Méthode d’essai biologique servant à mesurer l’inhibition de la croissance de la plante macroscopique dulcicole : chapitre 4

Section 4 : Procédures d’essai universelles

• 4.1 Préparation des solutions d’essai
• 4.2 Démarrage de l’essai
• 4.3 Conditions expérimentales
  • 4.3.1 pH
• 4.4 Observations et mesures au cours de l’essai
• 4.5 Paramètres et calculs
  • 4.5.1 Validité de l’essai
  • 4.5.2 Essais à concentrations multiples
  • 4.5.3 Essais à concentration unique
  • 4.5.4 Effets stimulants
  • 4.5.5 Autres plans d’expérience et utilité de ceux-ci
• 4.6 Toxique de référence
• 4.7 Considérations d’ordre juridique

Les procédures énoncées dans la présente section s’appliquent à chacun des essais toxicologiques prévus pour des échantillons de substances chimiques, d’eau usée ou d’eau réceptrice décrits aux sections 5, 6 et 7. Tous les aspects du système d’essai présenté à la section 3 doivent être intégrés dans les procédures d’essai universelles. Le tableau 3 décrit, sous forme de liste de contrôle, les procédures universelles recommandées pour la réalisation d’essais d’inhibition de la croissance de L. minor, de même que les conditions et procédures applicables à des types précis de substances ou de matières.

On décrit les procédures universelles pour la réalisation d’un essai toxicologique de 7 jours selon les deux options suivantes :

1. un essai sans renouvellement des solutions;
2. un essai à renouvellement intermittent des solutions, au moins tous les trois jours, au cours de l’essai.

Pour les solutions expérimentales dans lesquelles la concentration de la substance d’essai (ou d’un constituant biologiquement actif) risque de diminuer notablement au cours de l’essai^{Note de bas de page 38}, du fait de facteurs tels que la volatilisation, la photodégradation, la précipitation ou la biodégradation, on recommande la seconde option (Institut de recherche environnementale appliquée (ITM), 1990; l’Organisation de coopération et de développement économiques (OCDE), 1998, 2002)^{Note de bas de page 39}.

Les paramètres biologiques mesurés sont l’augmentation du nombre de thalles au cours de l’essai, de même que la masse sèche de ces derniers à la fin de l’essai.

4.1 Préparation des solutions d’essai

Il faut nettoyer et rincer à fond tous les récipients, les dispositifs de mesure, les agitateurs, les appareils de transfert (p. ex. les anses d’inoculation) et toutes les autres pièces d’équipement, conformément aux modes opératoires normalisés (v. EC, 1992a, pour ce qui concerne le nettoyage de la verrerie). Au dernier rinçage, on devrait utiliser de l’eau distillée ou désionisée pour les articles à utiliser immédiatement dans les préparatifs de l’essai. Si ces articles doivent être rangés, il faudrait les rincer dans l’eau distillée ou désionisée, les sécher à l’étuve et les recouvrir pour éviter leur contamination avant emploi.

Dans un essai donné, il faut utiliser la même eau témoin/de dilution (milieu d’essai) pour préparer les solutions témoins et toutes les concentrations d’essai. On devrait préparer cette eau de la façon exposée en 5.3, 6.3 ou 7.3 selon que l’essai porte sur des substances chimiques, une eau usée ou une eau réceptrice, respectivement.

Tableau  3. Liste de contrôle des conditions et des procédures recommandées pour les essais toxicologiques avec Lemna minor

Les caractéristiques de l’eau témoin/de dilution utilisée tout au long de l’essai devraient être uniformes. Dans le cas d’un essai à renouvellement intermittent, on améliore l’uniformité dans l’échantillon si l’on entrepose convenablement un volume suffisant d’eau témoin/de dilution pour parachever l’essai et si l’on en utilise des aliquotes pour le renouvellement périodique des solutions d’essai (sous-section 4.3).

Si l’on utilise comme eau témoin/de dilution de l’eau réceptrice ou de l’eau d’amont afin de simuler les conditions locales -- comme un rejet d’effluent, un déversement de produits chimiques ou une pulvérisation de pesticides --, il faut préparer une deuxième solution témoin à l’aide du milieu d’essai (milieu APHA modifié, milieu SIS ou milieu Steinberg modifié; v. 5.3, 5.6, 6.3 et 6.6). On ne peut pas utiliser d’eau d’amont ou d’eau réceptrice s’il est évident que cette eau est toxique et qu’elle entraîne des résultats invalides chez le témoin, selon les critères de la présente méthode^{Note de bas de page 40}. Dans ce cas, on devrait utiliser le milieu d’essai comme eau témoin/de dilution.

Il faut rajuster, au besoin, la température de l’eau témoin/de dilution et celle de l’échantillon ou de chaque solution expérimentale à ±2 °C de la température d’essai, avant le début de l’essai. On peut rajuster la température de l’échantillon ou des solutions d’essai par chauffage ou refroidissement dans un bain d’eau, mais on ne doit pas utiliser un thermoplongeur, car cela pourrait altérer la composition chimique et la toxicité.

