Annexes de l'évaluation préalable de la souche Bacillus cereus (ATCC 14579) Environnement Canada Santé Canada Juillet 2013

• aucune homologie connue avec cry et cyt,
• contientdes éléments mobiles et des protéines putatives

• Tn554, AbrB (régulateur)
• Bc1A (déterminant du revêtement de spore)

• Capsule de polysaccharide

• Élément prophage, similaire à Bam35

• Élément prophage

• Complexe toxine létale pagA, lef, cya

• aucune homologie connue avec cry et cyt,
• contientdes éléments mobiles et des protéines putatives

• Toxine protéinique insecticide (cry, cyt)

• Toxine émétique (céreulide)

• Possède un certain nombre de gènes transposables et d'éléments mobiles

• associé aux isolats péridontaux

• Complexe toxine létale, gènes pag, lef et cya

• Capsule d'acide D-glutamique,
• opéron coiffe BCADE

• Phénotype d'agrégation

• Complexe toxine létale, gènes pag, lef et cya

• Capsule d'acide D-glutamique,
• opéron coiffe BCADE

• Fonction inconnue
• Plasmide cryptique

• Résistance au mercure

• Présente les caractéristiques d'un élément mobile

• Transposase

• Ribozyme (ARN catalytique)

• Ribozyme (ARN catalytique)

• Autoépissage d'introns du groupe I associés à des éléments IS

Sphinx du tabac
Manduca sexta
Larves au cinquième stade larvaire
Sexe non précisé

Objectif ou contexte
Modèle d'infection chez l'insecte afin de caractériser le rôle du gène régulateur fur réagissant au fer dans la virulence de B. cereus.

Voie d’exposition
Injection de cellules végétatives (compartiment non précisé)
Conditions d'essai

• Non précisées

Régime de dosage

• Injection unique de doses connues mais non précisées
• Répétition unique d'au moins 20 larves par groupe de dose

Témoins

• Non précisés

Durée de l'étude

• 48 heures

• 569 WT
• 569 Δfur
• Tous deux cultivés dans un milieu LB avec antibiotiques
• fur est un homologue du gène fur de B. subtilis identifié dans B. cereus.

Intervalles d'observation

• Non précisés

Mortalité observée

• Dose létale médiane (DL50) calculée à partir de l'analyse par la méthode des probits des données de mortalité (les valeurs entre parenthèses correspondent aux limites de confiance à 95 %).
• Valeur DL50 du WT = 1859 cfu (1142-2774)
• Valeur DL50 du Δfur = 4932 cfu (3609-6912)

Conclusions

• Virulence réduite pour le mutant B. cereus 569 Δfur .
• Le mutant Δfur exprime les sidérophores de façon constitutive et accumule le fer à l'échelle intracellulaire à un niveau trois fois supérieur à celui de WT.

Fausse teigne de la cire
Galleria mellonella
Larves au dernier stade larvaire
Sexe non précisé

Objectif
Étude des propriétés opportunistes des souches acristalifères de B. thuringiensis (Bt) et de B. cereus et du rôle du gène plcR, un régulateur pléiotrope des facteurs extracellulaires

Voie d'exposition

• Co-ingestion par gavage
• Injection intrahémocèlique)

Méthode d'administration, respectivement 

• Aiguilles 0,5 X 25 mm et microinjecteur
• À la base de la dernière fausse patte, au moyen d'un microinjecteur avec une seringue hypodermique de 1 mL et des aiguilles de 0,45 X 12 mm

Régime de dosage

• 10 μL de suspension de spores par larve pour les deux méthodes
• Pour le gavage, les spores étaient associées à des toxines cristallines

Répétitions et réplications

• Aucune répétition sur le même animal
• Utilisation de 30 larves pour chaque dose et pour chaque méthode

Témoins

• Gavage avec spores (10⁶) ou toxines Cry1C seules

Durée de l'étude

• Les décès ont été enregistrés sur une période de sept jours.

• ATCC 14579
• Les spores ont été obtenues par culture de cellules dans un milieu HCT à 30 °C pendant quatre jours, centrifugées et remises en suspension dans 10 mL d'eau distillée stérile.
• Les préparations de spores ont été chauffées à 80 °C pendant 20 minutes.

Intervalles d'observation

• Vérification quotidienne des organismes.
• Après l'injection, les organismes ont été gardés individuellement dans des boîtes contenant de la cire d'abeille et du pollen à 25 °C.

Mortalité observée

• Après deux jours.
• Très faible (plus grand que 10 %) avec les cristaux ou les spores seuls (témoins).
• Mortalité d'environ 70 % causée par la co-ingestion de 106 spores avec une quantité sous-létale (1 μg) de toxine Cry1C.

Conclusions

• Patron de synergisme clair entre les spores de B. cereus et la toxine de B. thuringiensis.

Fausse teigne de la cire
Galleria mellonella
Larves au 2^e et au 5^e stade larvaire

Élevées sur cire d'abeille et pollen

Objectif
Déterminer si la fausse teigne de la cire (Galleria mellonella)
peut fonctionner comme modèle d'infection orale pour l'humain et les agents pathogènes entomo-bactériens. 

Voie d’exposition

• Infection orale

Ingestion libre

• Au 2^e stade larvaire
• Mélanges de 50 % de pollen avec 50 % d'eau contenant 10⁸ spores/mL seules ou avec 2 μg de Cry1C dilué dans le PBS à pH 7,4.
• Les deux préparations (2 mL) sont ajoutées à des boîtes de Pétri en matière plastique de 5 cm de diamètre et laissées sécher en surface.
• Les larves sont ensuite placées dans chaque boîte et incubées à 37 °C.

Gavage

• Au 5^e stade larvaire, pesant 200 mg avec un jeûne de 24 heures avant le test
• Utilisation d'un micro-injecteur
• 5 × 10⁵ - 1× 10⁶ spores ou cellules végétatives par larve, avec (2 – 3 μg) de toxine Cry1C et sans toxine

Répétitions et réplications

• Aucune répétition sur le même animal
• Dix larves au 2^e stade larvaire dans chaque boîte pour ingestion libre.
• Vingt larves au 5^e stade larvaire pour le gavage.
• L'expérience est reprise trois fois.

Témoins

• Spores seulement.
• Toxine Cry1C seulement.

Durée de l'étude

• 72 heures

Un isolat environnemental :

• ATCC 14579

Cinq autres souches diarrhéiques :

• D6 (F4370/ 75)
• D23 (F284/78)
• D17 (1651-00)
• D19 (NvH391/ 98)
• D24 (F352/90)

Quatre d'entre elles ont été mises à l'essai en gavage :

• D19
• D23
• D6
• ATCC 14579

Spores :

• produites en milieu HCT, lavées, remises en suspension dans l'eau, thermisées et énumérées

Cellules végétatives :

• recueillies à la phase de croissance exponentielle (OD600nm ≈ 1) en milieu LB

Intervalles d'observation

• Mortalité consignée quotidiennement.

