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Information sur les aliments nouveaux : le 2’-fucosyllactose (2’-FL) issu de la souche K12 MG1655 (sINB000846) d’Escherichia coli

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Contexte :

Santé Canada a avisé DuPont Nutrition & Biosciences, qu'il n'a aucune objection à l'utilisation du 2'-fucosyllactose (2'-FL) issu de la souche génétiquement modifiée K12 MG1655 (sINB000846) d'Escherichia coli (E. coli), « la souche de production » ou « la souche », comme ingrédient dans les préparations pour nourrissons, les aliments destinés aux jeunes enfants et d'autres aliments et boissons pour tous les groupes d'âge. Les préparations pour nourrissons et les fortifiants pour lait humain contenant du 2'-FL provenant de la souche génétiquement modifiée K12 MG1655 (sINB000846) d'E. coli doivent également faire l'objet d'un examen préalable à la mise en marché en vertu du titre 25. Le Ministère a effectué une évaluation exhaustive de cet oligosaccharide conformément à ses Lignes directrices sur l'évaluation de l'innocuité des aliments nouveaux. Ces lignes directrices sont fondées sur des principes reconnus à l'échelle internationale pour établir l'innocuité des aliments à caractères nouveaux.

Voici un résumé de l'avis de DuPont Nutrition & Biosciences (DuPont) et de l'évaluation de Santé Canada. Ce document ne contient aucun renseignement commercial confidentiel.

1. Introduction

DuPont a mis au point le 2'-fucosyllactose à partir de la souche génétiquement modifiée K12 MG1655 (sINB000846) d'E. Coli à l'aide de méthodes classiques de modification génétique. Le 2'-FL synthétisé par les bactéries se caractérise par une pureté de ≥ 96 % et est destiné à être utilisé dans les préparations conçues pour les nourrissons et les jeunes enfants, jusqu'à une concentration maximale proposée de 1,2 g de 2'-FL par litre de préparation pour nourrissons (compte tenu du surtitrage). Diverses concentrations maximales sont proposées pour d'autres aliments, comme les boissons, les produits laitiers et les produits analogues, les fruits et légumes transformés et les jus, les produits céréaliers destinés à tous les âges et les préparations pour alimentation orale ou entérale par tube.

Le 2'-FL est un oligosaccharide naturellement présent dans le lait humain et composé de L-fucose et de D-lactose (un disaccharide formé de D-galactose et de D-glucose). Il a été confirmé que le 2'-FL synthétisé par les bactéries produit par DuPont est chimiquement équivalent au 2'-FL isolé du lait humain. Cette évaluation ne comprenait pas un examen des allégations potentielles qui pourraient avoir été faites à propos du 2'-FL. Des modifications génétiques ont été apportées à la souche sINB000846 d'E. coli pour la production industrielle d'oligosaccharides par la modification de plusieurs gènes qui, ensemble, entraînent l'absorption de saccharose et de lactose et la conversion subséquente de ces matières en 2'-FL.

L'évaluation de l'innocuité effectuée par les évaluateurs scientifiques de la Direction des aliments a été réalisée conformément aux Lignes directrices sur l'évaluation de l'innocuité des aliments nouveaux de Santé Canada. Ces lignes directrices sont fondées sur les efforts d'harmonisation avec d'autres organismes de réglementation et reflètent l'orientation internationale dans ce domaine (p. ex., le Codex Alimentarius).

L'évaluation de l'innocuité a tenu compte de la façon dont le 2'-FL a été mis au point, de la comparaison entre la composition et la qualité nutritionnelle de cet ingrédient à celles des oligosaccharides du lait humain (OLH) et de la possibilité que le 2'-FL soit toxique ou cause des réactions allergiques.