S’il faut filtrer un échantillon (d’eau réceptrice ou d’eau usée renfermant des algues, p. ex.), on le passe sur un filtre en fibre de verre (taille des pores d’environ 1 µm, p. ex. filtre Whatman GF/C) avant l’essai (v. 6.2 et 7.2). On enregistre ensuite le pH de l’échantillon. On ajoute à l’échantillon d’eau usée ou d’eau réceptrice une aliquote de chacune des solutions mères nutritives utilisées pour préparer le milieu APHA modifié (c.-à-d. des solutions mères A, B et C), à raison de 10 mL d’aliquote par 1 000 mL d’échantillon. L’échantillon est ainsi dilué à 97 % de sa valeur initiale, ce qui représente la concentration maximale d’eau usée ou d’eau réceptrice (ou de tout autre échantillon exigeant une dilution de volume à volume) que l’on peut soumettre à l’essai. Les concentrations nominales des solutions corrigées en fonction du volume de solution mère nutritive (ou, dans le cas des substances chimiques, les concentrations mesurées; v. 5.4) sont adoptées comme concentrations d’essai.

Il faut ensuite aérer les échantillons d’effluent, d’élutriat, de lixiviat ou d’eau réceptrice avant de les employer pour préparer les solutions d’essai. L’aération préalable des échantillons d’eau usée et d’eau réceptrice enrichis permet d’équilibrer ceux-ci avec les nutriments ajoutés et d’en stabiliser le pH, après ajout des solutions mères nutritives. On devrait fournir l’air comprimé (exempt d’huile) par un flexible à embout jetable en verre ou en plastique (p. ex. tube capillaire ou pipette à cône d’Eppendorf) percé d’un petit orifice (p. ex. 0,5 mm de diamètre intérieur). Son débit ne devrait pas excéder 100 bulles/min^{Note de bas de page 41}, et sa durée doit être de 20 min^{Note de bas de page 42}.

On pourrait devoir rajuster le pH de l’échantillon ou des solutions (v. 4.3.1). Il faudrait normalement utiliser à cette fin de l’acide chlorhydrique (HCl) ou de l’hydroxyde de sodium (NaOH) ≤1 N. Dans certains cas (p. ex. échantillons d’effluents fortement tamponnés), on pourrait devoir utiliser des solutions plus concentrées d’acide ou de base.

Pour tout essai visant à estimer la CI_p (v. 4.5), il faut préparer au moins 7 concentrations plus une solution témoin (100 % de milieu d’essai); on recommande de préparer un nombre plus grand (>8, plus un témoin) pour augmenter la probabilité que chaque paramètre visé soit encadré. Les dilutions convenables peuvent suivre une progression géométrique, chaque concentration successive étant la moitié moins élevée que celle qui précède (p. ex. 100, 50, 25, 12,5, 6,3, 3,1 et 1,6 ou, dans le cas d’échantillons d’eau usée et d’eau réceptrice, 97, 48,5, 24,3, 12,1, 6,1, 3,0 et 1,5). On peut choisir les concentrations d’essai dans une autre série de dilutions convenable (p. ex. 100, 75, 56, 42, 32, 24, 18, 13, 10 et 7,5; v. la colonne 7 à l’annexe G). Habituellement, un rapprochement des concentrations supérieur à une dilution de 50 % n’améliore pas beaucoup la précision de l’essai. Dans les essais courants, le coefficient de dilution ne devrait pas être inférieur à 0,3, parce que cela mène à une estimation peu précise du paramètre ultime de mesure de la toxicité. Si l’incertitude entourant les concentrations toxiques est considérable, on devrait utiliser un plus grand nombre de concentrations pour obtenir un plus grand étalement plutôt que d’utiliser un coefficient de dilution plus faible pour espacer davantage les concentrations.

Les dilutions peuvent être préparées directement dans les récipients d’essai. On transfère d’abord à la pipette les volumes convenables d’eau témoin/de dilution dans chaque récipient d’essai. On ajoute ensuite dans chaque récipient d’essai l’échantillon préalablement aéré enrichi de nutriments, puis on mélange bien le tout pour obtenir les concentrations d’essai recherchées. On peut aussi préparer les dilutions d’essai dans des fioles jaugées, puis les répartir dans les récipients de répétition. Ces récipients sont laissés à la température ambiante pendant 1 h pour permettre l’équilibrage du milieu et du toxique.

Lorsque l’incertitude au sujet de la toxicité d’un échantillon est appréciable, il est avantageux de réaliser un essai préliminaire dans le seul but de choisir les concentrations à utiliser dans l’essai définitif. Les conditions et procédures de l’essai préliminaire devraient être identiques à celles de l’essai définitif; cependant, le plan expérimental pourrait différer. Une large gamme de concentrations (p. ex. au moins deux ordres de grandeur) devrait faciliter le choix des concentrations de l’essai définitif.

Pour les essais à concentration unique menés à des fins réglementaires (p. ex. satisfaisant ou non satisfaisant), on ferait normalement appel à un effluent, un lixiviat, une eau réceptrice ou un élutriat non dilués (ou, dans le cas de la présente méthode, à 97 % de sa concentration d’origine) ou à une concentration arbitraire ou prescrite de substance chimique. Pour les témoins, on appliquerait le même principe que pour les essais à concentrations multiples. La présente méthode ne décrit pas spécifiquement les essais à concentration unique, mais les modes opératoires sont évidents et tous les éléments s’appliquent, sauf que l’essai n’emploie qu’une seule concentration et un seul témoin.

