Information sur les aliments nouveaux : Soja HB4 résistant au stress abiotique et aux herbicides (IND-00410-5)
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Contexte :
Santé Canada a avisé Bioceres Crop Solutions Corp. qu'il n'a aucune objection à l'utilisation alimentaire du soja HB4 résistant au stress abiotique et aux herbicides (IND-00410-5) (c.-à-d. le soja HB4). Cet événement a d'abord été présenté au Ministère à titre d'actif appartenant à Verdeca LLC. Au cours de l'évaluation de cet événement, la propriété de cet actif a été transférée à Bioceres Crop Solutions Corp. Le Ministère a effectué une évaluation exhaustive de cette variété de soja conformément à ses Lignes directrices sur l'évaluation de l'innocuité des aliments nouveaux. Ces lignes directrices sont fondées sur des principes reconnus à l'échelle internationale pour établir l'innocuité des aliments à caractères nouveaux.
Le texte qui suit résume l'avis initial remis par Verdeca LLC ainsi que l'évaluation réalisée par Santé Canada. Il ne contient aucun renseignement commercial confidentiel.
1. Présentation
Verdeca LLC. a mis au point une variété de Glycine max. L. (soja) génétiquement modifiée qui présente une tolérance accrue aux stress environnementaux (ce qui entraîne une diminution des pertes de rendement des cultures) et une tolérance aux herbicides à base de glufosinate-ammonium.
Le soja HB4 a été mis au point grâce à l'introduction de deux gènes : un gène HaHB4 codant un facteur de transcription appartenant à la sous-famille I de la famille HD-Zip (HAHB4) et un gène-bar codant une protéine phosphinothricin acétyltransférase (PAT).
L'évaluation de l'innocuité effectuée par les évaluateurs de la Direction des aliments a été réalisée conformément aux Lignes directrices pour l'évaluation de l'innocuité des aliments nouveaux de Santé Canada. Ces dernières sont fondées sur les démarches visant l'harmonisation avec les directives établies par d'autres autorités réglementaires et reflètent les documents d'orientation internationaux dans ce domaine (p. ex., le Codex Alimentarius). L'évaluation a tenu compte de la façon dont cette variété de soja a été créée, de la composition et de la qualité nutritionnelle de cette variété par rapport aux variétés de soja non modifiées et de la possibilité que cette variété de soja soit toxique ou cause des réactions allergiques. Verdeca LLC. a fourni des données démontrant que le soja HB4 est tout aussi inoffensive et de même qualité nutritionnelle que les variétés de soja traditionnelles utilisées à des fins alimentaires au Canada.
La Direction des aliments est chargée par la loi de l'évaluation préalable à la mise en marché des aliments nouveaux et des ingrédients alimentaires nouveaux, comme le précise le Règlement sur les aliments et drogues (Titre B.28). Les aliments dérivés du soya HB4 sont considérés comme des aliments nouveaux dans la partie suivante de la définition des aliments nouveaux :
« c) aliment dérivé d'un végétal, d'un animal ou d'un micro-organisme qui, ayant été modifié génétiquement, selon le cas :
- (i) présente des caractères qui n'avaient pas été observés auparavant. »
2. Mise au point de la plante modifiée
Le pétitionnaire a fourni des renseignements décrivant les méthodes utilisées pour obtenir les données de biologie moléculaire et sur le soja HB4 qui ont caractérisé le changement génétique, ce qui entraîne une tolérance accrue aux stress environnementaux (entraînant une diminution des pertes de rendement des cultures) et une tolérance aux herbicides à base de glufosinate-ammonium.
Le soja HB4 a été mis au point grâce à la transformation induite par Agrobacterium de la variété de soja Williams 82 à l'aide du vecteur de transformation pIND2-HB4. Le vecteur pIND2-HB4 contient une construction (ADN-T) du gène HaHB4, codant un facteur de transcription appartenant à la sous-famille I de la famille HD-Zip (HAHB4) et au gène bar, codant une protéine phosphinothricin acétyltransférase (PAT).
