Information sur des aliments nouveaux : Riz tolérant à l’herbicide imidazolinone RTC1

Information sur des aliments nouveaux

Santé Canada a avisé RiceTec Inc. qu'il ne s'oppose pas à l'utilisation alimentaire de la lignée de riz RTC1 tolérante aux herbicides. Le ministère a effectué une évaluation exhaustive de cette lignée de riz conformément à ses Lignes directrices pour l'évaluation de l'innocuité des aliments nouveaux. Les présentes lignes directrices sont fondées sur des principes reconnus à l'échelle internationale pour établir l'innocuité des aliments à caractères nouveaux.

Sur cette page

1. Contexte
   1. 1. Introduction
   2. 2. Mise au point de la plante modifiée
   3. 3. Caractérisation de la plante modifiée
   4. 4. Information sur le produit
   5. 5. Exposition alimentaire
   6. 6. Données nutritionnelles
   7. 7. Données chimiques
   8. 8. Toxicologie
   9. 9. Allergénicité
2. Conclusion

Contexte

Voici un résumé de la déclaration de RiceTec Inc. et de l'évaluation de Santé Canada. Ce document ne contient aucun renseignement commercial confidentiel.

1. Introduction

RiceTec Inc. a mis au point une lignée de riz génétiquement modifié (GM) (Oryza sativa L.), RTC1, qui présente une tolérance à l'herbicide inhibiteur de l'acétohydroxyacide synthase (AHAS), l'imidazolinone (IMI). Ce caractère innovant est obtenu grâce à la mutagénèse chimique et à l'introgression réussie d'une enzyme AHAS mutante dans le génome du riz par croisement et sélection traditionnels.

L'enzyme AHAS mutante de la variété RTC1 possède une substitution d'acide aminé A205V (l'alanine par la valine à la position 205) qui confère une tolérance aux herbicides, permettant à l'enzyme de fonctionner en présence des herbicides de la famille de l'IMI. Santé Canada a déjà évalué des lignées de riz tolérantes à l'IMI (CL121 et CL141) qui présentaient une mutation ponctuelle différente dans l'AHAS (Santé Canada, 2002). Santé Canada a déjà évalué une lignée de tournesol tolérante à l'IMI, X81359 (Santé Canada, 2003) possédant la même mutation dans l'AHAS que la lignée RTC1.

Santé Canada n'a précédemment indiqué aucune objection à la vente de diverses cultures tolérantes à l'IMI (incluant la lignée de canola Cibus 5715, Santé Canada, 2013; le soya BPS-CV127-9, Santé Canada, 2012; la variété Teal 11A de blé Clearfield, Santé Canada, 2004; la variété de lentilles Clearfield RH44, Santé Canada, 2004; etc.).

L'évaluation de l'innocuité effectuée par les évaluateurs de la Direction des aliments a été réalisée conformément aux Lignes directrices pour l'évaluation de l'innocuité des aliments nouveaux de Santé Canada. Ces lignes directrices sont fondées sur les efforts d'harmonisation avec d'autres organismes de réglementation et reflètent les documents d'orientation internationaux dans ce domaine (p. ex., Codex Alimentarius). L'évaluation a tenu compte de la façon dont le riz RTC1 tolérant aux herbicides a été mis au point, de la façon dont la composition et l'innocuité nutritionnelle de cette variété ont été comparées à son comparateur non modifié ainsi que du potentiel de toxicité ou d'allergénicité de cette variété. RiceTec Inc. a fourni des données à l'appui du fait que cette variété peut être utilisée sans danger comme aliment au Canada.

La Direction des aliments est chargée par la loi de l'évaluation préalable à la mise en marché des nouveaux aliments et des nouveaux ingrédients alimentaires, comme le précise le Titre 28 de la Partie B du Règlement sur les aliments et drogues (aliments nouveaux). Le riz RTC1 tolérant à l'IMI est considéré comme un aliment nouveau dans la partie suivante de la définition des aliments nouveaux :

1. « c) aliment dérivé d'un végétal, d'un animal ou d'un micro-organisme qui, ayant été modifié génétiquement,
   1. iii. présente un ou plusieurs caractères qui ne se trouvent plus dans les limites prévues pour ce végétal, cet animal ou ce micro-organisme ».