Pour un essai à concentration unique, il faut prévoir au moins trois récipients de répétition et autant de récipients témoins. Pour un essai à concentrations multiples, on peut avoir recours à un nombre égal ou inégal de répétitions pour tous les traitements. Si l’on opte pour un nombre égal, il faut prévoir au moins quatre récipients de répétition pour chaque traitement. Par ailleurs, on peut utiliser un nombre inégal de répétitions pour tous les traitements (modèle de régression) lorsqu’on dispose de données historiques et/ou que le laboratoire a acquis de l’expérience en ce qui a trait aux mesures de la dose-réponse^{Note de bas de page 43}. Si l’on opte pour un nombre inégal de répétitions pour tous les traitements, il faudrait préparer six récipients de répétition pour le ou les témoins, quatre récipients pour les trois à cinq concentrations d’essai les plus basses et trois récipients pour les quatre ou cinq concentrations les plus élevées.

4.2 Démarrage de l’essai

On devrait entreprendre l’essai après avoir préparé les solutions et apporté les rajustements autorisés ou nécessaires à la température, au pH et aux filtrations (v. 4.1, 6.2 et 7.2).

Les thalles de Lemna doivent provenir de cultures satisfaisant aux exigences énoncées en 2.3 et aux critères de santé exposés en 2.3.8. Pour les essais à concentrations multiples, on choisit dans la culture acclimatée des plantes à trois thalles, de taille et d’état identiques (ou aussi identiques que possible)^{Note de bas de page 44}. On peut transférer directement les plantes de la culture acclimatée dans les gobelets qui serviront aux essais; on peut aussi les déposer dans un plat peu profond renfermant du milieu d’essai frais avant de les transférer dans les gobelets. Cette dernière façon de faire est particulièrement utile, car on peut ainsi s’assurer que le nombre de Lemna convient et que les plantes sont de qualité identique avant le démarrage de l’essai (Moody, 1998).

On doit mettre un nombre identique de thalles dans chaque récipient d’essai. Pour démarrer l’essai, on attribue au hasard deux Lemna à trois thalles à chaque récipient d’essai et on les y transfère (pour un total de six thalles par récipient) à l’aide d’une anse d’inoculation stérile en plastique jetable. On immerge brièvement les plantes dans la solution d’essai. On doit veiller à ne pas contaminer les Lemna désignées pour l’essai pendant le transfert dans les gobelets individuels. Si les plantes sont choisies directement à même la culture acclimatée ou dans un seul plat de Lemna rincées désignées pour l’essai (voir ci-dessus), on devrait utiliser une anse distincte pour chaque plante ou on devrait rincer l’anse dans de l’eau distillée/désionisée avant de la plonger de nouveau dans le plat de Lemna rincées. On peut aussi déposer un nombre suffisant de Lemna dans un plat peu profond rempli de milieu d’essai en vue de les répartir entre les répétitions d’une même concentration (essai à concentration unique). On peut utiliser la même anse pour transférer les Lemna dans chaque gobelet d’une concentration donnée. On doit veiller à ce que la plante n’adhère pas aux parois du gobelet et à ce que les radicelles soient à l’intérieur de ce dernier. Toute plante dont des parties se détachent au cours du transfert doit être remplacée.

Pendant ces manipulations, on doit procéder à une répartition aléatoire formelle des organismes dans les différents récipients. Le groupe de récipients de répétition réservé à un traitement donné (p. ex. une concentration expérimentale particulière) doit également être réparti en des endroits choisis au hasard dans l’enceinte environnementale ou la zone d’essai. On doit coder ou étiqueter les récipients pour bien identifier l’échantillon et sa concentration. Il faut enregistrer la date et l’heure du démarrage de l’essai sur des feuilles distinctes, prévues spécialement pour l’essai.

Les transferts de Lemna devraient se dérouler dans un endroit propre, à l’abri des courants d’air, le plus rapidement possible, pour réduire au minimum le risque de contamination des colonies. Dès que les plantes ont été mises dans les récipients d’essai, on devrait veiller à ne pas agiter ou à ne pas faire tourbillonner ces derniers afin que les plantes n’adhèrent pas aux parois. La première journée d’exposition des Lemna aux solutions est dite jour 0. En conséquence, le jour 7 correspond à la fin de l’essai.

4.3 Conditions expérimentales

L’essai d’inhibition de la croissance de L. minor dure 7 jours. Il peut s’agir d’un essai ne comportant aucun renouvellement des solutions pendant la durée de l’essai, ou, dans le cas de substances, matières ou produits chimiques dégradables, d’un essai à renouvellement intermittent des solutions.

Dans un essai à renouvellement intermittent, il faut remplacer chaque solution expérimentale tous les 3 jours (c.-à-d. aux jours 3 et 5), au moins, pendant l’essai (v. 5.2 et 6.1)^{Note de bas de page 45}. On devrait préparer les solutions de remplacement et les récipients d’essai conformément aux indications fournies en 4.1. On doit transférer avec soin les colonies de Lemna dans leurs récipients respectifs de solution fraîche, en veillant à réduire au minimum leur contamination. Ce transfert doit se faire aléatoirement, d’une répétition à l’autre d’une concentration donnée et il faudrait se conformer aux procédures décrites en 4.2 pour la manipulation des plantes. On devrait déterminer les caractéristiques physicochimiques des vieilles solutions (v. 4.4), puis se débarrasser de ces dernières (en respectant les règlements provinciaux et fédéraux) ou les conserver si des déterminations chimiques supplémentaires sont nécessaires (v. 5.4).

