Méthode d’essai biologique servant à mesurer des plantes terrestres exposées à des contaminants dans le sol : chapitre 6

Section 6 - Procédures particulières pour la mesure de la toxicité d’un sol enrichi d’une substance chimique

• 6.1 Propriétés, étiquetage et entreposage de l'échantillon
• 6.2 Préparation des mélanges destinés aux essais
• 6.3 Observations et mesures
• 6.4 Paramètres de l'essai et calculs

La présente section fournit des conseils et des instructions pour la préparation et la mise à l'essai d'un sol témoin négatif enrichi au laboratoire d'une substance ou d'un produit chimique ou plus. Ces recommandations et instructions s'appliquent à la méthode d'essai biologique décrite à la section 4. Les conseils présentés dans EC (1995) pour enrichir un sédiment témoin négatif d'une ou de plusieurs substances chimiques et réaliser des essais toxicologiques avec des mélanges de sédiment et de substance chimique sont également pertinents dans le cas d'un sol enrichi d'une substance chimique. Il pourrait s'avérer nécessaire d'évaluer et d'uniformiser plus avant les modes opératoires présentés ici (v. 6.2) pour préparer un sol enrichi d'une substance chimique avant de pouvoir appliquer les essais de toxicité d'un sol sur des plantes ou d'autres organismes endogés appropriés à l'évaluation de mélanges particuliers de sol et de substance chimique à des fins de réglementation.

On peut examiner au laboratoire la ou les causes de toxicité du sol et les interactions toxiques de substances ou de produits chimiques avec un sol par ailleurs non contaminé en enrichissant un sol témoin négatif (v. 3.4) de ces substances. L'enrichissement peut être effectué à l'aide d'une substance ou d'un produit chimique ou plus. Aux fins des essais toxicologiques sur des plantes effectués selon les modes opératoires décrits ici, on peut également enrichir un sol de référence (v. 3.6) ou un sol d'essai (v. 3.7) d'une substance ou d'un produit chimique ou plus. On peut avoir recours à des essais toxicologiques sur un sol enrichi d'une substance ou d'un produit chimique ou plus à diverses concentrations pour obtenir des estimations de paramètres statistiques fondées sur les concentrations seuils susceptibles de produire des effets sublétaux précis (v. 4.8).

La sous-section 6.2 décrit les modes de préparation des mélanges destinés aux essais avec un sol enrichi d'une substance chimique. La sous-section 6.3 traite des observations et des mesures en cours d'essai et à la fin de l'essai; la sous-section 6.4 explique comment estimer les paramètres dans des essais à concentrations multiples (v. aussi 4.8). Les modes opératoires décrits ici s'appliquent également au mélange de plusieurs concentrations d'un sol d'essai prélevé sur le terrain (y compris des déchets particulaires tels que des boues ou d'autres matériaux de dragage destinés à l'épandage sur le sol) dans un sol témoin négatif ou dans un sol de référence, à la réalisation d'essais à concentrations multiples et à la détermination des paramètres statistiques relatifs à ces mélanges (v. 5 et, surtout, 5.5). Les essais à concentrations multiples avec un sol témoin positif (v. 3.5) ou avec un ou plusieurs toxiques de référence ajoutés à un sol témoin négatif (v. 4.9) sont aussi exécutés selon les modes opératoires et les méthodes statistiques décrits dans la présente section. Enfin, les conseils et méthodes présentés ici peuvent s'appliquer à des essais toxicologiques réalisés avec des sols enrichis pour déterminer les effets des caractéristiques physicochimiques d'un sol témoin négatif naturel ou artificiel sur la toxicité des substances chimiques.