2. Mise au point de la plante modifiée

Dans le cas du riz, la première étape de la voie de biosynthèse des acides aminés à chaîne ramifiée (c.-à-d. valine, leucine et isoleucine) est catalysée par l'enzyme AHAS, aussi appelée acétolactate synthase (ALS). Les herbicides de la famille de l'imidazolinone (IMI) fonctionnent en se liant fortement au site actif de l'enzyme AHAS, inhibant ainsi la voie de biosynthèse des acides aminés à chaîne ramifiée, qui est essentielle à la croissance du riz. La tolérance à l'IMI dans les lignées de riz est souvent attribuée à des mutations ponctuelles dans leur gène ahas qui empêchent la liaison de l'herbicide à l'enzyme AHAS.

Le riz RTC1 tolérant à l'IMI a été produit par mutagénèse chimique de la variété parentale P1003, à l'aide de méthanesulfonate d'éthyle (EMS). Des graines mutagènes ont ensuite été cultivées et des plantes tolérantes ont été sélectionnées à l'aide d'un autre herbicide de la famille des IMI, l'imazéthapyre. Les plantes tolérantes ont ensuite été rétrocroisées avec la variété parentale sur six générations pour fixer la mutation dans la lignée parentale de la variété RTC1.

3. Caractérisation de la plante modifiée

La mutation de la lignée de riz RTC1 a été caractérisée à l'aide du séquençage de l'ADN de Sanger qui a confirmé une mutation ponctuelle de la C^®T (cytosine^®thymine) à la position nucléotide 536 du gène ahas. Cette mutation de l'ADN entraîne la substitution d'un seul acide aminé, soit celle de l'alanine par la valine, à la position 205.

Une analyse de ségrégation a été menée pour démontrer le mode de transmission des caractères de la lignée RTC1 et pour confirmer la stabilité du caractère de tolérance à l'IMI sur plusieurs générations. La ségrégation des lignées pour la mutation a été systématiquement testée par l'application de l'imazéthapyre, puis par la confirmation de l'hérédité des caractères à l'aide des marqueurs d'ADN spécifiques à l'allèle. Le rapport prévu de 1:3 de la sensibilité aux herbicides relativement à la tolérance a été observé pour les populations F2. On a également suivi les schémas de transmission par l'analyse de marqueurs moléculaires des populations rétrocroisées montrant la ségrégation d'un gène unique attendue selon la génération (rapport de 1:1 et de 1:2:1 dans les populations F1 et F2 respectivement). Tous les tests du Chi carré se sont révélés non significatifs, démontrant ainsi une transmission mendélienne stable du caractère de tolérance à l'IMI dans la lignée RTC1.

On a produit une AHAS synthétisée par des bactéries afin d'obtenir des quantités suffisantes d'AHAS RTC1 pour la digestion de la pepsine ainsi que pour les études sur la stabilité thermique. GenScript Biotech a utilisé un système d'expression dans Escherichia coli pour produire l'enzyme AHAS RTC1. GenScript a inséré un gène ahas synthétique (1965 bp) correspondant à la séquence d'ADN RTC1 connue, encodant la mutation du point RTC1, dans le vecteur pET-30a(+) et a transformé la construction en E. coli BL21 (DE3). La séquence synthétique du gène ahas RTC1 a été optimisée pour l'utilisation de codons bactériens et on a également encodé une étiquette His tag C-terminale pour la purification en aval de la protéine exprimée à l'aide d'une colonne de nickel. La protéine RTC1 exprimée a été purifiée davantage par dialyse et stérilisation par filtre à l'aide d'un filtre de 0,22 μm. L'analyse SDS-PAGE et Western blot, dans laquelle on a utilisé un anticorps anti-His, a confirmé que la protéine AHAS RTC1 exprimée consistait en un seul polypeptide avec la masse moléculaire prévue (72,7 kDa).

La protéine AHAS RTC1 synthétisée par des bactéries a été analysée à l'aide de la technique Nano-LC-MS/MS et d'un spectromètre de masse LTQ Orbitrap Thermo pour confirmer sa séquence d'acides aminés. Cette méthode a confirmé 88 % de la séquence d'acides aminés déduite pour l'AHAS RTC1 ainsi que la mutation ponctuelle A205V. On a jugé que l'AHAS RTC1 synthétisée par des bactéries était équivalente à l'AHAS RTC1 du riz grâce aux observations suivantes : l'identité de la séquence des acides aminés, y compris la mutation ponctuelle de l'AHAS synthétique, a été confirmée au moyen de la spectrométrie de masse; la masse moléculaire correcte de la protéine synthétique exprimée, telle que déterminée par l'analyse SDS-PAGE et Western; le profil d'activité enzymatique de l'AHAS RTC1 synthétique par rapport à celui de la plante était comparable.