On utilise pour les essais 2 Lemna par volume de 100 mL (ou de 150 mL) de solution expérimentale dans chacun des récipients d’essai de répétition (v. 3.3 et 4.1).

L’essai doit se dérouler à une température moyenne quotidienne de 25 ± 2 °C. L’éclairage doit être conforme aux indications fournies en 3.2. Les solutions d’essai ne doivent pas être aérées au cours de l’essai et ce dernier doit prendre fin au bout de 7 jours.

L’essai doit être considéré comme invalide si, à la fin de la période d’essai, le nombre moyen de thalles chez les témoins n’est pas au moins 8 fois plus élevé qu’au départ (en d’autres termes, le nombre moyen de thalles par récipient témoin doit être d’au moins 48 pour que l’essai soit valide).

4.3.1 pH

Normalement, les essais toxicologiques ne devraient pas exiger le rajustement du pH. Cependant, si l’échantillon de la substance d’essai déplace le pH à l’extérieur de la plage de 6,5 à 9,5 pour les essais en milieu APHA modifié, de 6,0 à 8,0 pour ceux en milieu SIS et de 5,0 à 8,0 pour ceux en milieu Steinberg modifié, et si l’on évalue la toxicité de la substance d’essai plutôt que les effets nocifs ou l’influence du pH, on devrait rajuster le pH des solutions d’essai ou de l’échantillon, ou encore effectuer en parallèle un deuxième essai à pH rajusté. Pour ce deuxième essai, on peut neutraliser le pH initial de l’échantillon, des solutions d’essai ou de chaque solution fraîche avant le renouvellement des solutions (essais à renouvellement intermittent), selon les objectifs de l’essai (réglage à pH 7,0) ou le rajuster à moins de ±0,5 unité de pH de celui de l’eau témoin/de dilution, avant l’exposition des Lemna. Une autre méthode acceptable pour ce deuxième essai consiste à rajuster le pH de l’échantillon à l’intérieur de la plage de 5,0 à 7,0 (si le pH de l’échantillon est inférieur à 5,0 ou si ce dernier a abaissé le pH à cette valeur) ou à 9,0-9,5 (si le pH de l’échantillon est supérieur à 9,5 ou si ce dernier a haussé le pH à cette valeur). On devrait normalement utiliser, pour tous les rajustements du pH, des solutions de HCl ou de NaOH 1 N ou moins. Certains échantillons (p. ex. échantillons d’effluent fortement tamponnés) pourraient exiger des solutions plus concentrées d’acide ou de base.

S’il faut rajuster le pH de l’échantillon, on le fait après addition des solutions mères nutritives et après aération préalable (v. 4.1). S’il faut rajuster le pH de plus de 0,5 unité, on recommande encore 30 min d’aération suivies d’un autre rajustement du pH (SRC, 1997). Abernethy et Westlake (1989) donnent des indications utiles sur le rajustement du pH. On devrait laisser reposer les aliquotes d’échantillon ou de solution d’essai dont on rajuste le pH pour que l’équilibre se fasse après chaque addition d’acide ou de base. Le temps d’équilibrage dépend de la capacité tampon de la solution ou de l’échantillon. Pour les échantillons d’effluent, on recommande une période de 30 à 60 min pour le rajustement du pH (Abernethy et Westlake, 1989). Dès la mise en route de l’essai, on surveille le pH de chaque solution, mais sans le rajuster. Il faut noter les volumes des solutions nutritives ajoutées, de même que ceux de NaOH et de HCl utilisés pour rajuster le pH, et s’en servir pour calculer la concentration nominale de la substance au début de l’essai.

Si l’objet de l’essai toxicologique est d’élucider la nature des toxiques présents dans la substance d’essai, on utilise souvent le rajustement du pH au même titre que d’autres techniques (p. ex. oxydation, filtration, entraînement à l’air, ajout d’un agent chélateur) pour caractériser et identifier les agents toxiques de l’échantillon. Ces techniques d’identification des agents toxiques constituent, pour les responsables des essais, des moyens utiles pour évaluer la nature physicochimique du ou des toxiques et leur sensibilité à la détoxication (USEPA, 1991a, 1991b).

4.4 Observations et mesures au cours de l’essai

Il faut observer et dénombrer les thalles dans chaque récipient au début et à la fin de l’essai (jours 0 et 7)^{Note de bas de page 46}. Les solutions témoins doivent être traitées de façon identique. Pour faciliter l’observation des plantes, on peut utiliser une loupe, un microscope à dissection ou tout autre moyen de grossissement, la lumière étant dirigée vers le côté ou le fond du récipient.

À chaque observation, il faut relever et enregistrer le nombre de thalles dans chaque récipient. Le dénombrement doit englober tous les thalles^{Note de bas de page 47} et tous les bourgeons visiblement saillants. On devrait aussi observer et noter les phénomènes suivants dans chaque récipient : chlorose (dépigmentation); nécrose (mort du tissu des thalles par endroit, d’aspect brun ou blanc); thalles jaunes ou d’une taille anormale; gibbosité (aspect bosselé ou gonflé des thalles); destruction de la colonie (thalles simples); destruction des radicelles; réduction de la flottabilité (v. la figure 2).