La Direction des aliments est chargée par la loi de l'évaluation préalable à la mise en marché des nouveaux aliments et des nouveaux ingrédients alimentaires, comme le précise le titre 28 de la Partie B du Règlement sur les aliments et drogues (aliments nouveaux). Comme le 2'-FL dont il est question ici est produit par une bactérie modifiée génétiquement, il est considéré comme un aliment nouveau selon la partie suivante de la définition des aliments nouveaux :

2. Mise au point du microorganisme modifié

La souche de production a été optimisée pour la production industrielle d'oligosaccharides par la modification de plusieurs gènes qui, ensemble, entraînent l'absorption de saccharose et de lactose et la conversion subséquente de ces matières en 2'-FL. Au total, dix-neuf gènes ont été complètement ou partiellement supprimés, et cinq gènes ont été insérés dans le génome. Les délétions génomiques avaient pour but d'optimiser la croissance de la souche, d'améliorer la production des enzymes, de maintenir le plasmide et de tirer le meilleur parti de la voie de production du 2'-FL. Les cinq gènes ont ensuite été insérés dans le génome pour favoriser la croissance de la souche, l'absorption des substrats, à savoir le saccharose et le lactose, ainsi que la conversion du saccharose en composé intermédiaire clé, le GDP-fucose. Un plasmide a également été introduit dans la souche afin qu'elle puisse synthétiser le 2'-FL à partir du GDP-fucose et du lactose. La souche de production n'est pas présente dans le produit final.

3. Caractérisation du microorganisme modifié

La caractérisation moléculaire de la souche a été effectuée au moyen de méthodes biochimiques et moléculaires. Les modifications génétiques apportées à la souche hôte ont été vérifiées par amplification par polymérisation en chaîne (PCR), séquençage Sanger et séquençage du génome entier (WGS). L'absence de marqueurs de plasmides auxiliaires a été confirmée par PCR et par phénotypage biochimique. La stabilité génétique a été démontrée à l'aide de méthodes moléculaires sur 60 générations de croissance pour montrer qu'aucune nouvelle mutation n'a été générée. Selon le séquençage du génome entier, plusieurs mutations relevées ont été attribuées à une variation naturelle spontanée. Dans la majorité des cas, il s'agissait de mutations ponctuelles qui se sont produites dans des régions intergéniques (à l'extérieur des régions de codage des protéines) ou qui étaient silencieuses, de sorte qu'il n'y aurait pas de modification des acides aminés dans les protéines exprimées. Aucun remaniement chromosomique n'a été observé dans la souche. Aucune répercussion sur la sécurité n'a été soulevée en ce qui concerne les polymorphismes de nucléotides uniques identifiés, et la souche semble être stable.

L'absence d'ADN recombinant dans le produit final a également été vérifiée au moyen de la PCR quantitative (qPCR) en trois lots. Les gènes insérés dans la souche n'expriment pas les protéines excrétées. Il n'y a aucune raison de s'inquiéter de l'efficacité du processus de purification visant à retirer la souche hôte, les endotoxines, l'ADN ou la protéine du produit final 2'-FL.

Les gènes insérés dans le génome et le plasmide ont tous été synthétisés chimiquement et clonés dans la souche de production à l'aide de méthodes standard de biologie moléculaire. Cela visait à empêcher que du matériel génétique autre que les gènes d'intérêt soit introduit dans l'organisme de production. L'utilisation de ces gènes pour le métabolisme et le transport des glucides ainsi que pour le maintien des souches ne posent aucun problème d'innocuité.

4. Information sur le produit

Le produit 2′-FL de DuPont est fabriqué dans une installation exploitée conformément aux bonnes pratiques de fabrication (BPF) ou aux certifications de l'Initiative mondiale de salubrité des aliments (Global Food Safety Initiative) et répond aux exigences de la Loi sur la salubrité des aliments au Canada. Le processus de production de 2'-FL de DuPont est divisé en deux grandes étapes : la fermentation et l'après-fermentation. L'après-fermentation comprend des étapes de purification brute pour éliminer la biomasse cellulaire, les endotoxines et les grosses molécules par microfiltration et ultrafiltration, suivies d'une concentration sélective et d'une cristallisation pour obtenir un produit pur. La taille des pores de la membrane de filtration pour la microfiltration varie entre 3 000 et 10 000 daltons de coupure moléculaire pour assurer une destruction adéquate des endotoxines pendant la réduction de la masse cellulaire. On a utilisé une membrane de nanofiltration au seuil de coupure moléculaire suffisamment élevé pour assurer un bon rendement du procédé et l'élimination simultanée de petites molécules comme les sels, le lactose et les sucres monomères.

