Renseignements sur les aliments nouveaux - Le riz HPHI2 (Provisia(R)) - tolérant les herbicides

Santé Canada a avisé BASF qu’il ne s’oppose pas à l’utilisation alimentaire de riz exprimant l’acétyl-CoA carboxylase endogène ACCase qui présente une mutation d’acide aminé unique conférant la tolérance aux herbicides des classes aryloxy phénoxypropionate (FOP) et cyclohexadione (DIM)  utilisés pour contrôler les graminées adventices. Le Ministère a réalisé une évaluation approfondie de cette lignée de riz conformément à ses Lignes directrices sur l’évaluation de l’innocuité des aliments nouveaux. Ces lignes directrices sont fondées sur les principes admis internationalement de l’établissement de l’innocuité d’aliments comportant des caractères nouveaux.

Le texte qui suit résume l’avis remis par BASF ainsi que l’évaluation qu’en a faite Santé Canada. Il ne contient aucun renseignement commercial confidentiel.

1.  Introduction

L’ACCase est une enzyme multifonctionnelle très répandue chez les végétaux. Le riz de type sauvage contient deux gènes pour l’ACCase, dont l’un est actif dans le cytosol (OsACC1), lequel résiste aux classes d’herbicides FOP et DIM de manière intrinsèque. Quant à l’autre, il est actif dans le plastide, un compartiment sous-cellulaire des cellules végétales (OsACC2), lequel est sensible à ces herbicides. Le riz HPHI2 exprime une variante du gène OsACC2 présentant un seul changement d’acide aminé, I1781(Am)L (la numérotation est fondée sur la protéine plastidique ACC2ase issue d’Alopecurus myosuroides, une plante herbacée, dont l’abréviation dans la demande en question ici est Am), dans la poche de liaison au substrat dans le domaine carboxy-terminal. Cette mutation confère la résistance aux herbicides des classes DIM et FOP. Le mode d’action de ces herbicides consiste à empêcher la biosynthèse des acides gras, ce qui porte atteinte à la membrane des cellules en développement et entraîne leur mort. L’enzyme ACCase est régulée par rétroinhibition par un produit final de la biosynthèse des acides gras, la palmitoyl-CoA.

Cette évaluation de l’innocuité, dont les scientifiques de la Direction des aliments se sont chargés, a été réalisée conformément aux Lignes directrices relatives à l’évaluation de l’innocuité des aliments nouveaux de Santé Canada. Ces dernières sont fondées sur les démarches visant l’harmonisation avec les directives établies par d’autres autorités réglementaires et reflètent les documents d’orientation internationaux (p. ex., du Codex Alimentarius). L’évaluation a pris en compte les éléments suivants : la façon dont le riz HPHI2 (appellation commerciale : Provisia®) a été mis au point, la comparaison de sa composition et de sa qualité nutritionnelle par rapport à celles des variétés de riz non modifiées, et sa toxicité ou son allergénicité éventuelles. BASF a produit des données démontrant que le riz HPHI2 est tout aussi sûr que celui issu des variétés traditionnelles de riz utilisées dans les aliments au Canada, et que sa qualité nutritionnelle est la même.

La responsabilité des évaluations préalables à la mise en marché des aliments et des ingrédients alimentaires nouveaux imposée par la loi incombe à la Direction des aliments comme établi au titre 28 du Règlement sur les aliments et drogues (Aliments nouveaux). Les aliments dérivés du riz HPHI2 sont considérés comme des aliments nouveaux selon la partie suivante de leur définition :

« c) aliment dérivé d’un végétal, d’un animal ou d’un micro-organisme qui, ayant été modifié génétiquement, selon le cas :

