur le terrain pour obtenir l'hydratation désirée (soit le pourcentage optimal de la CRE) peut être calculé comme suit^{Note de bas de page67} :

P_E = [CRE × (P_CRE/100)] - TH [équation 2]

où :

P_E = pourcentage d'eau à ajouter au sol
CRE = capacité de rétention d'eau (%)
TH_i = teneur en humidité initiale du sol

Le volume d'eau (V_E) qu'il faudrait ajouter à un échantillon de sol prélevé sur le terrain pour obtenir l'hydratation désirée (soit le pourcentage optimal de la CRE de l'échantillon) peut être calculé comme suit :

V_E = (P_E × M)/100 [équation 3]

où :

V_E = volume d'eau à ajouter au sol (mL)
P_E = pourcentage d'eau à ajouter au sol
M = masse totale de sol requise pour l'essai (masse sèche)^{Note de bas de page68}

Le pH des échantillons de sol prélevés sur le terrain ne doit pas être ajusté, sauf si les essais toxicologiques sont réalisés à des fins de recherche pour déterminer l'effet du pH sur la toxicité de l'échantillon, auquel cas on devrait effectuer deux essais en parallèle, l'un dans lequel le pH d'une ou de plusieurs séries de traitements est ajusté à une valeur donnée à l'aide de carbonate de calcium ou d'une solution acide ou basique appropriée, et l'autre dans lequel le pH d'une ou de plusieurs séries de traitements de répétition n'est pas ajusté.

Immédiatement après l'hydratation (ou la déshydratation) et le mélange de l'échantillon, les sous-échantillons du matériau d'essai nécessaires pour l'essai toxicologique et les analyses physicochimiques doivent être prélevés et placés dans des récipients d'essai étiquetés (v. 4.1), puis dans les contenants étiquetés où ils seront entreposés en vue des analyses physicochimiques subséquentes. Toutes portions restantes de l'échantillon homogénéisé qui pourraient être requises pour des essais toxicologiques supplémentaires sur des plantes ou d'autres organismes d'essai (p. ex. selon EC, 2004b, 2006) devraient alors être transférées également dans des contenants étiquetés. Tous les sous-échantillons entreposés devraient être conservés dans des contenants scellés comportant le moins d'air possible et doivent être entreposés dans l'obscurité à une température de 4 ± 2 °C (v. 5.2) jusqu'à ce qu'ils soient utilisés ou analysés. Chaque sous-échantillon doit être de nouveau bien mélangé afin d'en assurer l'homogénéité juste avant les analyses ou l'essai.

5.4 Observations et mesures en cours d'essai

On devrait procéder à une description qualitative de chaque matériau prélevé sur le terrain au moment de la préparation de l'essai, notamment en ce qui a trait à la couleur de l'échantillon, à sa texture, à son homogénéité et à la présence éventuelle de matière végétale ou de macro-invertébrés. On devrait également consigner et signaler tout changement d'aspect du matériau d'essai observé en cours d'essai ou à la fin de ce dernier.

La sous-section 4.6 fournit des conseils et établit les exigences en ce qui a trait aux observations et aux mesures à effectuer au cours ou à la fin de chaque essai. Ces observations et mesures s'appliquent et sont donc obligatoires lorsqu'on effectue l'essai de toxicité décrit ici avec un ou plusieurs échantillons de sol prélevés sur le terrain (sol de site).

Selon le plan d'étude et les objectifs de l'essai, il pourrait s'avérer nécessaire de préparer des récipients d'essai supplémentaires au début de l'essai (v. 4.1) dans le but de surveiller la composition chimique du sol. Ces récipients pourraient faire l'objet d'un échantillonnage destructif au cours et à la fin de l'essai. On pourrait ajouter ou non des organismes d'essai dans ces récipients supplémentaires, selon les objectifs de l'étude. Pour établir la composition chimique du sol contenu dans ces récipients, on peut en prélever des aliquotes aux fins des diverses analyses (v. 5.2).

5.5 Paramètres de l'essai et calculs

L'interprétation des résultats des essais employant un ou plusieurs échantillons de sol d'essai prélevés sur le terrain se résume toujours à une comparaison des effets biologiques observés dans ces échantillons de sol d'essai (sol de site) et de ceux constatés dans un sol de référence. Dans la mesure du possible, on devrait toujours se servir d'un échantillon de référence à des fins de comparaison, car cela permet d'évaluer la toxicité d'un lieu donné (EC, 1997a,b, 2001, 2004b). Cela dit, il arrive parfois que le sol de référence ne convienne pas à cet usage en raison de sa toxicité ou de ses caractéristiques physicochimiques atypiques. Dans de tels cas, on devrait plutôt comparer les sols d'essai avec le sol témoin négatif. Les résultats obtenus avec le sol témoin négatif aideront à distinguer les effets attribuables aux contaminants de ceux que l'on peut attribuer à des propriétés physicochimiques du sol telles que la composition granulométrique, la teneur en carbone organique total (%) et la teneur en matière organique (%). Toutefois, que l'on utilise un sol de référence ou un sol témoin négatif pour effectuer ces comparaisons statistiques, on doit toujours se servir des résultats obtenus avec le sol témoin négatif pour juger de la validité et de l'acceptabilité de l'essai (v. 4.4).