6.1 Propriétés, étiquetage et entreposage de l'échantillon

On devrait obtenir des renseignements sur les propriétés des substances ou des produits chimiques qui seront utilisés pour enrichir le sol témoin négatif au laboratoire^{Note de bas de page71}. On devrait également disposer d'information au sujet des substances ou des produits chimiques individuels (p. ex. les pesticides ou autres préparations commerciales) en ce qui a trait aux caractéristiques suivantes : teneur en ingrédients et impuretés importants ou « actifs », solubilité dans l'eau, pression de vapeur, stabilité chimique, constantes de dissociation, coefficients d'adsorption, toxicité pour les humains et pour les organismes terrestres, biodégradabilité. Lorsque la solubilité dans l'eau est douteuse ou problématique, on devrait obtenir et signaler les méthodes qui ont déjà été utilisées pour préparer des solutions aqueuses de la ou des substances chimiques. En l'absence de méthode éprouvée pour dissoudre la ou les substances chimiques d'essai dans l'eau, on devrait procéder à des essais de dissolution dans l'eau d'essai renfermant un solvant non aqueux et confirmer analytiquement la solubilité de la ou des substances. On devrait également obtenir et consigner tous les autres renseignements disponibles tels que les formules chimiques, la nature et le pourcentage des impuretés qu'il convient de prendre en compte, la présence et la quantité d'additifs et le coefficient de partage n-octanol-eau. Enfin, on devrait se procurer et examiner toutes fiches signalétiques pertinentes.

Les substances chimiques destinées aux essais devraient au moins être de qualité « réactif », à moins que ces essais ne portent sur une préparation commerciale ou une substance chimique de qualité « technique ». Leurs contenants doivent être scellés et codés ou étiquetés dès leur réception. On devrait inscrire sur l'étiquette et/ou sur une feuille de données séparée consacrée à l'échantillon tous les renseignements requis (appellation chimique, fournisseur, date de réception, personne responsable des essais, etc.). Les conditions d'entreposage (p. ex. température, protection contre la lumière) sont souvent dictées par la nature du produit.

6.2 Préparation des mélanges destinés aux essais

Le jour du démarrage de l'essai (jour 0), le ou les mélanges de substances ou de produits chimiques ajoutés au sol témoin négatif devraient être préparés et transvasés dans les récipients d'essai (v. 4.1 et 4.2). On devrait préparer une quantité suffisante de chaque lot de sol d'essai représentant un traitement (concentration) donné, et ce, pour obtenir toutes les répétitions d'essai de ce traitement (concentration) et toutes les répétitions ou quantités additionnelles requises aux fins d'analyses physicochimiques (v. 6.3) ou d'autres essais de toxicité du sol employant des vers de terre ou autres organismes endogés (p. ex. essais effectués conformément à EC, 2004b ou 2006).

Il est recommandé d'utiliser un sol artificiel (v. 3.4.2) pour préparer chaque mélange d'essai, car on obtient ainsi un sol uniforme et normalisé qui permettra de comparer les résultats obtenus avec d'autres substances ou produits chimiques soumis à des essais semblables dans le même laboratoire ou dans d'autres laboratoires (p. ex. selon USEPA, 1989; ISO, 1993a, 1995; ASTM, 1999b; OCDE, 2000a). Si l'on se sert d'un sol artificiel, on devrait suivre le mode de préparation décrit en 3.4.2. La quantité de sol artificiel requise pour l'essai ou les essais devrait être préparée, hydratée jusqu'à obtention d'une teneur en humidité de ~20 %, traitée au besoin afin que son pH se situe dans la fourchette 6,5-7,5^{Note de bas de page72}, laissée à vieillir pendant au moins 3 jours et entreposée à 4 ± 2 °C jusqu'à ce que l'on en ait besoin (v. 3.4.2). La teneur en humidité finale (y compris l'humidité due à l'ajout d'une aliquote mesurée d'une substance ou d'un produit chimique d'essai dissous dans l'eau d'essai, avec ou sans solvant organique) de tout sol enrichi d'une substance chimique préparé à l'aide d'un sol artificiel devrait correspondre à ~70 % de la CRE du mélange final (v. 3.4.2), pour chaque traitement (concentration)^{Note de bas de page73}. Tous les mélanges (traitements) inclus dans un essai devraient présenter des teneurs en humidité finales aussi semblables que possible.

