Méthode d’essai biologique servant à mesurer la survie de collemboles exposés à des contaminants dans le sol : chapitre 2


Section 2

Organismes expérimentaux

2.1 Espèces et stade de développement

L’essai décrit dans le présent document doit être réalisé avec des organismes élevés en laboratoire et appartenant aux espèces Folsomia candida Willem, 1902, Orthonychiurus folsomi Schäffer, 1900, Folsomia fimetaria Linnaeus, 1758, ou Proisotoma minutaTyllberg, 1871. Il est recommandé d’employer P. minuta seulement pour les sols prélevés dans les écozones de la région boréale et de la taïgaNotes de bas de page2. L’identification, la répartition et le cycle biologique des quatre espèces susmentionnées sont résumés en 1.2. L’identification des espèces doit être confirmée et documentéeNotes de bas de page3 par des personnes compétentes (p. ex., des taxinomistes) qui ont de l’expérience dans l’identification des espèces de collemboles (v. 1.2) prévues pour les essais. Les caractéristiques taxinomiques distinctives décrites et illustrées dans les clés taxinomiques, ou encore l’identification taxinomique fondée sur l’ADN (c.-à-d. le code à barres de l’ADN), peuvent servir à cette fin. Tous les deux ans au moins, on devrait identifier jusqu’au niveau de l’espèce les élevages de F. candida, d’O. folsomi, de F. fimetaria et de P. minutaconservés pendant une longue période dans le laboratoire d’essais. L’âge des organismes utilisés pour démarrer l’essai de toxicité d’un sol décrit dans le présent document varie selon l’espèce : 10-12 jours pour F. candida; 28-31 jours pour O. folsomi; 23-26 jours pour F. fimetaria; 13-14 jours pour P. minuta.

2.2 Source des organismes

Les organismes expérimentaux à utiliser doivent être des collemboles élevés en laboratoire (v. 2.3). Les sources de géniteurs de F. candida, d’O. folsomi, de F. fimetaria et de P. minutanécessaires pour démarrer les élevages peuvent être des laboratoires gouvernementaux ou privés qui font l’élevage de ces espèces de collemboles en vue d’essais de toxicité des sols, ou un fournisseur commercial de matériel biologique Notes de bas de page4

On peut obtenir un stock de géniteurs de F. candida, d’O. folsomi, de F. fimetaria ou de P. minuta auprès de la source canadienne suivante :

Unité de l’élaboration et de l’application
des méthodes
Direction générale de la science et de la technologie
Environnement Canada 335, ch. River
Ottawa (ON) K1A 0H3
Courriel: methods@ec.gc.ca

Tous les collemboles utilisés dans un essai de toxicité d’un sol doivent provenir de la même population. Les collemboles destinés à servir de géniteurs devraient être transportés au laboratoire avec une partie du sol ou du substrat auquel ils sont adaptés. Les stocks de géniteurs, issus d’un élevage d’organismes d’âges variés, devraient être transportés dans des boîtes de Petri contenant un substrat de plâtre de Paris (v. 2.3.5)Notes de bas de page5 ou dans un petit récipient contenant du sol. Au besoin, on se procurera des quantités supplémentaires de ce substrat à des fins d’acclimatationou d’élevage, selon les conditions et les exigences de l’élevage (v. 2.3). Les récipients utilisés pour l’expédition et le transport devraient être isolés afin de réduire au minimum les fluctuations de température pendant le transport; la température devrait être maintenue à ~20 °C. Le transport d’organismes vivants devrait se faire rapidement afin que les organismes soient livrés dans les plus brefs délais (c.-à-d. dans les 24 h). On devrait éviter toute surpopulation d’animaux pendant l’expédition ou le transport afin de réduire le stress au minimum.

À l’arrivée au laboratoire, les organismes peuvent être conservés dans le substrat (sol ou plâtre de Paris) utilisé pour le transport pendant qu’on ajuste la température, ou être transférés dans un nouveau substrat d’élevage (v. 2.3.5). Si la nature du substrat (y compris sa textureet sa teneur en humidité) dans lequel les collemboles ont d’abord été conservés (p. ex., par un fournisseur commercial) ou transportés diffère sensiblement de celle du substrat dans lequel ils doivent être élevés (v. 2.3.5), il serait prudent de prévoir une période d’adaptation de plusieurs jours au nouveau substrat.

On devrait ajuster graduellement la température du sol (p. ex., ±3 °C par jour) pour l’amener à la température à utiliser pendant l’élevage (v. 2.3.4). Il est recommandé de suivre les conseils fournis en 2.3.7 au sujet de la manipulation des collemboles lorsqu’on transfère les organismes d’une source extérieure aux récipients d’élevage (v. 2.3.2). Pendant cette période transitoire d’acclimatation du stock de géniteurs ou des organismes expérimentaux, les autres conditions devraient être aussi semblables que possible à celles utilisées pour le maintien des élevages (v. 2.3).