(i) présente des caractères qui n’avaient pas été observés auparavant,  

2. Mise au point de la plante modifiée

Le requérant a fourni des renseignements qui décrivent les méthodes utilisées pour mettre au point le riz HPHI2. Les graines parvenues à maturité de la lignée Indica-1 ont été disséquées, puis mises en culture dans le but de produire des grappes de tissu somatique appelées cals. Les cals ont été propagés en culture, puis soumis à quatre cycles d’exposition à des concentrations croissantes d’herbicide cycloxydime au cours de plusieurs semaines. Les tissus qui ont crû dans la présence de l’herbicide ont été induits à se déverlopper en plantules. Celles-ci ont fait l’objet d’une amplification par la polymérase (PCR) afin de détecter la présence de toute mutation spontanée dans le gène OsACC2. Les plantules présentant la mutation d’intérêt ont été régénérées en plantes (désignées génération M0). Ces dernières ont été traitées avec l’herbicide cycloxidime en diverses concentrations, exposées à une journée de sécheresse, puis à un arrosage normal et enfin, la fertilisation du substrat a été reprise. La sensibilité des plantes à l’herbicide a été observée pendant deux semaines. Celles qui ont subies aucune atteinte ou seules de faibles atteintes ont été conservées et désignées à titre de génération M1. Par la suite, leurs caractéristiques de développement et leur tolérance à l’herbicide sur le terrain ont été mises à l’épreuve. La lignée HPHI2 a été sélectionnée, puis sa caractérisation ainsi que celle des générations suivantes a été raffinée en laboratoire et au cours d’études sur le terrain. Les plantes de la génération M4 ont été utilisées pour toutes les études sur l’innocuité du produit.

3. Caractérisation de la plante modifiée

La caractérisation moléculaire du riz HPHI2 a été réalisée par le séquençage du gène OsACC2 dans la lignée en question et dans le riz traditionnel Indica-1. Les plantes des deux variétés ont été cultivées en serre sans application d’herbicide. L’ADN génomique isolé du tissu de la feuille a tenu lieu de gabarit pour l’amplification par la polymérase. Sept réactions en chaîne de la polymérase chevauchantes ont été utilisées afin d’amplifier la région codante entière du gène, y compris les régions non codantes constituées de 300 paires de bases flanquant le gène OsACC2. La transformation d’un seul nucléotide a été observée entre les séquences de contigs alignés. Cette modification découlerait d’un changement de la protéine exprimée en position 1781 d’isoleucine en leucine pour produire une protéine mutante appelée OsACC2-I1781(Am)L. En conclusion, un seul changement sur le plan d’un nucléotide dans le gène OsACC2 distingue la lignée de riz HPHI2 de son homologue traditionnel, Indica-1.

Une série d’étapes de rétrocroisement et d’autopollinisation a été appliquée en utilisant desont eu lieu en recourant aux méthodes traditionnelles de sélection dans le but d’évaluer la stabilité de la mutation I1781(Am)L. Le génotype ainsi que le phénotype des plantes des descendants de chaque étape ont été déterminés au moyen, respectivement, d’une détection du polymorphisme d’un nucléotide simple et de l’évaluation du caractère de tolérance de l’herbicide. Ensemble, les données recueillies pour caractériser le génotype et le phénotype de ces centaines de plantes produites à travers plusieurs générations se sont révélées conformes au modèle d’un seul locus génétique, OsACC2-I1781(Am)L, selon les principes mendéliens. La transmission de ce caractère, produit au moyen de la transformation d’un nucléotide, s’est révélée stable tout au long du programme de sélection.

4. Information sur le produit

Une protéine de référence était nécessaire à titre d’antigène pour la production d’un anticorps primaire et comme étalon, tant pour l’analyse quantitative par transfert de Western que pour les études de digestion et de stabilité. Isoler des quantités suffisantes de la protéine OsACC2-I1781(Am)L issue du riz Provisia® est difficile sur le plan technique. Par conséquent, une protéine de référence ACCase dérivée du riz natif a été exprimée, puis purifiée dans le maïs transgénique. Le maïs transgénique a été produit au moyen d’Agrobacterium en recourant à un vecteur contenant une cassette de surexpression de la protéine double mutante du riz OsACC2. Cette version a été utilisée, car elle était aisément disponible et facile à purifier par la présence d’un marqueur de purification attaché au carboxy terminal (His-6). La protéine OsACC2-His comportait deux mutations : I à L en position 1781 et I à N en position 2041 (numérotation fondée sur A. myosuroides). Cette dernière mutation, comme I1781, est située dans la cavité du site actif du domaine carboxy-terminal de la protéine OsACC2. La seconde mutation a été introduite afin d’améliorer la tolérance des herbicides inhibiteurs de l’ACCase. Les premiers essais sur les plantes portant cette mutation ont révélé que leur fonction ne s’est pas trouvée atteinte.

