ARCHIVÉE - Dosage de la mélamine dans divers produits qui contiennent du lait

Bureau d'innocuité des produits chimiques
Direction des aliments
Direction générale des produits de santé et des aliments
Novembre 2008
ISBN : 978-1-100-90391-0
Cat. : H164-102/2008F-PDF

Table des matières

• 1.0 Principe et portée
• 2.0 Définitions
• 3.0 Appareillage et fournitures
  • 3.1 Appareillage
  • 3.2 Matériel
  • 3.3 Substances chimiques
  • 3.4 Solutions
• 4.0 Santé et sécurité
• 5.0 Responsabilités
• 6.0 ProcMéthodeedure
  • 6.1 Échantillonnage
  • 6.2 Lavage de la verrerie
  • 6.3 Préparation de l'échantillon
  • 6.4 Extraction des échantillons
  • 6.5 Purification de l'échantillon
  • 6.6 Préparation de l'extrait pour l'analyse CPL/SM/SM
  • 6.7 Analyse de l'échantillon par CPL-SM-SM
  • 6.8 Analyse des données
• 7.0 Consignation
• 8.0 Assurance et contrôle de la qualité

1.0 Principe et portée

Ces consignes de travail décrivent la méthode analytique utilisée pour l'extraction et l'analyse quantitative de la mélamine dans les préparations liquides et en poudre pour les nourrissons. On peut aussi y avoir recours pour extraire la mélamine du lait, des boissons au yogourt et de divers produits qui contiennent du lait en poudre.

Pour la préparation des échantillons, la méthode fait appel à l'extraction liquide-liquide et à l'extraction en phase solide basée sur l'échange cationique. Pour réaliser l'analyse quantitative, on a recours à la chromatographie en phase liquide avec ionisation par électronébulisation en mode positif/ spectrométrie de masse en tandem.

2.0 Définitions

ACN :

Acétronitrile.

Lot analysé : Le groupe d'échantillons, de blancs et d'échantillons de CQ qu'un analyste est en mesure de préparer à la fois.

DCM :

Dichlorométhane.

Échantillon en duplicata : L'échantillon qui est extrait, traité et analysé deux fois dans le même lot analysé. On utilise l'échantillon en duplicata pour surveiller la précision de la méthode analytique.

HCl :

Acide chlorhydrique.

 

HILIC :

Chromatographie liquide d'interaction hydrophile.

Étalon internede performance :

Un composé dont les propriétés physico-chimiques sont aussi semblables que possible à celles de la substance à analyser, lequel est ajouté à tous les extraits d'échantillons et de blancs et à tous les étalons d'échantillonnage immédiatement avant l'analyse instrumentale. Cet étalon rectifie les variations dans l'échantillon final et les volumes standard ainsi que les variations dans les volumes d'injection et les effets de matrice.

Étalon interne de récupération :

Un composé dont les propriétés physico-chimiques sont aussi semblables que possible à celles de la substance à analyser, lequel est ajouté à tous les extraits d'échantillons et de blancs et à tous les étalons d'échantillonnage avant l'extraction au début du traitement des échantillons. Cet étalon permet d'assurer le suivi des pertes de la substance analysée pendant le traitement de l'échantillon.

CPL-SM/SM :

Chromatographie en phase liquide / spectrométrie de masse en tandem.

MEL :

Mélamine (1,3,5-triazine-2,4,6-triamine).

*MEL :

Mélamine- ¹⁵N ₃, ¹³C ₃.

MEL- ¹³C :

Mélamine- ¹³C ₃.

MeOH :

Méthanol.

Eau Milli-Q :

Eau désionisée filtrée au moyen d'un système Milli-Q pour atteindre une résistivité de 18 MW.

NH ₄OH :

Hydroxyde d'ammonium.

Carnet personnel de laboratoire :

Un carnet relié que l'on utilise pour consigner les renseignements et les données générales obtenus par une personne particulière.

CQ :

Contrôle de la qualité.

Étalon CQ de contrôle de l'étalonnage :

Une solution étalon préparée à partir d'une source de substance à analyser entièrement indépendante de celle qui est utilisée pour préparer les solutions d'étalonnage. L'étalon CQ est utilisé pour surveiller la précision du calibrage des instruments.

Préparation liquide CQ :

Une préparation liquide pour nourrissons dont la teneur en MEL est établie. On l'analyse fréquemment à titre de matériel de référence interne pour exercer une surveillance du rendement de la méthode d'analyse.

Préparation en poudre CQ :

Une préparation en poudre pour nourrissons dont la teneur en MEL est établie. On l'analyse fréquemment à titre de matériel de référence interne pour exercer une surveillance du rendement de la méthode d'analyse.

Blanc de réactif :

Un échantillon qui ne contient pas la substance à analyser. Celui-ci est traité et analysé exactement de la même façon que le sont les autres échantillons. Le blanc de réactif est utilisé pour exercer une surveillance des concentrations de fond de la substance à analyser qui contamine l'échantillon au cours du processus.

EPS :

Extraction en phase solide.

Classeur des solutions :

Le classeur qui contient toutes les solutions étalons préparées pour le projet de la mélamine.

UPLC :

Ultra Performance Chromatography ^MD.

