Méthode d’essai biologique servant à mesurer l’inhibition de la croissance de la plante macroscopique dulcicole : chapitre 6

Section 6 : Modes opératoires particuliers pour les essais sur des échantillons d’effluent, d’élutriat et de lixiviat

• 6.1 Prélèvement, étiquetage, transport et entreposage des échantillons
• 6.2 Préparation des solutions d’essai
• 6.3 Eau témoin/de dilution
• 6.4 Observations et mesures au cours de l’essai
• 6.5 Paramètres et calculs
• 6.6 Interprétation des résultats

La présente section renferme des instructions particulières sur le prélèvement et la préparation d’échantillons d’effluent, d’élutriat et de lixiviat et sur leur emploi dans les essais. Ces instructions s’ajoutent aux procédures exposées à la section 4.

6.1 Prélèvement, étiquetage, transport et entreposage des échantillons

Les contenants utilisés pour le transport et l’entreposage des échantillons ou sous-échantillons d’effluent, de lixiviat ou d’élutriat doivent être fabriqués d’un matériau non toxique. Sont recommandés les contenants souples en polyéthylène ou en polypropylène servant au transport de l’eau potable (p. ex. Reliance^MC). Leur volume peut se contracter pour s’adapter à l’intérieur d’une glacière, et le volume d’air intérieur peut être maintenu au minimum ou parfois même éliminé lorsqu’on y prélève des fractions de l’échantillon au laboratoire en vue d’essais toxicologiques ou d’analyses chimiques. Les contenants doivent être soit neufs, soit nettoyés à fond et rincés à l’eau non contaminée. Il faudrait aussi les rincer avec l’échantillon à prélever et les remplir complètement de façon à supprimer le volume d’air libre.

Avant d’entreprendre le programme, on devrait porter une attention particulière au volume de l’échantillon d’eau usée à obtenir. En général, un échantillon de 4 L d’effluent ou de lixiviat convient à un essai à concentrations multiples réalisé hors site ainsi qu’à l’analyse systématique de l’échantillon qui y est associée. Les essais à concentration unique exigent un volume moindre (v. 4.5.3). Dès le prélèvement, il faut remplir, fermer hermétiquement et étiqueter ou coder chaque contenant. On devrait indiquer sur l’étiquette au moins le type d’échantillon, son origine, la date et l’heure du prélèvement ainsi que le nom de la ou des personnes ayant procédé au prélèvement. On ne devrait pas soumettre à des essais les échantillons arrivant au laboratoire non étiquetés ou non codés, ni utiliser pour les essais courants les échantillons parvenant au laboratoire dans des contenants partiellement remplis ou non hermétiquement fermés, parce que les toxiques volatils peuvent passer dans le volume d’air. Cependant, s’il sait que la volatilité ne fait pas problème, le responsable de l’essai peut, à son gré, soumettre ces échantillons à des essais. On devrait noter la chaîne de conservation de l’échantillon au cours du prélèvement, du transport et de l’entreposage, de même que tout aspect (anomalie) de l’échantillon susceptible d’influer sur les résultats de l’essai.

On doit s’efforcer de garder les échantillons d’effluent ou de lixiviat au frais (1-7 °C, de préférence 4 ± 2 °C) durant le transport. Dès le prélèvement, il faut refroidir à 1-7 °C les échantillons tièdes (>7 °C), à l’aide de glace ordinaire (et non de glace sèche) ou de sachets réfrigérants. Au besoin, on doit ajouter dans le contenant de transport des quantités généreuses de glace, de sachets réfrigérants ou d’autres moyens de réfrigération, afin de maintenir la température de l’échantillon dans la plage de 1-7 °C durant le transport. Les échantillons ne doivent pas geler pendant le transport ou l’entreposage.

Il faut mesurer et noter la température de l’échantillon ou, le cas échéant, de l’un des sous-échantillons (on n’ouvre pas les autres sous-échantillons et on les laisse fermés hermétiquement) dès leur arrivée au laboratoire. On peut amener à la température d’essai, immédiatement ou pendant la nuit, une aliquote d’effluent ou de lixiviat dont on a besoin et l’utiliser dans l’essai. On doit garder dans l’obscurité le reste de l’échantillon ou des sous-échantillons dont on pourra avoir besoin pour le renouvellement des solutions ou pour des essais supplémentaires, dans des contenants fermés hermétiquement, sans espace libre, à 4 ± 2 °C. Quant aux élutriats et aux échantillons destinés à l’extraction en milieu aqueux puis à l’essai toxicologique, on devrait les transporter et les entreposer dans les conditions précisées pour les effluents et les lixiviats.