2.3 Élevage de F. candida, d’O. folsomi, de F. fimetaria et de P. minuta

2.3.1 Généralités

La présente sous-section fournit des orientations et des recommandations générales pour l’élevage de F. candida, d’O. folsomi, de F. fimetaria et de P. minuta en vue d’essais de toxicité des sols. En règle générale, ces quatre espèces de collemboles sont élevées dans les mêmes conditions et selon les mêmes méthodes. Conformément à l’adage selon lequel ce qui pourrait bien fonctionner dans un laboratoire pourrait ne pas fonctionner aussi bien dans un autre (EC, 1997a, 1997b, 2001; USEPA, 2000), de nombreux aspects de l’élevage, notamment le choix des récipients d’élevage, le nombre d’organismes par récipient, les conditions de renouvellement du sol, le substrat d’élevage, le type de nourriture et les rations, sont laissés à la discrétion du personnel de laboratoire, qui agira en fonction de son expérience, même si des indications et des recommandations sont fournies dans les paragraphes qui suivent. On utilise des indices de performanceNotes de bas de page6 pour déterminer si les organismes d’élevage conviennent aux essais et si les résultats des essais sont acceptables. Pour convenir aux essais, les élevages doivent présenter de faibles taux de mortalité et les organismes doivent sembler en bonne santé et se comporter et se nourrir normalement (v. 2.3.9). En outre, les organismes témoins doivent présenter des taux de mortalité suffisamment faibles et satisfaire à tous les critères de validité de l’essai toxicologique (v. 4.4). L’acceptabilité de l’élevage devrait également être démontrée au moyen d’essais réalisés parallèlement ou en continu à l’aide d’un toxique de référence (v. 4.9). Si un élevage ne satisfait pas à ces critères, il est recommandé de rechercher les causes de cette situation. Il est difficile de distinguer trois des quatre espèces recommandées dans la présente méthode et, partant, il faut prendre soin d’éviter toute contamination croisée d’un élevage avec d’autres espèces de collemboles. En conséquence, il est conseillé de procéder à des vérifications taxinomiques périodiques (p. ex., tous les ans) des élevages conservés au laboratoire.

Il incombe au laboratoire de faire la preuve de sa capacité d’obtenir des résultats cohérents et précis à l’aide d’un toxique de référence lorsqu’il se prépare pour la première fois à effectuer des essais de toxicité d’un sol avec des collemboles F. candida, O. folsomi, F. fimetaria et P. minuta d’élevage. À cette fin, il devrait déterminer sa précision intralaboratoire, exprimée sous la forme d’un coefficient de variation(CV) des données respectives sur la concentration létale médiane (CL50), en effectuant ≥5 essais avec des lots (groupes) différents d’organismes expérimentaux provenant de la même source, avec le même toxique de référence ainsi qu’un mode opératoire et des conditions expérimentales identiques pour chaque essai (v. 4.9).

Lorsque le laboratoire effectue régulièrement des essais de toxicité des sols avec F. candida, O. folsomi, F. fimetaria ou P. minuta, il devrait réaliser des essais toxicologiques de référence tous les deux mois avec des organismes de ces élevages, dans les conditions et selon les méthodes décrites en 4.9. En l’absence d’essais bimensuels, il est recommandé d’évaluer la performance de collemboles provenant de l’élevage utilisé pour démarrer un essai de toxicité d’un sol en effectuant parallèlement un essai toxicologique de référence. De plus, on devrait vérifier la performance de tout élevage établi récemment à l’aide d’un nouveau stock de géniteurs (v. 2.2) en effectuant un essai toxicologique de référence. Si les résultats sont jugés acceptables (v. 2.3.9 et 4.9), le laboratoire pourra alors s’approvisionner en organismes expérimentaux dans ces élevages.

Les élevages de F. candida, d’O. folsomi, de F. fimetaria et de P. minuta devraient être observés fréquemment (p. ex., une ou deux fois par semaine). Idéalement, on devrait consigner les informations suivantes :

  • la date de démarrage de l’élevage avec des adultes;
  • les dates de renouvellement du substrat;
  • le régime d’alimentation et d’arrosage (y compris le type et la quantité d’aliments et d’eau ajoutés chaque fois);
  • les conditions ambiantes et la qualité du substrat (p. ex., température ambiante, photopériode et qualité de la lumière, pH du substrat);
  • des observations sur l’état de santé des élevages (p. ex., comportement et aspect des collemboles, odeur du substrat, emplacement des collemboles dans le récipient, quantité de nourriture délaissée dans le récipient, présence de champignons).

On trouvera à l’annexe E un résumé des divers modes opératoires et conditions décrits dans les méthodes internationales (Wiles et Krogh, 1998; ISO, 1999; OCDE, 2009) d’élevage de diverses espèces de collemboles. Le tableau 1 qui suit présente une liste de contrôle des conditions et modes opératoires recommandés et exigés pour l’élevage de F. candida, d’O. folsomi, de F. fimetaria et de P. minuta afin d’obtenir des organismes utilisables dans les essais de toxicité des sols.

2.3.2 Installations et appareils

L’élevage des collemboles devrait se faire dans une installation de laboratoire à température contrôlée. Le dispositif de régulation de la température (incubateur ou pièce à température constante) devrait permettre de maintenir la température à l’intérieur des limites recommandées (v. 2.3.4). La zone d’élevage doit être isolée de tout secteur d’essai, d’entreposage des échantillons ou de préparation de ceux-ci afin d’éviter la contamination à partir de ces sources. Elle doit être conçue et construite de façon à prévenir la contamination des élevages (p. ex., absence de tuyaux ou d’accessoires en cuivre ou en métal galvanisé qui pourraient laisser dégoutter des condensats contaminés par des métaux). Dans le cas de P. minuta, on devrait réduire au minimum l’exposition des élevages à toute vibration occasionnée par un équipement ou une construction se trouvant près de ceux-ci, car les vibrations peuvent perturber la reproduction des organismes (EC, 2013b).