3.0 Appareillage et fournitures

3.1 Appareillage

• 3.1.1 Centrifugeuse: Centrifugeuse réfrigérée; Eppendorf, modèle 5804R et/ou 5810R.
• 3.1.2 Agitateur rotatif: Roto-torque, modèle 7637 Cole Palmer.
• 3.1.3 Agitateur-mélangeur vortex: Vortex 2 Genie, Scientific Industries.
• 3.1.4 Collecteur EPS: Collecteur à vide pour l'extraction en phase solide à 12 emplacements avec robinet pour fixation sous vide.
• 3.1.5 Générateur d'azote liquide de laboratoire; Parker Analytical Gas System, modèle 75-880.
• 3.1.6 Évaporateur d'azote : Organomation, The Myer N-Evap.
• 3.1.7 Sonicateur Branson, modèle 5210 ou l'équivalent.
• 3.1.8 Système Acquity UPLC; Waters.
• 3.1.9 Diverses pipettes à volume variable de 10 à 5000μL à canal simple; VWR.
• 3.1.10 Balance à plateau supérieur, modèle TS4KD, Ohaus ou l'équivalent.
• 3.1.11 Balance de précision, modèle AE 200, Mettler Toledo ou l'équivalent.
• 3.1.12 Spectromètre de masse en tandem, Waters: SM/SM à triple quadrupôle; Manchester, R.-U.
• 3.1.12.1 Logiciel Masslynx 4.1; Manchester, R.-U.
• 3.1.12.2 Mode d'ionisation: électronébulisation d'ions positifs.

3.2 Matériel

• 3.2.1 Verrerie et contenants de laboratoire : Béchers, fioles jaugées de classe A, tubes à culture et flacons d'entreposage recouverts de Teflon.
• 3.2.2 Embouts de polypropylène jetables pour pipettes (3.1.8).
• 3.2.3 Pipettes Pasteur.
• 3.2.4 Scoopula.
• 3.2.5 Tubes à centrifuger: tubes coniques de propylène de 50 ml; Corning, 50ml, n° de cat. 05-538-55A, Fisher.
• 3.2.6 Tubes à centrifuger: tubes coniques de propylène de 15ml; Corning, 15ml, n° de cat. 05-538-55A, Fisher.
• 3.2.7 Cartouches EPS échangeuses de cations; Oasis MCX de 6 cc, 150 mg, 30µm; n° de cat. 186 000 256, Waters.
• 3.2.8 Disques filtrants pour seringue Acrodisc de nylon, pores de 0,2 µm x 13 mm; Pall, Life Science, n° de cat. 28143-985, VWR.
• 3.2.9 Seringues jetables: Seringue à tuberculine BD de 1ml avec embout coulissant (pour les filtres); n° de cat. BD309602, VWR.
• 3.2.10 Plateau de balance.
• 3.2.11 Flacons d'échantillonnage automatique: Flacons DP ambrés de 2ml, 12 x 32mm avec capuchon vissé Target DP bleu avec septum, n° de cat. C58002 W/C580053B, Chromatographic Specialties.
• 3.2.12 Tubes à culture jetables de 10ml.
• 3.2.13 Filtres à solvant CLPH: pores de 0,20µm x 47 mm, de nylon 66; Supelco Inc., Bellefonte, PA.
• 3.2.14 Colonne HILIC: Colonne Acquity UPLC BEH HILIC de 2,1 x 100mm, 1,7µm; Waters, pièce n° 186003461.
• 3.2.15 Pipettes de transfert en polyéthylène jetables.

3.3 Substances chimiques

• 3.3.1 Acide chlorhydrique (37,4%, de qualité réactif ACS, Sigma).
• 3.3.2 Dichlorométhane (ultra pur, OmniSolv, EMD).
• 3.3.3 Méthanol (ultra pur; OmniSolv, EMD).
• 3.3.4 Hydroxyde d'ammonium (30%, Baker).
• 3.3.5 Acétonitrile (ultra pur; OmniSolv, EMD).
• 3.3.6 Mélamine pure à 99%, 5g de cristaux; Sigma Aldrich, n° de cat. 240818.
• 3.3.7 Mélamine pure à 98%. Solution étalon de 100µg/ml; Cambridge Isotope Laboratories (CIL), n° de cat. ULM-8156-1.2.
• 3.3.8 Mélamine-¹⁵N₃,¹³C₃. ¹⁵N₃ pure à 98%; ¹³C₃ pure à 99%. Solution étalon de 100µg/ml; Cambridge Isotope Laboratories (CIL), n° de cat. ULM-8150-1.2. À utiliser comme étalon interne de rendement.
• 3.3.9 Mélamine-¹³C₃. ¹³C₃ pure à 99%. Obtenue par synthèse conformément à la méthode décrite dans Preparation of [¹³C₃]-melamine and [¹³C₃]-cyanuric acid and their application to the analysis of melamine and cyanuric acid in meat and pet food using liquid chromatography-tandem mass spectrometry, Varelis et al. 2008, Food Additives and Contaminants 10:1210-1217. À utiliser comme étalon interne de récupération.
• 3.3.10 Gaz de désolvatation et gaz du cône: Azote: Fourni par un générateur d'azote de laboratoire (Parker Analytical Gas System, modèle n° 75-880).
• 3.3.11 Gaz de collision: Argon ultra pur.
• 3.3.12 Azote gazeux ultra pur.
• 3.3.13 Formiate d'ammonium; Sigma, n° de cat. F-2004.
• 3.3.14 Acide formique concentré > 96%, de qualité réactif ACS; Sigma, n° de cat. 251364-500G).
• 3.3.15 Eau de qualité CPL-SM; OmniSolv, EMD Chem. Inc.
• 3.3.16 Eau Milli-Q.