Mortalité observée pour l'ingestion libre :

• 2 ± 2 % pour les spores de ATCC 14579 seule.
• 5 ± 5 % pour la toxine Cry1C seulement.
• De 12 ± 7 % (D24) à 57 ± 20 % (D23) pour la co-ingestion de toxine Cry1C.

Mortalité observée pour le gavage :

• 0 % (D19) à 8 ± 6 % (D23) sans toxine.
• 10 ± 8 % (D19) à 50 ± 13 % (D23) en co-ingestion.

Conclusions

• Des variations importantes ont été observées entre les souches.
• Ces résultats démontrent la synergie.
• La faible virulence de D19 (10 %) était imprévue puisqu'il s'agit d'un élément reconnu pour sa virulence élevée en tant qu'agent pathogène humain.
• Les valeurs de mortalité des insectes ne sont pas en corrélation avec le potentiel pathogène des souches bactériennes.

Fausse-arpenteuse du chou
Trichoplusia ni
Âgées de 1 à 8 jours.
Larves en santé d'une culture souche

Objectif
Test de pathogénicité dans le but de caractériser la cause non virale de la mort des larves dans une étude sur le NPV

Voie d’exposition

• Ingestion libre d'un test de pathogénicité dans une diète contaminée.

Méthode d'administration

• Suspension déposée à la pipette à la surface d'une diète artificielle fraîchement préparée dans une coupelle en plastique d'une once.
• Une larve à la fois a été placée dans la coupelle pour s'y nourrir.

Conditions physiques

• 25-28 °C.
• Humidité relative : 75-85 %

Régime de dosage

• 0,1 mL de suspension
• Bactérie, virus ou combinaison (3 groupes d'essai)
• 2,5 ou 5,0 × 10⁷ cellules/coupelle

Répétitions et réplications

• Aucune répétition sur la même larve
• 50 larves par dosage
• Deux expériences

Témoins

• Solution saline stérile ou eau

Durée de l'étude

• 12 jours

• Aucune désignation de la souche précisée
• Isolat de larves mortes ou moribondes
• Cellules en suspension dans une solution saline stérile

• La cause de la mort et les symptômes ont été attribués à B. cereus selon les critères de A. Krieg’s key, 1970.

Paramètres mesurés

• Mortalité consignée quotidiennement.
• Données corrigées selon la formule d'Abbott.

Étendue des effets

• Le niveau le plus élevé, 7,2 × 10⁸cellules/coupelle, a entraîné une mortalité de 100 % en onze jours.
• Taux de mortalité de 69 % et 50 %, chez les larves exposées à 3,6 et 1,8 × 10⁸ cellules/coupelle.
• 70 à 100 % des larves sont mortes en moins de 10 jours.
• Les symptômes étaient identiques à ceux observés chez les larves à partir desquelles les isolats originaux ont été prélevés : les larves ont cessé de s'alimenter, ont paralysé, les téguments ont noirci et les larves sont mortes.
• Les larves d'un jour semblent plus sensibles que les larves de 2 à 8 jours.
• Les cultures de B. cereus d'une journée créent une mortalité plus importante et plus rapide que les cultures de 2, 3 ou 20.

Conclusions

• La combinaison des deux pathogènes entraîne une mortalité légèrement plus élevée que l'un ou l'autre des agents pathogènes employé seul, mais sans qu'il y ait d'effet de synergie.
• La pathogénicité pour T. ni n'est associée à aucune toxine démontrable.

Ver à soie
Larve au 5^e stade larvaire
Élevées à partir d'œufs fertilisés en laboratoire
Nourries aux aliments sans antibiotiques pendant une journée

Objectif
Purification et identification d'une bactérie exotoxine du sol, la sphingomyélinase C

Voie d’exposition

• Injection dans l'hémolymphe à travers la surface dorsale

Méthode d'administration

• Aiguille de calibre 27

Conditions physiques

• Non précisées

Régime de dosage

• Trois groupes tests
• 0,05 mL d'une culture nocturne ou d'un surnageant de culture
• Dilutions doubles de sphingomyélinase purifiée.

Répétitions et réplications

• Deux vers à soie pour chaque dose de cultureou de surnageant de culture
• Cinq vers à soie pour chaque dose de toxine

Témoins

• Aucun indiqué

Durée de l'étude

• 24 heures

• ATCC 14579
• 25 colonies distinctes, dont 16 ont causé la mort des vers à soie
• Neuf souches de Bacillus non désignées isolées du sol
• Des échantillons de sol ont été étendus sur des plaques de gélose d'infusion de cerveau-cœur et les colonies ont été isolées après une nuit d'incubation à 30 °C.
• Les cultures ont été centrifugées et filtrées à travers un filtre de 0,22-μm.

Paramètres mesurés

• Nombre de vers à soie vivants après 24 heures.

Étendue des effets pour les isolats de sol

• Des 25 isolats distincts, 16 ont causé la mort des vers à soie
• 5 des 16 surnageants de culture ont tué des vers à soie. Ces cinq souches ont été identifiées comme des membres de l'espèce Bacillus (séquences 16S ARNr).
• La toxine purifiée à partir de l'isolat 11 a été identifiée comme de la sphingomyélinase C de B. cereus.

Étendue des effets pour la sphingomyélinase de la souche ATCC 14579 de B. cereus

• Mort des vers à soie avec une DL50 de 0,7 μg.

Blatte germanique
Blattela germanica
Adultes mâles

Objectif
Purification et caractérisation de la toxicité pour les insectes de la sphingomyélinase C produite par B. cereus

Voie d’exposition

• Injection dans l'abdomen

Méthode d'administration

• Non précisée

Conditions physiques

• Insectes élevés à 26 et 60 % d'humidité relative

Régime de dosage

• 2 μL de surnageant acellulaire ou de solution d'échantillon de protéine
• Bouillons de culture non traité, thermisés et traité à la protéinase K testé sur les blattes (trois groupes)

Répétitions et réplications

• Utilisation de cinq blattes pour chaque dose

Témoins

• Non précisés

Durée de l'étude

• 10 minutes

• ATCC 14579 (99,9 % d'homologie de séquence ARNr)
• Isolé à partir de mandibules de larves de fourmis-lions, Myrmeleon bore, au dernier stade larvaire
• Produit des facteurs insecticides lorsque cultivé en aérobie

Paramètres mesurés

• Symptômes observés 10 minutes après l'injection.
• Dose paralysante minimale (DPM) à laquelle au moins quatre ou cinq insectes ont été paralysés.

Étendue des effets

• Paralysie rapide après l'injection.
• DPM de 262 ± 29 ng protéine/insecte.
• La bactérie a été en mesure de poursuivre sa croissance même à 50 °C.
• L'activité insecticide a été abolie par chauffage à 100 °C et par traitement à la protéinase K.

Conclusions

• La sphingomyélinase C produite par B. cereus peut tuer les insectes rapidement à faible dose.
• Les facteurs insecticides produits par B. cereuspeuvent aider à l'activité de capture de proies des fourmis-lions.
• L'effet insecticide de la sphingomyélinase C est dû à son action sur le système nerveux.