Tableau 1. Liste de contrôle des conditions et modes opératoires recommandés et exigés pour l’élevage de F. candida, d’O. folsomi, de F. fimetaria et de P. minuta destinés à servir d’organismes expérimentaux dans des essais de toxicité des sols

Source du stock de géniteurs
adultes provenant d’un élevage d’un laboratoire gouvernemental, privé ou commercial; identification confirmée jusqu’au niveau de l’espèce
Acclimatation
graduelle, pour les différences de température (recommandé : ≤3 °C/jour) et de substrat à l’arrivée au laboratoire
Récipients d’élevage
pour F. candida , O. folsomi et P. minuta : enceintes de reproduction d’une capacité de ~1-6 L (p. ex., bacs en plastique mesurant de 15 × 23 × 8 cm à 20 × 33 × 11 cm environ), avec couvercles perforés ou non; parois ou couvercle transparents ou translucides pour permettre à la lumière d’atteindre la surface du substrat d’élevage dans le cas de F. candida ; pour F. fimetaria : boîtes de Petri en polystyrène (10 cm de diamètre sur 1,5 cm de profondeur), avec couvercle
Température ambiante
moyenne quotidienne : 20 ± 2 °C; instantanée : 20 ± 3 °C
Éclairage
pour O. folsomi , F. fimetaria et P. minuta : obscurité permanente ou éclairage incandescent ou fluorescent; intensité de 400-800 lux à la surface du récipient d’élevage; photopériode fixe (p. ex., 16 h ou 12 h); pour F. candida : éclairage incandescent ou fluorescent; intensité  de 400-800 lux à la surface du récipient d’élevage; photopériode fixe (p. ex., 16 h ou 12 h)
Type de substrat
mélange de plâtre de Paris et de charbon actif selon un ratio de 8:1; épaisseur minimale recommandée : 1 cm; pour O. folsomi et P. minuta : surface du substrat recouverte de plâtre de Paris ou de morceaux triangulaires de papier filtre enduits de plâtre de Paris; autre possibilité pour O. folsomi : très fine couche de sol artificiel déposée sur la surface du substrat
Hydratation du substrat
avec de l’eau d’essai; teneur en humidité suffisante pour maintenir la surface du substrat humide, mais sans accumulation d’eau surnageante
pH du substrat
6,0-7,0
Renouvellement du substrat
au besoin et au moins une fois tous les 1-2 mois; transférer à la main les collemboles dans les récipients d’élevage fraîchement préparés; mélanger des adultes provenant de récipients d’élevage d’une même espèce pour O. folsomi , F. fimetaria et P. minuta
Surveillance de l’élevage
vérification hebdomadaire de la température ambiante dans l’installation d’élevage; mesure du pH des nouveaux lots de plâtre de Paris
Entretien de l’élevage
aérer les récipients au moins une fois par semaine en enlevant les couvercles des récipients d’élevage pendant plusieurs minutes; vérifier le taux d’humidité du substrat dans chaque récipient au moment de l’aération; ajouter plusieurs gouttes d’eau d’essai pour maintenir le taux d’humidité; consigner l’état de l’élevage; maintenir la densité de population des collemboles à ~2-3 organismes par centimètre carré pour F. candida et O. folsomi , à ~5-6 organismes par centimètre carré pour F. fimetaria et à ~6-8 organismes par centimètre carré pour P. minuta ; proportion recommandée d’au moins 2 femelles pour 1 mâle dans le cas d’ O. folsomi et de F. fimetaria
Alimentation
levure sèche granulée (p. ex., Fleischmann’s MC ); nourriture divisée en 2-3 tas ou saupoudrée sur la surface du substrat; deux fois par semaine; pour F. candida et O. folsomi : ~100 mg (par récipient de 15 × 23 × 8 cm); pour F. fimetaria : ~10 mg (par boîte de Petri de 10 cm); pour P. minuta , ~200 mg (par récipient de 15 × 23 × 8 cm)
Entretien des élevages synchrones
pour F. candida , F. fimetaria et P. minuta : déposer 200-300 adultes provenant d’un élevage existant sur le nouveau substrat afin de stimuler l’oviposition; nourrir les organismes; surveiller quotidiennement l’apparition d’œufs; pour F. candida , O. folsomi , F. fimetaria et P. minuta : surveiller l’apparition de grosses couvées d’œufs dans les élevages existants; 7 jours après l’apparition des premières couvées dans les nouveaux récipients d’élevage ou de grosses couvées dans les élevages existants, transférer les couvées dans des récipients d’éclosion (c.-à-d. des boîtes de Petri de ~10 cm de diamètre et de ≥1 cm de profondeur) contenant du substrat frais; nourrir les organismes; vérifier quotidiennement s’il y a éclosion; pour F. candida , retirer les œufs non éclos 48 h après l’apparition des juvéniles; pour O. folsomi et F. fimetaria , 72 h après l’apparition des juvéniles; pour P. minuta , 24 h après l’apparition des juvéniles
Âge/taille des organismes expérimentaux
F. candida : juvéniles âgés de 10-12 jours; O. folsomi : adultes âgés de 28-31 jours; F. fimetaria : adultes âgés de 23-26 jours; P. minuta : juvéniles âgés de 14 jours (ajout facultatif de juvéniles âgés de 13 jours)
Indices de la santé de l’élevage
élevage considéré en bonne santé si : 1) les collemboles se déplacent activement sur la surface du substrat; 2) les résultats des essais toxicologiques de référence avec des collemboles provenant de l’élevage se situent à l’intérieur des limites de contrôle « historiques » de 95 %