3.4 Solutions

• 3.4.1 Solution d'acide chlorhydrique 1,0 N pour l'extraction de l'échantillon.
  • 3.4.1.1 En employant un cylindre gradué de 100ml, mesurer 83,0ml d'acide chlorhydrique concentré; transvider dans une fiole jaugée de 1l qui contient environ 500ml d'eau Milli-Q.
  • 3.4.1.2 Remplir au trait avec de l'eau Milli-Q et mélanger la solution.
  • 3.4.1.3 Étiqueter la fiole en indiquant le nom de la solution (HCl 1N) et la date de préparation. Entreposer à la température ambiante. Dans ces conditions, la solution peut être utilisée jusqu'à un an après sa préparation.
• 3.4.2 Solution de lavage EPS d'acide chlorhydrique 1,0 N.
  • 3.4.2.1 En employant un cylindre gradué de 100ml, mesurer 100,0ml d'acide chlorhydrique (préparé à 3.4.1); transvider dans une fiole jaugée de 1l qui contient environ 500ml d'eau Milli-Q.
  • 3.4.2.1 Remplir au trait avec de l'eau Milli-Q et mélanger la solution.
  • 3.4.2.2 Étiqueter la fiole en indiquant le nom de la solution (HCl 0,1 N) et la date de préparation. Entreposer à la température ambiante. Dans ces conditions, la solution peut être utilisée jusqu'à un an après sa préparation.
• 3.4.3 Solution d'élution EPS, NH₄OH 5% dans du MeOH (vol/vol).
  • 3.4.3.1 En employant un cylindre gradué de 100ml, mesurer 50ml de NH₄OH (30%); transvider dans un erlenmeyer de 1l qui contient 500ml de MeOH.
  • 3.4.3.2 Ajouter 450ml supplémentaires de MeOH et mélanger la solution.
  • 3.4.3.3 Étiqueter la fiole en indiquant le nom de la solution (NH₄OH 5% dans du MeOH [vol/vol]) et la date de préparation. Entreposer à la température ambiante. Dans ces conditions, la solution peut être utilisée jusqu'à un mois après sa préparation.
• 3.4.4 Solution de reconstitution, ACN:H₂O 90:10 (vol/vol).
  • 3.4.4.1 En employant un cylindre gradué de 500ml, mesurer 500ml, puis 400ml d'ACN (900ml au total); transvider dans un erlenmeyer de 1l.
  • 3.4.4.2 Ajouter 100ml d'eau Milli-Q et mélanger la solution.
  • 3.4.4.3 Étiqueter la fiole en indiquant le nom de la solution (ACN:H₂O 90:10 [vol/vol]) et la date de préparation. Entreposer à la température ambiante. Dans ces conditions, la solution peut être utilisée jusqu'à un mois.
• 3.4.5 Solution étalon interne; 500 pg/µl *MEL dans de l'ACN:H₂O; 90:10 (vol/vol).
  • 3.4.5.1 En employant une pipette à volume variable 2-20 µl, transvider 7,5µl de *MEL de 100µg/ml (solution Cambridge décrite à 3.3.8) dans une fiole de 2ml.
  • 3.4.5.2 Ajouter 1350,0µl d'ACN et 142,5µl d'eau Milli-Q à la fiole en utilisant des pipettes à volume variable de 100-1000 µl et de 20-200µl.
  • 3.4.5.3 Placer le capuchon vissé sur la fiole, mélanger la solution. Cette solution peut être entreposée à la température ambiante ou elle peut être réfrigérée. La solution peut être utilisée jusqu'à un mois après sa préparation.
• 3.4.6 Solution mère étalon interne de récupération; 100µg/µl *MEL dans de l'ACN:H₂O; 90:10 (vol/vol).
  • 3.4.6.1 À l'aide d'une balance analytique, peser précisément 1,00mg de cristaux de MEL-¹³C₃ (obtenue par synthèse en laboratoire, voir 3.3.9) dans une fiole jaugée de 10ml.
  • 3.4.6.2 Ajouter environ 9ml d'eau Milli-Q.
  • 3.4.6.3 Traiter dans le sonicateur pendant environ 30 minutes ou jusqu'à ce que les cristaux soient entièrement dissouts.
  • 3.4.6.4 Remplir au trait avec de l'eau Milli-Q et mélanger la solution.
  • 3.4.6.5 Cette solution peut être entreposée à la température ambiante ou elle peut être réfrigérée. La solution peut être utilisée jusqu'à 6 mois après sa préparation.
  • Remarque: Cette MEL-¹³C₃ n'est pas pure. Ainsi, les concentrations calculées sont fondées sur le poids du produit, contrairement à la MEL-¹³C₃ pure.
• 3.4.7 Solution étalon interne intermédiaire de récupération; 500pg/µl MEL-¹³C₃ dans de l'ACN:H₂O; 90:10 (vol/vol).
  • 3.4.7.1 En employant une pipette à volume variable de 10-100 µl, transvider 50µl de la solution mère étalon interne de récupération préparée à 3.4.6 dans une fiole jaugée de 10ml.
  • 3.4.7.2 Remplir au trait avec de l'ACN:H₂O; 90:10 (vol/vol) (voir 3.4.4) et mélanger la solution.
  • 3.4.7.3 Cette solution peut être entreposée à la température ambiante ou elle peut être réfrigérée. La solution peut être utilisée jusqu'à un mois.