• Défi intrahémocèlique

• Quatre souches, comprenant :
• B1
• NCIB 3329

• B1 a été la plus pathogène.
• NCIB 3329 a été la moins pathogène.

Scolyte de l'orme Scolytus scolytus
Larve au 5^e stade larvaire
Recueillies dans des billots d'orme infesté.

Objectif
Études pour un agent de contrôle biologique du vecteur de la maladie hollandaise de l'orme, parmi les espèces de Bacillus.

Conditions d'essai

• Larves en suspension dans une suspension de cellules.
• Temps de suspension : une heure.
• Par la suite, élevées sur un milieu artificiel à 27 °C.
• Les larves mortes sont retirées chaque jour.

Régime de dosage

• 8 × 10⁵ cellules/mL

Témoins

• Larves en suspension dans l'eau distillée.

Durée de l'étude

• 21 jours

• B. cereus 11796

Mortalité observée

• Après correction pour mortalité naturelle : 63,6 % des 40 larves ont été tuées.
• Le groupe-témoin a eu un taux de mortalité de 17,5 % (corrigé à 0 %) pour 40 larves.

• Inoculation orale

• Aucune désignation de la souche fournie

• Les souches isolées à partir de scolytes morts étaient pathogènes.

Anthonome du cotonnier 
Anthonomus grandis,

Noctuelle africaine du coton
Spodoptera littoralis

Puceron noir des fèves
Aphis fabae.

• Méthode d'ingestion libre de surnageant
• Colonies utilisées

• 575 souches utilisées pour A. grandis
• 270 souches utilisées pour S. littoralis et A. fabae

• Quatre des 575 souches étaient toxiques pour A. grandis (taux de mortalité de 85 à 100 %).
• Cinq des 270 souches ont produit un taux de mortalité de 41 à 97 % pour A. fabae.
• Aucun effet sur S. littoralis

• Dilutions progressives de culture (200 mL) ajoutées à 20 bocaux contenant chacun un nouveau-né (âgé de 24 heures)
• Concentration finale 10⁴ – 10⁶ CFU mL-1
• Présence d'événements de décès vérifiée chaque jour.
• Contrôle des animaux non infectés

• BD170 EH2, un Bacillus subtilis non hémolytique à l'origine exprimant un gène introduit d'hémolysine II de B. cereus , hlyII
• B. cereus VKM B-771

• La mort des animaux est survenue en 8 à 16 jours.
• BD170 EH2 a diminué la fécondité.

Voie d'exposition

• Injection (compartiment non précisé)

Régime de dosage

• Non précisé
• Culture de surface à 24 heures sur une plaque de gélose

Témoin

• 40 cc bouillon de glucose

• ATCC 21 sous-cultivé rapidement pendant quelques générations
• N. R. Smith No 156
• Les deux souches ont été sous-cultivées rapidement pendant quelques générations.

• Les cobayes sont morts uniquement lorsque les souches ont été sous-cultivées.
• Le bouillon de glucose n'a pas tué les animaux.

Voie d'exposition

• Injection intradermale de filtrats de culture (0,05 mL) à des cobayes albinos des deux sexes.

Témoin

• Des témoins positifs et négatifs ont été inclus.
• Les animaux ont été observés après 6 et 24 heures.

• B-4ac utilisé pour l'épreuve biologique cutanée
• 24 autres souches de B. cereus ont été testées
• Aucune désignation de la souche fournie

• Les souches B-4ac et 21 ont produit des réactions nécrotiques entourées d'une inflammation au site d'injection.

Néo-Zélandais blanc
Oryctolagus cuniculus

Anse iléale ligaturée

• Modèle expérimental d'intoxication alimentaire
• Six boucles d'essai par animal.
• Un témoin négatif et un témoin positif par lapin.

• 22 souches différentes désignées

• Accumulation rapide de 3 à 20 mL de liquide couleur paille, souvent sanglant.
• Réponse positive pour 19 des 22 souches.
• Réponse constamment positive pour les lapins plus jeunes.
• La plupart des lapins présentant au moins une anse positive sont mort dans les 10 heures suivant la chirurgie.

• Injection intradermique de 0,05 mL de filtrat de culture acellulaire dans des lapins de 2 à 3 kg.
• Trois heures après l'injection, du colorant bleu d'Evans a été injecté dans la veine de l'oreille.

• 11 souches de B. cereus
• Une seule d'entre elles portait la désignation B. cereus B-4ac, connue pour être positive dans l'anse iléale et dans l'épreuve biologique dermique du cobaye.

• La zone de bleuissement représentant l'augmentation de la perméabilité vasculaire variait de 4 à 100 mm2 pour la souche B-4ac.
• Neuf des dix autres variétés ont produit une réaction vasculaire positive.

Lapin hollandais
Oryctolagus cuniculus

Mâles pesant 1,8 ± 0,2 kg

• 0,1 ou 0,3 mL en injection intramusculaire dans le flanc
• 0,15 mL en injection sous-cutanée
• Les animaux ont été tués avant que l'infection ne devienne fatale.
• Des cellules végétatives et des suspensions de spores ont été utilisées.
• Concentration environ 102 cellules/mL.

• Variante négative de la lécithinase SV1

• Présence d'abcès indiquant une réaction inflammatoire.
• Présence de nodules sous la peau avec fibres nécrotiques et fibrose en périphérie.
• Calcification observée dans 80 % des animaux après sept jours.

• Injection intradermale (0,1 mL) chez des lapins pesant entre 2,5 et 3 g

• 50 de 136 souches isolées de produits laitiers
• 102 souches donnent un résultat positif pour les toxines extracellulaires

• Les 102 souches ont causé une perméabilité vasculaires dans la peau des lapins (bleuissement intense causé par le colorant bleu d'Evans.

• Trois entérotoxines dans des filtrats concentrés de cultures acellulaires
• Épreuve biologique sur anse iléale ligaturée
• Résultats préliminaires pour 23 isolats
• Quatre souches sélectionnées

• Souche isolée d'un incident ayant causé de la diarrhée chez six de dix singes
• Souche isolée de riz brut n'ayant pas produit de symptômes chez huit singes
• Souches isolées d'un abcès au cerveau (2141/74, sérotype 11).
• B-4ac

• Bien que onze souches seulement aient été testées plus de deux fois, deux seulement de ces onze souches ont présenté une probabilité à plus grand que 50 % de donner un résultat positif sur des essais répétés.
• Accumulation de fluide dans l'anse iléale des lapins pour les deux premières souches.
• Perturbations graves de la muqueuse dans la muqueuse iléale pour la troisième souche.