D'après les renseignements fournis, l'utilisation du riz RTC1 dans les aliments ne cause pas de préoccupations du point de vue moléculaire.

4. Information sur le produit

Le riz résistant aux herbicides RTC1 diffère de son homologue traditionnel par la présence d'un gène mutant codant AHAS dans le génome hôte. L'expression de ce gène aboutit à une enzyme AHAS mutante capable de fonctionner en présence d'herbicides inhibiteurs de l'AHAS, permettant ainsi au riz RTC1 résistant aux herbicides de croître en présence de tels herbicides, à savoir les imidazolinones (IMI).

RiceTec Inc. a fourni une justification pour résoudre le problème des changements potentiels à l'expression de l'enzyme AHAS tolérante à l'IMI dans le riz. On s'attend à ce que la mutation ponctuelle dans l'AHAS RTC1 tolérant l'IMI ait très peu de chances de compromettre les niveaux d'expression de l'AHAS dans la variété RTC1 par rapport à ceux du riz d'origine. Étant donné que l'enzyme AHAS est essentielle au métabolisme des acides aminés, ses niveaux d'activité devraient être fortement contrôlés. Toute différence notable dans l'expression de cette enzyme aurait probablement un impact sur le phénotype de la plante et serait notée pendant le processus de sélection. D'après les renseignements fournis, l'utilisation du riz RTC1 dans les aliments ne cause pas de préoccupations du point de vue moléculaire.

5. Exposition alimentaire

On s'attend à ce que le riz RTC1 résistant aux herbicides soit utilisé dans des applications semblables à celles des variétés de riz traditionnelles. Le pétitionnaire ne prévoit pas de changement important dans l'utilisation alimentaire du riz par suite de l'introduction du riz RTC1 tolérant aux herbicides.

6. Données nutritionnelles

Des données sur la composition pour un hybride contenant la modification génétique RTC1 seulement (« mutant simple »), un hybride de RTC1 comportant une lignée dans laquelle s'est produit un événement tolérant à l'IMI déjà évalué (« hybride à double mutation »), et un hybride traditionnel étroitement lié (« témoin ») ont été recueillies dans le cadre de trois essais sur le terrain menés à deux endroits en Argentine au cours de la saison de croissance 2015-2016. Dans chaque essai, trois répliques de chaque entrée ont été plantées suivant un schéma de bloc aléatoire complet. Les hybrides à mutation simple et double ont été traités avec un herbicide de la famille des IMI.

Des échantillons de grains ont été récoltés et analysés pour déterminer la présence de macronutriments et de fibres, d'acides gras, d'acides aminés, de minéraux, de vitamines et d'anti-nutriments (lectines, acide phytique, inhibiteurs de la trypsine). Ces composants nutritionnels sont conformes aux recommandations énumérées dans le document consensuel de l'Organisation de coopération et de développement économiques (OCDE) sur les considérations relatives à la composition des nouvelles variétés de riz. Les analyses de chaque composant ont été effectuées à l'aide de méthodes analytiques approuvées et validées à l'échelle internationale.

Les données ont été résumées comme suit : moyenne, minimum, maximum et écart-type. Lorsqu'une différence statistiquement significative (valeur P < 0,05) a été relevée entre les hybrides modifiés et les hybrides traditionnels, d'autres renseignements contextuels pour l'interprétation de la pertinence nutritionnelle de la différence ont été obtenus par comparaison avec la fourchette prévue pour le riz ordinaire, telle que définie par les moyennes déclarées dans l'International Life Sciences Institute Crop Composition Database, le document consensuel de l'OCDE, ou la soumission du pétitionnaire basée sur l'analyse nutritionnelle de plusieurs lignées de riz traditionnelles autres que l'hybride témoin.

Des différences statistiquement significatives ont été observées entre le mutant simple et le groupe témoin pour les composants suivants (unité témoin c. unité mutant simple) : fibre de détergent neutre (19,189 c. 21,367, % PS), manganèse (0,011 c. 0,010, % PS), alpha-tocophérol (7,580 c. 8,524 mg/kg PS), gamma-tocophérol (3,198 c. 3,786 mg/kg PS). Étant donné que le cultivar modifié n'a jamais été en dehors de la gamme prévue pour ces composants pour le riz ordinaire, ces différences n'ont pas été considérées comme une préoccupation en matière de sécurité nutritionnelle.

