Méthode d’essai biologique servant à déterminer la toxicité des sédiments à l’aide d’une bactérie luminescente : chapitre 6

Section 4 : Essai du sédiment

• 4.1 Prélèvement de l’échantillon
• 4.2 Étiquetage, transport et entreposage des échantillons
• 4.3 Manipulation et caractérisation des échantillons
• 4.4 Sédiments témoins négatif et positif
• 4.5 Conditions d’essai
  • 4.5.1 Grandes lignes de l’essai
  • 4.5.2 Manipulations, réglages et corrections
  • 4.5.3 Température
  • 4.5.4 Durée des manipulations
  • 4.5.5 Tableau des dilutions
• 4.6 Modes opératoires
  • 4.6.1 Photomètre, bain d’eau et fiche de laboratoire
  • 4.6.2 Sous-échantillons pour la détermination de l’humidité
  • 4.6.3 Solution mère
  • 4.6.4 Solutions filles
  • 4.6.5 Reconstitution du réactif bactérien
  • 4.6.6 Inoculation et incubation
  • 4.6.7 Préparation de l’ordinateur
  • 4.6.8 Filtration
• 4.7 Mesures et observations
• 4.8 Critère de validité de l’essai

4.1 Prélèvement de l’échantillon

Environnement Canada (1994) donne des orientations sur les plans d’échantillonnage sur le terrain et sur les bonnes techniques de prélèvement des échantillons, qu’il faudrait suivre si ces échantillons sont destinés aux essais de toxicité à l’aide de la présente méthode de référence.

Les modes opératoires et les préleveurs (c’est-à-dire carottiers, bennes, dragues, préleveurs d’échantillons composites) dépendent de la nature des échantillons ainsi que des objectifs de l’étude ou des exigences réglementaires. On devrait prélever les échantillons de déblais de dragage à toutes les profondeurs auxquelles on s’intéresse.

Chaque série d’essais de toxicité selon la présente méthode de référence devrait comprendre un ou plusieurs échantillons de sédiment de référence. On devrait chercher ce sédiment dans les endroits où ses propriétés géochimiques, notamment la granulométrie, sont semblables à celles du sédiment d’essai (contaminé ou susceptible d’être contaminé) dans le lieu de prélèvement de ce sédiment. Idéalement, le sédiment de référence devrait provenir d’un endroit à l’abri de l’influence de la source ou des sources de contamination, mais dans les parages des endroits où on prélève le sédiment d’essai. Il est recommandé de prélever le sédiment de référence en plus d’un emplacement, pour accroître la probabilité d’une bonne correspondance de la granulométrie et d’autres caractéristiques physicochimiques avec celles des sédiments d’essai.

Le plan d’expérience d’un essai de toxicité employant un ou plusieurs échantillons de sédiment d’essai grossier comportant moins de 20 % de fines doit comprendre un échantillon de sédiment de référence non contaminé ou de sédiment témoin négatif, pour comparer la toxicité des échantillons (v. § 6.2). Le taux de fines de ces sédiments de référence ou témoin ne doit pas différer de plus de 30 % du taux de fines de l’échantillon ou des échantillons de sédiment d’essai auquel on les compare (§ 6.2). Si leur taux de fines satisfait à cette exigence, ces sédiments prélevés sur le terrain peuvent servir de référence ou de témoin, auquel cas l’orientation relative au prélèvement des échantillons s’applique. On peut aussi, pour faire coïncider étroitement le taux de fines avec celui du ou des échantillons de sédiment d’essai grossier, opter pour la préparation d’un ou de plusieurs échantillons de sédiment témoin négatif artificiel. Les orientations sur sa préparation sont données dans les § 4.3 et 4.4.

Le nombre de stations à échantillonner dans l’emplacement étudié et le nombre d’échantillons réitérés par station sont particuliers à l’étude. Dans la plupart des cas, il s’agira d’établir un compromis entre les contraintes logistiques et pratiques (p. ex. temps et coûts) et les besoins statistiques. Il faudrait consulter Environnement Canada (1994) pour obtenir des orientations sur le plan d’échantillonnage, y compris le nombre minimal recommandé de prélèvements réitérés sur le terrain. On peut trouver des orientations supplémentaires sur l’échantillonnage pour l’immersion en mer dans Environnement Canada (1995a ; 2002a). Nous incitons les demandeurs à consulter le Bureau régional de l’immersion en mer d’Environnement Canada (coordonnées dans l’annexe C) avant d’entreprendre les prélèvements et les essais.