Il est possible que les chercheurs choisissent d'utiliser un sol témoin naturel (v. 3.4.1) plutôt qu'un sol témoin artificiel (v. 3.4.2) comme sol témoin négatif qui sera enrichi d'une substance ou d'un produit chimique ou plus, de même que pour la préparation des répétitions correspondantes de sol témoin qui seront incluses dans l'essai. Les procédures décrites ici s'appliquent tout autant à un sol naturel, sauf que la teneur en humidité finale de chaque lot de sol enrichi d'une substance chimique (y compris les lots témoins) préparé à l'aide d'un sol prélevé sur le terrain devrait être ajustée, conformément aux indications fournies en 5.3, afin qu'elle corresponde au pourcentage optimal de sa CRE. Le volume de sol dans chaque récipient d'essai pourrait également être différent si l'on se sert de sols naturels, en raison des écarts dans les masses volumiques apparentes des divers sols susceptibles d'être utilisés.

Le mode opératoire à employer pour enrichir un sol au laboratoire dépend des objectifs de l'étude et de la nature de la substance d'essai qui est mélangée au sol témoin négatif ou à un autre sol. Très souvent, pour obtenir un mélange de sol et de substance chimique, on prépare une solution mère de la ou des substances ou du ou des produits chimiques d'essai, et on en ajoute un ou plusieurs volumes mesurés au sol témoin négatif artificiel ou naturel (v. 3.4). Le solvant à privilégier pour la préparation des solutions mères est l'eau d'essai (eau désionisée ou distillée) pure à 100 %; à moins de nécessité absolue, on devrait éviter l'usage de tout autre solvant. En présence de substances ou de produits chimiques peu solubles dans l'eau d'essai, on peut utiliser une petite quantité d'un solvant organique miscible avec l'eau et relativement peu toxique (p. ex. acétone, méthanol ou éthanol) pour faciliter la dispersion de la ou des substances d'essai dans l'eau. On ne devrait pas employer de surfactifs.

Si l'on a recours à un solvant organique, l'essai doit comprendre une série de récipients d'essai de répétition ne contenant que du sol témoin négatif (soit un sol non contaminé artificiel ou naturel pur à 100 %) et une autre série de récipients d'essai de répétition ne contenant qu'un témoin sol-solvant (OCDE, 1984a, 2000a; ISO, 1993a, 1995; ASTM, 1999b; EC, 2000). À cette fin, on doit préparer un lot de témoin sol-solvant en ajoutant l'agent solubilisant à la concentration présente dans les récipients d'essai contenant la concentration la plus élevée de la ou des substances ou du ou des produits chimiques d'essai dans le sol. Le solvant doit provenir du lot qui a servi à préparer la solution mère de la ou des substances d'essai. Cela dit, on devrait utiliser les solvants avec parcimonie, car ils pourraient contribuer à la toxicité du sol d'essai que l'on prépare. La concentration maximale de solvant dans le sol ne devrait pas avoir d'effet néfaste sur la levée ou la croissance des plantes pendant l'essai. Si cette concentration n'est pas connue, on devrait effectuer un essai préliminaire avec solvant seulement en ajoutant ce dernier à diverses concentrations dans le sol témoin négatif afin de déterminer la concentration seuil, c'est-à-dire celle à partir de laquelle le solvant envisagé pour l'essai définitif a un effet néfaste.

Pour les essais faisant intervenir la préparation de concentrations d'une substance chimique ajoutée à un sol artificiel, dans lesquels la substance chimique est insoluble dans l'eau mais soluble dans un solvant organique, la quantité de substance d'essai requise pour préparer un volume donné d'une concentration d'essai particulière devrait être dissoute dans un petit volume d'un solvant organique approprié (p. ex. l'acétone). Ce mélange de substance chimique et de solvant devrait ensuite être pulvérisé sur une petite portion, ou mélangé avec cette petite portion, de la quantité finale de sable quartzeux fin requise pour préparer chaque concentration d'essai comprenant une quantité mesurée d'un mélange particulier de substance chimique et de solvant ajouté à un sol artificiel (v. 3.4.2). On élimine ensuite le solvant par évaporation en plaçant le contenant sous une hotte pendant au moins une heure, jusqu'à ce qu'aucune odeur résiduelle de solvant ne puisse plus être décelée. Puis, on combine soigneusement le mélange de substance chimique et de sable (une fois le solvant évaporé) avec la quantité restante du sable préhumidifié et des autres ingrédients nécessaires pour préparer le sol artificiel (v. 3.4.2). On ajoute alors au mélange sol-sable-tourbe la quantité d'eau désionisée requise pour obtenir une teneur en humidité finale équivalant à environ 70 % de la CRE maximale de ce sol artificiel et on mélange. Le sol enrichi d'une substance chimique peut maintenant être ajouté aux récipients d'essai (OCDE, 2000a).