Les essais portant sur un effluent, un élutriat ou un lixiviat peuvent être exécutés « hors site » dans des conditions contrôlées de laboratoire. Pour ces échantillons, on recommande comme méthode normalisée l’essai sans renouvellement des solutions. Cependant, si la concentration du constituant actif de l’eau usée est susceptible de diminuer notablement au cours de l’essai, il est recommandé de procéder à un essai à renouvellement intermittent des solutions (v. 4.3).

Si l’on opte pour l’essai sans renouvellement, il faut prélever un seul échantillon d’eau usée et s’en servir pour la préparation des solutions expérimentales au début de l’essai. Si l’on opte pour l’essai à renouvellement intermittent des solutions, il faut prélever les échantillons suivant l’une des deux méthodes et approches suivantes :

1. On peut utiliser un seul échantillon d’eau usée tout au long de l’essai, à la condition de le répartir dans trois contenants (c.-à-d. trois sous-échantillons) dès son prélèvement^{Note de bas de page 72}.
2. Si l’on sait ou prévoit que la toxicité de l’eau usée évoluera notablement au cours des 7 à 10 jours d’entreposage qui précèdent l’utilisation de cette eau dans l’essai, on doit prélever des échantillons frais en au moins trois occasions distinctes, à des intervalles de deux ou trois jours ou moins. On doit utiliser ces échantillons successivement au cours de l’essai^{Note de bas de page 73}.

Si l’eau usée est instable, on peut effectuer sur place un essai à renouvellement intermittent avec une eau usée fraîche (v. 4.3).

L’essai sur des échantillons d’effluent et de lixiviat devrait débuter le plus tôt possible après le prélèvement. Dans un essai donné, il faudrait utiliser un échantillon dans les 24 h suivant le prélèvement, si possible, et pas plus de 3 jours après. Si l’on utilise des effluents ou des lixiviats dans un laboratoire sur place, les échantillons devraient servir à l’essai 24 h ou moins après le prélèvement^{Note de bas de page 74} (United States Environmental Protection Agency (USEPA), 1989, 2002).

Les échantillons de sédiment ou d’autre matière solide prélevés en vue de l’extraction en milieu aqueux puis d’un essai sur l’élutriat devraient être soumis à l’essai le plus tôt possible après leur prélèvement et pas plus de 10 jours après leur réception au laboratoire. On devrait se conformer aux modes opératoires d’Environnement Canada (EC, 1994) pour la préparation des élutriats. Dans le cas de ces derniers, on devrait utiliser si possible des aliquotes de l’échantillon préparé selon le calendrier indiqué pour les échantillons d’effluent ou de lixiviat. Il n’est pas souhaitable d’entreposer longtemps les échantillons d’élutriat parce que leur toxicité pourrait ne pas être stable. Les essais portant sur des élutriats doivent débuter dans les 3 jours suivant leur préparation, sauf indication contraire dans un règlement ou une méthode prescrite.

6.2 Préparation des solutions d’essai

Il faut agiter vigoureusement, juste avant de le vider, le contenant dans lequel l’échantillon ou le sous-échantillon a été prélevé ou entreposé pour assurer la remise en suspension des matières décantables. Il faut mesurer, immédiatement avant emploi, le pH de chaque échantillon ou sous-échantillon.

Normalement, il n’est ni nécessaire ni recommandé de filtrer les échantillons ou les sous-échantillons. Cependant, si les échantillons d’eau usée sont mélangés avec de l’eau réceptrice ou en contiennent (p. ex. effluent prélevé dans la zone de mélange d’un lac ou d’un cours d’eau), ils peuvent renfermer des algues, de sorte qu’il pourrait être nécessaire de les filtrer pour réduire le risque de contamination (c.-à-d. une croissance excessive des algues) pendant l’essai. Tout échantillon d’eau usée devrait être examiné au microscope afin de détecter la présence éventuelle d’algues. Le cas échéant, il faudrait passer les échantillons sur des filtres en fibre de verre (à pores d’environ 1 µm, p. ex. filtres Whatman GF/C (glass filter grade C) pour réduire le risque de contamination par les algues. On peut ensuite les passer sur des filtres à ouvertures de 0,22 µm afin de supprimer tout risque résiduel de contamination par les algues (SRC, 1997). Ces filtrations pourraient arrêter des matières en suspension caractéristiques de l’échantillon, qui risquent autrement de contribuer à une partie de la toxicité ou de la modifier. Si l’on s’inquiète de l’effet de la filtration sur la toxicité, on devrait effectuer un deuxième essai (simultané), en tout point identique au premier si ce n’est qu’il porte sur une portion de l’échantillon ou du sous-échantillon non filtré.