• 3.4.8 Mélamine (native); 10µg/ml de la solution intermédiaire dans de l'ACN:H₂O; 90:10 (vol/vol).
  • 3.4.8.1 En employant une pipette à volume variable de 10-100 µl, transvider 100 µl de solution mère de mélamine achetée chez CIL (voir 3.3.7) dans un flacon auto-échantillonneur de 2 ml.
  • 3.4.8.2 En employant une pipette à volume variable de 100-1000 µl, ajouter 900µl d'ACN au flacon.
  • 3.4.8.3 Placer le capuchon vissé sur le flacon, mélanger la solution. Cette solution peut être entreposée à la température ambiante ou elle peut être réfrigérée. La solution peut être utilisée jusqu'à un mois.
• 3.4.9 Mélamine (native); 1µg/ml de la solution intermédiaire dans de l'ACN:H₂O; 90:10 (vol/vol).
  • 3.4.9.1 En employant une pipette à volume variable de 2-20 µl, transvider 10 µl de solution mère de mélamine achetée chez CIL (voir 3.3.7) dans un flacon auto-échantillonneur de 2 ml.
  • 3.4.9.2 En employant une pipette à volume variable 10-100 µl, ajouter 90µl d'eau Milli-Q.
  • 3.4.9.3 En employant une pipette à volume variable 100-1000 µl, ajouter 900µl d'ACN.
  • 3.4.9.4 Placer le capuchon vissé sur le flacon, mélanger la solution. Cette solution peut être entreposée à la température ambiante ou elle peut être réfrigérée. La solution peut être utilisée jusqu'à un mois.
• 3.4.10 Mélamine (native); 0,02µg/ml de la solution intermédiaire dans de l'ACN:H₂O; 90:10 (vol/vol).
  • 3.4.10.1 En employant une pipette à volume variable 2-20 µl, prélever 20µl de solution intermédiaire de mélamine 1µg/ml préparée à 3.4.9 et vider la pipette dans un flacon auto-échantillonneur de 2ml.
  • 3.4.10.2 En employant une pipette à volume variable de 100-1000 µl, ajouter 980µl d'ACN:H₂O; 90:10 (vol/vol) au flacon.
  • 3.4.10.3 Placer le capuchon vissé sur le flacon, mélanger la solution. Cette solution peut être entreposée à la température ambiante ou elle peut être réfrigérée. La solution peut être utilisée jusqu'à un mois après sa préparation.
• 3.4.11 Courbe d'étalonnage pour les solutions de mélamine (le volume définitif de toutes les solutions de la courbe d'étalonnage est de 10ml).
• 3.4.12 Solution mère de mélamine (native) de 1,26g/L dans H₂O.
  • 3.4.12.1 À l'aide de la balance analytique, peser précisément 0,63g de cristaux de mélamine native (achetée chez Sigma-Aldrich, voir 3.3.6) sur un plateau.
  • 3.4.12.2 Transvider les cristaux dans une fiole jaugée de 500ml.
  • 3.4.12.3 Effectuer un transfert quantitatif en ajoutant une petite quantité d'eau Milli-Q au plateau et en transférant le produit du rinçage dans une fiole jaugée de 500ml, répéter à 2 reprises. Ajouter 480ml d'eau Milli-Q et agiter la solution à la main.
  • 3.4.12.4 Traiter dans le sonicateur pendant environ 30 minutes ou jusqu'à ce que les cristaux soient entièrement dissouts. Remplir au trait avec de l'eau Milli-Q.
  • 3.4.12.5 Cette solution peut être entreposée à la température ambiante ou elle peut être réfrigérée. La solution peut être utilisée jusqu'à 6 mois après sa préparation.
• 3.4.13 Solution intermédiaire de mélamine (native) de 12,6µg/L dans H₂O.
  • 3.4.13.1 En employant une pipette à volume variable de 100-1000 µl, prélever 1,0ml de la solution de 1,26g/L préparée à 3.4.12 et vider la pipette dans une fiole jaugée de 100 ml.
  • 3.4.13.2 Remplir au trait avec de l'eau Milli-Q et mélanger la solution.
  • 3.4.13.3 Cette solution peut être entreposée à la température ambiante ou elle peut être réfrigérée. La solution peut être utilisée jusqu'à 6 mois après sa préparation.
• 3.4.14 Mélamine (native); solution de 1,26µg/ml diluée dans de l'ACN:H₂O 90:10 (vol/vol).
  • 3.4.14.1 En employant une pipette à volume variable de 10-100 µl, prélever 100µl de solution de 12,6µg/ml préparée à 3.4.13 et vider la pipette dans un flacon auto-échantillonneur de 2 ml.
  • 3.4.14.2 Ajouter 900µl d'ACN, placer le capuchon vissé et mélanger la solution.
  • 3.4.14.3 Cette solution peut être entreposée à la température ambiante ou elle peut être réfrigérée. La solution peut être utilisée jusqu'à un mois après sa préparation.
• 3.4.15 Étalon QC de contrôle d'étalonnage:

  MEL de 50pg/µl, *MEL de 5pg/µl et MEL-¹³C₃ de 50pg/µl dans de l'ANC:H₂O 90:10 (vol/vol) préparée dans un flacon auto-échantillonneur de 2,0 ml.

