Dosage du benzo[a]pyrène dans le tabac entier : T-307

1.1

La présente méthode s'applique au dosage du benzo[a]pyrène (B[a]P) dans le tabac entier par chromatographie liquide haute performance (CLHP) avec détection en fluorescence.

2.1

Méthode officielle de Santé Canada T-115, Dosage du goudron, de l'eau, de la nicotine et du monoxyde de carbone dans la fumée principale de tabac, 2016.

2.2

Méthode officielle T-402 de Santé Canada. Préparation de cigarettes, de bâtonnets de tabac, de tabac à cigarette, de cigares, de petits cigares, de kreteks, de bidis, de tabac en feuille, de tabac à pipe ou de tabac sans fumée aux fins d'essais, 2016.

2.3

Organisation internationale de normalisation, ISO 8243, Cigarettes – Échantillonnage, 2013.

2.4

Organisation internationale de normalisation, ISO 15592-1, Tabac à rouler et objets confectionnés à partir de ce type de tabac – Méthodes d'échantillonnage, de conditionnement et d'analyse – Partie 1 : Échantillonnage, 2001.

2.5

AOAC INTERNAIONAL, méthode officielle 973.30, Polycyclic Aromatic Hydrocarbons and Benzo[a]pyrene in Food - Spectrophotometric Method, Official Methods of Analysis of AOAC INTERNATIONAL, 20^ème édition, 2016.

3.1

Pour une définition des termes utilisés dans le présent document, se reporter à la méthode T-301.

4.1

La présente méthode est une modification de la méthode officielle 973.30 de l'AOAC, intitulée « Polycyclic Aromatic Hydrocarbons and Benzo[a]pyrene in Food - Spectrophotometric Method ». La taille de l'échantillon et le volume des réactifs utilisés sont adaptés aux exigences analytiques, à la quantité d'échantillon et à la disponibilité de l'équipement.

4.2

Les hydrocarbures aromatiques polycycliques sont extraits après saponification de l'échantillon de tabac broyé avec une solution alcoolique de KOH et fractionnement à l'isooctane. L'extrait est ensuite complètement asséché, puis redissous dans l'isooctane. Cette dernière solution est passée sur une cartouche de florisil et lavée avec de l'isooctane. Le B[a]P est élué avec du benzène, évaporé jusqu'à siccité, puis redissous dans de l'acétonitrile. L'échantillon est alors dosé par chromatographie liquide en phase inversée avec détection par fluorescence.

4.3

Quelques matrices peuvent s'avérer trop complexes pour permettre un dosage précis par cette méthode de nettoyage par extraction. Ces types d'échantillons peuvent nécessiter un nettoyage sur CLHP, par chromatographie en phase normale sur une colonne de silice, permettant de récupérer la fraction renfermant le B[a]P. Cette fraction est alors concentrée, puis analysée par CLHP en phase inversée.

5.1

Unité de préparation par extraction en phase solide (EPS), ou l'équivalent.

5.2

Condensateur, de type Friedrich.

5.3

Bouteille d'argon avec manifold pour la purge des flacons lors de la saponification, ou l'équivalent.

5.4

Pipettes en verre, de 2 à 50 mL.

5.5

Micropipette, de 1000 µL, ou l'équivalent.

5.6

Entonnoir en verre.

5.7

Laine de verre.

5.8

Tubes à culture, de 16 × 125 mm (20 mL).

5.9

Ballons de 250 mL ou l'équivalent.

5.10

Ampoules à décanter de 1000 mL ou l'équivalent.

5.11

Turbo-évaporateur Zymark ou l'équivalent.

5.12

Évaporateur rotatif Buchi ou l'équivalent.

5.13

Balance pour analyses, précise à au moins quatre décimales.

5.14

Pipettes Pasteur.

5.15

Filtres pour seringue, de 0,45 µL, en nylon ou l'équivalent.

5.16

Cartouches de Florisil, 1 g × 6 mL, ou l'équivalent.