Tout le matériel et tous les récipients et accessoires susceptibles d’entrer en contact avec les organismes ou le substrat dans l’installation d’élevage doivent être propres, rincés convenablement et fabriqués dans des matériaux non toxiques (p. ex., verre, TéflonMC, acier inoxydable 316, nylon, NalgèneMC, porcelaine, polyéthylène, polypropylène). Les matériaux toxiques comme le cuivre, le zinc, le laiton, le métal galvanisé, le plomb et le caoutchouc naturel ne doivent pas entrer en contact avec l’appareillage et le matériel, ni avec le substrat d’élevage ou l’eau.

Divers récipients d’élevage tels que des bacs en plastique ou des enceintes de reproduction d’une capacité de 1-6 L (p. ex., boîtes en polystyrène blanc mesurant entre 15 × 23 × 8 cm et 20 × 33 × 11 cm environ) conviennent à l’élevage de F. candida, d’O. folsomi et de P. minuta. Pour F. candida, les côtés ou le couvercle devraient être translucides ou transparents afin de permettre à la lumière d’atteindre la surface du substrat d’élevage (v. 2.3.3). Chaque récipient devrait être doté d’un couvercle - celui-ci peut être non perforé afin de réduire au minimum l’assèchement du substrat en surface et le risque de contamination, ou être perforé (p. ex., trous couverts d’un grillage en fibre de verre) pour permettre la circulation d’air tout en empêchant les collemboles de s’échapper. Pour F. fimetaria, il est recommandé d’utiliser des boîtes de Petri en polystyrène (10 cm de diamètre sur 1,5 cm de profondeur). Le tableau 2 de l’annexe E fournit des détails sur le type et la taille de divers récipients recommandés par les organismes internationaux pour l’élevage en laboratoire de diverses espèces de collemboles et pour la production d’organismes à utiliser dans les essais de toxicité des sols. L’emploi de récipients d’élevage en bois n’est pas recommandé en raison de la présence possible de contaminants toxiques (p. ex., colles pour contreplaqué, produits chimiques anti-tache de sève ou produits d’extraction du bois tels que les acides résiniques et les juvabiones).

Le choix de la taille et du nombre de récipients d’élevage pourrait dépendre du nombre de collemboles adultes dont le laboratoire a besoin pour effectuer une ou des séries d’essais de toxicité des sols. Chaque récipient d’élevage devrait pouvoir recevoir une couche de substrat d’élevage de ≥1 cm d’épaisseur.

2.3.3 Éclairage

Les espèces O. folsomi, F. fimetaria et P. minuta peuvent être élevées dans l’obscurité totale (p. ex., dans un tiroir fermé ou dans un récipient d’élevage opaque), ou sous un éclairage incandescent ou fluorescent, avec une photopériode régulée (p. ex., 16 h ou 12 h). Pour F. candida, les élevages devraient être éclairés par des lampes à incandescence ou à fluorescence, avec une photopériode régulée (p. ex., 16 h ou 12 h). L’intensité lumineuse à proximité de la partie supérieure des récipients d’élevage devrait être de 400-800 lux. Cet intervalle équivaut à un flux quantique de 5,6-11,2 μmol/(m2 · s) pour un éclairage fluorescent blanc froid, de 6,4-12,8 μmol/(m2 · s) pour un éclairage fluorescent à spectre continu ou de 7,6-15,2 μmol/(m2 · s) pour un éclairage incandescent. Les sources lumineuses devraient être suffisamment éloignées des récipients d’élevage pour empêcher l’évaporation causée par l’accumulation de chaleur.

2.3.4 Température

Pour les quatre espèces expérimentales, la moyenne quotidienne de la température ambiante dans l’installation d’élevage devrait être de 20 ± 2 °C, et la température instantanée de l’installation, de 20 ± 3 °C.

2.3.5 Substrat d’élevage

Divers substrats ont été utilisés pour l’élevage de collemboles destinés à des essais de toxicité des sols (v. tableau 4, annexe E). Le choix du substrat est laissé à la discrétion du personnel de laboratoire, qui décidera en fonction de son expérience; cependant, le substrat d’élevage décrit ci-dessous a fait ses preuves et est recommandé pour les quatre espèces visées ici.