  Cette solution peut être entreposée à la température ambiante ou elle peut être réfrigérée. Cette solution a été fraîchement préparée pour chaque lot analysé.
• 3.4.16 Solution mère de formiate d'ammonium 1 M: Dissoudre 63,06g de formiate d'ammonium dans 1l d'eau de qualité CPL-SM. Entreposer à la température ambiante. Dans ces conditions, la solution peut être utilisée jusqu'à un an après sa préparation.
• 3.4.17 Phases mobiles UPLC.
  • 3.4.17.1 Phase mobile A: solution aqueuse de formiate d'ammonium de 0,5mm et d'acide formique à 0,01% (vol/vol):
  • Ajouter 500µl de solution aqueuse de formiate d'ammonium, 1 M, (voir 3.4.16) et 100µl d'acide formique dans 1 litre d'eau de qualité CPL-SM.
  • 3.4.17.2 Phase mobile B: Acide formique 0,01% (vol/vol) dans l'acétonitrile:
    
    Ajouter 100µl d'acide formique concentré à 1l d'acétonitrile.

4.0 Santé et sécurité

Pendant le traitement et l'analyse des échantillons, les vêtements de protection et une protection des yeux standard en laboratoire sont requis.

5.0 Responsabilités

L'analyste est responsable de préparer les échantillons de mélamine conformément à ces directives de travail.

6.0 Méthode

Cette méthode a été adapté de la méthode d'analyse décrite dans Determination and confirmation of melamine residues in catfish, trout, tilapia, salmon, and shrimp by liquid chromatography with tandem mass spectrometry Andersen et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008, 56(12):4340-4347.

6.1 Échantillonnage

Un plan d'échantillonnage a été établi pour faire en sorte d'obtenir un portrait réel de la disponibilité ou de la consommation des produits au sein de la population canadienne. Le plan d'échantillonnage doit être accompagné de tous les renseignements requis conformément au mode opératoire normalisé.

6.2 Lavage de la verrerie

Généralement, la verrerie employée est jetable et ne requiert aucun lavage. Cependant, lorsque certains articles de verrerie l'exigent (p. ex., les fioles jaugées), ils doivent être lavés conformément à la méthode suivante:

• 6.2.1 Utiliser de l'eau chaude du robinet et le détergent de laboratoire pour le lavage manuel de la verrerie.
• 6.2.2 Laver la verrerie en la brossant manuellement à l'aide d'une brosse de nettoyage de laboratoire.
• 6.2.3 Rincer à fond toute la verrerie à l'eau chaude du robinet, puis à trois reprises avec de l'eau distillée.
• 6.2.4 Rincer la verrerie à l'éthanol et la laisser sécher à l'air.

6.3 Préparation de l'échantillon

• 6.3.1 Peser environ 5,00g de l'échantillon; les transvider dans un tube Falcon de 50ml (3.2.5) à l'aide d'une pipette Pasteur ou d'une pipette de transfert jetable de polyéthylène pour les échantillons liquides ou avec une spatule Scoopula pour les échantillons solides.
• Remarque: Veiller à ce que les échantillons CQ soient compris dans le lot analysé (voir 8.1).
• 6.3.2 Inscrire la masse précise dans le Carnet personnel de laboratoire.
• 6.3.3 Ajouter 25µl de solution mère interne de récupération de 100μg/ml (voir 3.4.6) à tous les échantillons, y compris aux blancs de réactif.
• 6.3.4 Laisser reposer tous les échantillons solides pendant une heure. Laisser reposer tous les échantillons liquides pendant 30 minutes.

6.4 Extraction des échantillons

• 6.4.4 En employant un cylindre gradué de 25ml, ajouter 24,0ml d'eau Milli-Q à chacun des échantillons et des blancs.
• 6.4.5 Employer une pipette à volume variable de 10-1000μl pour ajouter précisément 1,0ml de HCl 1 N.
• 6.4.6 Visser le capuchon solidement, agiter à la main, puis mélanger tous les échantillons et les blancs dans un agitateur-mélangeur vortex pendant 5 secondes.
• 6.4.7 Mélanger tous les échantillons et les blancs dans l'agitateur rotateur pendant dix minutes en le réglant à 5 (équivalent à 50 rpm).
• 6.4.8 Centrifuger tous les échantillons et les blancs pendant 10 minutes à 3200 - 5500g à 4°C.
• 6.4.9 En employant une pipette à volume variable de 500-5000μl, prélever une aliquote de 5,00ml de surnageant. Éviter de prélever toute matière solide.
• 6.4.10 Transvider l'aliquote de 5,00ml dans un tube à centrifuger de polypropylène de 15ml.
• 6.4.11 En employant une pipette, ajouter 10ml de DCM à l'aliquote de 5,00ml.
• 6.4.12 Visser le capuchon solidement, puis agiter tous les échantillons et les blancs à la main.
• 6.4.13 Mélanger tous les échantillons et les blancs dans l'agitateur rotateur pendant dix minutes en le réglant à 5 (équivalent à 50 rpm).
• 6.4.14 Centrifuger tous les échantillons et les blancs pendant 10 minutes à 3200 - 5500g à 4°C.
• 6.4.15 En employant une pipette Pasteur ou une pipette de transfert de polyéthylène jetable, retirer entièrement la couche aqueuse supérieure.
• 6.4.16 Placer la couche aqueuse recueillie dans un tube de verre de 10ml.
• 6.4.17 En employant une pipette à volume variable de 500-5000 μl, ajouter 2,50ml d'eau Milli-Q au DCM restant et extraire à nouveau en répétant les étapes 6.4.12 à 6.6.14.
• 6.4.18 En employant une pipette Pasteur ou une pipette de transfert de polyéthylène jetable, retirer entièrement la couche aqueuse (c.-à-d., la couche supérieure) et combiner avec la couche aqueuse de 5,00ml précédente obtenue à 6.4.16. Garder la pipette pour transvider l'extrait sur la cartouche EPS pour l'extraction en phase solide.
  