On doit ensuite enrichir un échantillon d’eau usée avec les mêmes nutriments que ceux ayant servi à préparer les milieux de croissance APHA (American Public Health Association) modifiés (eau usée enrichie de nutriments) (v. 6.3; tableau 5). On ajoute une aliquote de chacune des trois solutions mères nutritives (A, B, C) à l’échantillon d’eau usée selon un ratio de 10 mL pour 1 000 mL d’échantillon, ce qui en diminue le titre à 97 %. On aère ensuite l’échantillon enrichi pendant 20 min (v. 4.1) avant de le répartir entre les récipients de répétition.

6.3 Eau témoin/de dilution

Pour les essais réalisés sur des effluents ou des lixiviats afin d’en déterminer la conformité aux règlements, on doit utiliser le milieu APHA modifié (tableau 5) ou un échantillon de l’eau réceptrice enrichie de solutions mères nutritives APHA modifiées (eau réceptrice enrichie de nutriments) comme eau témoin/de dilution. Il faut définir les objectifs de l’essai avant de choisir l’eau témoin/de dilution qui conviendra, car les résultats pourraient différer selon les deux types d’eau. On devrait aussi tenir compte des difficultés et des coûts reliés au prélèvement et à l’expédition des échantillons d’eau réceptrice devant servir d’eau témoin/de dilution.

On prépare le milieu APHA (modifié) à l’aide de trois solutions mères, comme il est indiqué au tableau 5. On prépare les solutions mères avec des produits chimiques de qualité réactif, dans de l’eau distillée sous verre, de l’eau désionisée ou l’équivalent. Pour préparer 1 L de milieu, on ajoute 10 mL de chaque solution mère (A, B, C) à 970 mL d’eau distillée dans une bouteille de 1 L. On aère le tout vigoureusement pendant au moins 1-2 h. Si l’on prépare un volume plus important de milieu (>4 L), on recommande l’aération de ce dernier pendant la nuit afin de stabiliser le pH. Immédiatement avant l’essai, on rajuste le pH du milieu à 8,3 ± 0,1 au moyen de NaOH ou de HCl 0,5 N^{Note de bas de page 75}. On ne stérilise pas le milieu. On peut entreposer séparément les solutions A, B et C au réfrigérateur (4 ± 2 °C) pendant un mois au plus.

Le milieu APHA modifié constitue l’eau témoin/de dilution exigée ordinairement pour les échantillons d’effluent, d’élutriat et de lixiviat. Cependant, il pourrait être souhaitable d’utiliser de l’eau réceptrice comme eau témoin/de dilution lorsqu’on doit obtenir, pour un site particulier, des renseignements sur l’effet toxique éventuel d’un effluent, d’un lixiviat ou d’un élutriat sur une eau réceptrice donnée (v. la note 40 et la sous-section 4.1). Un exemple important d’une telle situation serait la détermination de l’effet sublétal d’une substance ou d’une matière à la périphérie de la zone de mélange, conformément aux exigences réglementaires visant un site donné. Pour le prélèvement, le transport et l’entreposage de ces échantillons d’eau réceptrice, on devrait se plier aux conditions décrites en 6.1.

Avant de l’utiliser, on passe sur un filtre en fibre de verre (pores d’environ 1 µm, p. ex. filtre Whatman GF/C) une aliquote de l’eau réceptrice qui servira d’eau témoin/de dilution pour réduire le risque de contamination des milieux d’essai par les algues. On peut passer ensuite l’échantillon d’eau réceptrice sur des filtres à ouvertures de 0,22 µm, pour empêcher la croissance d’algues (SRC, 1997). Il faut ensuite enrichir l’eau réceptrice selon les mêmes concentrations de nutriments que le milieu APHA modifié [10 mL de chacune des solutions mères (A, B, C) pour 1 000 mL d’eau réceptrice]. On devrait aérer vigoureusement les échantillons d’eau réceptrice enrichie pendant 1-2 h (ou plus longtemps dans le cas de volumes plus importants), sans rajuster le pH, pour stabiliser ce dernier^{Note de bas de page 76}. On enregistre avant l’essai le pH de l’eau réceptrice enrichie et aérée.

Si l’on doit utiliser un échantillon d’eau réceptrice d’amont comme eau témoin/de dilution, il faut préparer une solution témoin distincte à l’aide du milieu APHA modifié. Les conditions expérimentales et les modes opératoires de l’évaluation de chaque solution témoin devraient être identiques à ceux décrits à la section 4 et en 5.3.