• Test de toxicité rétinienne in vitro : Mesure de la libération cytolytique de lacticodéshydrogénase (LDH) des boutons rétiniens traités avec des toxines de B. cereus(600 ng/mL HBLeq).
• Modèle d'endophtalmie stérile in vivo : injection intravitréale d'exotoxine pure ou brute (0,1 à 1,15 mL)
• Échantillons témoins et échantillons contenant des toxines inclus

• MGBC 145

• Les boutons rétiniens traités avec CET ou HBL se sont complètement désagrégés en cellules et en débris de cellules et se sont effondrés au moment d'être enlevés.
• Dans un délai de quatre heures, tous les yeux ayant reçu plus grand ou égal à 0,8 μg d'exotoxine brute affichaient une exsudation, un œdème conjonctival et une hyperémie marqués.
• Avec 1-4 μg, absence totale ou quasi-totale de reflet rétinien, hémorragie vitréale, chémosis hémorragique de la conjonctive et opacité cornéenne.
• Réponse plus légère à des doses faibles.

• Modèle d'accumulation de liquide dans l'anse iléale
• Trois composants purifiés de HBL

• F837/76

• Cause de l'accumulation de fluide et les trois éléments doivent être présents ensemble pour causer une activité maximale.

Néo-Zélandais blanc
Oryctolagus cuniculus

2 à 3 kg

• Injection intravitréale dans les yeux de B. cereus(log 2,06 CFU)viable ou de surnageant acellulaire
• Témoins chirurgicaux et absolus

• MGBC145

• Inflammation intraoculaire et réduction de la réponse rétinienne après trois heures.
• Décollement de la rétine et plissement et perturbation de la couche photoréceptrice après neuf heures.
• À 18 heures, les yeux affichent une inflammation maximale, y compris des tissus périoculaires.
• L'injection de surnageant de culture produit des résultats similaires.

• Injection intrapéritonéale (0,5 mL) et sous-cutanée (0,25 mL)
• Quatre dilutions injectées dans chacune de 12 souris ou plus
• Formes végétatives et spores testées.

• NRS 201
• NRS 232
• NRS 1256

• Une quantité de 10 à 100 fois plus élevée de spores a été nécessaire pour causer la mort des souris.
• La mort survient après les injections intrapéritonéales mais non après les injections sous-cutanées.
• Les injections sous-cutanées ont produit une lésion nécrotique ouverte.

• Injection intrapéritonéale ou sous-cutanée (0,25 mL)  d'une suspension (environ 500 millions de bacilles par mL)
• Les cultures étaient souvent transférées d'un milieu à un autre pour en augmenter la virulence.
• Groupes de 4 à 8 souris

• Souches activées
• Aucune désignation de la souche fournie

• Maladie aiguë létale à dose élevée, en moins de 6 heures dans presque tous les cas
• La gravité de la maladie est clairement associée à la dose.
• La dose minimum causant un taux de mortalité de 84 à 100 % était d'environ 2,2 X 10⁷ bacilles.
• Les doses plus faibles entraînaient une maladie plus bénigne et parfois des ulcères nécrosants de la peau au site d'injection.

• 0,5 mL de filtrat de culture injecté dans la veine caudale de quatre souris ICR adultes
• Deux isolats cliniques ont été utilisés comme témoins positifs et le milieu de culture a été utilisé comme témoin négatif.

• 183 souches isolées de produits laitiers

• Des 11 isolats présentant une forte activité d'hémolysine, trois ont tué les souris.

• Injection intraveineuse de 8 μg d'hémolysine II purifiée

• FS-1

• Décès en moins de deux minutes

• Test de perméabilité vasculaire, réaction de nécrose intestinale et test de létalité sur des souris

• 116 souches
• Environ 13 de ces souches ont été désignées

• Bonne corrélation de la production de nécrose de la peau avec les tests intestinaux et le test d'accumulation de fluide.

Souris
Mus musculus

Souche BALB/c
Femelles âgées de 5 semaines

Gardées dans une enceinte de sécurité biologique en groupes de cinq, avec de l'eau stérile et de la nourriture.

Objectif
Étude des propriétés opportunistes d'une mutation de B. thuringiensis et de B. cereus, et du rôle du gène plcR

Voie d’exposition

• Instillation nasale sous légère anesthésie à l'éther

Méthode d'administration

• La suspension de spores ou de bactéries a été déposée avec soin au coin de la narine. La souris a inhalé l'inoculat en respirant.

Régime de dosage

• 50 μL de la suspension (spores ou cellules végétatives)

Répétitions et réplications

• Aucune répétition
• Groupes de 5 à 10 souris utilisées pour chaque souche

Témoins

• Aucun indiqué

Durée de l'étude

• Mortalité observée après 24 heures

Deux souches de B. cereustestées :

• ATCC 14579
• ATCC 14579 ΔplcR
• Les cellules végétatives ont été préparées à partir de culture en milieu TSB à 37 °C et récupérées par centrifugeage après culture pendant une période de 18 heures (phase stationnaire tardive).
• Les suspensions de spores ont été préparées à partir d'une culture âgée de 10 jours sur gélose. Les spores ont été lavées et remises en suspension dans de l'eau stérile, puis incubées pendant une heure à 65 °C pour tuer les formes végétatives.

Mortalité observée

• 10⁸ spores par souris ont produit un taux de mortalité de 100 % pour les deux souches.
• 5 X 10⁷ spores par souris ont produit un taux de mortalité de 90 % et de 22 %, respectivement.
• 10⁷ spores par souris ont produit un taux de mortalité de 90 % et de 0 %, respectivement.
• 6 × 10⁶ spores par souris ont produit un taux de mortalité de 100 % et de 0 %, respectivement.

Conclusions

• La souche ATCC 14579 présente des facteurs additionnels, non régulés par PlcR, qui peuvent potentialiser ses propriétés opportunistes.
• Décès rapide de l'hôte si des doses fortes de cellules sporulées ou végétatives sont utilisées.
• Il est peu probable que la mort soit due à la croissance des bactéries.

Souris
Mus musculus

Souche BALB/c

Voie d’exposition

• Endotrachéale

• ATCC 14579

• L'exposition aux spores a des effets négligeables.
• Exposition aux cellules vététatives.
• expérience interrompue après 4 heures en raison de la gravité des symptômes;
• cytokines pyrogènes élevées; 
• infiltration des granulocytes pulmonaires;
• marqueurs de réponse en phase aigüe.

Singes
Macaca mulatta

Souche rhésus

Objectif
Déterminer l'utilité des macaques rhésus pour modéliser l'entéropathogénicité de B. cereus.

Voie d’exposition

• Gavage.

Méthode d'administration

• Faire jeuner les macaques pendant 18 heures avant de les nourrir.
• Administré par sonde stomacale.

Régime de dosage

• Trois types de matériaux donnés en nourriture : cultures entières, filtrats de cultures stériles ou toxines précipitées purifiées.
• 40 mL par macaque
• Des aliments normaux sont disponibles ensuite.

Répétitions et réplications

• Six macaques pour chaque matériau testé.
• Des tests d'accumulation de fluide dans l'anse iléale de lapins et de perméabilité des capillaires de la peau aussi effectués.

Témoin

• BHIG stérile comme témoin négatif

Durée de l'étude

• Jusqu'à ce que des symptômes soient observés (au moins 210 minutes).