  Remarque: À cette étape, les échantillons et les blancs peuvent être placés dans le réfrigérateur à 4°C et y demeurer jusqu'au lendemain.

6.5 Purification de l'échantillon

• 6.5.1 Conditionner chaque cartouche EPS Oasis MCX.
  • 6.5.1.1 En employant une pipette, appliquer 5,0ml de MeOH à la cartouche pour l'extraction en phase solide. Laisser s'écouler par gravité seulement. Ne pas laisser sécher la cartouche.
  • 6.5.1.2 En employant une pipette, ajouter 5,0ml de H₂O à la cartouche pour l'extraction en phase solide. Laisser s'écouler par gravité seulement. Ne pas laisser sécher la cartouche.
  • 6.5.2 En employant une pipette Pasteur ou une pipette de transfert jetable de polyéthylène, ajouter l'échantillon entier ou l'extrait de l'échantillon ou de blanc sur la cartouche pour extraction en phase solide. Laisser s'écouler par gravité seulement. Ne pas laisser sécher la cartouche.
    
    Remarque: Avant d'effectuer cette étape, l'échantillon doit avoir atteint la température ambiante.
• 6.5.3 Une fois l'extrait de l'échantillon ou de blanc complètement chargé, laver la cartouche pour extraction en phase solide.
  • 6.5.3.1 En employant une pipette, ajouter 5,0ml de HCl 1 N à chaque tube de verre d'échantillon et transvider sur la cartouche pour l'extraction en phase solide. Laisser s'écouler par gravité seulement. Ne pas laisser sécher la cartouche.
  • 6.5.3.2 En employant une pipette, ajouter 2,0ml de MeOH à la cartouche pour l'extraction en phase solide. Laisser s'écouler par gravité seulement.
• 6.5.4 Sécher la cartouche en y propulsant de l'air, en employant une seringue jetable vide et un adaptateur.
• 6.5.5 Éluer la cartouche pour extraction en phase solide avec 5,0ml de NH₄OH (dans le MeOH 5% vol/vol). Recueillir chaque échantillon dans un tube de verre de 10ml.
• 6.5.6 Répéter l'étape de séchage (6.5.4).

6.6 Préparation de l'extrait pour l'analyse CPL/SM/SM

• 6.6.1 Évaporer à sec sous azote l'éluat dans un bain d'eau à 55°C.
• 6.6.2 En employant une pipette à volume variable de 100-1000 μL, reconstituer l'extrait sec dans 1,0ml d'ACN:H₂O 90:10 (vol/vol).
• 6.6.3 Mélanger tous les échantillons et les blancs dans un agitateur-mélangeur vortex pendant 5 secondes (à faible intensité).
• 6.6.4 En employant une seringue jetable, filtrer la solution dans un flacon d'auto-échantillonneur à travers un disque filtrant dont la taille des pores est de 0,2μm.
• 6.6.5 En employant une pipette à volume variable de 10-100 µl, prélever une aliquote de 100μL d'extrait filtré et la transvider dans un flacon d'auto-échantillonneur.
• 6.6.6 En employant une pipette à volume variable de 2-20μl de la solution 500pg/μl préparée à 3.4.5 de façon à ce que la concentration définitive de *MEL égale 5pg/μl une fois préparée au volume définitif (6.6.7).
• 6.6.7 En employant une pipette à volume variable de100-1000 μl, ajouter 890 μl d'ACN:H₂O 90:10 (vol/vol) de façon à ce que le volume définitif de tous les extraits atteignent 1,00 ml.
• 6.6.8 Visser le capuchon solidement et mélanger tous les échantillons et les blancs dans un agitateur-mélangeur vortex pendant 5 secondes.
• 6.6.9 Afin d'éviter les difficultés au chapitre de la solubilité de la MEL, les échantillons et les blancs sont entreposés à la température ambiante, et ce, jusqu'à l'analyse CPL-SM/SM.

6.7 Analyse de l'échantillon par CPL-SM-SM

• 6.7.1 Conditions et réglage de l'UPLC
  • 6.7.1.1 État de l'UPLC
    • Composition de la phase mobile (voir 3.4.17):
      
      Phase mobile A: 0,5 mM de formiate d'ammonium et de l'acide formique 0,01% dans l'eau.
      