Il faut surveiller la température durant l’essai et la mesurer au moins tous les jours dans des récipients représentatifs (c.-à-d. au moins dans les concentrations élevée, médiane et faible, de même que dans les solutions témoins s’il s’agit d’un essai à concentrations multiples). On peut préparer des récipients supplémentaires pour y mesurer la température de l’eau. Si la mesure se fait dans d’autres récipients que les récipients d’essai (c.-à-d. dans l’incubateur ou dans une pièce à température contrôlée à proximité des récipients d’essai), il faut établir le rapport qui existe entre ces lectures et la température à l’intérieur des récipients. Sont acceptables l’enregistrement continu ou la mesure quotidienne des températures maximale et minimale.

Qu’il s’agisse d’un essai sans renouvellement ou à renouvellement intermittent des solutions, il faut mesurer le pH au début de l’essai, avant le transfert des Lemna ainsi qu’à la fin de l’essai, au moins dans les récipients où se trouvent les concentrations élevée, médiane et faible ainsi que dans le ou les témoins. Pour les essais à renouvellement intermittent des solutions, il faut aussi mesurer le pH immédiatement avant et immédiatement après chaque renouvellement (c.-à-d. dans les solutions fraîches et dans celles qu’il faut jeter) au moins dans les concentrations élevée, médiane et faible ainsi que dans le ou les témoins.

Il faut mesurer le débit de fluence photonique au moins une fois au cours de l’essai en des points situés à peu près à la même distance de la source lumineuse que les thalles des Lemna et en plusieurs endroits dans la zone d’essai.

On devrait prendre note de l’aspect général des échantillons pour essai et de tout changement survenant au cours de la préparation des solutions expérimentales, de même que de tout changement d’aspect de ces solutions au cours de l’essai (v. 5.4, 6.4 et 7.4).

On enregistre le nombre de thalles dans chaque répétition du témoin et dans les diverses concentrations de la substance d’essai, au début et à la fin des 7 journées d’exposition. On devrait exclure de l’essai les récipients d’où l’on a retiré accidentellement des thalles et des colonies ou dont les thalles et les colonies adhèrent aux parois (et ont séché) et ne pas les faire entrer dans le calcul du paramètre.

Une fois dénombrés, les thalles de Lemna sont séchés et pesés. Dans chaque récipient de solution d’essai, on détermine la masse sèche collective des thalles. On recueille les colonies présentes dans les récipients respectifs (y compris les radicelles), on les éponge jusqu’à siccité^{Note de bas de page 48} et on les fait sécher immédiatement à l’étuve, dans de petites nacelles tarées et numérotées, soit à 100 °C pendant 6 h, soit à 60 °C pendant 24 h. Au sortir de l’étuve, il faut porter immédiatement les nacelles au dessiccateur. Ensuite, en les choisissant au hasard, on récupère les nacelles individuellement et on les pèse sur une balance dont la précision à 0,01 mg près est constante. Pour éviter l’absorption excessive et erratique de vapeur d’eau, il faut procéder rapidement et consacrer le même temps à chaque nacelle. On devrait récupérer les nacelles au hasard pour leur pesée; la première nacelle devrait être remise dans le dessiccateur, puis pesée de nouveau à la fin de toutes les pesées pour vérifier l’absorption d’eau par les dernières nacelles pesées. L’écart avec la première masse obtenue ne devrait pas être supérieur à 5 %. Sinon, il faudrait remettre à sécher les nacelles pendant 1 ou 2 h puis les peser de nouveau. On devrait tarer quelques nacelles, les faire sécher et les peser, sans plantes, et les résultats devraient être conformes aux normes de contrôle de la qualité du laboratoire. Il faut déterminer la masse sèche totale des thalles dans chaque récipient (c.-à-d. dans chaque répétition de chaque concentration et dans le ou les témoins).

4.5 Paramètres  et calculs

Les paramètres se fondent sur les effets néfastes des matières ou substances d’essai sur la croissance de L. minor, évalués par comparaison avec les témoins. L’essai comporte deux paramètres biologiques, le premier étant une augmentation moindre du nombre de thalles par rapport au témoin, et le deuxième, une masse sèche finale des thalles inférieure à celle du témoin. On calcule l’augmentation du nombre de thalles en soustrayant le nombre initial de thalles dans un récipient d’essai donné du nombre final de thalles dans le même récipient. Pour déterminer la réduction de la masse sèche des thalles, on compare la masse sèche totale des thalles de Lemna à celle du témoin à la fin de l’essai (jour 7). Il s’agit essentiellement d’une mesure de la croissance, sauf que la masse initiale n’est pas déterminée.

4.5.1 Validité de l’essai

Si l’on suppose que toutes les conditions et tous les modes opératoires recommandés sont respectés^{Note de bas de page 49}, le nombre moyen de thalles chez les témoins doit être au moins 8 fois plus élevé qu’au départ, à la fin de l’essai de 7 jours, pour que ce dernier soit valide (en d’autres termes, le nombre moyen de thalles chez les témoins doit être d’au moins 48 par récipient à la fin de l’essai).