5.17

Flacons pour échantillonneur automatique, avec bouchons à vis revêtus de téflon.

5.18

Système de gradient pour chromatographie en phase liquide haute performance avec détecteur de fluorescence :

5.18.1

Colonne de CLHP Merck de 250 × 4 mm, RP-18^e, avec garniture de 5 µm, ou l'équivalent.

5.18.2

Colonne de garde Lichrocart 4-4 garnie de Lichrosphere 100 RP-18 « endcapped » de 5 µm, ou l'équivalent.

6.1

Tous les réactifs doivent être, au minimum, de qualité réactif pour analyses.

6.2

Acétonitrile - [75-05-8].

6.3

Argon - [7440-37-1] UHP ou l'équivalent.

6.4

Benzène - [71-43-2].

6.5

Benzo[a]pyrène (B[a]P) - [50-32-8].

6.6

Éthanol - [64-17-5].

6.7

Isooctane - [540-84-1].

6.8

Isopropanol (IPA) - [67-63-0].

6.9

Hydroxyde de potassium - [1310-58-3] 50 % (w/v).

6.10

Chlorure de sodium - [7647-14-5] (en solution saturée).

6.11

Sulfate de sodium anhydre - [7757-82-6].

6.12

Tétrahydrofurane (THF) - [109-99-9].

6.13

Eau de type I, tel que stipulé dans le tableau 1 de la méthode D1193 de l'ASTM, Processes for Reagent Water Production, Note A.

7.1

Laver et sécher la verrerie de manière à assurer qu'il n'y ait aucune contamination.

8.1

Préparation des étalons de travail et des solutions dopées

8.1.1

Solution mère primaire de B[a]P : dissoudre 10 mg de B[a]P solide dans 50 mL d'acétonitrile.

8.1.2

Solution mère secondaire: mettre 100 µl de solution mère primaire dans 50 mL d'acétonitrile.

8.1.3

Étalons de travail :

9.1

L'échantillonnage des cigarettes aux fins de tests doit se faire conformément à la norme ISO 8243.

9.2

L'échantillonnage des kreteks, des petits cigares, des bidis, des bâtonnets de tabac aux fins des tests doit être effectué conformément à la norme ISO 8243, mais modifié en remplaçant le terme cigarettes par kreteks, petits cigares, bidis ou bâtonnets de tabac, pour lesquels le terme carton est équivalent à 200 unités.

9.3

L'échantillonnage des cigares aux fins des tests doit être effectué conformément à la norme ISO 8243, mais modifié en remplaçant le terme cigarettes par cigares, pour lesquels 200 unités de cigarettes est équivalent à 200 grammes de cigare.

9.4

L'échantillonnage du tabac à cigarette aux fins des tests doit être effectué conformément à la norme ISO 15592-1.

9.5

L'échantillonnage des feuilles de tabac, du tabac à pipe et du tabac sans fumée aux fins des tests doit être effectué conformément à la norme ISO 15592-1, mais modifié en remplaçant le terme tabac à rouler par le terme feuilles de tabac, tabac à pipe ou tabac sans fumée.

10.1

La préparation des produits de tabac aux fins de tests doit se faire conformément à la méthode T-402.

11.1

Extraction - Saponification

11.1.1

Peser avec précision 2 g de tabac préparé dans un ballon de 250 mL.

11.1.2

Ajouter 60 mL d'éthanol.

11.1.3

Ajouter 4,5 mL de solution de KOH.

11.1.4

Purger le ballon avec de l'argon.

11.1.5

Mettre en place un système de reflux, de telle manière qu'il soit continuellement purgé avec un faible débit d'argon.

11.1.6

Faire bouillir à gros bouillon au reflux pendant deux heures.

11.1.7

Laisser revenir à la température ambiante tout en continuant de purger avec de l'argon.

11.1.8

Boucher le ballon et le conserver dans le noir jusqu'au moment du fractionnement.