Des études ont été réalisées pour déterminer si la protéine OsACC2 exprimée dans le riz natif (Indica-1; témoin) et la His-OsACC2-I1781(Am)L/I2041(Am)N double mutante exprimée dans le maïs purifié (de référence) étaient équivalents à la protéine OsACC2-I1781(Am)L dans le riz HPHI2 (expérimental) et pourraient, par conséquent être utilisés comme étalons valables pour mesurer le degré de l’expression de la protéine dans le tissu du riz et pour en évaluer la stabilité. Les extraits de tissus de riz produits des lignées HPHI2 et Indica-1 ont été enrichis en OsACC2 par purification partiel. Par la suite, ces extraits ont subi la caractérization par l’électrophorèse en gel et la spectrométrie de masse en tandem, le dernier atteignant une bonne couverture (87 % pour Indica-1, 88 % pour HPHI2, et 90 % pour l’ACCase double mutant). Des études de suivi des fragments de peptide au moyen de l’analyse par spectrométrie de masse ont démontré que toutes les régions pertinentes pour la détection d’anticorps ont été caractérisées, et qu’aucune des lacunes n’a suscité de préoccupations. L’ensemble des séquences et poids moléculaires des trois protéines étaient identiques à l’exception des différences attendues aux résidus 1781(Am) et 2041 (Am).

La réactivité de l’anticorps anti-OsACC2 s’est révélée similaire qu’il s’agisse du riz expérimental (HPHI2) ou du riz témoin (Indica-1) ou bien des matériaux de référence (OsACC2 double mutante exprimée par le maïs). Globalement, la caractérisation de la protéine soutient l’allégation que la protéine de référence exprimée dans le maïs peut être utilisée pour mesurer le degré d’expression de la protéine dans le tissu du riz et en évaluer la stabilité.

L’ACCase du type sauvage est sujette à une rétroinhibition alors qu’un produit métabolique, la palmitoyl-CoA, réduit l’activité enzymatique de façon proportionnelle à la concentration. Des études biochimiques ont été réalisées dans le but d’évaluer si la mutation I1781(Am)L nuit à cette fonction régulatrice et de déterminer si l’ajout d’herbicide influe sur l’activité enzymatique dans la biosynthèse des acides gras. Des essais ont été réalisés en recourant aux préparations d’extrait de protéine des tissus de méristème aériens des plantes de type sauvage (Indica-1, Wells) et des plantes mutantes (HPHI2) cultivées en serre. La caractérisation fonctionnelle des formes de type sauvage et mutante d’OsACC2 a démontré que l’unique substitution d’acide aminé de l’OsACC2-I1781(Am)L exprimée dans le riz HPHI2 a produit la résistance attendue aux herbicides FOP, mais sans modifier la sensibilité à la rétroinhibitioin par la palmitoyl-CoA, le métabolite endogène.

Le degré d’expression et de distribution d’ACCase a été mesuré dans divers tissus des plantes de riz, et ce, à diverses étapes de croissance afin de déterminer si la substitution de I1781(Am)L a influé sur l’expression. Tant les plantes traitées à l’herbicide que celles non traitées ont été évaluées. L’ACCase attaché au marqueur His a servi de matériel de référence pour la mesure des teneurs en OsACC2 au moyen d’une analyse quantitative par transfert de Southern. Également, la présence de la substitution I1781(Am)L n’a pas modifié le degré d’expression ni de distribution dans les tissus de l’ACCase pendant la croissance du plant de riz. De la même manière, l’application de l’herbicide Targa® n’a pas d’incidence sur l’expression de l’ACCase.

Les données présentées pour caractériser l’expression de la protéine ne soulèvent aucune préoccupation à l’égard de l’utilisation du riz HPHI2 à des fins alimentaires.

5. Exposition alimentaire

Le riz HPHI2 est le résultat d’une modification génétique visant à conférer la tolérance des herbicides des classes FOP et DIM, sans poursuivre l’intention de modifier dans une importante mesure les paramètres nutritionnels de l’aliment. On s’attend à ce que le riz HPHI2 sera utilisé dans des applications semblables à celles pour lesquelles les variétés traditionnelles de riz sont utilisées. Avec le lancement de la lignée du riz HPHI2, le requérant ne prévoit pas de modification importante à la façon dont le riz sera utilisé dans l’alimentation.