• B-4ac, isolé à partir d'une poussée d'intoxication alimentaire
• Six autres souches dans désignation spécifique, isolées à partir des poussées associées au riz

Intervalles d'observation

• Observation continue

Symptômes observés

• Diarrhée déclenchée par les trois matériaux de test dans un délai de 35-150 minutes après l'administration.
• Durée de 60 à 210 minutes.
• Le témoin a été négatif.
• Variations considérables dans la sensibilité des différents macaques.
• Environ 50 % des macaques ont présenté une réaction positive.
• Aucun vomissement n'a été observé.
• Quatre des six souches désignées ont donné des résultats positifs pour la diarrhée mais négatifs pour le vomissement.
• B-4ac cultivé sur du riz a induit la diarrhée chez trois des six macaques mais aucun vomissement.

Conclusions

• Corrélation directe entre la capacité de causer de l'accumulation de fluide dans les anses iléales de lapin, altération de la perméabilité des capillaires de la peau et capacité d'induire la diarrhée chez les macaques.
• Le macaque rhésus est un modèle pertinent.
• La diarrhée est causée par la synthèse et l'extraction d'une toxine par des cellules en croissance logarithmique.

Singes
Macaca mulatta

Sexe non précisé
Jeune souche rhésus d'environ 3 kg

Objectif
Tenter de confirmer que les éclosions d'origine alimentaire étaient causées par B. cereus et de déterminer la participation d'un nouveau matériau entérotoxique.

Voie d’exposition

• Gavage

Méthode d'administration

• Du riz contaminé a été homogénéisé et concentré.
• Les organismes ont également été cultivés dans un bouillon liquide.
• Sous anesthésie, le matériau de test a été administré par voie buccale au moyen d'une sonde d'alimentation lubrifiée.

Régime de dosage

• 30 mL d'une culture de huit heures.
• Dans la nourriture, environ 1010 d'organismes viables.
• Dans le bouillon, environ 1011 organismes.
• 100 à 150 mL de matériau.
• De plus, l'accumulation de fluide iléal a été mesurée avec des filtrats concentrés à 12-15 plis.

Répétitions et réplications

• Entre 4 et 24 macaques pour chaque combinaison de souche et de milieu de culture

Témoin

• Milieu non ensemencé

Durée de l'étude

• 24 heures

Trois souches de B. cereus :

• 4810/73 (anciennement souche 88) isolée à partir de vomi, associé à la maladie
• 4433/73 isolé à partir de pain de viande impliqué dans une éclosion d'intoxication alimentaire
• 2532B/74 isolé à partir de riz

Paramètres mesurés

• Activité émétique : début des vomissements en moins de cinq heures.
• Diarrhée : présence de selles liquides ou molles en moins de 24 heures.
• Examen fécal.
• Épreuve biologique d'anse iléale ligaturée

Étendue des effets pour l'activité émétique

• L'alimentation à partir de milieu non ensemencé n'au eu aucun effet.
• Seules les cultures sur riz peuvent causer des vomissements.
• Dix des 24 macaques ont montré des vomissements positifs à partir de la souche 4810/73.

Étendue des effets pour l'activité diarrhéique

• L'alimentation à partir de milieu non ensemencé n'au eu aucun effet.
• Largement confinée à la souche 4433/73.
• Principalement de la diarrhée chez six macaques sur dix, pour le riz.
• Présente pour les cultures sur bouillon et sur riz.
• Examen fécal.
• L'image bactériologique reflète avec exactitude les quantités dans le matériau donné en alimentation.

Épreuve biologique d'anse iléale ligaturée

• Sur 13, 15 et 12 tests réalisés pour chaque souche, 2, 12 et 9 ont été positives pour l'anse iléale.

Conclusions

• Une distinction claire existe entre les souches causant les vomissements et la diarrhée.
• La différence entre les activités des deux premières souches est renforcée  par le test d'anse iléale du lapin.
• La gamme d'aliments impliqués dans l'éclosion de diarrhée est large tandis que les vomissements sont limités à la consommation de riz.

Singes
Macaca mulatta
Souche rhésus  6-8 kg

Souris
Mus musculus
ICR, souche non précisée.
Sexe non précisé
Pesant 20-24 g

Objectif
Étudier la corrélation entre la toxine émétique et le facteur de vacuolisation HEp-2 produit par B. cereus isolé à partir d'une éclosion d’intoxication alimentaire de type vomitoire.

Tests effectués

• Létalité murine
• Activité émétique sur les singes

Voie d’exposition

• Injection intraveineuse
• Administration intragastrique

Méthode d'administration

• Détails non fournis pour les souris
• Administration orale par cathéter pour les singes

Régime de dosage

• 0,2 mL de l'échantillon test
• 20 mL de l'échantillon test

Substances testées

• Céreulide purifiée
• Facteur de vacuolisation partiellement purifié

Conditions d'essai

• Des aliments et de l'eau ont été fournis avant l'administration de l'échantillon d'essai aux singes.

Reprises

• Non précisées

Témoin

• Chacun testé sur deux singes
• Surnageant de B. cereus No 35 comme témoin négatif
• Solution saline physiologique

Durée de l'étude

• Observation des souris pendant 60 minutes
• Observation des singes pendant 24 heures.

• B. cereus No 35 produit des entérotoxines mais pas de facteurs de vacuolisation
• B. cereus No 55, isolé à partir d’une éclosion. Produit des facteurs de vacuolisation mais pas d'entérotoxines

Activité létale murine

• Aucune observée pour 100-500 unités des deux substances.
• A été constatée pour plus de 1 000 unités de toxine.

Activité émétique chez les singes

• Aucune activité observée pour les témoins.
• Pour la céréulide à 14 000 unités, les trois singes ont montré des vomissements en 2-4 heures.
• Pour le facteur partiellement purifié à 30 000 unités, un des deux singes a montré des vomissements après six heures.
• Pour le facteur partiellement purifié à 36 000 unités, les deux singes ont montré des vomissements après deux et quatre heures.

Signification

• Démontre que le facteur de vacuolisation HEp-2 est un céréulide du type toxine émétique.
• Ces toxines peuvent causer des vomissements chez les singes.

Moutons et bovins

Jeunes femelles

Voie d’exposition

• Injection intraveineuse

Nombre et état des animaux

• Cinq brebis gestantes de 90 à 110 jours
• Six génisses gestantes de sept mois
• Tous les animaux ont été logés dans un bâtiment d'isolement pendant dix jours avant l'inoculation.

Régime de dosage pour les brebis

• 5,1 × 10⁵ organismes

Régime de dosage pour les brebis

• Trois groupes de deux animaux
• Groupe 1 : 8 × 10⁶ organismes
• Groupe 2 : 8 × 10⁵ organismes
• Groupe 3 : 8 X 103 organismes

Reprises

• Des sections dupliquées de tissus ont été colorées.

