Méthode d’essai biologique servant à déterminer la toxicité des sédiments à l’aide d’une bactérie luminescente : chapitre 7

Section 5 : Essai d’un toxique de référence

L’emploi systématique d’un toxique de référence est nécessaire pour évaluer, dans des conditions normalisées, la sensibilité relative des bactéries après reconstitution, l’exactitude des techniques de dilution et d’autres facteurs influant sur la précision et la fiabilité des données produites par le personnel de laboratoire employant la méthode de référence en phase solide (EC, 1992). Le ou les toxiques de référence doivent être testés au moins une fois par mois au cours des périodes où l’on exécute des essais de toxicité des sédiments en phase solide à l’aide de V. fischeri et au début de la première utilisation d’un nouveau lot ou d’un nouvel envoi de réactif bactérien.

Il faut utiliser comme toxique(s) de référence pour cette méthode de référence un ou plusieurs échantillons de sédiment témoin positif (v. § 4.4). Lorsque l’on effectue chaque essai de toxicité de référence, il faut suivre les modes opératoires et respecter les conditions d’essai définies dans les § 4.5 et 4.6.

Pour effectuer un essai de toxicité de référence conformément aux modes opératoires et aux conditions précisées dans la présente méthode, il est recommandé d’utiliser un sédiment contaminé étalon tel que la matière de référence de port marin du CNRC (Harbour Marine Reference Material, p. ex. HS-5 ou HS-6), que l’on peut se procurer auprès du CNRC^{Note de bas de page 12}. On peut aussi utiliser comme toxique de référence un sédiment témoin enrichi après normalisation des modes opératoires convenables pour l’enrichissement. À cet égard, il faudrait consulter le guide d’Environnement Canada sur l’emploi d’un sédiment témoin enrichi d’un toxique de référence (EC, 1995b).

Pour les besoins de l’essai de toxicité de référence, on devrait choisir une série de concentrations qui, d’après des essais préliminaires ou des essais antérieurs réalisés dans les mêmes conditions et avec les mêmes modes opératoires, permettront de calculer une CI50 pour la luminescence de V. fischeri (v. § 6.1), avec des limites de confiance à 95 % d’une étroitesse acceptable. Les concentrations choisies devraient encadrer la CI50 prédite.

Il revient au personnel de laboratoire de montrer qu’il est capable d’obtenir des résultats constants, précis, avec le toxique de référence avant d’effectuer des essais définitifs sur les sédiments à l’aide de la présente méthode de référence. À cette fin, il devrait d’abord déterminer la précision intralaboratoire, exprimée sous forme de pourcentage par un coefficient de variation (CV), en effectuant au moins cinq essais de toxicité de référence avec différents lots de réactif bactérien (§ 2.1), en utilisant le même toxique de référence et les modes opératoires et conditions définis dans le présent document. Cet essai devrait servir à acquérir l’expérience du mode opératoire et servir de point de comparaison pour les essais ultérieurs (EC, 1998). Tout en l’appliquant systématiquement à chaque lot de réactif bactérien, le personnel ne devrait pas s’écarter du mode opératoire. Dès que l’on possède des données suffisantes (EC, 1995b), il faut porter les CI50 successives déterminées grâce à ces essais sur une carte de contrôle propre à chaque toxique et déterminer graphiquement si les résultats se situent à moins de ± 2 écarts-types des valeurs obtenues dans les essais antérieurs employant le même toxique de référence et le même mode opératoire. Il faut construire puis actualiser une carte de contrôle pour chaque toxique de référence utilisé avec la présente méthode de référence. La carte de contrôle devrait montrer le logarithme de la concentration, sur l’axe vertical, en fonction de la date de l’essai ou du numéro de l’essai, sur l’axe horizontal. Chaque nouvelle CI50 correspondant au toxique de référence doit être comparée aux limites établies de la carte ; la CI50 est acceptable si elle se situe dans la zone de confiance. Tous les calculs de la moyenne et de l’écart-type devraient employer le logarithme de la CI50 (log CI50).

Tous les calculs de la moyenne et de l’écart-type et tous les graphiques devraient employer le logarithme de la concentration (y compris de la CI50). On adhère ainsi simplement à l’hypothèse selon laquelle chaque CI50 a été estimée à partir de logarithmes de concentrations. On peut construire la carte de contrôle par report des valeurs logarithmiques de la moyenne ± 2 écarts-types (σ) sur papier arithmétique ou par conversion de ces valeurs en valeurs arithmétiques et report de ces dernières sur l’échelle logarithmique de papier semi-logarithmique. Si la distribution des CI50 se trouvait à ne pas être log-normale, la moyenne et l’écart-type arithmétiques pourraient se révéler plus convenables. On devrait recalculer la moyenne des log (CI50) obtenues ainsi que les limites supérieures et inférieures de la zone de confiance (± 2 σ) à chaque CI50 successive jusqu’à ce que les statistiques se stabilisent (EC, 1995b ; 2002b).

Si une CI50 particulière tombe à l’extérieur de la zone de confiance, on devrait s’interroger sur la sensibilité des organismes ainsi que sur la réalisation et la précision de l’essai. Comme elle risque de survenir 5 % du temps, du seul fait du hasard, une CI50 aberrante ne traduit pas nécessairement une sensibilité anormale du lot de réactif bactérien ou une précision insatisfaisante des données toxicologiques. Ce serait plutôt un avertissement qu’il pourrait y avoir un problème. On devrait vérifier en profondeur toutes les conditions et tous les modes opératoires de l’essai. Selon les conclusions auxquelles on arriverait, il pourrait être nécessaire de répéter l’essai de toxicité de référence ou d’obtenir un nouveau lot du réactif bactérien pour évaluer la toxicité des échantillons de la matière d’essai (en même temps qu’on effectuerait un nouvel essai de toxicité de référence avec le nouveau lot d’organismes).

Les résultats cantonnés à l’intérieur des limites de confiance ne signifieraient pas nécessairement que les résultats du laboratoire sont cohérents. La grande variabilité des données relatives à un toxique de référence se traduirait par l’élargissement de la zone de confiance ; une nouvelle donnée pourrait se trouver à l’intérieur de cette zone tout en représentant un écart indésirable. Environnement Canada (1995b) propose comme limite raisonnable un coefficient de variation de pas plus de 30 %, de préférence de 20 % ou moins. Pour la présente méthode de référence, le coefficient de variation des moyennes des résultats des essais de toxicité de référence effectués dans un laboratoire d’essai ne devrait pas excéder 30 %.