Si l’on vise un degré poussé d’uniformisation, on devrait utiliser le milieu APHA modifié pour toutes les dilutions et comme eau témoin, puisque l’emploi d’un milieu donné accroît la probabilité de réduire l’influence qu’exercent des compositions différentes de l’eau de dilution. Cela est particulièrement indiqué dans les études approfondies visant à corréler les données toxicologiques relatives à divers types et sources d’effluents, de lixiviats ou d’élutriats provenant d’un certain nombre de laboratoires. Il est alors souhaitable de réduire au minimum l’influence des propriétés chimiques de l’eau de dilution.

6.4 Observations et mesures au cours de l’essai

Outre les observations et mesures décrites en 4.4, il faudrait en effectuer d’autres au cours des essais sur des effluents, des élutriats et des lixiviats.

Avant et après la filtration de l’échantillon, on devrait en observer et en noter la couleur, la turbidité, l’odeur et l’homogénéité (présence de matières flottantes ou de décantats). On devrait noter tout changement survenant au cours de la préparation de l’échantillon pour essai (p. ex. précipitation, floculation, changement de couleur ou d’odeur, émission de matières volatiles), de même que tout changement d’aspect des solutions au cours de l’essai (p. ex. formation de mousse, dépôt, floculation, accroissement ou diminution de la turbidité, changement de couleur).

Dans le cas d’échantillons d’effluents renfermant une quantité appréciable de matières solides, il est souhaitable de mesurer dès leur réception leur teneur en matières totales en suspension et en matières décantables (APHA et coll., 1995). Ces caractéristiques font partie de la description globale de l’effluent et elles sont susceptibles d’influer sur les résultats de l’essai toxicologique. On devrait aussi effectuer des mesures supplémentaires qui aideraient à caractériser chaque échantillon d’effluent, de lixiviat ou d’élutriat : pH, conductivité, dureté, alcalinité, couleur, demande chimique d’oxygène, demande biochimique d’oxygène, oxygène dissous, concentrations de certains contaminants toxiques (p. ex. acides résiniques, chlorophénols, métaux dissous, chlore, chloramine, ammoniaque), notamment.

6.5 Paramètres  et calculs

Les paramètres à mesurer au cours des essais sur des échantillons d’eau usée sont habituellement les CI₂₅ fondées sur l’augmentation du nombre de thalles au cours de l’essai et sur la masse sèche des thalles à la fin de l’essai (indicateurs de la croissance). Pour les essais réalisés aux fins de la surveillance ou de la réglementation des effluents, des lixiviats ou des élutriats, on doit utiliser les options et les paramètres standards définis à la section 4.

Normalement, les essais réalisés à des fins de surveillance ou de vérification de la conformité aux règlements devraient comprendre, pour le moins, trois répétitions ou plus de l’échantillon ou des sous-échantillons non dilués (ou une dilution précisée de ces derniers) et trois solutions témoins ou plus de répétition. Selon les exigences réglementaires précisées, on pourrait limiter les essais de détermination de la conformité à une seule concentration (p. ex. échantillon « non dilué », soit 97 % de la concentration d’origine selon la présente méthode, sauf indication contraire); on pourrait aussi exiger une série de concentrations (c.-à-d. un essai à concentrations multiples) (v. 4.5.2). Les essais à concentration unique sont souvent d’un bon rapport coût-efficacité lorsqu’il s’agit de déterminer si l’on est en présence d’une toxicité mesurable et d’évaluer préalablement un nombre élevé d’échantillons.

On pourrait adapter à des fins spéciales l’essai toxicologique normalisé, par exemple pour repérer dans une usine les sources de toxicité ou pour évaluer l’efficacité de changements apportés aux procédés ou du traitement des effluents dans une usine. Les essais pourraient porter sur une série de concentrations ou une seule concentration (97 % de la concentration d’origine ou une dilution convenable, plus un témoin). Les paramètres à mesurer dépendraient des objectifs, mais ils pourraient englober des limites arbitraires « satisfaisant/non satisfaisant » ou le taux de ralentissement de la croissance à une concentration donnée (4.5.3).

La sous-section 4.5.3 fournit des indications pertinentes sur l’analyse statistique et les comptes rendus consécutifs aux séries d’essais sur différents échantillons évalués chacun à une concentration seulement.

6.6 Interprétation des résultats

Dans tout essai utilisant comme eau témoin/de dilution une autre eau que le milieu APHA modifié, on devrait veiller particulièrement à comparer la croissance des Lemna dans cette eau témoin/de dilution à celle de témoins standards dans le milieu APHA modifié. Il est nécessaire de procéder à une comparaison statistique pour déterminer si l’eau témoin/de dilution est phytotoxique (v. 4.5.3). Il faut signaler toute augmentation de la croissance dans les solutions d’essai par rapport à la croissance dans les solutions témoins et en tenir compte dans l’interprétation des résultats de l’essai (v. 4.5.2 et 4.5.4).