11.2

Extraction - Fractionnement

11.2.1

Transvaser le contenu du ballon dans une ampoule à décanter de 1000 mL à l'aide d'un entonnoir en verre muni d'un bouchon en laine de verre pour filtrer les matières solides.

11.2.2

Laver le ballon avec 2 × 20 mL d'eau de type I et transvaser ces portions dans l'ampoule à décanter (I).

11.2.3

Laver le ballon avec 2 × 15 mL d'alcool, de qualité réactif, et transvaser ces portions dans l'ampoule à décanter (I).

11.2.4

Laver le ballon avec 25 mL d'isooctane et transvaser cette portion dans l'ampoule à décanter (I).

11.2.5

Agiter l'ampoule à décanter pendant trois minutes ou jusqu'à ce que l'on observe plus d'accumulation de pression et laisser aux couches le temps de se séparer.

11.2.6

Soutirer avec précaution la couche inférieure et la recueillir dans une deuxième ampoule à décanter (II).

11.2.7

Répéter l'extraction en ajoutant 20 mL d'isooctane dans le ballon et transvaser cette portion dans l'ampoule à décanter (II).

11.2.8

Agiter l'ampoule à décanter pendant trois minutes ou jusqu'à ce que l'on observe plus d'accumulation de pression et laisser aux couches le temps de se séparer.

11.2.9

Soutirer avec précaution la couche inférieure et la recueillir dans une troisième ampoule à décanter (III).

11.2.10

Répéter l'extraction en ajoutant 20 mL d'isooctane dans le ballon et transvaser cette portion dans l'ampoule à décanter (III).

11.2.11

Agiter l'ampoule à décanter (III) pendant trois minutes ou jusqu'à ce que l'on observe plus d'accumulation de pression et laisser aux couches le temps de se séparer.

11.2.12

Soutirer avec précaution la couche inférieure et la jeter.

11.2.13

Laver chaque couche d'isooctane (ampoules à décanter I, II et III) trois fois avec 50 mL d'eau de type I chaude additionnée de 500 µL de solution saturée de NaCl.

11.2.14

Jeter la couche aqueuse (inférieure) après chaque lavage.

11.2.15

Après avoir complété le lavage, laisser s'écouler les couches d'isooctane dans un entonnoir contenant du sulfate de sodium anhydre, puis recueillir les fractions réunies dans un ballon de 250 mL (commencer par l'ampoule I, puis la II et enfin la III).

11.2.16

Rincer la troisième ampoule à décanter (III) avec 25 mL d'isooctane, puis agiter.

11.2.17

Transvaser l'isooctane dans la deuxième ampoule à décanter (II), puis agiter.

11.2.18

Transvaser l'isooctane dans la première ampoule à décanter (I), puis agiter.

11.2.19

Transvaser l'isooctane de la première ampoule à décanter (I) dans le ballon de 250 mL contenant les fractions précédentes d'isooctane.

11.2.20

Répéter ce processus de rinçage (11.2.16 à 11.2.19) avec 25 mL d'isooctane, en commençant de nouveau par l'ampoule à décanter (III).

11.2.21

Laver le sulfate de sodium anhydre avec 2 × 5 mL d'isooctane.

11.2.22

Sur un évaporateur rotatif à environ 55 ° C, évaporer jusqu'à siccité la solution d'isooctane contenue dans le ballon de 250 mL.

11.2.23

Dissoudre de nouveau l'échantillon dans 2 mL d'isooctane.

11.3

Nettoyage de l'échantillon

11.3.1

Conditionner la cartouche de Florisil en y ajoutant environ 1 g de sulfate de sodium anhydre, puis en y faisant passer 2 × 5 mL d'isooctane (laisser le solvant s'écouler par gravité à une vitesse d'environ 1 goutte par seconde).

11.3.2

Verser tout l'échantillon ainsi obtenu (dans 2 mL d'isooctane) sur la cartouche en laissant éluer par gravité. Jeter l'éluat.