Des différences statistiquement significatives entre l'hybride à double mutation et le témoin ont été observées pour les composants suivants (hybride témoin c. hybride à double mutation, unités) : fibre de détergent neutre (19,189 c. 22,144, % PS), acide myristique (0,316 c. 0,338, % d'acides gras totaux). Étant donné que le cultivar modifié n'a jamais été en dehors de la gamme prévue pour ces composants pour le riz ordinaire, ces différences n'ont pas été considérées comme une préoccupation en matière de sécurité nutritionnelle.

La teneur en folate de l'hybride à double mutation (3,123 mg/kg PS) était beaucoup plus élevée que celle de l'hybride témoin (1,717 mg/kg PS). On a noté que les niveaux de folate plus élevés, comparativement à ceux du témoin, semblaient se limiter à un seul des deux emplacements sur le terrain. Le pétitionnaire a fourni des données supplémentaires suggérant que des concentrations plus élevées de folate dans l'hybride à double mutation peuvent être attribuées aux différences dans la lutte contre les mauvaises herbes et la concurrence interspécifique, par suite de la comparaison entre les hybrides traités avec des herbicides et les hybrides non traités, plutôt qu'à la modification génétique en soi. Premièrement, des concentrations élevées de folate ont été décelées lorsque les hybrides à double mutation traités par l'IMI ont été comparés à des témoins non traités, mais pas lorsque les hybrides à double mutation non traités ont été comparés à des témoins non traités. Deuxièmement, on n'a pas observé de concentrations élevées de folate lorsque les hybrides à double mutation traités par l'IMI ont été comparés à des hybrides témoins traités porteurs d'une modification génétique conférant une tolérance à l'IMI. En outre, on a noté que l'apport maximal tolérable (UL) pour le folate ne s'applique qu'à sa forme synthétique (c.-à-d. l'acide folique), qui n'est pas naturellement présente dans les plantes. D'après la compréhension actuelle de la biosynthèse du folate chez les plantes, il semble extrêmement improbable que la modification génétique inhérente à l'hybride à double mutation entraîne l'accumulation d'acide folique (par rapport aux formes naturelles de folate). Par conséquent, la différence observée dans la teneur en folate n'a pas été considérée comme une préoccupation en matière d'innocuité nutritionnelle.

D'après les renseignements fournis, l'utilisation du RTC1 dans les aliments ne cause pas de préoccupations en matière d'innocuité du point de vue nutritionnel.

7. Données chimiques

Aucune donnée analytique n'a été fournie par le pétitionnaire pour le plomb, l'arsenic, le cadmium ou le mercure. Cependant, on a effectué une évaluation de la composition en comparant l'hybride à simple mutation (RTC1) et l'hybride à double mutation (la lignée RTC1 croisée avec une lignée comportant un événement tolérant à l'IMI précédemment évalué) et 3 lignées témoin. Les échantillons ont été évalués pour déterminer les concentrations de divers nutriments, y compris le calcium, le cuivre, le fer, le magnésium, le manganèse, le phosphore, le potassium et le zinc. Comme il a été déterminé que les niveaux d'éléments traces dans la lignée RTC1 et l'hybride à double mutation étaient comparables aux lignées témoin, on ne s'attend pas à ce que la variété de riz RTC1 absorbe plus d'éléments traces toxiques que le riz non modifié.

Aucune donnée analytique n'a été fournie par le pétitionnaire pour les mycotoxines. La susceptibilité aux mycotoxines peut réduire la croissance des plantes. Toutefois, la soumission indique qu'il n'y a aucune différence observée dans les données phénotypiques entre l'hybride à simple mutation (RTC1), l'hybride à double mutation et leurs homologues non modifiés. On considère cela comme une indication que le processus de modification génétique n'a pas donné lieu à des effets imprévus liés à la susceptibilité aux mycotoxines.

Selon les renseignements fournis, on ne s'attendrait pas à ce que la lignée de riz RTC1 tolérante à l'IMI pose un problème pour la santé humaine du point de vue des contaminants chimiques.

8. Toxicologie

Les preuves toxicologiques fournies pour démontrer l'innocuité de la lignée de riz RTC1 exprimant la nouvelle protéine AHAS ont été évaluées. Le pétitionnaire a fourni une justification fondée sur l'absence d'exposition systémique ou de similitude avec les toxines connues, comme le démontrent les essais in vitro et les analyses in silico.