      Phase mobile B: 0,01% d'acide formique dans de l'actonitrile.
  • Colonne UPLC: Acquity UPLC BEH HILIC, 2,1 x 100 mm, particules de 1,7μm (Waters)
  • Débit: 0,17ml/min
  • Volume d'injection: 5,0µl
  • Température de la colonne: 28°C
  • Température du plateau de l'auto-échantillonneur: 20°C
  • Temps d'élution de la mélamine: Environ 5,2 minutes
  • Gradient:
  • 6.7.1.2 Réglages de la SM/SM
    • Mode d'ionisation: ESI (mode positif)
    • Tension du capillaire: 3,5kV
    • Tension du cône: 30 V
    • Température de la source: 120°C
    • Température de désolvatation: 400°C
    • Débit de gaz (N₂) du cône: 50l/h
    • Débit de gaz (N₂) de désolvatation: 900l/h
    • Pression de gaz (Ar) de collision: 9,8 x 10-3 mb (0,5ml/min)
    • Énergies ioniques pour les deux analyseurs quadruples: 0,3 V
    • Résolution: Résolution de l'unité de base pour les deux analyseurs quadruples
    • Tension du multiplicateur 650 V
    • État du suivi de réactions multiples:
  • 6.7.2 Les transitions utilisées pour le dosage de la mélamine en mode de suivi de réactions multiples.
    • 6.7.2.1 Transition d'analyse quantitative pour la MEL : m/z 127 -> m/z 85; transition primaire pour la MEL.
    • 6.7.2.2 Transition de confirmation pour la MEL : m/z 127 -> m/z 68.
    • 6.7.2.3 Transition de confirmation secondaire pour la MEL : m/z 127 -> m/z 43.
    • 6.7.2.4 Transition d'analyse quantitative pour la *MEL : m/z 133 -> m/z 89; transition primaire pour la *MEL.
    • 6.7.2.5 Transition de confirmation pour la *MEL : m/z 133 -> m/z 45.
    • 6.7.2.6 Transition d'analyse quantitative pour la MEL-¹³C : m/z 130 -> m/z 87; transition primaire pour la MEL-¹³C.
    • 6.7.2.7 Transition de confirmation pour la MEL-¹³C : m/z 130 -> m/z 44.

6.8 Analyse des données

• 6.8.1 Critères pour l'analyse quantitative.
  • 6.8.1.1 Rapport entre la hauteur du pic pour la transition d'analyse quantitative et la hauteur du pic de la transition de confirmation pour les paires de transition pour la MEL et la *MEL doivent demeurer dans les tolérances prescrites du rapport des moyennes de tous les échantillons de travail pour chaque série d'analyses.
  • 6.8.1.1.1 Si, dans l'extrait, la concentration de la MEL est = 10 pg/ml, la tolérance est de ± 20% du rapport des moyennes pour les étalons.
  • 6.8.1.1.2 Si, dans l'extrait, la concentration de la MEL est < 10 pg/ml, la tolérance est de ± 25% du rapport des moyennes pour les étalons.
  • 6.8.1.2 Le temps de rétention pour la MEL et la *MEL dans tous les échantillons et les blancs ne doit pas excéder 0,3 minute du temps de rétention moyen pour la MEL et la *MEL des étalons d'étalonnage. Le temps de rétention pour la MEL et la *MEL dans un échantillon ne doit pas différer de plus de 0,05 minute.
  • 6.8.1.3 Chaque pic doit avoir un rapport signal sur bruit plus élevé que 9 à 1.
  • 6.8.1.4 Le coefficient de corrélation de la courbe d'étalonnage pour la transition d'analyse quantitative de la MEL native associée à chaque lot d'échantillons analysé doit être = 0,99.
  • 6.8.2 Courbe d'étalonnage
  • 6.8.2.1 Toutes les courbes d'étalonnage ont été établies à l'aide du logiciel TargetLynx (en tandem avec MassLynx 4.1).
  • 6.8.2.2 Le facteur de réponse de la MEL a été calculé comme rapport entre la hauteur du pic de la transition d'analyse quantitative pour la MEL (6.7.2.1) et la hauteur du pic de la transition d'analyse quantitative pour la *MEL (6.7.2.4).
  • 6.8.2.3 Une courbe d'étalonnage basée sur sept concentrations a été conçue en utilisant les solutions étalons suivantes: 0,10, 0,50, 1,0, 5,0, 10, 50, et 100pg/µl MEL (voir 3.4.11). Une courbe linéaire pondérée 1/X a été utilisée pour exprimer graphiquement le facteur de réponse de la MEL versus la concentration en MEL dans les solutions-étalons.
  • 6.8.3 Analyse des données sur les échantillons et les blancs.
  • 6.8.3.1 Les facteurs de réponse pour la MEL ont été calculés en ayant recours au logiciel TargetLynx tel que décrit à 6.8.2.2.
  • 6.8.3.2 Les concentrations (pg/µl) de MEL des extraits d'échantillons et de blancs ont été calculées à l'aide de TargetLynx en employant l'équation de courbe de calibration générée à 6.8.2.3.
  • 6.8.3.3 Les concentrations (échantillon ng/g) de MEL dans les extraits d'échantillons et de blancs ont été calculées à l'aide d'Excel de Microsoft sur la base de l'équation suivante:

    ***SI L'ÉCHANTILLON EST SOLIDE (p. ex., échantillon de lait en poudre)

    où:

    MEL _échantillon - concentration de MEL dans un échantillon en ng/g.
    