À l’instar de Wiles et Krogh (1998), ISO (1999), Greenslade et Vaughan (2003), OCDE (2009) et EC (2007a), nous recommandons d’employer un substrat composé de 8 parties de plâtre de Paris (stuc)Notes de bas de page7 et de 1 partie de charbon (p. ex., un charbon actif de qualité analytique de 375 μm mesh, dont celui de marque Fisher, no 35-474 au catalogue) pour l’élevage de F. candida, d’O. folsomi, de F. fimetaria et de P. minuta. Le substrat d’élevage est préparé sous une hotte, dans un flacon de 1 L en verre ou en plastique. On commence par déposer 120 g de plâtre de Paris et 15 g de charbon dans le flacon à l’aide d’un entonnoir et on agite vigoureusement le flacon pendant ~30 secondes. Lorsque le mélange est homogène, on ajoute 130 mL d’eau d’essai (ultra pure; il est recommandé d’employer de l’eau MilliQ® pour préparer le substrat à utiliser avec F. fimetaria) et on agite de nouveau le flacon, après l’avoir bouché, pendant encore 30 secondes. La quantité d’eau nécessaire peut varier selon le type de plâtre utilisé. On verse ensuite le mélange de plâtre de Paris ainsi préparé dans le ou les récipients d’élevage de façon à obtenir une couche de 1 cm d’épaisseur (Becker-van Slooten et coll., 2003; Stämpfli et coll., 2005)Notes de bas de page8, Notes de bas de page9. Il est recommandé de procéder rapidement afin d’éviter que le substrat durcisse avant d’être versé dans les récipients d’élevage. On tapote doucement les récipients sur les côtés et sur la table de travail pour éliminer les bulles d’air qui pourraient s’être formées pendant le mélange, pour répartir également le substrat d’élevage et pour supprimer les aspéritésNotes de bas de page10. Il faudrait placer les récipients d’élevage sur une surface plane et laisser sécher le substrat à l’air pendant ≥3 h. Une fois le substrat durci, on ajoute de l’eau d’essai dans les récipients d’élevage, pratiquement jusqu’à saturation (il ne devrait pas y avoir d’eau surnageante). Si les récipients d’élevage préparés ne sont pas utilisés immédiatement, ils peuvent être entreposés à la température ambiante pendant ≤3 semaines. Avant l’entreposage, il est recommandé de saturer le substrat avec de l’eau d’essai (on verse lentement ~1 cm d’eau d’essai sur le substrat préparé) afin d’éviter son assèchement pendant l’entreposage. Si le substrat s’assèche de manière excessive, il se tassera et se détachera des parois du récipient, créant ainsi un vide. Dans un tel cas, il est recommandé d’éliminer le substrat, car les collemboles se rassembleront et pondront des œufs le long des parois et au fond du récipient (ils seront alors inaccessibles). On devrait rincer le substrat avec de l’eau d’essai avant d’y déposer les collemboles. Pour rincer, on ajoute ~1 cm d’eau d’essai au substrat et on frotte doucement la surface du bout du doigt (ganté) afin d’éliminer les aspérités. Le substrat devrait être rincé 3 fois. On vide ensuite l’eau en excès, on éponge légèrement la surface avec un essuie-tout et on ferme hermétiquement les récipients avec les couvercles, après quoi les récipients sont prêts à être utilisés.

On vérifie le pH de chaque nouveau lot de substrat en plaçant un papier pH sur la surface humide du substrat. Le pH du substrat devrait se situer entre 6,0 et 7,0. Il est recommandé de réhydrater les récipients d’élevage avec de l’eau d’essai 1-2 fois par semaine pour maintenir le taux d’humidité (qui est optimal lorsque le plâtre de Paris reste humide). Pour la réhydratation, on ajoute plusieurs gouttes d’eau d’essai à l’aide d’une pipette ou on vaporise doucement les parois du récipient à l’aide d’un brumisateur ou d’un flacon pressable jusqu’à ce que l’eau commence à rester en surface. On prendra soin de ne pas blesser les collemboles ou de ne pas souffler les collemboles en dehors du récipient d’élevage pendant la réhydratation.

Les récipients doivent être aérés au moins une fois par semaine; toutefois, il est recommandé de les aérer deux fois par semaine si on a déjà eu des problèmes de champignons dans les élevages ou s’il s’agit d’élevages de F. fimetaria, qui sont plus sensibles à la présence de champignons. On peut aérer les élevages pendant la réhydratation hebdomadaire en retirant simplement les couvercles pendant ≥1 min.

Un mélange de terreau exempt d’engrais (mélange de fumier, de tourbe et de limon), de tourbe à sphaignes et de sol artificielNotes de bas de page11 s’est également révélé approprié pour l’élevage d’O. folsomi (ESG et AquaTerra, 2003), de F. fimetaria [J.I. Princz, Laboratoire de toxicologie des sols, Section de l’évaluation biologique et normalisation, Environnement Canada, Ottawa (ON), comm. pers., 2006] et de P. minutaNotes de bas de page12 [C. Fraser, Laboratoire de toxicologie des sols, Section de l’évaluation biologique et normalisation, Environnement Canada, Ottawa (ON), comm. pers., 2013]. On peut utiliser un tel mélange pour conserver de gros élevages ou des élevages de secours au laboratoireNotes de bas de page13.

2.3.6 Alimentation

Divers types d’aliments et de régimes alimentaires ont été utilisés pour l’élevage de collemboles destinés à des essais de toxicité des sols (v. tableau 5, annexe E). On a réussi à élever les quatre espèces décrites dans la présente méthode en employant de la levure sèche active (AquaTerra, 1998; Wiles et Krogh, 1998; ISO, 1999; AquaTerra et ESG, 2000; ESG, 2000, 2001, 2002; ESG et AquaTerra, 2002, 2003; Becker-van Slooten et coll., 2003, 2005; Greenslade et Vaughan, 2003; Stämpfli et coll., 2005; EC, 2006a, 2013b).