5. Exposition alimentaire

Le lait humain est composé de lactose, de matières grasses et d'oligosaccharides du lait humain (OLH). Parmi ces composants, les OLH sont le troisième composant solide le plus abondant et sont présents dans le lait maternel à des concentrations de 5 à 25 g/l (Chen, 2005; Thurl et coll.; 2010; Gabrielli et coll., 2011). La plupart des nourrissons allaités sont naturellement exposés au 2'-FL. En fait, sur les 20 OLH connus dans le lait maternel humain, l'un des plus abondants est le 2'-FL (de 0,06 à 4,65 g/l), dont l'absorption estimée par la consommation de lait humain varie entre 170 à 660 mg/kg et 1 150 mg/kg de poids corporel (p.c.) par jour (Erney et coll., 2000; EFSA, 2015).

Comparativement au lait humain, la concentration d'oligosaccharides dans le lait d'autres animaux est d'environ 100 à 1 000 fois inférieure (Vandenplas et coll., 2018). Fait important, étant donné que le lait de vache est souvent utilisé dans les préparations pour nourrissons, le 2'-FL n'est habituellement présent dans les préparations pour nourrissons qu'en faibles concentrations ou, dans certains cas, pas du tout. Cette faible concentration dans les compositions actuelles de préparations pour nourrissons a motivé la mise au point d'une méthode efficace de production de 2'-FL synthétique à grande échelle.

L'exposition alimentaire des nourrissons qui consomment du 2'-FL dans les préparations pour nourrissons serait inférieure ou équivalente à l'exposition actuelle des nourrissons allaités, puisque le taux d'addition de 2'-FL proposé dans les préparations est inférieur à la concentration de 2'-FL dans le lait maternel. Le lait maternel contient en moyenne 2,38 g/l de 2'-FL (Erney et coll., 2000), ce qui est environ deux fois plus élevé que la concentration maximale proposée par le demandeur, qui est de 1,2 g/l de 2'-FL (compte tenu du surtitrage).

6. Nutrition

Le 2'-FL agit de la même façon que d'autres oligosaccharides fermentables qui sont métabolisés en acides gras à chaîne courte ou qui sont excrétés dans les matières fécales. On ne s'attend pas à ce qu'il ait un effet négatif sur l'absorption des nutriments.

De légers symptômes gastro-intestinaux, comme des ballonnements et des flatulences, peuvent se manifester dans les cas de consommation excessive, ce qui correspond aux effets de tout glucide qui n'est pas entièrement absorbé par l'organisme. On s'attend à ce que ces symptômes gastro-intestinaux se résorbent après une diminution de la consommation et à ce qu'ils s'autorégulent du fait que les les fabricants et les consommateurs cherchent à éviter la préparation et la consommation de produits susceptibles d'entraîner de tels symptômes. En 2016, Elison et coll. ont signalé que les effets indésirables les plus courants étaient les flatulences, les douleurs à l'estomac, la diarrhée et les gargouillements, qui n'ont été observés qu'à la dose la plus élevée étudiée, soit 20 g/jour.

L'utilisation par DuPont du 2'-FL à une concentration maximale de 1,2 g par litre de préparation pour nourrissons à terme (compte tenu du surtitrage) et à diverses concentrations maximales dans d'autres aliments, notamment destinés aux jeunes enfants, ne pose aucun problème d'innocuité nutritionnelle. Toute nouvelle préparation pour nourrissons qui contient du 2'-FL devra faire l'objet d'une évaluation préalable à la mise en marché, conformément au titre 25 du Règlement sur les aliments et drogues.

7. Microbiologie

La souche hôte K12 d'E. coli est une souche non thérapeutique bien caractérisée qui a été largement utilisée dans l'industrie biopharmaceutique comme hôte pour l'expression des protéines recombinantes. Comme au moins trois caractéristiques de la paroi cellulaire de la souche K12 d'E. coli déficientes empêchent la colonisation du tractus gastro-intestinal humain dans des conditions normales, cette souche n'est pas considérée comme pathogène (Tourret et coll., 2011; FDA, 1990; Curtiss, 1978). Les National Institutes of Health considèrent la souche K12 comme un organisme qui ne présente pas de risque important pour la santé ou l'environnement (section III-F, Guidelines for Research Involving Recombinant or Synthetic Nucleic Acid Molecules, National Institutes of Health).