L'analyse des résultats diffère selon l'objet de l'essai et le plan d'étude. La présente sous-section traite des méthodes d'analyse à employer, de la plus simple à la plus complexe. En général, les méthodes statistiques ordinaires suffisent pour analyser les résultats.

Les chercheurs peuvent trouver des conseils au sujet des paramètres statistiques appropriés et de leur calcul dans EC (2005c). Comme toujours, on devrait demander l'avis d'un statisticien versé dans le domaine de la toxicologie pour établir des plans d'étude et analyser les résultats des essais.

Pour interpréter statistiquement les résultats d'essais de toxicité des sols, on emploie couramment l'analyse de la variance (ANOVA), qui fait intervenir des comparaisons multiples des valeurs des paramètres obtenues dans des essais à concentration unique réalisés sur des répétitions de terrain de sol provenant d'un ou de plusieurs lieux d'échantillonnage. Cette approche, fondée sur les tests d'hypothèses, comporte néanmoins d'importantes lacunes. En particulier, toute augmentation de la variabilité dans l'essai tend à amoindrir la capacité de distinguer les effets toxiques (la toxicité est sous-évaluée). De la même façon, le fait d'employer un petit nombre plutôt qu'un grand nombre de répétitions peut aussi diminuer le pouvoir discriminatoire de l'essai, menant à la même conclusion erronée au sujet de la toxicité du sol, toutes autres choses étant égales (v. 5.5.2). Cela dit, l'approche fondée sur les tests d'hypothèses s'impose lorsque l'on compare les données de toxicité d'échantillons multiples de sol prélevés sur le terrain (répétitions de terrain provenant de plus d'un lieu d'échantillonnage) comportant une seule concentration (échantillons habituellement non dilués, ou purs à 100 %). Il existe cependant d'autres solutions pour comparer les estimations ponctuelles de la toxicité dans le cas d'essais à plusieurs concentrations de chaque échantillon de sol prélevé sur le terrain, lorsqu'on détermine des valeurs multiples de la CI_p ou de la CE₅₀ (v. 6.4). Il est recommandé de consulter la section 9 d'EC (2005c) pour obtenir des conseils au sujet de la comparaison de valeurs multiples de la CI_p ou de la CE₅₀.

Les analyses paramétriques au moyen de l'ANOVA pour des données comparatives obtenues dans des essais à concentration unique sur des échantillons multiples de sol prélevés sur le terrain (répétitions de terrain de sol provenant de plus d'un lieu d'échantillonnage) supposent que les données sont normalement distribuées, que les traitements sont indépendants et que la variance est homogène parmi les différents traitements. Il faudrait donc commencer par vérifier ces hypothèses en appliquant le test de Shapiro-Wilk pour la normalité de la distribution des données et le test de Bartlett pour l'homogénéité de la variance (Eisenhart et coll., 1947; Sokal et Rohlf, 1969). Si les données satisfont à ces hypothèses, on peut procéder aux analyses. Dans le cas contraire, on pourrait transformer les données (p. ex. en racines carrées, en logarithmes ou en racines carrées d'arc sinus dans le cas de données quantiques destinées aux analyses statistiques; Mearns et coll., 1986). Il est possible que les données transformées satisfassent alors aux hypothèses de normalité et d'homogénéité; en fait, c'est ce que l'on attend de la transformation des données. Les hypothèses devraient toujours être soumises à un nouveau test après toute transformation de données. Les essais paramétriques sont raisonnablement robustes dans le cas d'écarts modérés en ce qui a trait à la normalité de la distribution et à l'homogénéité de la variance; par conséquent, l'analyse paramétrique (p. ex. ANOVA et comparaisons multiples) devrait être entreprise même s'il existe encore une non-conformité modérée après la transformation des données. L'exclusion d'un ensemble de données en raison d'irrégularités mineures pourrait priver les chercheurs d'une analyse sensible et de résultats satisfaisants et empêcher la détection des effets réels de la toxicité^{Note de bas de page69}. Parallèlement à ces analyses paramétriques, on devrait procéder à des évaluations statistiques non paramétriques, en utilisant la plus sensible des deux analyses (celle pour laquelle la valeur du paramètre est la plus basse) pour obtenir les estimations finales de la toxicité. La section 3 d'EC (2005c) fournit des conseils au sujet de la comparaison des résultats d'essais à concentration unique sur des répétitions de terrain d'échantillons provenant de plusieurs lieux de prélèvement, à l'aide de tests paramétriques et non paramétriques.