• Aucune désignation de la souche fournie
• Souches isolées à partir d'un fœtus bovin avorté

Symptômes observés chez les brebis

• Quatre agneaux morts avortés entre trois et huit jours après l'inoculation.
• L'une des brebis est morte après avoir eu de la fièvre, de la tachycardie, de la tachypnée et des troubles du système nerveux central.

Symptômes observés chez les génisses

• Les animaux des groupes 1 et 2 ont avorté de veaux morts entre 7 et 12 jours après l'inoculation.
• Les animaux du groupe 3 ont eu des veaux normaux à terme.

Examen des veaux et des agneaux

• Des degrés divers de changement autolytique.
• Ascite sanguinolent, hydrothorax, hydropéricarde et œdème sous-cutané.
• Les membranes fœtales étaient hyperthémiées et œdèmateuses.

Constats bactériologiques

• B. cereus a été isolé en cultures pures à partir des tissus des brebis, des agneaux et des veaux morts.

Conclusion

• La placentite nécrotique était présente dans tous les avortements, indiquant que le placenta avait été le principal site d'infection.

• Entérotoxine purifiée

• FM-1

• Perméabilité vasculaire chez le lapin.
• Létale pour les souris.
• Cause de l'accumulation de fluide dans l'anse iléale ligaturée des souris.

État des animaux

• Au cours de deux saisons de repos, le taux de larves malades portant des lésions cutanées brunes a été de 4,1 % et de 1,7 %.
• Le taux de larves mortes portant des lésions cutanées brunes a été de 2 % et de 0,4 %.

Nombre d'animaux étudiés

• Pour chaque année,
• 50/ 28 en juillet
• 347/ 51 en août
• 1 612/ 458 en septembre

Témoin

• Aucun indiqué

Durée de l'étude

• 2 ans

• Aucune désignation de la souche fournie

Symptômes observés

• Lorsque ces larves ont été conservées en laboratoire, plusieurs d'entre elles sont mortes dans un délai de 8 à 45 jours.
• Les taux de mortalité de décembre à avril ont été de 45, 54, 20, 8 et 0 % au cours de la première saison.
• Ils ont été de 56, 20, 20, 20 et 0 % durant la deuxième saison.

Observation bactériologique

• B. thuringiensisfinitimus et B. cereus ont été isolées à partir de ces larves, mais non des larves en santé ou des larves mortes ne présentant pas les lésions.

Conclusion

• La diminution de la virulence au fil de l'avancement de la période de repos peut indiquer que les larves qui sont atteintes par la maladie plus tard peuvent être ou devenir plus résistantes à ses effets.

• Isolats d'une pupe atrophiée

• WGPSB-2 (MTCC 7182)

• La souche a été en mesure d'infecter les insectes et de causer un taux de mortalité de 92 % et de 67 % respectivement chez les larves au deuxième stade larvaire d'Anomala dimidiata et de Holotrichia seticolis.

• Jusqu'à un cinquième de la population a affiché des symptômes d'infection bactérienne

• WGPSB-2

• Parmi les 27 isolats bactériens testés sur A. dimidiata, la souche présentant la plus forte toxicité a été B. cereus.

Voie d'exposition

• Injection dans les quartiers

Régime de dosage

• Produit antibiotique commercial contaminé

Nombre et état des animaux

• Huit troupeaux laitiers
• Total de 80 vaches touchées

Études menées

• Deux carcasses entières d'animaux morts de mammite aiguë ont été examinées
• Des tissus ont été prélevés sur les carcasses et sur neuf vaches : tissus mammaires, ganglions lymphatiques supramammaires, foie, rate et reins

Témoins

• Aucun indiqué

Durée de l'étude

• Environ un an (1974)

• Aucun indiqué.
• Identification de B. cereus à partir de cas décrits antérieurement (Perrin et al.,. 1976)

Symptômes observés

• Certaines des vaches affectées ont développé une mammite aiguë en moins de 24 heures, dans la plupart des cas peu de temps après le vêlage.

Examen grossier

• Sang aqueux qui ne coagule pas.
• Œdème sous-cutané marqué sur le pis.
• De nombreuses zones rouge foncé bien délimitées étaient réparties sur l'ensemble des quartiers touchés.
• Hypertrophie marquée des ganglions lymphatiques supramammaires.
• Poumons modérément œdémateux et emphysémateux.
• Rate atteignant deux fois la taille normale, rouge foncé et turgescente.

Constats histologiques

• Glandes mammaires : cloisons interstitielles œdèmateuses, thrombose aiguë des veines et des canaux lymphatiques.
• Présence d'érythrocytes dans le tissu interstitiel.
• Les sections soumises à l'épreuve de coloration de Gram ont révélé la présence d'organismes Gram positifs dans les alvéoles nécrotiques seulement.
• Lymphadénie aiguë dans des sections des ganglions supramammaires avec foyers de nécrose et un nombre élevé de cellules inflammatoires.
• Présence de nécrose hypoxique centrolobullaire dans le foie.
• L'examen des tissus rénaux a révélé la présence de coulées hémoglobinémiques dans les tubules.
• La présence de thrombus hyalins était évidente dans les capillaires des glomérules et à la jonction cortico-médullaire.
• Épaississement des cloisons alvéolaires dû à l'œdème. Les capillaires alvéolaires étaient engorgés de sang et plusieurs présentaient des thrombus hyalins.

Cas 1 :

• Fœtus bovin mâle, huit mois de gestation
• Deuxième avortement en huit mois dans un troupeau de 80 vaches Suisses brunes

Cas 2 :

• Fœtus bovin mâle, huit mois de gestation
• Deuxième avortement en huit mois dans un troupeau de 150 vaches Holstein-Friesian

Cas 3 :

• Fœtus bovin femelle, sept mois de gestation
• Seul avortement en un an dans un troupeau de 21 vaches Holstein-Friesian

• Aucune désignation de la souche fournie

• Trois rapports d'avortements.
• Nécropsie, examen cytobiologique et histopathologique effectué sur chacun des fœtus et sur les membranes fœtales lorsqu'elles étaient disponibles.

Conclusions d’autopsie

• Poumons atélectasique, fermes et rouge foncé.
• Pleurite, péricardite et péritonite fibrineuses
• Foie jaune, deux fois la taille normale.
• Ganglions lymphatiques hypertrophiés et congestionnés.

Conclusions microbiologique

• B. cereus a été le seul microorganisme isolé à partir du contenu gastrique et des tissus.

Conclusions d’histopathologie

• Vasculite, œdème, inflammation et nécrose dans l'espace intercotylédonaire.
• Hyperplasie de la rate.
• Foie congestionné.

Bovins laitiers
Bos taurus

Femelles adultes

• Quartiers inoculés avec B. cereus

• Aucune désignation de la souche fournie

• Apparition de mammite aiguë, suivie d'une atrophie et de la cessation de la production de lait.