La souche de production sINB000846 ne contient aucun marqueur de résistance aux antibiotiques et a la même sensibilité aux antibiotiques que l'hôte de type sauvage, la souche K12 MG1655 d'E. coli. Le retrait du plasmide auxiliaire, qui contenait un marqueur de résistance aux antibiotiques, a été validé par PCR et au moyen d'une méthode de réplique sur une plaque contenant l'antibiotique pour lequel le marqueur du plasmide auxiliaire est présent. L'organisme hôte et la souche de production possèdent les mêmes gènes de résistance aux antimicrobiens, et ceux-ci ne posent pas de problème de sécurité puisque le produit final ne contient aucun résidu de la souche, de la protéine ou de l'ADN.

Le demandeur a fourni les spécifications du 2'-FL de qualité alimentaire ainsi que les résultats d'analyses de trois lots non consécutifs qui montrent que tous les lots sont conformes aux spécifications. Selon les spécifications relatives à la teneur microbienne précisées, les résultats des trois lots analysés ont montré des concentrations acceptables. Les paramètres microbiens analysés comprenaient le dénombrement sur plaque standard, les contaminants aérobies, la quantité totale de levures et de moisissures ainsi que les spores Enterobacteriaceae, Salmonella, Listeria monocytogenes, Cronobacter Sakazaki, Coagulase pos. staphylocoques, C. perfringens, B. cereus, Enterococci et Clostridia. Des essais analytiques menés sur cinq lots de fabrication ont confirmé que le produit final 2'-FL ne contient pas l'organisme de production, l'ADN résiduel ou les protéines recombinantes. Les analyses ont été effectuées selon des méthodes normalisées et respectaient les spécifications. Il n'y a aucune préoccupation concernant les spécifications ou la sécurité microbienne du 2'-FL.

8. Données chimiques

Le demandeur a fourni les spécifications de son produit, soit le 2'-FL, y compris des limites de concentration pour les éléments traces, qu'il a établies en l'absence de spécifications pour cette substance dans le Codex des produits chimiques alimentaires ou dans le Répertoire des normes pour les additifs alimentaires préparé par le Comité mixte FAO/OMS d'experts sur les additifs alimentaires (CMEAA).

Les normes du demandeur pour l'arsenic, le cadmium et le mercure sont acceptables et peuvent être systématiquement respectées selon les résultats d'analyse du 2′-FL fournis par DuPont. Les concentrations estimées de ces oligoéléments dans les aliments proposés seraient bien inférieures aux concentrations de base habituellement observées dans des aliments semblables sur le marché canadien. De plus, l'exposition potentielle à ces éléments traces provenant de la consommation de 2'-FL dans les aliments proposés aux concentrations maximales demandés contribuait à des quantités négligeables d'arsenic et entraînait une exposition alimentaire globale et une exposition au mercure et au cadmium d'ordres de grandeur inférieurs à leurs concentrations toxicologiques de référence respectives. Dans l'ensemble, l'exposition potentielle à l'arsenic, au cadmium, au plomb et au mercure découlant de l'utilisation proposée du 2′-FL ne devrait pas poser de problèmes de sécurité chimique.

Une liste détaillée de toutes les substances (identité chimique et numéro de registre du Chemical Abstracts Service [CAS]) utilisées pendant la fabrication du 2'-FL a été incluse dans la demande. L'acceptabilité d'utilisations particulières de substances à des fins technologiques dans la fabrication du 2'-FL est distincte de l'acceptabilité de l'aliment lui-même. De façon plus générale, il incombe au demandeur de s'assurer que la présence de contaminants dans le produit et l'utilisation de toute substance dans la fabrication du 2'-FL ne contreviennent pas à l'article 4 de la Loi sur les aliments et drogues. À cet égard, le demandeur a fait remarquer que toutes les matières utilisées dans la production du 2'-FL sont de qualité alimentaire.