On devrait se conformer aux lignes directrices de la section 6 (y compris celles de la sous-section 6.2 en ce qui a trait aux essais préliminaires et celles de la sous-section 4.8 pour le calcul des paramètres de l'essai) si l'on entreprend un essai à concentrations multiples employant un ou plusieurs échantillons de sol prélevés sur le terrain et dilués avec un sol témoin négatif ou un sol de référence non contaminé. Il est recommandé de consulter la section 9 d'EC (2005c) lorsque l'on veut comparer de telles estimations ponctuelles de la toxicité pour plusieurs échantillons de sol prélevés sur le terrain.

5.5.1 Variantes du plan d'étude et des analyses

Une étude très préliminaire peut n'employer qu'un seul échantillon de sol d'essai (sol de site contaminé ou susceptible d'être contaminé) et un échantillon de sol de référence, sans répétition. Il suffit souvent d'examiner les résultats ainsi obtenus pour concevoir des études plus approfondies.

Si l'on a utilisé un seul échantillon d'essai et un seul échantillon de référence, avec un nombre égal de répétitions pour chaque échantillon, un simple test t de Student conviendra tout à fait pour l'analyse (Paine et McPherson, 1991; EC, 1997a,b, 2001). Ce test est passablement robuste et fonctionne avec des nombres inégaux de répétitions et d'échantillons de référence, de même qu'avec des variances modérément hétérogènes dans les deux groupes (Newman, 1995; USEPA, 1995).

On pourrait imaginer une évaluation préliminaire effectuée avec des échantillons provenant d'un grand nombre de stations d'échantillonnage, mais sans répétitions provenant du terrain ou préparées au laboratoire (intra-échantillon). L'objectif pourrait être de repérer un nombre réduit de stations d'échantillonnage qui méritent une étude plus détaillée et approfondie. Dans ce cas, les possibilités d'analyse statistique seraient limitées. Les données d'essai sans répétition pourraient être comparées aux données de référence à l'aide des méthodes de détection des valeurs aberrantes (USEPA, 1994a; Newman, 1995; EC, 1997a,b, 2001, 2005c, 2006). L'échantillon serait jugé toxique si l'on en rejetait les résultats parce qu'ils sont aberrants par rapport à ceux obtenus avec le sol de référence et/ou le sol témoin négatif.

Dans une étude de sol plus traditionnelle, le mode opératoire consisterait à prélever des répétitions en plusieurs endroits, en ayant recours aux mêmes méthodes de prélèvement, et à comparer ces répétitions à des répétitions d'un sol de référence et/ou d'un sol témoin négatif unique. Il existe plusieurs pistes d'analyse, selon le type et la qualité des données, mais on commencera très souvent par une analyse de la variance (ANOVA), suivie de l'un des tests à comparaisons multiples. Dans l'ANOVA, le sol de référence serait également traité comme un échantillon provenant d'un « emplacement ».

Dans ces études mettant en cause des emplacements multiples, le type de répétition aurait des répercussions sur l'interprétation des résultats. Si des répétitions de terrain sont recueillies à chaque emplacement et que l'on ne prépare pas de répétitions au laboratoire, une ANOVA unidimensionnelle permettra d'évaluer l'écart global dans les résultats de l'essai en regard de l'emplacement, en sus de la variabilité combinée du prélèvement des échantillons et de la réalisation de l'essai. Il serait inhabituel -- mais l'analyse serait beaucoup plus probante -- de recueillir des répétitions de terrain pour tous les emplacements et de préparer également des répétitions au laboratoire pour chaque répétition de terrain. Les répétitions de laboratoire pourraient alors s'emboîter pour l'exécution d'une ANOVA unidimensionnelle et servir de base au calcul de la variabilité pour comparer les différences entre échantillons. L'ANOVA pourrait être utilisée pour déterminer s'il existe un écart global : a) entre les résultats de l'essai en fonction du lieu de prélèvement des échantillons et b) entre les répétitions recueillies à chacun des lieux de prélèvement. Après une ANOVA, on procéderait à un ou plusieurs tests à comparaisons multiples, comme il est expliqué ci-après.

Si l'essai portait seulement sur des répétitions de laboratoire (sans répétitions de terrain), il serait impossible de tirer des conclusions au sujet des écarts dus au lieu d'échantillonnage (v. 5.1). Les répétitions de laboratoire n'indiqueraient que les différences éventuelles entre échantillons qui seraient supérieures à la variabilité de base dans les procédures intralaboratoires de préparation et d'exécution de l'essai. La variabilité associée au lieu de prélèvement de l'échantillon ne serait pas vraiment évaluée dans l'analyse statistique, mais elle contribuerait aux différences éventuelles dans les résultats de l'essai observées entre lieux d'échantillonnage.