4.5.2 Essais à concentrations multiples

Dans un essai à concentrations multiples, le paramètre statistique exigé pour les données sur la croissance (nombre de thalles, masse sèche des thalles) est une CI_p^{Note de bas de page 50,Note de bas de page 51} et ses limites de confiance à 95 %. Il faut calculer une CI_p distincte et sa limite de confiance à 95 % pour chacun des deux paramètres biologiques (soit l’augmentation moindre du nombre de thalles et la réduction de la masse sèche totale). À cette fin, on utilise directement les paramètres quantitatifs (c.-à-d. l’augmentation du nombre de thalles et la masse sèche totale). On trouvera dans EC (2005) des explications et des conseils pour le calcul de la CI_p, y compris des diagrammes de décision pour orienter le choix des tests statistiques pertinents. Tous les tests statistiques utilisés pour calculer les paramètres exigent que les concentrations soient exprimées sous forme de logarithmes et, le cas échéant, qu’elles soient corrigées pour tenir compte du volume de solution nutritive utilisé (c.-à-d. une dilution à 97 %).

Il est vivement recommandé de tracer un diagramme initial des données brutes (augmentation du nombre de thalles, masse sèche) en fonction du logarithme de la concentration afin d’obtenir une représentation visuelle des données, d’une part, et de vérifier si les résultats obtenus sont raisonnables en regard des calculs statistiques ultérieurs, d’autre part^{Note de bas de page 52}. Tout écart important entre le graphique de la CI_p approximative et la CI_p calculée à l’aide d’un programme informatique doit être expliqué. Le graphique permettrait aussi de déterminer si un lien logique a été obtenu entre la concentration logarithmique (ou, dans certains cas, la concentration) et l’effet, ce qui est souhaitable dans tout essai valide (EC, 2005).

L’analyse de régression constitue la principale méthode statistique à utiliser pour calculer la CI_p. Un certain nombre de modèles permettent d’évaluer les données sur la croissance (à l’aide d’un test statistique quantitatif) au moyen d’une analyse de régression. Pour que les méthodes de régression puissent être utilisées, les données doivent satisfaire aux hypothèses de normalité et d’homoscédasticité. Des techniques de pondération peuvent être appliquées pour réaliser l’hypothèse d’homoscédasticité. Il convient aussi d’examiner les données afin de détecter les valeurs aberrantes à l’aide d’une des méthodes recommandées (v. 10.2 dans EC, 2005). Toute analyse statistique dont sont exclues les valeurs aberrantes devrait aussi être effectuée en incluant ces valeurs. Il faut signaler les valeurs aberrantes et, le cas échéant, justifier leur suppression. Enfin, il faut choisir le modèle présentant le meilleur ajustement^{Note de bas de page 53} pour déterminer la CI_p et ses limites de confiance à 95 %. Les paramètres calculés au moyen d’une analyse de régression doivent être encadrés par les concentrations d’essai; l’extrapolation des paramètres au-delà de la concentration expérimentale maximale ne constitue pas une pratique acceptable.

La possibilité de décrire mathématiquement l’hormèse (c.-à-d. une stimulation ou une réponse « supérieure à celle du témoin » ne se produisant que lors d’une exposition à des concentrations faibles) dans la courbe dose-réponse a été intégrée dans les modèles de régression récents pour les données quantitatives (v. 10.3 dans EC, 2005). Les données relatives à une hormèse peuvent être saisies directement puisque tous les points de données peuvent être pris en compte et incorporées dans le modèle; il n’y a aucun équeutage des points de données indiquant une réponse hormétique.

Si les données ne se prêtent pas à une analyse de régression, on peut avoir recours à une interpolation linéaire (p. ex. le programme ICPIN; v. 6.4.3 dans EC, 2005) en vue de calculer une CI_p. Le même processus décisionnel concernant l’analyse statistique doit être appliqué séparément à chacun des deux paramètres mesurés dans les essais avec L. minor (c.-à-d. augmentation du nombre de thalles et masse sèche des thalles). Par exemple, si l’augmentation du nombre de thalles ne peut faire l’objet d’une analyse de régression et que l’analyste s’en remet par défaut au programme ICPIN, il faut tout de même essayer d’effectuer une analyse de régression des données sur la masse sèche des thalles. Le fait que le premier paramètre examiné soit analysé au moyen du programme ICPIN n’empêche pas l’analyse de régression du deuxième paramètre.

Les calculs suivants doivent être effectués et enregistrés pour chaque concentration d’essai comportant un ou des traitements témoins : (i) la moyenne (± ET) de l’augmentation du nombre de thalles dans chaque traitement, y compris le ou les témoins, d’après le dénombrement effectué à la fin de l’essai; (ii) la moyenne (± ET) de la masse sèche des thalles de Lemna dans chaque traitement, y compris le ou les témoins, d’après la masse sèche établie à la fin de l’essai.

4.5.3 Essais à concentration unique

Dans un essai à concentration unique, la réponse des organismes à la concentration expérimentale est comparée à celle des organismes témoins^{Note de bas de page 54}. Si l’on évalue le nombre de thalles et la masse sèche (données quantitatives) à un seul site expérimental et à un seul site témoin, le test de Student^{Note de bas de page 55} constitue habituellement la méthode qui convient pour comparer les données relatives à la concentration d’essai et à la concentration témoin. Lorsque plus d’un site expérimental est à l’étude et que le responsable de l’essai souhaite comparer de nombreux sites avec le site témoin ou comparer les sites entre eux, il peut avoir recours à divers tests ANOVA (ou équivalent non paramétrique) (sous-section 3.3 dans EC, 2005). Le choix du test à utiliser est fonction des éléments suivants :

1. le type de comparaison à établir (p. ex. une série complète de comparaisons par paire entre tous les sites ou une comparaison des données propres à chaque emplacement avec celles du témoin seulement);
2. un gradient dans la réponse chimique et/ou biologique est prévu;
3. les hypothèses de normalité et d’homoscédasticité sont satisfaites.