La séquence de codage pour la protéine HAHB4 a été isolée du tournesol (Helianthus annuus L.) La protéine HAHB4 appartient à une grande catégorie de facteurs de transcription, qui sont présents dans plusieurs espèces végétales et sont régulés en fonction de différents environnements. On a observé une augmentation du niveau d'ARNm du HaHB4 à la suite d'une exposition à différents stimuli environnementaux stressants.
La séquence de codage de la protéine PAT a été isolée de la bactérie Streptomyces hygroscopicus. L'expression de la protéine PAT dans la cellule entraîne une détoxication (c.-à-d. catalyse l'acétylation de l'isomère L de phosphinothricine (L-PPT)), ce qui rend la plante tolérante aux herbicides à base de glufosinate-ammonium. Pendant la mise au point du soja HB4, le gène bar a été utilisé comme marqueur de sélection des transformants efficaces. Cependant, il a été déterminé que l'expression de la protéine PAT conférait également une tolérance aux herbicides à base de glufosinate-ammonium aux niveaux utilisés en culture.
Le pétitionnaire a fourni des renseignements à l'appui de l'innocuité et des antécédents de longue date d'utilisation des organismes donneurs (H. annuus L. and S. hygroscopicus) et de l'organisme receveur (G. max L.) Aucun de ces organismes ne pose de risque pour la santé.
3. Caractérisation de la plante modifiée
Le nombre de sites d'intégration de l'insert d'ADN-T dans le soja HB4 a été caractérisé par une analyse par transfert de Southern sur l'ADN génomique (ADNg) préparé à partir de feuilles. Les résultats de l'analyse par transfert de Southern ont démontré la présence d'une seule copie intacte de l'insert d'ADN-T dans le génome du soja HB4. Les résultats de l'analyse par transfert de Southern ont également confirmé l'absence de toute séquence de squelette de vecteur dans le génome du soja HB4.
Des analyses bio-informatiques ont été effectuées pour évaluer la toxicité et l'allergénicité potentielles de tout peptide putatif codé par la traduction des six cadres de lecture dans l'insert d'ADN-T et des séquences d'ADNg flanquantes. Les cadres de lecture ouverts (ORF) ont été définis en recherchant la séquence nucléotidique délimitée pour tout codon d'initiation et de terminaison produisant un peptide de huit acides aminés ou plus. Soixante-quatorze (74) peptides contenant jusqu'à 177 acides aminés de longueur ont été identifiés.
Le potentiel toxigène et allergène de chacun de ces peptides a été évalué par comparaison séquentielle avec les toxines connues dans la base de données du NCBI et la base de données sur les toxines animales (ATDB) et les allergènes connus dans la base de données AllergenOnline. Aucun des peptides putatifs ne montrait d'homologie significative avec des toxines ou des allergènes connus.
La stabilité de l'insert d'ADN-T dans le génome du soja HB4 a été démontrée par une évaluation des plantes de soja HB4 individuelles de quatre générations (T1, T3, T5 et T6) au moyen d'analyses de la réaction en chaîne de la polymérase (Pcr). Les résultats indiquent que l'insert d'ADN-T est intact et stable sur les quatre générations de soja HB4.
Les ratios de ségrégation ont confirmé que les gènes HaHB4 et bar contenus dans l'insert d'ADN-T sont hérités de la manière prévue pour une seule insertion. Les résultats sont conformes aux principes mendéliens de l'hérédité et appuient la conclusion selon laquelle le génome du soja HB4 contient un seul insert d'ADN-T intégré dans un seul locus chromosomique dans le génome du soja.
4. Information sur le produit
Le soja HB4 se distingue de ses homologues traditionnels par l'ajout de deux constructions d'expression génique, l'un pour le gène HaHB4 qui exprime une protéine HAHB4 conférant une résistance accrue aux stress environnementaux (entraînant une réduction de la perte de rendement des cultures), et le deuxième pour le gène bar qui exprime une protéine PAT conférant une résistance aux herbicides à base de glufosinate-ammonium.
Les niveaux d'expression de la protéine HAHB4 dans les tissus du soja HB4 ont été déterminés par la méthode de quantification absolue (AQUA) de quantification des protéines par chromatographie en phase liquide ciblée avec spectrométrie de masse en tandem (CPL SM/SM). Malgré la très grande sensibilité de cette méthode, la protéine HAHB4 n'a été détectée que dans deux échantillons de tissus fourragers provenant de deux essais sur le terrain aux États-Unis (5 et 4 ng/g poids sec, respectivement). La faible expression de la protéine HAHB4 peut être due à une expression temporelle, environnementale, localisée et/ou à un contrôle réglementaire actif, comme cela a été décrit pour les facteurs de transcription HD Zip connexes.