On peut se procurer dans les épiceries la levure sèche active à utiliser comme nourriture pour les élevages. Nous recommandons la levure Fleischmann’sMC, car cette marque a été utilisée avec succès dans la mise au point de la présente méthode (AquaTerra, 1998; EC, 2006a, 2007a, 2007b; Fraser, comm. pers., 2013). La quantité de nourriture ajoutée à chaque récipient d’élevage dépend de la densité de population des collemboles et de leur stade de développement. Cette quantité devrait donc être établie en fonction des observations et des notes prises au sujet de la nourriture qui a été consommée ou non pendant les semaines précédentes. Les quantités établies pour chaque espèce sont les suivantes :

  • F. candida et O. folsomi : ~100 mg (pour un récipient d’élevage de 15 × 23 × 8 cm environ);
  • F. fimetaria : ~10 mg (pour une boîte de Petri de ~10 cm de diamètre);
  • P. minuta : ~200 mg (pour un récipient d’élevage de 15 × 23 × 8 cm environ).

La nourriture peut être divisée en 2 ou 3 tas ou saupoudrée sur la surface du substrat. Les collemboles devraient être nourris deux fois par semaine, au moment de l’aération et de la réhydratationNotes de bas de page14. On ôtera les restants de levure non consommée (le cas échéant) avant d’ajouter la nouvelle levureNotes de bas de page15. On devrait veiller à éviter toute apparition d’une quantité excessive de champignons et de bactéries dans les récipients d’élevage, surtout pour F. fimetaria et P. minuta, qui sont plus sensibles aux champignons et aux bactériesNotes de bas de page16. Pour rendre la levure active, il est recommandé de l’ajouter après l’hydratation du substrat. On peut aussi hydrater la levure avec quelques gouttes d’eau d’essai.

2.3.7 Manipulation des organismes et entretien des élevages

Il est recommandé de manipuler le moins possible les collemboles pour éviter de les blesser et de les stresser inutilement. S’il faut les manipuler, on devrait procéder avec douceur, minutie et rapidité afin de réduire au minimum le stress subi par les animaux. On peut employer un pinceau fin et humide pour transférer les collemboles d’un récipient à un autre; toutefois, on doit se garder de blesser les organismes ou d’endommager leurs œufs. On peut également utiliser un système d’aspiration à faible succion, décrit dans ISO (1999), pour transférer les collemboles. Une pipette Pasteur munie d’une poire d’aspiration donne également de bons résultats, tout comme un dispositif d’aspiration à l’eau (v. annexe I). Il est recommandé d’ajuster le dispositif de manière à aspirer le plus délicatement possible les collemboles pour ne pas les blesser, en particulier P. minuta, qui est très sensible à des vibrations excessives (EC, 2013b). On peut aussi transférer les collemboles en tapotant doucement un récipient au-dessus d’un autre. Les animaux blessés ou apparemment stressés lors de la manipulation ne doivent pas être utilisés pour les essais et il est recommandé de les éliminer.

Le tableau 6 de l’annexe E renferme des conseils utiles sur l’entretien des élevages de diverses espèces de collemboles; ces conseils sont tirés de méthodes et guides publiés par des organismes internationaux au sujet des essais de toxicité des sols avec des collemboles.

Il est recommandé d’inspecter le contenu de chaque récipient d’élevage immédiatement avant chaque distribution hebdomadaire de nourriture afin de déterminer l’état apparent des collemboles et du substrat d’élevage. On devrait consigner dans un registre l’état apparent de l’élevage (organismes et substrat) au moment de chaque observation (v. 2.3.1).

Il faudrait limiter la densité de chargement des collemboles dans chaque récipient d’élevage afin d’éviter la surpopulation et ses conséquences négatives sur la croissance et la reproduction des collemboles et sur la santé de l’élevage (ISO, 1999). On suggère les densités suivantes (nombre de collemboles par centimètre carré) : pour F. candida et O. folsomi, ~2-3 collemboles adultes [Becker-van Slooten, comm. pers., 2004; G.L. Stephenson, AquaTerra Environmental Ltd., Orton (ON), comm. pers., 2006]; pour F. fimetaria, ~5-6 collemboles adultes (Princz, comm. pers., 2007); pour P. minuta, ~6-8 collemboles adultes (Fraser, comm. pers., 2013).

On devrait renouveler le substrat dans chaque récipient d’élevage selon les besoins et tous les 1-2 mois, quelle que soit la densité des collemboles. Pour ce faire, on peut préparer de nouveaux récipients d’élevage et y transférer les collemboles en tapotant l’ancien récipient au-dessus du nouveau. Pour réduire la population de collemboles dans un récipient d’élevage surpeuplé, on transfère une partie seulement de l’élevage (p. ex., 75 % des organismes). Le changement de substrat stimulera l’oviposition (Wiles et Krogh, 1998; Fraser, comm. pers, 2013). Pour O. folsomi, F. fimetaria et P. minuta, il est important que les nouveaux élevages contiennent un mélange de mâles et de femelles (soit ≥2 femelles pour chaque mâle) et que les organismes soient mélangés entre les différents récipients afin d’éviter les croisements consanguins (Stämpfli et coll., 2005). P. minuta pond des œufs sur un substrat frais pendant 1-3 semaines (selon la densité de population). La production d’œufs ralentit par la suite et il faut alors transférer les organismes dans un substrat frais pour qu’elle se poursuive (Fraser, comm. pers., 2013)Notes de bas de page17.

Il est recommandé de surveiller la température ambiante dans l’installation d’élevage une fois par semaine et de vérifier le taux d’humidité du substrat d’élevage au moment de l’aération hebdomadaire. Au besoin, on effectuera les ajustements nécessaires (v. 2.3.4et 2.3.5).