6. Nutrition

Les échantillons de riz obtenus en vue de l’analyse de leur composition nutritionnelle provenaient de plants du riz expérimental (HPHI2) et du riz témoin (Indica-1) cultivés en 2013 dans cinq endroits des États-Unis selon un plan en blocs aléatoires complets sur quatre parcelles par variété. Tous les essais sur le terrain du riz HPHI2 se sont révélées acceptables. Toutes les analyses auxquelles ont été soumises les variétés expérimentale, témoin et de référence ont été effectuées en recourant à des méthodes d’analyse approuvées et à des méthodes statistiques appropriées.

Les variétés expérimentale, témoin et de référence ont été analysées pour mesurer dans leur grain les nutriments et les facteurs antinutritionnels suivants : macromolécules : protéines, lipides bruts, cendre, humidité, glucides calculés, fibres au détergent neutre, fibres au détergent acide, fibres alimentaires totales; acides aminés : essentiels et non essentiels; acides gras : palmitique, stéarique, oléique, linoléique, linolénique, arachidique, eicosénoïque, lignocérique; minéraux : calcium, cuivre, fer, magnésium, manganèse, phosphore, potassium, sodium, zinc; vitamines : folate, niacine, acide pantothénique, pyridoxine, riboflavine, thiamine, alpha-tocophérol, biotine; facteurs antinutritionnels : acide phytique, lectines, inhibiteurs de la trypsine.

À l’échelle des cinq sites de culture, des différences statistiques ont été observées entre le riz HPHI2 traité au moyen du Targa® par rapport au témoin traité avec de l’herbicide pour 11 analytes. Seule la teneur à la baisse en folate s’est révélée significative sur le plan statistique, et ce, à deux sites différents. Les données n’ont révélé aucune autre tendance. En combinant tous les sites, une différence statistique a été observée dans un analyte, le cuivre (1,08 mg/100 g dans le riz HPHI2 traité au Targa par rapport à 1,19 mg/100 g dans le témoin, Indica-1). Cependant, ces teneurs en cuivre se sont révélées toutes deux plus faibles que dans les variétés de référence Japonica et semblables aux teneurs publiées dans le document de consensus de l’OCDE.

Selon les données présentées au sujet de la composition nutritionnelle, le riz HPHI2 est semblable au riz traditionnel commercial. Aucune préoccupation n’a été exprimée au sujet de l’innocuité ni de la qualité nutritionnelle du riz HPHI2.

7. Chimie et toxicologie

Pour démontrer l’innocuité de la lignée de riz HPHI2, une démarche en plusieurs étapes a été adoptée. Ces étapes comprenaient la documentation de l’historique d’utilisation de la protéine dans les végétaux génétiquement modifiés; la caractérisation des propriétés physicochimiques et fonctionnelles de la protéine; la quantification de son degré d’expression dans les tissus végétaux; la comparaison entre la séquence codante de la protéine inserée dans la génome et des toxines et des allergènes connus; l’évaluation de la digestibilité dans le liquide gastrique simulé (LGS) et le liquide intestinal simulé (LIS); et l’évaluation de la stabilité de la protéine soumise à un traitement thermique typique à la fabrication d’ingrédients et de produits alimentaires et l’évaluation de l’allergénicité potentielle des protéines exprimées.

L’organisme source, Oryza sativa L., a une longue historique de consommation de longue date en toute innocuité comme denrée alimentaire de base. Par conséquent, le recours à Oryza sativa L. de type sauvage (Indica-1) comme lignée parentale ne devrait pas susciter de préoccupations, que ce soit sur le plan pathogène ou toxique.

Le mode d’action non toxique de l’enzyme ACCase est bien caractérisé. Elle est omniprésente dans les végétaux et consommée de longue date en toute innocuité dans les cultures, y compris dans le riz.

L’analyse bio-informatique a démontré que la protéine OsACC2-I1781(Am)L ne partage aucune séquence d’acide aminé avec des toxines connues, ce qui indique que cette protéine nouvellement exprimée ne devrait pas susciter de préoccupations sur le plan toxique.

Le maïs tolérant versl’herbicide séthoxydime contient l’ACCase portant la même substitution d’acide aminé que celle observée dans l’enzyme ACCase présente dans le riz HPHI2. L’utilisation alimentaire de ce maïs a été autorisée par Santé Canada en 1997, et il est commercialisé depuis de nombreuses années sans que des effets indésirables sur la santé lui aient été attribués.