Les niveaux d'expression de la protéine PAT ont été mesurés dans les tissus du fourrage et des semences du soja HB4 cultivé pendant la saison de croissance 2012-2013 au moyen de la méthode immuno-enzymatique ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). La valeur la plus élevée mesurée dans les échantillons de tissus de semences de soja HB4 était de 69,05 µ/g de poids frais (FW) et de 12,68 µ/g de poids frais dans les échantillons de fourrage.
Les niveaux d'expression de la protéine PAT dans les feuilles, les tiges, les racines, les fleurs, les jeunes cosses et les tissus de semence recueillis pendant la saison de croissance 2017 aux États-Unis ont été mesurés à l'aide de la méthode ELISA. Les niveaux de protéines PAT étaient semblables dans tous les tissus, allant de 24 à 43 µ/g de poids frais.
En raison de l'expression extrêmement faible de la protéine HAHB4 dans le soja HB4, la protéine d'origine végétale n'a pas pu être purifiée en quantités suffisantes pour d'autres essais. Le pétitionnaire a conçu une version recombinante de la protéine HAHB4 pour la surexpression dans un système d'expression dans Escherichia coli. La protéine HAHB4 produite par E. coli a été conçue pour avoir la même séquence primaire d'acides aminés que la protéine HAHB4 produite par les plantes. L'équivalence entre la protéine d'origine végétale et la protéine produite par E. coli a été démontrée à l'aide de la chromatographie en phase liquide avec spectrométrie de masse en tandem (CPL SM), de la détection de masse TDV-DILAM, de l'analyse de la séquence N-terminale et d'une analyse SDS-PAGE.
5. Exposition alimentaire
On s'attend à ce que le soja HB4 soit utilisé dans des applications semblables à celles des variétés de soja traditionnelles. Le pétitionnaire ne prévoit pas de changement important dans l'utilisation alimentaire du soja par suite de l'introduction du soja HB4.
6. Nutrition
Cinq essais sur le terrain ont servi à prélever des échantillons pour l'analyse de la composition du soja HB4 et de son homologue témoin (Williams 82). Les essais sur le terrain ont été effectués dans les principales zones de production de soja des États-Unis en 2013. Ces régions de culture chevauchent les régions canadiennes de culture du soja. Le soja HB4 et le soja témoin ont été cultivés sur tous les sites. Chacun des groupes a été répliqué quatre fois dans un schéma de bloc aléatoire complet. De plus, une analyse de la composition a été effectuée sur plusieurs variétés commerciales de référence sur chaque site. Des pratiques de production agricole commerciale typiques ont été utilisées pour les essais sur le terrain.
Les échantillons de semences de soja ont été analysés pour déterminer l'humidité, les protéines, les matières grasses, les cendres, les glucides, les fibres au détergent acide (FDA), les fibres au détergent neutre (FDN), les fibres brutes, le calcium, le phosphore, les acides gras, les vitamines E et K1, les acides aminés et les anti-nutriments (daidzéine, génistéine, glycitéine, stachyose, raffinose, acide phytique, lectine et inhibiteurs de trypsine). Des échantillons de fourrage ont également été analysés pour en déterminer l'humidité, les protéines, les matières grasses, les cendres, les glucides, ainsi que les FDA et les FDN.
Au total, 44 analytes ont été détectés dans l'analyse des semences et 7 dans le fourrage. L'analyse statistique a été effectuée à l'aide du logiciel SAS et les différences statistiques ont été établies à un niveau de signification de 5 %. L'analyse du soja HB4 et de la variété témoin a révélé six différences statistiquement significatives dans l'analyse combinée du site, soit pour l'acide stéarique, l'acide oléique, l'acide arachidique, la vitamine K1, la daidzéine et la glycitéine. Dans tous les cas, les différences étaient faibles, et les niveaux d'analytes se situaient dans les plages de référence observées pour les variétés commerciales de soya et/ou signalées dans la documentation scientifiqueNote de bas de page 1.