2.3.8 Élevages synchrones destinés aux essais

Pour que les élevages donnent de bons résultats, il faut qu’ils produisent le nombre nécessaire d’organismes expérimentaux en bonne santé, à un stade de développement connu, ayant le même âge et la même taille. En outre, les organismes d’élevage doivent satisfaire à des indices de santé et de performance précis (v. 2.3.9). Les paragraphes suivants décrivent les procédures à suivre pour obtenir des organismes expérimentaux du même âge (10-12 jours pour F. candida, 28-31 jours pour O. folsomi, 23-26 jours pour F. fimetaria et 14 jours pour P. minuta) aux fins des essais toxicologiques décrits dans le présent document.

Pour F. candida, F. fimetaria et P. minuta, on peut mettre en route de nouveaux élevages pour lancer le processus de synchronisationNotes de bas de page18. Afin d’obtenir suffisamment d’organismes pour les essais, on devrait préparer ≥2 gros nouveaux élevages (grands récipients d’élevage décrits en 2.3.2 pour F. candida, O. folsomi et P. minuta) ou plusieurs petits élevages (boîtes de Petri décrites en 2.3.2 pour F. fimetaria). Pour ce faire, on peut transférer 200-300 F. candida, F. fimetaria ou P. minuta matures provenant d’un élevage existant en tapotant légèrement le récipient de manière à faire tomber doucement les collemboles sur le substrat nouvellement préparé dans un récipient d’élevage (v. 2.3.5). Il faut éviter de transférer >300 organismes, car il y aurait alors surpopulation de collemboles et inhibition de la reproduction. Pour nourrir les élevages, on dépose 100-200 mg de levure dans chaque nouveau récipient. Le nombre d’organismes transférés et la quantité de levure ajoutée aux élevages dépendent de la taille des récipients d’élevage utilisés. On devrait inspecter les nouveaux élevages tous les jours afin de vérifier la présence d’œufs. Les collemboles devraient commencer à pondre les premières couvées dans les 24-48 h après avoir été transférés sur le nouveau substrat d’élevage.

Pour O. folsomi, on devrait utiliser les élevages existants afin d’obtenir suffisamment d’œufs pour assurer la synchronisation des élevages. On peut aussi se servir des élevages existants pour obtenir des œufs de F. candida, F. fimetaria ou P. minuta aux fins de la synchronisation, en plus d’établir de nouveaux élevages selon la méthode décrite précédemment.

Sept jours après l’apparition des premières couvées dans les nouveaux élevages (les œufs de P. minuta auront tout juste commencé à éclore) ou d’un grand nombre de couvées dans les élevages existants, il faudrait transférer plusieurs couvées (ou toutes, si possible) sur du papier filtre enduit de plâtreNotes de bas de page19 et humecté qu’on dépose ensuite dans les nouveaux récipients d’élevage ou dans des boîtes d’éclosion plus petitesNotes de bas de page20, Notes de bas de page21. On peut transférer les œufs à l’aide d’une fine spatule ou d’un pinceau légèrement humide. Il est recommandé de passer délicatement le pinceau sous la couvée et à travers celle-ci, puis de tapoter doucement le pinceau pour déposer les œufs sur le papier filtre enduit de plâtre et humecté ou sur le substrat de plâtre des boîtes d’éclosion. Le substrat de plâtre des nouveaux récipients d’éclosion et le papier filtre enduit devraient être suffisamment humides, sinon les œufs se déshydrateront (le substrat est assez humide lorsqu’une gouttelette d’eau reste à la surface et n’est absorbée que très lentement dans le substrat). Pour O. folsomi et F. fimetaria, on peut déposer un petit nombre de femelles adultes (~6 des organismes les plus gros) dans chaque boîte d’éclosion pour améliorer le taux d’éclosion. Pour P. minuta, il convient de hausser de ~30 % le nombre d’œufs requis pour la mise en route de l’essai afin de disposer de suffisamment d’adultes parmi lesquels choisir le nombre voulu de mâles et de femelles.

On devrait ajouter 3-5 grains de levure sèche active au substrat humide dans chaque récipient d’éclosion. On devrait ensuite fermer hermétiquementNotes de bas de page22 les boîtes d’éclosion et surveiller quotidiennement l’apparition des juvéniles. On ajoute de l’eau d’essai pour garder continuellement humides le substrat et le papier filtre enduit de plâtre. Les œufs de F. candida devraient éclore dans les 2-3 jours suivant le transfert (c.-à-d. ~10 jours après l’oviposition), ceux de F. fimetaria, dans les 3-4 jours suivant le transfert, et ceux de P. minuta, dans les 24 h suivant le transfert. Les papiers filtres enduits où se trouvent des œufs non éclos devraient être retirés 48 h après l’apparition des premiers juvéniles pour F. candida, 72 h après l’apparition des premiers juvéniles pour O. folsomi et F. fimetaria, et 24 h après avoir été déposés dans les récipients d’élevage pour P. minuta, puis on les place dans de nouveaux récipients d’éclosion fraîchement préparés. On répète la procédure pour obtenir un plus grand nombre d’organismes expérimentaux dans les élevages synchrones. Comme les juvéniles ont tendance à s’accrocher sous le papier filtre ou à se glisser sur le dessus, il est recommandé de tapoter le papier filtre ou de passer un pinceau sec sur celui-ci (en prenant soin de ne pas enlever les œufs qui sont sur le papier filtre) avant de retirer le papier filtre. S’il arrivait que des femelles adultes de l’espèce F. fimetaria soient déposées avec les œufs dans les récipients d’éclosion, ces femelles devraient être enlevées au moment où le papier filtre est retiré. Pour les essais, les juvéniles de l’espèce F. candida peuvent être utilisés 10 jours après l’enlèvement des œufs non éclos restants (ils doivent être âgés de 10-12 jours au début des essais); les adultes de l’espèce F. fimetaria peuvent être utilisés 23 jours après l’enlèvement des œufs non éclos restants (ils doivent être âgés de 23-26 jours au début des essais); les adultes de l’espèce O. folsomi peuvent être utilisés 28 jours après l’enlèvement des œufs non éclos restants (ils doivent être âgés de 28-31 jours au début des essais); les juvéniles de l’espèce P. minutadevraient être utilisés 14 jours après l’enlèvement des œufs non éclos restants. Toutefois, si le nombre de P. minuta âgés de 14 jours est insuffisant pour les essais, on peut y ajouter un deuxième groupe d’organismes âgés de 13 jours pour combler les besoins (en d’autres termes, les organismes doivent être âgés de 13-14 jours, mais il est recommandé d’utiliser seulement des organismes âgés de 14 jours pour les essais)Notes de bas de page23.