L'échantillon de témoin sol-solvant à inclure dans l'essai doit être préparé de la même manière, mais sans l'ajout de la substance chimique d'essai. En outre, le témoin sol-solvant doit contenir une concentration de solvant aussi élevée que celle qui est présente dans n'importe laquelle des concentrations de sol enrichi d'une substance chimique incluses dans l'essai.

Si la substance chimique d'essai qui doit être ajoutée au sol artificiel est insoluble à la fois dans l'eau et dans un quelconque solvant organique approprié (non toxique), on devrait préparer un mélange comprenant 10 g de sable quartzeux industriel finement broyé et la quantité de substance chimique d'essai nécessaire pour obtenir la concentration d'essai désirée dans le sol. Les constituants restants du sol artificiel préhumidifié devraient ensuite être incorporés soigneusement au mélange. On ajoute enfin la quantité d'eau désionisée nécessaire pour obtenir une teneur en humidité finale équivalant à ~70 % de la CRE maximale, et on mélange soigneusement. Le mélange ainsi obtenu de sol enrichi d'une substance chimique peut alors être ajouté aux récipients d'essai (OCDE, 2000a).

Les concentrations des substances ou des produits chimiques dans le sol sont habituellement calculées, mesurées et exprimées en milligrammes de substance d'essai par kilogramme de sol (ou en microgrammes de substance par gramme de sol), selon la masse sèche (OCDE, 1984a; ISO, 1993a, 1995). Les paramètres (p. ex. les CI_p) sont également exprimés en fonction de la masse sèche (v. 4.8).

Les conditions de mélange, y compris le rapport entre la solution d'essai et le sol, de même que les durées et les températures de brassage et de conservation, doivent être uniformes d'un traitement à l'autre dans un essai donné. La durée de brassage d'un sol enrichi devrait être suffisante pour assurer une répartition homogène de la substance chimique, ce qui pourrait prendre de quelques minutes à 24 heures. Pendant le brassage, on devrait maintenir la température assez basse pour réduire au minimum l'activité microbienne et l'altération des caractéristiques physicochimiques du mélange. On conseille d'analyser des sous-échantillons du mélange afin de déterminer le degré de mélange et d'homogénéité obtenu.

Pour certaines études, on ne devra peut-être préparer qu'une seule concentration d'un mélange particulier de sol témoin négatif (ou autre) et d'une substance ou d'un produit chimique ou plus, ou un mélange d'une seule concentration de sol contaminé ou de déchets particulaires dans un sol témoin négatif ou autre. Par exemple, un essai à concentration unique pourrait être effectué pour déterminer si une concentration particulière de substance ou de produit chimique dans un sol non contaminé est toxique pour les organismes d'essai. Un tel essai pourrait être réalisé dans le cadre de travaux de recherche ou à des fins réglementaires (p. ex. essai « limite »).

On devrait cependant avoir recours à un essai à concentrations multiples, comprenant une gamme de concentrations de substance chimique ajoutées à un sol témoin négatif (ou autre) dans des conditions normalisées, pour déterminer le ou les paramètres visés (CE₅₀ et CI_p; v. 4.8). Un essai à concentrations multiples avec un sol témoin négatif enrichi d'un déchet particulaire donné pourrait également être approprié. Pour chacun des essais à concentrations multiples, on doit préparer au moins neuf concentrations d'essai plus le ou les traitements témoins appropriés; on recommande toutefois d'en préparer un plus grand nombre (≥11, témoins en sus) (v. 4.1 et 4.8). Pour choisir les concentrations d'essai, on peut se servir d'une suite de dilutions en progression géométrique dans laquelle chaque concentration successive de substance ou de produit chimique dans le sol correspond au moins à la moitié de la précédente (p. ex. 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2,5, 1,25, 0,63 mg/kg). Les concentrations d'essai peuvent aussi être sélectionnées à partir d'une suite de dilutions logarithmique appropriée (v. annexe H), ou en fonction des résultats d'essais toxicologiques préliminaires. Le lecteur trouvera en 4.1 d'autres conseils au sujet du choix des concentrations d'essai.