Comme dans le cas d’un essai à concentrations multiples, les autres calculs à effectuer et à enregistrer lorsqu’on procède à un essai à concentration unique incluent : (i) la moyenne (± ET) de l’augmentation du nombre de thalles dans chaque traitement, y compris le ou les témoins, d’après le dénombrement effectué à la fin de l’essai; (ii) la moyenne (± ET) de la masse sèche des thalles de Lemna dans chaque traitement, y compris le ou les témoins, d’après la masse sèche établie à la fin de l’essai.

4.5.4 Effets stimulants

Un effet stimulant (réponse plus marquée à toutes les concentrations ou aux concentrations élevées) doit être signalé pour toutes les concentrations auxquelles une stimulation importante a été observée. Le cas échéant, on procède à une comparaison statistique avec les témoins au moyen d’une ANOVA, puis à une comparaison par paire avec le témoin (v. 3.3 et 7.5 dans EC, 2005). Cette analyse permettra de déterminer quelles concentrations provoquent un effet stimulant qui s’écarte significativement de celui observé chez les témoins. Le pourcentage de stimulation attribuable à ces concentrations doit être noté; on l’établit à l’aide de l’équation suivante (USEPA, 2002)^{Note de bas de page 56} :

où :

• S (%)  = pourcentage de stimulation
• T = augmentation moyenne du nombre de thalles ou masse sèche totale moyenne des thalles à la fin de l’essai dans les récipients d’essai
• C = augmentation moyenne du nombre de thalles ou masse sèche totale moyenne des thalles à la fin de l’essai chez les témoins

4.5.5 Autres plans d’expérience et utilité de ceux-ci

On peut calculer la vitesse spécifique moyenne de croissance (ou vitesse relative de croissance)^{Note de bas de page 57} et/ou l’aire sous la courbe^{Note de bas de page 58} à partir du nombre de thalles dans chaque répétition; cependant, il faut effectuer des mesures régulières au cours de l’essai (p. ex. aux jours 3 et 5) aux fins de ces calculs (ASTM, 1997; OCDE, 1998, 2002)^{Note de bas de page 59}.

4.6 Toxique de référence

L’utilisation systématique d’un ou de plus d’un toxique de référence est un moyen pratique et nécessaire pour évaluer, dans des conditions normalisées, la sensibilité relative de la culture de Lemna utilisée, de même que la précision et la fiabilité des données obtenues par le laboratoire à l’égard du toxique de référence choisi (EC, 1990). Dans les 14 jours incluant la période réservée à l’essai toxicologique, il faut évaluer la sensibilité des Lemna au toxique de référence (en d’autres termes, l’évaluation doit débuter à l’intérieur de la période de 14 jours englobant celle pendant laquelle l’essai a été mené). On peut utiliser la même culture (âgée de 7 à 10 jours) pour les essais employant le toxique de référence et l’échantillon (il peut y en avoir plus d’un dans les deux cas). L’essai toxicologique de référence doit se dérouler dans les mêmes conditions expérimentales que l’essai portant sur l’échantillon ou les échantillons pour essai.

Les critères sur lesquels se fonde la recommandation quant à l’utilisation des toxiques de référence qui conviennent pour cet essai incluent les suivants :

• produit facilement accessible à l’état pur;
• durée de conservation stable (longue);
• forte solubilité dans l’eau;
• stabilité en solution aqueuse;
• risque minime pour l’utilisateur;
• analyse facile et précise;
• bonne courbe dose-réponse pour L. minor;
• influence connue, sur les plans quantitatif et qualitatif, du pH sur la toxicité du produit pour les organismes d’essai.

On recommande comme toxiques de référence pour cet essai le nickel (Ni)^{Note de bas de page 60} et/ou le chlorure de potassium (KCl)^{Note de bas de page 61} de qualité réactif. Si l’on se sert du Ni, il est recommandé de consulter attentivement la fiche signalétique du produit et de prendre toutes les précautions utiles.

Il faut évaluer la sensibilité des Lemna au moyen d’essais normalisés, conformément aux modes opératoires et aux conditions énoncés dans le présent document, afin de déterminer la CI_p du ou des toxiques de référence choisis. Si l’on choisit le Ni, on devrait utiliser le sulfate de nickel (NiSO₄ · 6H₂O) pour préparer les solutions mères. Ces dernières devraient être fraîchement préparées pour chaque essai toxicologique de référence. La concentration de Ni devrait être exprimée en milligrammes de Ni par litre (mg/L). Il faudrait préparer les solutions mères de KCl la journée même de l’essai. L’eau témoin/de dilution devrait convenir aux toxiques de référence utilisés (milieu APHA modifié pour les essais avec le Ni et milieu APHA modifié, milieu SIS ou milieu Steinberg modifié pour ceux avec le KCl).