D'après les renseignements fournis sur la composition du soja HB4 et de la variété témoin, l'utilisation du soja HB4 comme ingrédient alimentaire au Canada ne pose aucun problème de salubrité du point de vue nutritionnel.
7. Toxicologie
L'innocuité de la protéine PAT est bien documentée dans la documentation publique et appuyée par les évaluations antérieures de neuf cultures génétiquement modifiées exprimant cette protéine. L'équivalence de la protéine PAT exprimée dans le soja HB4 et de la protéine PAT telle qu'elle est décrite dans la documentation et les évaluations antérieures a été confirmée. Par conséquent, l'innocuité de la protéine PAT produite à partir du gène bar est bien établie et, par conséquent, aucune nouvelle étude toxicologique n'était requise pour appuyer l'innocuité de la protéine PAT exprimée dans le soja HB4.
Le principal argument en faveur de l'innocuité de la protéine HAHB4 est un manque d'exposition. Le pétitionnaire a analysé les niveaux d'expression de la protéine HAHB4 dans les semences de soja. Deux méthodes d'analyse différentes ont été utilisées, et aucune des deux n'a permis de détecter la protéine dans les semences de soya à l'aide de méthodes sensibles (CPL-SM/SM, LD = 0,026 µ/g poids sec; spectromètre de masse à quadrupole tri-étagé, LD = 0,007 µ/g PS). Le très faible risque d'exposition porte à croire que la protéine HAHB4 ne poserait pas de problème toxicologique pour les consommateurs.
L'estimation de l'exposition alimentaire la plus prudente a été calculée par les évaluateurs. L'évaluation de l'exposition était fondée sur le fait que les nourrissons sont les plus grands consommateurs de soja en fonction du poids corporel (p.c.) et sur l'hypothèse que la protéine HAHB4 est exprimée à la LD. En utilisant les valeurs de consommation des préparations pour nourrissons et en supposant que les protéines de soja sont ajoutées à la concentration maximale permise, on a estimé que les nourrissons de 0 à 6 mois consommeraient jusqu'à 0,13 µ/kg p.c. de la protéine HAHB4 par jour. Par conséquent, même avec l'estimation la plus prudente, on a conclu que l'exposition potentielle à la nouvelle protéine est considérée comme extrêmement faible et qu'elle ne devrait pas poser de problème de sécurité.
Le pétitionnaire a fourni des analyses pour déterminer si la protéine est digérée dans un liquide gastrique simulé (LGS) et dégradée par la chaleur. Les résultats indiquent que la protéine HAHB4 est facilement digérée dans un LGS en 0,5 minute, mais n'est pas significativement dégradée par la chaleur. Bien que des bandes de petites protéines (~5 kDa) étaient encore visibles jusqu'à 30 minutes après l'exposition au LGS, elles n'étaient pas considérées comme étant significatives sur le plan toxicologique, car elles ne montraient pas d'homologie entre la séquence d'acides aminés et les toxines protéiques connues. La majeure partie de la protéine était instantanément dégradée, ce qui porte à croire que la protéine intacte ne serait pas absorbée et ne devrait donc pas poser de problème toxicologique.
Le pétitionnaire a identifié 74 cadres de lecture ouverts (ORF) potentiels qui pourraient théoriquement entraîner la traduction d'une nouvelle protéine. Pour éviter cette possibilité, le pétitionnaire a identifié les peptides putatifs qui pourraient être exprimés par ces ORF en faisant une recherche dans la base de données du NCBI et a également comparé leurs séquences d'acides aminés aux toxines protéiques connues dans la base de données ATDB. Les 74 peptides putatifs étaient de nature hypothétique (c.-à-d. prédits par analyse de séquences) et aucun ne correspondait aux toxines connues dans les bases de données. D'après cette analyse, il est peu probable que des peptides préoccupants inattendus soient exprimés dans le soja HB4.
D'après les renseignements fournis, les évaluateurs n'ont pas relevé de problèmes en matière d'innocuité du point de vue toxicologique relativement à l'utilisation du soja HB4 à des fins alimentaires.