Si l'on souhaite comparer les résultats obtenus avec les répétitions provenant de chaque lieu d'échantillonnage à ceux obtenus avec le sol de référence afin de vérifier si la toxicité des sols provenant des deux sources (lieux d'échantillonnage) diffère, on devrait se servir du test de Dunnett. Ce test s'appuie sur les hypothèses de normalité et de variance homogène et fait intervenir une valeur expérimentale de a (probabilité de déclarer un écart appréciable là où il n'en existe pas). Si les répétitions sont inégales, il est conseillé aux chercheurs d'utiliser la modification de Dunn­-Sidak du test t ou encore l'ajustement de Bonferroni du test t (p. 189 dans Newman, 1995; annexe D dans USEPA, 1995; paragraphe 7.5.1 dans EC, 2005c).

Dans une étude à lieux d'échantillonnage multiples, le chercheur pourrait vouloir savoir quels échantillons provenant de divers lieux d'échantillonnage ont produit des résultats statistiquement différents des autres, et lesquels ont produit des résultats statistiquement différents de ceux obtenus avec l'échantillon ou les échantillons de référence et/ou de sol témoin négatif. Cela peut être le cas lorsque les échantillons sont prélevés à des distances de plus en plus grandes d'une source ponctuelle de contamination et que le chercheur souhaite savoir lesquels des lieux d'échantillonnage présentent une toxicité passablement plus élevée et nécessitent donc plus particulièrement une décontamination. Le test de Tukey, couramment intégré dans les progiciels statistiques et capable de traiter des échantillons de tailles différentes, convient parfaitement à ce type d'analyse^{Note de bas de page70}.

Si l'on souhaite plutôt comparer la toxicité des échantillons provenant de chaque lieu d'échantillonnage à celle de l'échantillon ou des échantillons de référence, mais que les données ne répondent pas aux exigences de normalité de la distribution et d'homogénéité de la variance, l'ANOVA et les tests subséquents seraient remplacés par des tests non paramétriques. Si les répétitions sont égales, on ferait appel au test de classement multi-univoque de Steel et, si elles ne le sont pas, au test de sommation des rangs de Wilcoxon avec l'ajustement de Bonferroni.

5.5.2 Analyse de puissance

Un facteur important à considérer quand on analyse les résultats d'essais toxicologiques sur des sols est le risque d'obtenir des faux positifs (soit de conclure qu'un site non contaminé est contaminé; erreur de type I) ou des faux négatifs (soit de conclure qu'un site contaminé est non contaminé; erreur de type II). Les chercheurs, habituellement prudents quand ils choisissent le degré de signification statistique (a) pour tolérer les faux positifs (erreurs de type I), le fixent généralement à P = 0,05 ou 0,01. On demande depuis peu aux toxicologues de signaler à la fois la valeur de a et celle de la puissance statistique (1 - b), c'est-à-dire la probabilité de rejeter avec raison l'hypothèse nulle (H₀) et de ne pas commettre une erreur de type II. Plusieurs facteurs peuvent avoir une incidence sur la puissance statistique, dont :

• la variabilité des répétitions représentant le même traitement;
• la probabilité de commettre une erreur de type I (a);
• l'amplitude de l'effet (l'amplitude du véritable effet qui fait l'objet de l'essai);
• le nombre d'échantillons ou de répétitions utilisé dans l'essai (n).

Le lecteur trouvera de plus amples explications et des conseils au sujet des erreurs de type I et II dans le document d'orientation d'Environnement Canada sur les méthodes statistiques applicables aux essais écotoxicologiques (EC, 2005c).

L'analyse de puissance peut être utilisée a priori pour déterminer l'ampleur de l'erreur de type II et la probabilité d'obtenir des faux positifs. On peut également se servir de cette analyse pour confirmer le nombre de répétitions de terrain et de laboratoire requises pour des études subséquentes, ou pour choisir de futurs sites d'échantillonnage. Il est toujours prudent de prévoir dans le plan d'étude le plus grand nombre de répétitions qu'il soit possible d'inclure, des points de vue économique et logistique (v. 5.1), ce que l'analyse de puissance aidera à déterminer. Le document de l'USEPA (1994a) explique clairement ce qu'est la puissance d'un test et comment l'évaluer. On peut également trouver des conseils au sujet de l'analyse de puissance dans EC (2005c).

Les cherheurs sont nombreux à éprouver des difficultés avec l'analyse de puissance et à ne pas l'appliquer en raison de son apparente complexité et du fait que les formules diffèrent selon les tests statistiques. Compte tenu de cette complexité, les chercheurs ont aussi la possibilité de remplacer l'analyse de puissance par la méthode de la différence significative minimale (comme « indice de puissance »; on trouvera des conseils à ce sujet dans EC, 2005c).