On devrait doser, à l’aide des méthodes pertinentes, le toxique de référence dans toutes les solutions mères (p. ex. APHA et coll., 1995). Au cours de la préparation des solutions d’essai, il faudrait prélever des aliquotes au moins dans la solution témoin et dans les concentrations élevée, médiane et faible et les analyser directement ou les entreposer pour analyse ultérieure, au cas où la CI_p tombe à l’extérieur des limites de contrôle de 95 %. Si l’on entrepose les aliquotes pour usage ultérieur, il faut les conserver dans l’obscurité à 4 ± 2 °C et, au besoin, leur ajouter un agent conservateur (v. APHA et coll., 1995). On devrait analyser les aliquotes à doser le plus tôt possible après la fin de l’essai toxicologique. Il est souhaitable de doser les mêmes solutions à la fin de l’essai, après avoir terminé les observations biologiques. Les calculs de la CI_p devraient se fonder sur les concentrations mesurées, si elles sont notablement différentes (c.-à-d. ≥20 %) des concentrations nominales et si la précision des analyses chimiques est satisfaisante.

Dès que l’on possède suffisamment de données, il faut préparer une carte de contrôle des valeurs de la CI_p en fonction du nombre de thalles, puis l’actualiser pour chaque toxique de référence utilisé (EC, 1990, 2005). Il faut préparer une carte de contrôle distincte pour chaque clone de L. minor utilisé dans les essais toxicologiques, parce que la sensibilité des clones peut différer selon les toxiques (v. 2.2; note 11). Il faut également préparer une carte distincte pour chacun des milieux utilisés pour les essais toxicologiques de référence (c.-à-d. chaque milieu APHA modifié, milieu SIS et milieu Steinberg modifié). On porte sur la carte de contrôle les CI_p successives, puis on détermine si les résultats se trouvent à ±2 ET (limites de contrôle de 95 %) des valeurs obtenues dans les essais antérieurs avec le même toxique de référence et en suivant le même mode opératoire. On calcule de nouveau la moyenne et l’écart-type du logarithme des CI_p disponibles à chaque essai successif, jusqu’à ce que la statistique se stabilise (EC, 1990, 2005). La carte de contrôle devrait représenter le logarithme de la CI_p sur l’axe vertical en fonction de la date de l’essai (ou du numéro de l’essai) sur l’axe horizontal.

On doit utiliser le logarithme de la concentration (log CI_p) dans tous les calculs de la moyenne et de l’écart-type. On continue ainsi d’adhérer à l’hypothèse selon laquelle on a estimé chaque CI_p d’après le logarithme des concentrations. On peut construire la carte de contrôle en reportant les valeurs logarithmiques de la moyenne et ses limites sur papier graphique ordinaire ou en reportant les valeurs arithmétiques sur l’échelle logarithmique de papier semi-logarithmique. Si l’on devait montrer catégoriquement que les CI_pn’obéissent pas à la loi log-normale, la moyenne et les limites arithmétiques pourraient se révéler plus indiquées.

Chaque nouvelle CI_p du toxique de référence devrait être comparée aux limites de contrôle de 95 % établies pour le nombre de thalles; on estime que la CI_p est acceptable si elle se trouve à l’intérieur de ces limites. Si une valeur donnée de la CI_p se trouve à l’extérieur, la sensibilité de la culture de Lemna ainsi que le rendement et la précision de l’essai sont suspects. Comme le phénomène pourrait se produire 5 % du temps par le seul effet du hasard, une valeur aberrante n’est pas nécessairement le signe d’une sensibilité douteuse des cultures ou d’une mise en question de la précision des données de toxicité recueillies par le laboratoire. Ce serait plutôt un avertissement que tel pourrait être le cas. On exige alors que le personnel de laboratoire vérifie en profondeur les conditions et procédures de culture et d’essai. Selon les résultats qui en ressortiront, il pourrait être nécessaire de répéter l’essai toxicologique de référence et/ou de préparer une nouvelle culture de Lemna avant d’entreprendre d’autres essais toxicologiques avec les organismes d’essai.

Des résultats qui restent à l’intérieur des limites de contrôle de 95 % n’indiquent pas nécessairement que le laboratoire obtient des résultats constants. Les résultats extrêmement variables que donne un toxique de référence élargissent ces limites; un nouveau point de donnée pourrait s’y trouver, tout en représentant un écart indésirable. Pour obtenir des indications sur la variation raisonnable entre les données sur les toxiques de référence (c.-à-d. des limites de contrôle de 95 % pour une carte de contrôle), prière de consulter la sous-section 2.8.1 et l’annexe F de EC (2005).

Si une valeur de la CI_p était située à l’extérieur des limites d’action (moyenne ±3 ET), l’essai serait fort probablement inacceptable et il faudrait le répéter, en examinant soigneusement tous ses aspects. Si les paramètres se situaient entre les limites d’action et les limites de contrôle plus de 5 % du temps, cela signifierait que la précision se détériore et, là encore, il faudrait répéter l’essai le plus récent en examinant soigneusement les procédures, les conditions et les calculs.

4.7 Considérations d’ordre juridique

Il faut veiller à l’admissibilité, devant un tribunal, des échantillons prélevés et analysés dans le dessein d’engager des poursuites. À cette fin, les échantillons doivent être représentatifs de la substance ou de la matière échantillonnée, ne pas être contaminés par des substances ou matières étrangères et être identifiables quant à la date, à l’heure et au lieu du prélèvement; il faut aussi que leur chaîne de conservation soit documentée et qu’ils aient été analysés le plus tôt possible après le prélèvement. Les responsables de l’exécution de l’essai et de la transmission des résultats doivent assurer la continuité de la preuve (McCaffrey, 1979) et l’intégrité des résultats.