    MEL _extrait = concentration de MEL dans l'extrait (calculé à 6.8.3.2) en pg/μL.
    
    Volume _extrait = 1000μL.
    
    FD_{1 (solide)} = premier facteur de dilution = 5 (pour les échantillons solides seulement).
    
    FD₂ = second facteur de dilution - 10.
    
    masse _échantillon = masse de l'échantillon analysé en g.

    ***SI L'ÉCHANTILLON EST LIQUIDE (p. ex., échantillon de lait)

    où:

    MEL _échantillon = concentration de MEL dans un échantillon en ng/g.

    MEL _extrait = concentration de MEL dans l'extrait (calculé à 6.8.3.2) en pg/μL.

    Volume _extrait = 1000μL.

    FD_{1 (liquide)} = premier facteur de dilution = 6 (pour les échantillons liquides seulement).

    FD₂ = second facteur de dilution = 10.

    masse _échantillon = masse de l'échantillon analysé en g.
  • 6.8.3.4 Les concentrations de MEL dans les blancs ont été calculées sur une base de ng/g en tenant pour acquis que 5 g de l'échantillon est équivalent.
  • 6.8.3.5 Les concentrations corrigées (échantillon ng/g) de MEL dans les échantillons ont été calculées à l'aide d'Excel de Microsoft sur la base de l'équation suivante:

    où:

    MEL _échantillon = concentration de MEL dans un échantillon en ng/g.

    MEL _blanc = concentration de MEL dans un blanc de réactif en ng/g.

    (Tous deux calculés à 6.8.3.3.)
  • 6.8.4 Calcul de la récupération.
    • 6.8.4.1 ***SI L'ÉCHANTILLON EST SOLIDE (p. ex., échantillon de lait en poudre)

      Les concentrations (pg/µl) en MEL-¹³C des extraits d'échantillons et de blancs ont été calculées à l'aide de TargetLynx en employant l'équation de courbe de calibration générée à 6.8.2.3.

      Les pourcentages de récupération de l'étalon interne de récupération sont calculés à l'aide d'Excel de Microsoft sur la base de l'équation suivante:

      où:

      MEL-¹³C _{récupération} = % de récupération de l'étalon interne de récupération dans l'échantillon.

      MEL-¹³C _échantillon = concentration de l'étalon interne de récupération dans l'extrait d'échantillon

      MEL-¹³C _échantillon moyenne = concentration moyenne de l'étalon interne de récupération dans toute la série d'étalons d'étalonnage dans l'analyse d'un lot particulier.
    • 6.8.4.2 ***SI L'ÉCHANTILLON EST LIQUIDE (p. ex., échantillon de lait)

      Les concentrations (pg/µl) en MEL-¹³C des extraits d'échantillons et de blancs ont été calculées à l'aide de TargetLynx en employant l'équation de courbe de calibration générée à 6.8.2.2.

      Les pourcentages de récupération de l'étalon interne de récupération sont calculés à l'aide d'Excel de Microsoft sur la base de l'équation suivante:

      * 1,2

      où:

      MEL-¹³C _{récupération} = % de récupération de l'étalon interne de récupération dans l'échantillon.

      MEL-¹³C _échantillon = concentration de l'étalon interne de récupération dans l'extrait d'échantillon

      MEL-¹³C _échantillon moyenne = concentration moyenne de l'étalon interne de récupération dans toute la série d'étalons d'étalonnage dans l'analyse d'un lot particulier.

      *1,2 = facteur considéré en raison de la dilution supérieure des échantillons liquides.

7.0 Consignation

• 7.1 Tous les renseignements au sujet de la préparation des échantillons et des étalons, de l'état des instruments, des calculs, etc. doivent être consignés dans le Carnet personnel de laboratoire.
• 7.2 Tous les étalons de mélamine préparés seront décrits dans le classeur des solutions.

8.0 Assurance et contrôle de la qualité

• 8.1 Les mesures de CQ suivantes sont prises au cours de l'analyse des échantillons: *Si les critères d'acceptabilité ne sont pas respectés, la mesure corrective appropriée doit être mise en oeuvre.
• 8.2 Échantillon en duplicata:

  La différence relative en pourcentage des mesures des duplicatas mesurés de MEL dans l'échantillon (ng/g) doit être inférieure à 20 %. Calculer cette différence comme suit:

  où:

  DRP = différence relative en pourcentage.

  MEL _{échantillon corr.} = concentration corrigée du blanc de MEL dans l'échantillon.

  MEL _{duplicata corr.} = concentration corrigée du blanc de MEL dans le duplicata.
• 8.3 Échantillons de CQ de préparation
• Des échantillons de CQ supplémentaires sont sélectionnés pour assurer le suivi de l'exactitude et de la précision:
  • On choisit une préparation liquide de CQ dont la concentration en mélamine est > la limite de l'analyse quantitative. La même préparation liquide est utilisée à titre d'échantillon liquide de CQ tout au long de l'étude.
  • On choisit une préparation en poudre de CQ dont la concentration en mélamine est > la limite de l'analyse quantitative à titre de CQ lorsque l'on analyse un lot d'échantillons en poudre (solides). La même préparation liquide est utilisée à titre d'échantillon en poudre de CQ tout au long de l'étude.