Des analyses ont également confirmé l'absence de bactéries et d'endotoxines bactériennes. Selon la spécification pour les endotoxines (< 300 EU/g) et la méthode d'analyse validée utilisée, les trois lots de 2'-FL de DuPont ont été jugés acceptables (< 300 EU/g). Il n'y a pas de problème de sécurité concernant les endotoxines dans le produit final 2'-FL.

Le demandeur a fourni des données analytiques qui ont démontré que le 2'-FL produit par fermentation de la souche sINB000846 est chimiquement et structurellement équivalent au 2'-FL isolé du lait humain. Le niveau d'utilisation proposé du 2'-FL issu de la souche dans les préparations pour nourrissons et d'autres aliments, notamment pour les jeunes enfants, ne pose aucun problème de sécurité chimique.

9. Toxicologie

DuPont a l'intention d'utiliser ce 2'-FL dans une variété d'aliments et de boissons pour tous les groupes d'âge, en plus de l'utiliser dans les préparations pour nourrissons et tout-petits jusqu'à une concentration maximale de 1,2 g/l. Le demandeur a utilisé la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN de 1H) et un étalon de référence pour confirmer la dénomination du 2'-FL de DuPont (≥ 96 % de pureté), produit à partir de la souche sINB000846 d'E. coli. Étant donné que l'étalon de référence a été isolé du lait maternel, cette même analyse a également confirmé que le 2'-FL de DuPont est chimiquement équivalent au 2'-FL du lait maternel humain.

Le demandeur a cité des études publiées à l'appui de la sécurité et de la tolérabilité du 2'-FL, qui ont été examinées précédemment pour les utilisations autorisées du 2'-FL. Le demandeur a également fourni des études toxicologiques non publiées qui ont analysé le 2'-FL de DuPont. Une étude de toxicité aiguë par voie orale chez le rat a déterminé que la DL50 était > 5 000 mg/kg. Une étude de toxicité subchronique de 90 jours par voie orale (alimentaire) chez le rat a révélé que la dose sans effet nocif observé (DSENO) était de 5,737 g/kg p.c. par jour (une dose équivalente provenant de la concentration alimentaire la plus élevée de 10 %). Les deux épreuves de génotoxicité in vitro (épreuve de mutation inverse bactérienne [Ames] et épreuve sur les micronoyaux de cellules de mammifères) ont été négatives pour les pouvoirs mutagène et clastogène. Toutes les études étaient conformes aux lignes directrices respectives de l'OCDE. Aucune étude ou épreuve n'a fait état d'effets nocifs. Les résultats confirment la sécurité du 2'-FL de DuPont.

Le demandeur a cité une étude clinique (Elison et coll., 2016) à l'appui de la tolérabilité du 2'-FL chez les adultes en bonne santé (n = 10 par groupe; hommes et femmes, âgés de 19 à 57 ans). Le protocole consistait en une prise quotidienne de 5, de 10 ou de 20 g de 2'-FL (produit chimiquement par Glycom A/S; pureté de 99,9 %) ou de 2 g de glucose sous forme de placebo au petit-déjeuner pendant deux semaines. Seule la dose la plus élevée (20 g par jour) était associée à des effets indésirables qui étaient considérés comme légers (nausées, gargouillements, ballonnements, flatuosités, diarrhée, selles molles et besoin urgent d'aller à la selle). Tous les participants ont terminé l'étude, et aucun effet nocif n'a été observé pour ce qui est de la chimie clinique, des paramètres hématologiques et des effets cliniques (p. ex., fréquence cardiaque, tension artérielle).

Le demandeur a estimé l'exposition alimentaire maximale de 2'-FL chez les adultes à 5,9 g/jour (90e percentile; utilisateurs adultes, 50 ans et plus). À ce niveau, aucun effet nocif n'a été observé dans l'étude clinique. L'Autorité européenne de sécurité des aliments (2015) a évalué le 2'-FL produit de façon synthétique pour un élargissement similaire de l'utilisation alimentaire aux adultes, et n'a exprimé aucune préoccupation quant à une exposition alimentaire maximale estimée semblable pour les adultes (5 g par jour). Pour la nouvelle utilisation élargie aux groupes plus âgés, l'exposition estimée la plus élevée est de 0,14 g/kg p.c. par jour pour les enfants de 3 à 12 ans. La DSENO de 5,737 g/kg par jour, tirée de l'étude de 90 jours sur la toxicité par voie orale chez les rats, est plus de 40 fois supérieure à l'apport alimentaire estimé le plus élevé. Cette marge d'exposition a été jugée suffisante, compte tenu de l'absence de toxicité du 2'-FL et des antécédents d'utilisation sûre dans l'alimentation à partir de la consommation de lait maternel.