Bovins laitiers
Bos taurus

Femelles adultes

Objectif
Présence accidentelle de mammite à B. cereus dans plusieurs troupeaux utilisés dans des essais d'efficacité d'un produit proposé pour le traitement des vaches taries

Voie d'exposition

• Injection dans les quartiers

Régime de dosage

• Produit expérimental contenant 500 mg de cloxacilline dans l'huile d'arachide et 3 % de base monostéarate

Nombre et état des animaux

• Cinq troupeaux de 120, 70, 1 600, 1 500 et 1 500 vaches en lactation
• Injection délibérée chez 151 vaches taries
• Injection par inadvertance à 33 vaches en lactation

Études menées

• Un échantillon de premier lait des quatre quartiers a été pris immédiatement avant la dernière traite de la période de lactation.
• Les quartiers ont été traités peu après cette traite.
• Les mamelles ont été trempées dans un bain iodophore après le traitement et les réactions indésirables ont été surveillées par les propriétaires.
• Un rééchantillonnage a été fait et les échantillons ont été cultivés.

Témoins

• Aucun indiqué

Reprises

• Double échantillonnage (deux échantillons indépendants ont été recueillis de façon aseptique avec nettoyage et séchage de la mamelle avant la collecte)
• Prise d'un échantillon unique post-traitement

Durée de l'étude

• Environ trois mois

• Aucune désignation de la souche fournie
• Isolation à partir du produit expérimental et des quartiers

Symptômes observés

• Développement d'une mammite nécrotique chez cinq vaches au vêlage.
• Développement d'une mammite clinique dans 15 autres quartiers infectés, principalement au vêlage ou durant la lactation.
• Seulement 26 des 184 vaches et 37 des 735 quartiers exposés ont été infectés.

Étude de la culture

• Excellent accord entre les deux cultures
• La présence de B. cereus a été constatée dans 9,9 % des quartiers traités, dans 3,6 % des quartiers présentant une autre infection au moment de l'exposition et dans 15,5 % des cultures négatives au moment de l'exposition, lors d'une nouvelle culture.
• Dans la plupart des cas, l'isolement a été fait entre 33 et 56 jours après l'exposition et à partir de quartiers ne présentant pas de signes cliniques de mammite.

Conclusions

• Le nombre d'organismes dans les quartiers infectés varie fortement et est souvent faible.
• Il est proposé que l'organisme est principalement présent sous forme de spores et qu'il répond ainsi moins bien aux procédures simples de culture ou de traitement.
• Le nombre d'organismes dans chaque fiole de produit était faible et toutes les fioles n'étaient pas contaminées.

Bovins laitiers
Bos taurus

Femelles adultes

• Onze vaches présentant une mammite aiguë entre 1963 et 1973

• Aucun indiqué

• B. cereus a été isolé chez une vache.

Bovins laitiers Holstein
Bos taurus

Femelles adultes

Objectif
Thérapie antibiotique utilisant la cloxacilline dans le cadre d'un programme de santé du troupeau

Conditions physiques

• Troupeau bien géré sans problème grave de mammite
• Programme antibiotique entrepris chez 67 vaches
• Administration par perfusion de l'antibiotique durant la période de tarissement ou la période de lactation, ou les deux
• Vaccination de 41 vaches, avant ou après le traitement antibiotique. Injection sous-cutanée de 10 mL de bactérine

Nombre d'animaux étudiés

• 129 vaches sur un troupeau de 140 têtes

Témoin

• Aucun indiqué

Durée de l'étude

• 3 mois

• Aucune désignation de la souche fournie
• Isolat tiré du lait de vaches infectées

Préparation de la bactérine

• Incubation de l'isolat dans un bouillon d'infusion cerveau-cœur. Remise en suspension des sédiments dans une solution saline à 0,85 % avec 0,25 % de formaldéhyde, stérilité testée. Dilution finale selon la norme McFarland 3.

Symptômes observés chez les vaches perfusées

• Mammite aiguë grave chez 62 des 67 vaches perfusées avec la cloxacilline.
• Durant la période de tarissement :
• Onze des 25 vaches perfusées ont développé une mammite grave (après 24 jours en moyenne, plage de 2 à 94 jours).
• L'examen post-mortem de l'une des vaches a révélé des glandes mammaires de couleur écarlate entourées de matière gélatineuse et remplie de fluide sérosanguinolent. Les ganglions lymphatiques mammaires présentaient une apparence mouillée et étaient entourés de matière gélatineuse.
• Pendant la période de lactation :
• Les 33 vaches perfusées ont développé une mammite dans un délai de 1 à 30 jours (entre 1 et 3 jours dans la majorité des cas).
• L'observation de l'une des vaches le lendemain du vêlage a révélé la présence d'un quartier arrière très dur au toucher, ne contenant qu'un liquide séreux rouge. La vache refusait de manger et sa température rectale a atteint 39,5 °C, avec des fèces légèrement diarrhéiques. Dans les jours qui ont suivi, la glande mammaire est devenue froide au toucher, noire et a commencé à se déliter.
• Durant la période de tarissement et la période de lactation :
• les quatre vaches perfusées ont développé une mammite.
• Cinq vaches perfusées avec la cloxacilline n'ont pas développé de mammite.

Symptômes observés après administration de bactérine

• Des 21 vaches non vaccinées, six sont mortes subitement et 15 ont survécu.
• Les 41 vaches vaccinées ont développé une forme moins grave mais récurrente de mammite et présenté une faible production de lait.

Conclusions

• La maladie découle habituellement de l'injection de  B. cereus dans la citerne de la mamelle lors du traitement de la mammite ou d'une autre cause. Les sources d'infection décrites comprennent les antibiotiques, les manchons, les seringues et les dilatateurs contaminés.
• Des cas d'inflammation nécrotique et de mammite aiguë avec symptôme de généralisation ont été rapportés.
• La sécrétion était séreuse et contenait souvent des érythrocytes, de la fibrine et des leucocytes.
• Une quantité très faible de B. cereus peut produire des effets pathogènes importants.

Bovins laitiers
Bos taurus

Chèvre
Capra hircus

Femelles adultes

Objectif
Rapport de mammite bovine apparemment causée par B. cereus

Conditions physiques

• Des tissus parés d'un animal affecté ont été préparés pour le découpage.
• Tests de toxine avec perméabilité vasculaire de peau de lapin et réaction nécrotique

Nombre d'animaux étudiés

• 28 vaches
• Une chèvre
• Réparties sur quatre fermes

Témoin

• Aucun indiqué

Durée de l'étude

• Non précisée

• Aucune désignation de la souche fournie
• Identifiée comme B. cereus par morphologie de la colonie

Symptômes observés

• Cinq rapidement fatals.
• Autres allant de nécrotiques à légers.

Ferme 1 :

• Trois cas de mammite très aiguë en une semaine.
• La première vache est morte en moins de 24 heures.
• Aucune réponse au traitement aux antibiotiques.
• Lait de couleur « porto ».
• Le deuxième animal présentait une température sous la normale et un pis gonflé et froid. Le lait et l'urine étaient de couleur porto; l'animal est mort en moins de 24 heures.
• L'examen des viscères a révélé des reins et un pis d'un rouge profond, la présence de sang dans le pelvis, un foie congestionné ainsi que la présence de caillots blancs de grande taille et de liquide teinté de sang dans la citerne de mamelle.
• Ces deux dernières étaient vers la fin de leur période de lactation.
• La troisième vache venait de vêler et a développé une mammite deux jours après la mise bas.
• Son lait était de couleur brun pâle et elle venait de recevoir un traitement antibiotique.