Pour choisir la bonne fourchette de concentrations, il pourrait être utile d'effectuer un essai préliminaire qui engloberait une gamme de concentrations plus étendue. On pourrait réduire le nombre de répétitions par traitement (v. 4.1) ou les supprimer carrément si l'essai est réalisé pour déterminer une gamme de concentrations. De même, dépendamment de la variance prévue ou mise en évidence (selon des études antérieures réalisées avec la même substance d'essai ou avec une substance similaire) entre les récipients d'essai pour un traitement donné, on pourrait également réduire le nombre de répétitions dans le cas de recherches ou d'essais biologiques de dépistage réalisés à des fins non réglementaires.

Selon les objectifs de l'essai, il pourrait être souhaitable de déterminer les effets des caractéristiques du substrat (p. ex. composition granulométrique ou teneur en matière organique) sur la toxicité des mélanges de sol et de substance chimique. On pourrait par exemple mesurer les effets de la composition granulométrique sur la toxicité de la substance chimique en effectuant des essais parallèles à concentrations multiples avec une série de mélanges comprenant la substance ou le produit chimique, ou les substances ou produits chimiques, incorporés dans une gamme de fractions (granulométriques) ou de types de sol témoin négatif naturel ou artificiel (v. 3.4). De la même manière, on pourrait évaluer la mesure dans laquelle la teneur en carbone organique total (%) ou en matière organique (%) du sol peut modifier la toxicité de la substance chimique en effectuant des essais parallèles à concentrations multiples sur divers mélanges de substance chimique et de sol préparés à partir d'une série de sols témoins négatifs enrichis de matière organique. Chacune des fractions ou des préparations de sol témoin négatif naturel ou artificiel utilisées pour préparer ces mélanges devrait être incluse en guise de témoin dans l'essai.

Selon les objectifs et le plan de l'étude, certains essais de toxicité d'un sol sur des plantes pourraient être effectués avec des échantillons de sol témoin négatif ou de sol de référence dans lesquels les substances ou produits chimiques sont pulvérisés sur la surface du sol, plutôt que mélangés au sol. La pulvérisation en surface peut se faire sur le terrain ou au laboratoire. L'une des méthodes qui peuvent être employées consiste à utiliser un pulvérisateur calibré à rampe ou monté sur rails afin d'obtenir une répartition uniforme de la substance chimique sur une surface donnée. La concentration de la substance ou du produit chimique dans le sol peut être déterminée en fonction de la profondeur de pénétration, de l'aire pulvérisée ou de la largeur des bandes, de la taille des buses, de la pression et de la vitesse à laquelle le pulvérisateur couvre la surface [G.L. Stephenson, communication personnelle, Aquaterra Environmental, Orton (Ont.), 2001]. On trouvera dans OCDE (2000a) des indications au sujet de la pulvérisation de substances d'essai à la surface du sol en vue d'essais de levée et de croissance sur des plantes terrestres.

6.3 Observations et mesures

Lorsqu'on prépare l'essai, on devrait consigner une description qualitative de chaque mélange de sol enrichi d'une substance chimique. Cette description pourrait inclure des observations relatives à la couleur, à la texture et à l'homogénéité apparente du mélange. Toute modification dans l'aspect du mélange d'essai observée au cours ou à la fin de l'essai devrait être consignée.

La sous-section 4.6 fournit des conseils et établit les exigences au sujet des observations et des mesures à effectuer au début, au cours et à la fin de l'essai. Ces observations et mesures s'appliquent aux essais de toxicité d'un sol décrits ici, employant un ou plusieurs échantillons de sol enrichi d'une substance chimique, et sont donc obligatoires.