8. Allergénicité
L'innocuité de la protéine PAT est bien documentée dans la documentation publique et appuyée par les évaluations antérieures de neuf cultures génétiquement modifiées exprimant cette protéine. L'équivalence de la protéine PAT exprimée dans le soja HB4 et de la protéine PAT telle qu'elle est décrite dans la documentation et les évaluations antérieures a été confirmée. Par conséquent, l'innocuité de la protéine PAT produite à partir du gène bar est bien établie et, par conséquent, aucune nouvelle étude allergénique n'était requise pour appuyer l'innocuité de la protéine PAT exprimée dans le soja HB4.
En utilisant plusieurs bases de données (AllergenOnline, Allergone.org, SDAP Database), le pétitionnaire a analysé la séquence d'acides aminés ainsi que les composants structurels de la protéine pour déterminer si la protéine HAHB4 ressemblait à des allergènes connus. Aucune correspondance pertinente n'a été trouvée. De plus, la protéine HAHB4 n'est pas glycosylée – une caractéristique commune des protéines allergènes (Ladics et al., 2018Note de bas de page 2).
Le pétitionnaire a démontré que la protéine HAHB4 est digérée rapidement (en moins de 0,5 minute) dans un essai de liquide gastrique simulé (LGS). Cela porte à croire que même si la protéine était consommée, elle n'atteindrait pas le tissu immunologique dans le tractus gastro-intestinal et ne devrait pas provoquer de réaction allergique. Les bandes faibles représentant de petits fragments protéiques (~5 kDa) restant jusqu'à 30 minutes après la digestion ne devraient pas poser de problème, car il n'y avait pas d'homologies de séquence avec les allergènes connus.
Le soja est un allergène prioritaire au Canada. Le pétitionnaire a effectué une analyse des concentrations de plusieurs allergènes endogènes connus exprimés dans le soja HB4 par rapport à sa lignée parentale, ainsi que de plusieurs autres lignées de soja disponibles sur le marché. Les résultats indiquent que les modifications génétiques introduites dans le soja HB4 n'ont pas modifié de façon significative les niveaux d'allergènes endogènes (c.-à-d. que les niveaux d'allergènes endogènes se situaient dans les limites documentées pour le soja).
La séquence d'acides aminés des 74 peptides putatifs qui pouvaient théoriquement être exprimés par des ORF putatifs identifiés dans le soja HB4 a été comparée aux séquences d'allergènes connus dans la base de données AllergenOnline. Aucune correspondance significative n'a été trouvée. Par conséquent, dans l'éventualité peu probable où ces peptides putatifs seraient exprimés, on ne s'attendrait pas à ce qu'ils posent un problème d'allergénicité.
D'après les renseignements fournis, les évaluateurs n'ont pas relevé de problèmes en matière d'innocuité du point de vue allergénique relativement à l'utilisation du soja HB4 à des fins alimentaires.
Conclusion :
L'examen par Santé Canada des renseignements présentés à l'appui de l'utilisation alimentaire du soja HB4 ne soulève pas de préoccupations liées à l'innocuité des aliments. Santé Canada est d'avis que les aliments dérivés de cette variété de soja sont tout aussi sécuritaires et nutritifs que les aliments issus des variétés de soja sur le marché actuellement.
L'opinion de Santé Canada porte uniquement sur l'utilisation du soja HB4 à des fins alimentaires. Les questions liées à son utilisation comme aliment pour animaux ont été traitées séparément dans le cadre des processus réglementaires existants de l'ACIA.
Le présent document d'information sur les aliments nouveaux a été préparé pour résumer l'avis concernant le produit en question fourni par la Direction des aliments, Direction générale des produits de santé et des aliments de Santé Canada. Cet avis est fondé sur l'examen exhaustif des renseignements soumis par le pétitionnaire conformément aux Lignes directrices sur l'évaluation de l'innocuité des aliments nouveaux.
(Also available in English)
Pour de plus amples renseignements, veuillez communiquer avec :
Section des aliments nouveaux
Direction des aliments
Direction générale des produits de santé et des aliments
Santé Canada, PL2204A1
251, promenade Frederick Banting
Ottawa (Ontario) K1A 0K9
hc.bmh-bdm.sc@canada.ca
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