La teneur en protéine ACCase exprimée dans le grain de riz HPHI2 est relativement faible (0,004 mg/g de graines sèches) et est la même que celle observée dans la variété parentale et les variétés traditionnelles de riz. Cela indique que l’exposition alimentaire relativement faible à cette protéine du riz HPHI2 est semblable à celle découlant de la consommation des variétés témoins de riz.

Dans les liquides gastrique et intestinal simulés, la protéine OsACC2-I1781(Am)L s’est trouvée rapidement dégradée. Par conséquent, même si elle survivait aux conditions de transformation et de cuisson, la protéine OsACC2-I1781(Am)L ne serait pas absorbé sur le plan systémique et ne comporterait pas de risques pour la santé.

De plus, la protéine OsACC2-I1781(Am)L s’est trouvé inactivé rapidement lorsqu’exposée à des températures supérieures à 60 °C, ce qui indique son manque de stabilité en conditions de transformation et de cuisson. En règle générale, le riz est cuit à des températures plus élevées. Par conséquent, on ne s’attend à aucune exposition à la protéine active. La protéine dénaturée devrait être digérée comme toute autre protéine alimentaire. Par conséquent, la protéine OsACC2-I1781(Am)L ne devrait pas comporter de risque pour la santé.

Selon ces données et ces facteurs pris en compte, d’un point de vue toxicologique, le riz HPHI2 est tout aussi inoffensif que les variétés traditionnelles de riz.

8. Allergénicité

L’incidence des modifications génétiques apportées au riz HPHI2 sur son degré d’allergénécité par rapport à celui des variétés traditionnelles a été examinée. Le riz HPHI2 se distingue du riz de type sauvage Indica-1 par une seule mutation d’une paire de bases dans la région codante du gène OsACC2. Comme mentionné ci-dessus, la modification est la même que celle apportée au maïs tolérant au séthoxidime, une lignée commercialisée depuis plusieurs années sans que des effets allergènes ne lui aient été imputés. Dans le grain de riz, le degré d’expression de la protéine est faible, et la protéine mutante est rapidement dégradée par les enzymes digestives ainsi qu’inactivée par la chaleur. En plus, les analyses bioinformatiques ont démontré que la séquence d’acides aminés de la protéine OsACC2-I1781(Am)L ne présente aucune similarité avec quelconque allergène connu. En se fondant sur ces aspects, la protéine modifiée ne comporterait pas de risque allergène.

Au Canada, le riz ne fait pas partie des aliments allergènes courants. Cependant, il contient des allergènes endogènes. Selon le processus utilisé pour la mise au point de ce produit, lequel n’a entraîné qu’un changement de nucléotide sans le recours à des mutagènes ni à l’ADN recombinant, on ne s’attendrait pas à des effets en aval qui augmenteraient la quantité d’allergènes endogènes dans le riz. Le fait que ce produit contienne plus d’allergènes endogènes que les variétés traditionnelles de riz est considéré comme improbable.

En se fondant sur ce qui précède, le riz HPHI2 ne susciterait pas davantage de préoccupations en matière d’allergénécité que les variétés traditionnelles de riz.

9. Conclusion

L’examen qu’a réalisé Santé Canada de l’information présentée à l’appui de l’utilisation alimentaire du riz HPHI2 (Provisia®) n’a suscité aucune préoccupation en matière d’innocuité alimentaire. De l’avis de Santé Canada, les aliments dérivés du riz HPHI2 ne comportent pas davantage de danger et sont tout aussi nutritifs que les variétés de riz actuellement sur le marché.

L’opinion formulée par Santé Canada n’a trait qu’à l’utilisation alimentaire du riz HPHI2. Les questions relatives à son utilisation dans l’alimentation animale ont été étudiées séparément conformément aux processus réglementaires sous le mandat de l’Agence canadienne d’inspection des aliments (ACIA). L’ACIA a évalué l’information fournie au sujet des éventuels enjeux en matière d’environnement et de santé animale associés au riz HPHI2. Elle en a conclu que de ces points de vue, la vente commerciale des produits dérivés de cette lignée de riz Provisia® ne soulève aucune préoccupation.

Le présent document d’information sur les aliments nouveaux a été préparé pour résumer l’avis sur le produit visé de la Direction des aliments, Direction générale des produits de santé et des aliments, Santé Canada. Cet avis est fondé sur l’analyse détaillée des renseignements fournis par le requérant, conformément aux Lignes directrices relatives à l’évaluation de l’innocuité des aliments nouveaux.

(Also available in English.)

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