Selon les objectifs de l'essai et le plan d'étude, on pourrait préparer des récipients d'essai supplémentaires au début de l'essai (v. 4.1) pour surveiller les caractéristiques chimiques du sol. Des échantillons seraient alors prélevés de manière destructive dans ces récipients au cours ou à la fin de l'essai. Selon les objectifs de l'étude, on pourrait ajouter des organismes d'essai, ou ne pas en ajouter, dans ces récipients d'essai supplémentaires. Pour mesurer les concentrations de la ou des substances chimiques dans le sol de ces récipients d'essai, on pourrait prélever des aliquotes de sol aux fins des différentes analyses au début, au cours et/ou à la fin de l'essai, selon la nature du toxique et les objectifs de l'essai.

Des mesures de la qualité (y compris le pH et la teneur en humidité du sol) de chaque mélange de sol enrichi soumis à l'essai (y compris le sol témoin négatif) doivent être effectuées et consignées au début et à la fin de l'essai pour le pH et au début seulement pour la teneur en humidité, comme il est expliqué en 4.6. Si l'on dispose des capacités analytiques nécessaires, il est recommandé d'analyser la ou les solutions mères en parallèle avec un ou plusieurs sous-échantillons de chaque mélange de sol enrichi afin de déterminer les concentrations de la ou des substances chimiques et de vérifier si le sol a été enrichi de manière satisfaisante. Ces échantillons devraient être conservés, entreposés et analysés selon des méthodes convenables et éprouvées.

À moins d'avoir de bonnes raisons de croire que les dosages chimiques ne sont pas précis, pour tout essai toxicologique dans lequel on a mesuré les concentrations dans chaque mélange de sol enrichi, on devrait calculer et exprimer les résultats de l'essai en fonction de ces valeurs mesurées. On devrait au moins prendre des aliquotes des échantillons représentatifs des concentrations élevée, moyenne et faible au début et à la fin de l'essai^{Note de bas de page74}; dans ce cas, les valeurs des paramètres seraient calculées en fonction des valeurs nominales (v. 4.8 et 6.4). Toutes les mesures des concentrations des substances ou des produits chimiques d'essai devraient être comparées, consignées et analysées sous l'angle de leur degré de différence par rapport aux valeurs nominales. Si l'on se sert des concentrations nominales pour exprimer les résultats d'un essai toxicologique, on doit l'indiquer explicitement dans le rapport d'essai (v. 7.1.6).

6.4 Paramètres de l'essai et calculs

Les essais à concentrations multiples employant des mélanges de sol enrichi sont caractérisés par des paramètres statistiques particuliers à l'essai (v. 4.8). Des conseils relatifs au calcul de la CE₅₀ pour la levée sont fournis en 4.8.2; des conseils similaires pour le calcul de la CI_p (à partir de données montrant une inhibition de la croissance; v. 4.8) sont fournis en 4.8.3. Les conseils présentés en 5.5 au sujet du calcul et de la comparaison des paramètres pour les essais à concentration unique employant des échantillons de sol prélevés sur le terrain s'appliquent également aux essais à concentration unique réalisés avec des mélanges de sol enrichi. Pour en savoir plus au sujet des méthodes statistiques paramétriques (ou non paramétriques) applicables aux paramètres de l'essai, les chercheurs sont invités à consulter le document d'orientation d'Environnement Canada sur les méthodes statistiques applicables aux essais écotoxicologiques (EC, 2005c).

Si les essais comprennent un témoin sol-solvant (v. 6.2), on doit comparer statistiquement les résultats de l'essai pour les plantes cultivées dans ce sol avec ceux obtenus pour les organismes d'essai cultivés dans le sol témoin négatif. Si un test t de Student révèle des écarts importants entre les paramètres correspondant à ces deux sols témoins utilisés pour établir la validité de l'essai (v. 4.4), on ne pourra se servir que du témoin sol-solvant aux fins de comparaison et de calcul des résultats. En revanche, si les résultats des deux témoins sont semblables, on devrait combiner les données obtenues avec les deux témoins avant de les utiliser dans le calcul des résultats ou l'évaluation de la validité de l'essai.