11.3.3

Laver le ballon avec 3 × 5 mL d'isooctane, en versant chaque fraction sur la cartouche et en laissant s'écouler par gravité. Jeter l'éluat.

11.3.4

Placer un tube à culture jetable en verre de 20 mL sous chaque cartouche.

11.3.5

Éluer par gravité le B[a]P retenu sur les cartouches en y ajoutant 3 × 5 mL de benzène.

11.3.6

Ajouter 1 mL de THF dans chaque tube.

11.3.7

Placer les tubes contenant les 16 mL d'éluat sur un turbo-évaporateur Zymark.

11.3.8

Évaporer les échantillons jusqu'à siccité.

11.3.9

À l'aide d'une pipette, mettre 1000 µL d'acétonitrile dans chacun des tubes secs pour dissoudre l'analyte et tout résidu présent.

11.3.10

Agiter l'échantillon pendant environ 15 secondes sur agitateur à grande vitesse.

11.3.11

Avec une pipette en verre, laver les parois du tube cinq fois avec l'échantillon, puis transvaser le liquide dans une fiole jaugée de 2 mL.

11.3.12

Laver encore le tube avec 500 µL d'acétonitrile, comme ci-dessus, puis transvaser le liquide dans la fiole jaugée de 2 mL.

11.3.13

Compléter la fiole avec de l'acétonitrile.

11.3.14

Transvaser l'échantillon dans un contenant de 2 mL pour échantillonneur automatique, muni d'un bouchon à vis et d'un septum revêtu de téflon.

11.3.15

Les échantillons sont prêts pour l'analyse par CLHP et peuvent être conservés ainsi à 4 ° C.

12.1

Analyse par chromatographie liquide haute performance en phase inversée

12.1.1

Conditions pour le détecteur de fluorescence Jasco

Longueur d'onde d'excitation :

365 nm

Longueur d'onde d'émission :

425 nm

Gain :

× 1000

Atténuation :

32

12.1.2

Échantillonneur automatique : volume injecté

12.1.2.1

Faire les analyses en injectant 50 µL.

12.1.3

Phase mobile et gradient (système de gradient ternaire)

Solvant A :

acétonitrile/isopropanol à 1 % dans de l'eau de type I à 55/45 (dégazé et passé sur un filtre de nylon de 0,45 µm)

Solvant B :

méthanol

Solvant C :

acétonitrile

Débit :

1,5 mL/minute

Gradient :

exemple

Temps d'équilibrage : 8,00 minutes

13.1

Détermination du facteur de réponse

13.1.1

Réaliser un étalonnage initial en analysant des étalons jusqu'à l'obtention d'une réponse et d'un temps de rétention identiques.

13.1.2

Tracer une courbe d'étalonnage en rapportant la hauteur du pic obtenu avec un détecteur de fluorescence en fonction de la concentration de B[a]P dans l'étalon.

13.1.3

Le facteur de réponse est égal à la pente de la droite calculée par régression linéaire (hauteur de pic/concentration).

13.2

Calcul de la teneur en B[a]P [ng/g]

14.1

Paramètres de contrôle typiques

14.1.1

Blanc de réactifs (BR)

Procéder à l'analyse d'un blanc de réactifs (BR) afin de détecter toute contamination pouvant s'être produite lors de la préparation et de l'analyse des échantillons. Le BR est constitué de tous les réactifs utilisés pour exécuter l'analyse des échantillons, manipulés avec tout le matériel employé à cette fin. Le BR est analysé comme s'il s'agissait d'un échantillon.

14.1.2

Blanc fortifié (BF)

Procéder à l'analyse d'un blanc fortifié (BF) afin de détecter toute perte d'analytes pouvant s'être produite lors de la préparation et de l'analyse des échantillons. Le BF est constitué de tous les réactifs utilisés pour exécuter l'analyse des échantillons, manipulés avec tout le matériel employé à cette fin, et en plus, d'un « agent de fortification » qui correspond à une quantité connue d'au moins un des analytes d'intérêt. Le degré de fortification doit refléter l'intervalle de résultats caractéristiques de l'échantillon. Le BF est analysé comme s'il s'agissait d'un échantillon.