Une autre méthode pour synchroniser les élevages de collemboles consiste à déposer un certain nombre d’adultes dans un grand nombre de petits récipients contenant le substrat de plâtre de Paris et de charbon (v. 2.3.5). On laisse les adultes pondre leurs œufs pendant 48 h (F. candida, O. folsomi et F. fimetaria) ou 24 h (P. minuta). On retire les adultes 48 h (F. candida, O. folsomi et F. fimetaria) ou 24 h (P. minuta) après l’apparition de la première couvée d’œufs. Il est recommandé de surveiller l’apparition des juvéniles dans les petits récipients et de nourrir les organismes avec 2-3 grains de levure sèche active, selon les besoins. Les œufs non éclos sont retirés 48 h après l’apparition des juvéniles pour F. candida, 72 h après l’apparition des juvéniles pour O. folsomi et F. fimetaria, et 24 h après l’apparition des juvéniles pour P. minuta. Les organismes peuvent ensuite être utilisés dans un essai de toxicité 10, 23, 28 et 14 jours après l’éclosion des premiers juvéniles pour F. candida, F. fimetaria, O. folsomi et P. minuta, respectivement.

Tous les collemboles élevés en laboratoire aux fins des essais visant à mesurer les effets d’une substance ou matière toxique (y compris un toxique de référence) sur leur survie et leur reproduction devraient être acclimatés en laboratoire avant la mise en route desdits essais, le plus possible dans les conditions de l’essai toxicologique (v. 4.3). Pendant la période de synchronisation des élevages, les conditions de température doivent être identiques à celles utilisées dans les essais, et les collemboles doivent être nourris avec de la levure sèche (v. 2.3.4, 2.3.6 et 4.3).

2.3.9 Indices de santé et de performance

Chaque récipient d’élevage devrait faire l’objet d’une vérification au moins une fois par semaine, vérification pendant laquelle la performance de l’élevage devrait être surveillée et consignée (v. 2.3.1, 2.3.6 et 2.3.7). On devrait évaluer régulièrement et rajuster au besoin les méthodes et procédures utilisées pour entretenir l’élevage afin de préserver ou de restaurer sa santé. Si l’élevage semble en mauvaise santé ou atypique lors d’une vérification hebdomadaire (ou plus fréquente), il est recommandé de le vérifier quotidiennement pour s’assurer qu’il ne se produit pas une « mortalité en cascade » (augmentation exponentielle du taux de mortalité au fil du temps). Les élevages sont considérés comme étant en bonne santé si des collemboles de tailles différentes se déplacent activement à la surface du substrat.

Avant d’entreprendre un essai de toxicité définitif(v. 4.9), on doit effectuer au moins un essai avec un toxique de référence (essai de 7 jours pour O. folsomi et F. fimetaria et de 14 jours pour F. candida et P. minuta) à l’aide d’une partie de la population des collemboles issus d’un élevage synchrone donné. Idéalement, on devrait effectuer un essai toxicologique de référence parallèlement à chaque essai de toxicité d’un sol. Les laboratoires qui effectuent régulièrement des essais de toxicité des sols à l’aide de collemboles d’élevage peuvent choisir, plutôt, d’effectuer périodiquement un ou des essais toxicologiques de référence (au moins tous les deux mois) avec des collemboles provenant des mêmes élevages synchrones que les organismes utilisés pour l’essai ou les essais de toxicité d’un sol. Tous les essais effectués avec le ou les toxiques de référence devraient être réalisés dans les conditions et selon les modes opératoires exposés en 4.9. Les critères expérimentaux utilisés pour juger de la validité d’un essai particulier de toxicité d’un sol (et, indirectement, de la santé de l’élevage) d’après la performance des organismes expérimentaux dans le sol témoin négatif sont décrits en 4.4.

Un laboratoire qui effectue régulièrement (p. ex., une fois par mois ou plus souvent) des essais de toxicité avec des collemboles pourrait trouver utile de surveiller les données sur le nombre de descendants obtenus dans le sol témoin négatif, comme mesure de la santé et de la performance de l’élevage. Un graphique de ces données en fonction du temps peut révéler des problèmes de reproduction attribuables au régime alimentaire ou à d’autres conditions auxquelles les élevages sont exposés (Stephenson, comm. pers., 2004).

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