Un essai de labilité thermique a démontré que la nouvelle protéine AHAS perd toute activité enzymatique lorsqu'elle est exposée à des températures supérieures à 70 °C pendant 30 minutes (le premier point temporel mesuré). Une analyse visuelle effectuée par SDS-PAGE a permis de déterminer que l'exposition à la chaleur ne dégrade que partiellement la protéine. On a conclu que la nouvelle protéine AHAS perd sa structure tertiaire et sa fonction enzymatique aux températures utilisées pour la cuisson du riz, mais qu'elle n'est pas entièrement dégradée dans ces conditions. La perte d'activité enzymatique suggère que la protéine AHAS ne serait pas active dans le riz cuit et ne serait donc pas capable de provoquer de réactions toxiques.

Un test de liquide gastrique simulé (LGS) a été effectué pour déterminer la stabilité de la nouvelle protéine AHAS dans des conditions semblables à celles de l'estomac humain. La protéine a été exposée au LGS pendant des périodes allant de 0,5 à 60 minutes. Une analyse SDS-PAGE a montré que la bande de 70 kDa représentant la protéine intacte n'était plus visible en moins de 0,5 minute, bien qu'un petit fragment de 10 kDa ait été observé. Aucune bande protéique n'était visible après 2 minutes. Ces résultats indiquent que la protéine nouvelle se dégrade rapidement dans des conditions similaires à celles qu'on trouve dans l'estomac et qu'aucune exposition systémique à celle-ci n'est prévue après la consommation de riz.

Une recherche d'homologies des séquences d'acides aminés entre la protéine AHAS mutée et les toxines protéiques connues n'a pas permis d'établir de correspondance significative. Dans tous les cas, les correspondances étaient soit de faible similitude (< 35 %), n'incluaient pas la mutation ponctuelle et/ou concernaient des protéines hypothétiques.

D'après les renseignements disponibles, l'utilisation proposée de la lignée de riz RTC1 ne soulevait aucune préoccupation sur le plan toxicologique.

9. Allergénicité

Le pétitionnaire a fourni des renseignements et des données pour appuyer le manque de potentiel allergène de la protéine AHAS nouvelle. Le pétitionnaire a effectué une recherche d'homologies des séquences d'acides aminés entre la protéine AHAS mutée et des allergènes connus. On n'a trouvé aucune correspondance se caractérisant par une homologie supérieure à 35 % sur plus de 80 résidus d'acides aminés avec une probabilité inférieure à 1,0. On a conclu que la protéine AHAS nouvelle ne ressemble à aucun allergène protéique connu figurant dans cette base de données.

De plus, l'essai de liquide gastrique simulé décrit ci-dessus a démontré qu'il est peu probable que la protéine intacte atteigne l'intestin pour provoquer une réaction allergique.

Le pétitionnaire a également fourni une justification pour appuyer l'absence de changements dans les niveaux d'allergènes endogènes dans le riz. Selon le pétitionnaire, la base de données AllergenOnline relève plusieurs protéines allergènes chez les espèces d'Oryza appartenant à la famille des inhibiteurs de la trypsine/l'alpha-amylase. Le pétitionnaire a fait valoir qu'il est peu probable que les concentrations de ces allergènes endogènes aient été modifiées ou augmentées de façon notable à la suite de la procédure de mutagénèse, parce que le rétrocroisement intensif dont la lignée mutante originale a fait l'objet aurait éliminé la majeure partie du matériel génétique original muté. Pour ajouter à la justification, le pétitionnaire a également démontré que l'activité de la trypsine dans la lignée RTC1 était semblable à celle des lignées de riz traditionnelles. Dans l'ensemble, rien n'indique qu'il existe un risque accru de réactions allergiques aux protéines endogènes dans la lignée de riz RTC1.

D'après les éléments de preuve présentés, il n'y a pas de problème d'allergénicité concernant l'utilisation proposée de la lignée de riz RTC1.

Conclusion

L'examen par Santé Canada des renseignements présentés à l'appui de l'utilisation de la variété de riz RTC1 tolérante à l'imidazolinone (IMI) ne soulève pas de préoccupations liées à l'innocuité des aliments.

L'opinion de Santé Canada porte uniquement sur l'utilisation alimentaire du riz RTC1. Les questions liées à son utilisation comme aliment pour animaux ont été traitées séparément dans le cadre des processus réglementaires existants de l'Agence canadienne d'inspection des aliments.

(Also available in English)

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Santé Canada
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