14.1.3

Matrice fortifiée (MF)

Procéder à l'analyse d'une matrice fortifiée (MF) afin de détecter tout effet perturbant de la matrice. Lors de la préparation et/ou de l'analyse des échantillons, ou au cours des deux étapes, diviser un échantillon et fortifier une des portions avec une quantité connue d'au moins un des analytes d'intérêt. Le degré de fortification doit refléter l'intervalle de résultats caractéristiques de l'échantillon. La MF est analysée comme s'il s'agissait d'un échantillon.

14.1.4

Échantillon témoin

Afin d'évaluer la performance globale d'une méthode d'analyse, procéder à l'analyse d'un échantillon témoin. En utilisant des méthodes statistiques appropriées, comparer les résultats ainsi obtenus aux « valeurs prévues » obtenues dans le laboratoire ou, en l'absence de tels résultats, aux valeurs publiées dans la littérature. Le laboratoire obtiendra ainsi des données sur l'exactitude et la précision de la méthode d'analyse.

14.1.5

Échantillon-étalon

Pour évaluer la stabilité du système d'analyse, analyser un étalon comme s'il s'agissait d'un échantillon. En utilisant des méthodes statistiques appropriées, comparer les résultats ainsi obtenus aux concentrations prévues.

14.2

Taux de récupération et niveaux de contamination

14.2.1

Les taux de récupération typiques des BF et des MF se situent entre 75 et 95 %, lorsqu'une solution dopée (ou un échantillon) est soumise au processus d'extraction complet.

14.2.2

Des taux de récupération inférieurs à 65 % indiquent que soit l'élution du B[a]P lors de l'extraction en phase solide est insuffisante, soit le facteur de réponse (FR) du détecteur de fluorescence a changé. Il faut d'abord vérifier le FR du détecteur de fluorescence avant de recommencer le traitement des échantillons.

14.2.3

Les valeurs obtenues avec des BR typiques se situent dans l'intervalle 0,0-0,3 ng/g. Une contamination de cet ordre est, en général, attribuée à une contamination du filtre lors de son conditionnement ou à un mauvais lavage de la verrerie.

14.3

Limite de détection (LD) et limite de quantification (LQ)

14.3.1

La limite de détection (LD) est égale à trois fois l'écart-type des résultats obtenus en analysant l'étalon le moins concentré au moins 10 fois sur une période de plusieurs jours.

14.3.1.1

La concentration typique de la LD selon cette méthode est à 0,04 ng/g.

14.3.2

La limite de quantification (LQ) est égale à 10 fois l'écart-type des résultats obtenus en analysant l'étalon le moins concentré au moins 10 fois sur une période de plusieurs jours.

14.3.2.1

La concentration typique d'une LQ calculée selon cette méthode est égale à 0,14 ng/g.

14.4

Stabilité des réactifs et des échantillons

14.4.1

Les solutions mères et les étalons doivent être conservés à -20 ° C.

14.4.2

Les étalons mères et les solutions mères dopées sont stables jusqu'à 6 mois. Bien qu'il ne produise aucune perte d'analyte, l'évaporation (perte) du solvant peut poser un problème.

14.4.3

De nouveaux étalons de travail doivent être préparés tous les deux mois.

14.4.4

Les échantillons sont stables à 4 ° C pendant trois semaines après l'extraction.

15.1

Tomkins, B. A.; Jenkins, R. A.; Griest, W. H.; Reagen, R. R. 1985. Liquid Chromatographic Determination of Benzo[a]pyrene in Total Particulate Matter of Cigarette Smoke. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 68, 5. 935-940.

15.2

ASTM International, Méthode ASTM D1193-06(2011), Standard Specifications for Reagent Water.