Le demandeur a effectué des analyses bioinformatiques sur tous les sites de modification et les régions adjacentes. Les séquences de peptides putatifs de régions modifiées du génome de l'organisme de production ont été comparées à des toxines connues à l'aide de la base de données UniProtKB/Swiss-Prot. Aucune correspondance pertinente n'a été trouvée. De plus, la concentration maximale de protéines détectée dans le produit final au moyen de la méthode modifiée de Bradford était de 3,64 µg/g (l'équivalent de 0,000364 %), ce qui est négligeable. Aucun problème toxicologique n'a été relevé concernant le 2'-FL issu de la souche INB000846 qui sera utilisé dans les préparations pour nourrissons et d'autres aliments, notamment destinés aux jeunes enfants.

10. Allergénicité

Le demandeur a démontré que le produit final est hautement purifié pour le 2'-FL (≥ 96 %) et que la présence de protéines est négligeable. De plus, le demandeur a effectué des analyses bioinformatiques sur tous les sites de modification et les régions adjacentes. Les séquences de peptides putatifs des régions modifiées du génome de l'organisme de production ont été comparées aux allergènes connus à l'aide de la base de données du Food Allergy Research and Resource Program (FARRP) (version 18B publiée le 23 mars 2018; http://www.allergenonline.org). Deux recherches ont été effectuées : une recherche à l'aide d'une fenêtre coulissante de 80 segments d'acides aminés de chaque protéine pour trouver des identités supérieures à 35 % (selon les lignes directrices du Codex Alimentarius, 2003), et une autre fondée sur huit appariements exacts d'acides aminés. Aucune correspondance pertinente n'a été trouvée.

Les évaluateurs ont effectué une recherche dans la littérature à jour et n'ont trouvé aucun rapport d'allergénicité associé au 2'-FL. Dans l'ensemble, l'utilisation proposée du 2'-FL issu de la souche INB000846 d'E. Coli dans les préparations pour nourrissons, les aliments destinés aux jeunes enfants et d'autres aliments n'a soulevé aucune préoccupation liée à l'allergénicité.

Conclusion :

L'examen par Santé Canada des renseignements présentés à l'appui de l'utilisation du 2'-FL issu de la souche de production dans les préparations pour nourrissons, les aliments destinés aux jeunes enfants et d'autres aliments ne soulève pas de préoccupations liées à l'innocuité des aliments.

L'avis de Santé Canada ne fait référence qu'à l'utilisation du 2'-FL comme ingrédient dans les préparations pour nourrissons, les aliments destinés aux jeunes enfants et les autres aliments énumérés dans la demande. Les préparations pour nourrissons et les fortifiants pour lait humain contenant du 2'-FL dérivé d'une souche génétiquement modifiée K12 MG1655 (sINB000846) d'E. coli doivent également faire l'objet d'un examen préalable à la mise en marché en vertu du titre 25.

Le présent document d'information sur les aliments nouveaux a été préparé pour résumer l'avis concernant le produit en question fourni par la Direction des aliments, Direction générale des produits de santé et des aliments de Santé Canada. Cette opinion est fondée sur l'examen exhaustif des renseignements soumis par le demandeur conformément aux Lignes directrices sur l'évaluation de l'innocuité des aliments nouveaux.

(Also available in English)

Pour de plus amples renseignements, veuillez communiquer avec :

Section des aliments nouveaux
Direction des aliments
Direction générale des produits de santé et des aliments
Santé Canada, PL2204A1
251, promenade Frederick Banting
Ottawa (Ontario) K1A 0K9
bmh-bdm@hc-sc.gc.ca

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