Ferme 2 :

• Les symptômes étaient bénins.
• Faible réponse au traitement aux antibiotiques.

Ferme 3 :

• Une vache couchée suite à une fièvre vitulaire a soudainement développé une mammite suraiguë et est morte. Lait de couleur porto.
• Le deuxième cas est une vache qui venait de mettre bas et qui se trouvait dans la même boite de mise bas. La présence de B. cereus a été constatée dans le pis.

Ferme 4 :

• Une vache est morte d'une mammite aiguë le matin suivant une coupure à une mamelle.

Examen bactériologique des fèces et des céréales

• Organismes présent dans les fèces des animaux affectés et non affectés à des niveaux de105 / 106 par g.
• 102 / 103 cellules de B. cereus par g ont été recueillis dans les céréales bien préservées et 104 / 105 cellules lorsqu'une détérioration était survenue.
• 7.5 × 10⁵ et 4 × 10⁸ dans les céréales obtenues du même fournisseur.
• B. cereus a été isolée à 17 autres occasions dans des cultures pures de lait de mammite.

Examen histopathologique

• Lésion, cloison interstitielle œdémateuse et contenant des érythrocytes.
• Présence de thrombus dans les veines.
• Nécrose des cellules alvéolaires.

Test de perméabilité

• Un seul des 19 isolats de mammite et des isolats environnementaux affichait une activité toxique forte.

Conclusions

• Il est possible que les céréales aient été la source de l'infection.
• L'organisme est plus susceptible de s'établir en l'absence d'infection préexistante dans le pis.

Bovins laitiers
Bos taurus

Femelles adultes

• Mammite bovine

• 1820/77
• 1419/77
• 1414/77
• 1589/77
• 624/76

• 1820/77 : décès
• 1419/77, 1414/77 et 1589/77 : 2 décès.
• 624/76 : données non disponibles.

Les considérations pouvant mener à la mise en évidence d'un danger élevé incluent un micro-organisme qui :

• est reconnu incontestablement comme étant un pathogène;
• cause des effets nocifs irréversibles (p. ex., perte de biodiversité, perte d'habitat, maladie grave);
• crée des incertitudes importantes quant à la détermination et à la caractérisation des effets possibles.

Les considérations pouvant mener à la mise en évidence d'un danger modéré incluent un micro-organisme qui :

• est reconnu comme étant un pathogène opportuniste chez les espèces non-humaines ou pour qui il existe certaines preuves documentaires de pathogénicité ou de toxicité;
• cause certains effets nocifs, mais qui sont réversibles ou disparaissent d'eux-mêmes.

Les considérations pouvant mener à la mise en évidence d'un danger faible incluent un micro-organisme qui :

• n'est pas reconnu comme étant un pathogène chez les espèces non-humaines;
• est bien caractérisé et identifié et n'est pas reconnu pour ses effets écologiques nocifs;
• pourrait théoriquement avoir des impacts négatifs pendant une courte période, mais qui ne cause pas d'effets prévisibles à long terme sur les populations microbiennes, végétales ou animales ou sur les écosystèmes;
• démontre un historique d'utilisation sûre sur plusieurs années.

Les considérations pouvant mener à la mise en évidence d'un danger élevé incluent :

• une maladie grave, de longue durée, chez les humains en bonne santé ou provoque des séquelles;
• une maladie potentiellement létale chez les humains susceptibles;
• un potentiel de transmission infectieuse horizontale ou d'infection communautaire;
• des effets létaux ou graves chez les mammifères de laboratoire lorsqu'on utilise une dose ou une concentration de danger maximal et qu'on doit ensuite procéder à des essais à doses multiples.

Les considérations pouvant mener à la mise en évidence d'un danger modéré incluent :

• des rapports de cas de maladie chez l'homme dans les publications scientifiques concernent essentiellement des populations susceptibles ou des manifestations rares, localisées et rapidement résolues d'elles-mêmes chez les humains en santé;
• un faible potentiel de transmission horizontale;
• des effets en présence d'une dose de danger maximal ou d'une dose maximale de provocation chez les mammifères de laboratoire ne sont pas létaux et ne touchent que les voies d'exposiion invasives (c.-à-d., intrapéritonéale, intraveineuse, intratrachéale) ou bien ils sont mineurs et disparaissent rapidement d'eux-mêmes.

Les considérations pouvant mener à la mise en évidence d'un danger faible incluent :

• aucun rapport de cas de maladie chez l'homme dans les publications scientifiques, ou les rapports de cas associés à des facteurs prédisposants sont peu nombreux et n'indiquent aucun potentiel de transmission secondaire, et les effets sont essentiellement mineurs, asymptomatiques ou bénins;
• une absence d'effets observables en présence d'une dose maximale de provocation chez les mammifères de laboratoire, peu importe la voie d'exposition.

Les considérations pouvant mener à la mise en évidence d'un degré d'exposition élevé incluent un micro-organisme qui :

• est rejeté en une quantité élevée, pendant une longue durée et à une fréquence élevée;
• est susceptible de survivre, de persister, de se disperser, de proliférer et de s'implanter dans l'environnement;
• est susceptible de se disséminer ou d'être transporté vers d'autres milieux naturels;
• est rejeté de telle sorte qu'il est probable que des organismes vivants ou des écosystèmes sensibles y soient exposés et que les rejets ne se limitent pas à une seule région ou à un seul écosystème;
• produit chez les organismes exposés sensibles, par l'intermédiaire des voies d'exposition, des effets toxiques ou pathogènes.

Les considérations pouvant mener à la mise en évidence d'un degré d'exposition modéré incluent un micro-organisme qui :

• est susceptible d'être rejeté dans l'environnement en une quantité, pendant une durée et à une fréquence modérée;
• est susceptible de persister dans l'environnement, mais en une quantité modérée; 
• présente un potentiel limité de dissémination et de transport; 
• est rejeté de telle sorte qu'il est probable que des organismes vivants sensibles y soient exposés;
• produit chez les organismes exposés, par l'intermédiaire des voies d'exposition, à peu près pas d'effets toxiques ou pathogènes.

Les considérations pouvant mener à la mise en évidence d'un degré d'exposition faible incluent un micro-organisme qui :

• n'est plus en utilisation;
• est utilisé dans un milieu clos (aucun rejet intentionnel);
• possède des caractéristiques biologiques ou est rejeté de telle sorte qu'il est improbable que des populations ou des écosystèmes sensibles y soient exposés;
• est susceptible d'être rejeté en une faible quantité, pendant une courte durée et à une faible fréquence et qui est peu susceptible de survivre, de persister, de se disperser ou de proliférer dans l'environnement dans lequel il est rejeté.