Lorsque cela est pratique et est compatible avec le plan et les objectifs de l’étude, on devrait prélever au moins cinq échantillons de sédiment dans chaque station d’échantillonnage et à chaque profondeur à laquelle on s’intéresse. Lorsque cela est pratique et convenable (v. section 6), les échantillons prélevés devraient comprendre au moins cinq échantillons d’au moins une station de référence (c’est-à-dire d’emplacements où on peut trouver un sédiment non contaminé, aux propriétés physicochimiques semblables à celles des sédiments d’essai) dans les parages. L’objectif du prélèvement réitéré d’échantillons dans chaque station (prélèvements réitérés) est de permettre des comparaisons statistiques quantitatives relativement à la station ou entre différentes stations (EC, 1994 ; 1998 ; 2002b). En conséquence, chacun de ces « véritables échantillons réitérés » de sédiment devrait être soumis à un essai de sa toxicité aiguë pour V. fischeri. Des répétitions de laboratoire employant des sous-échantillons de chaque échantillon prélevé sur le terrain de sédiment d’essai et de référence, après mélange et autres manipulations (v. § 4.3), pourraient aussi faire partie d’une étude, dans les cas où l’homogénéité des échantillons ou la précision des résultats expérimentaux sont douteuses.

On devrait utiliser une benne (p. ex. Smith-MacIntyre, Van Veen, PONAR) ou un carottier pour prélever le sédiment, plutôt qu’une drague, afin de perturber au minimum l’échantillon. On devrait veiller, au cours de l’échantillonnage, à réduire au minimum la perte de fines. On devrait utiliser partout la même méthode de prélèvement.

Le volume d’échantillons nécessaire à un essai de toxicité des sédiments employant V. fischeri et portant sur plusieurs concentrations est faible (v. § 4.6). Environ 100 mL devraient être expressément utilisés pour la réalisation de l’essai^{Note de bas de page 6}. On a souvent besoin, par échantillon, d’au moins 5 à 7 L de sédiment entier (EC, 1994), bien que ce volume dépende des objectifs et du plan de l’étude ainsi que de la nature des analyses physicochimiques connexes et de la batterie d’essais de toxicité à effectuer. Pour obtenir le volume nécessaire d’échantillons pour la batterie d’essais, il est souvent nécessaire de combiner des sous-échantillons obtenus au moyen du préleveur. On devrait suivre les orientations données dans Environnement Canada (1994) pour obtenir un échantillon composite à partir de sous-échantillons prélevés sur le terrain.

4.2 Étiquetage, transport et entreposage des échantillons

Outre les consignes qui suivent, on trouve des orientations plus détaillées et utiles concernant l’étiquetage, le transport et le stockage des échantillons dans Environnement Canada (1994), document qu’il faudrait bien connaître à cette fin.

Les récipients servant au transport et à l’entreposage des échantillons doivent être neufs ou nettoyés et rincés à fond avec de l’eau propre. On devrait consulter Environnement Canada (1994) pour obtenir des orientations sur le choix des récipients convenables. Chaque récipient devrait être rempli entièrement de l’échantillon, pour en exclure l’air. Sans délai, on devrait le sceller, puis l’étiqueter ou le coder. L’étiquetage et les enregistrements connexes qui accompagnent cette opération doivent comprendre au moins un code que l’on peut utiliser pour identifier l’échantillon ou le sous-échantillon. Un registre à renvois croisés, qui pourrait ou pourrait ne pas accompagner l’échantillon ou le sous-échantillon, doit être établi par le personnel de terrain identifiant le type d’échantillon (p. ex. prélevé par benne, carottier, échantillon composite), sa source, le lieu précis du prélèvement (p. ex. hydronyme, latitude, longitude, profondeur), le numéro d’échantillon réitéré et la date du prélèvement. Cet enregistrement devrait aussi comprendre le ou les noms et signatures du ou des préposés au prélèvement, lesquels devraient aussi conserver des registres décrivant :

• la nature, l’aspect, le volume et/ou la masse de chaque échantillon ;
• la méthode et l’appareillage utilisés pour le prélèvement ;
• toute méthode utilisée pour obtenir un échantillon composite ou des sous-échantillons des sédiments prélevés par benne ou carottier ;
• le nombre d’échantillons réitérés prélevés dans chaque station d’échantillonnage ;
• le calendrier d’échantillonnage ;
• les types de récipients utilisés pour le transport des échantillons et leur nombre ;
• toute mesure effectuée sur le terrain (p. ex. température, salinité, pH, oxygène dissous) dans la colonne d’eau ou dans le sédiment sur les lieux du prélèvement) ;
• les méthodes et les conditions concernant le refroidissement et le transport des échantillons.

Dès le prélèvement, on devrait refroidir les échantillons tièdes (> 7 °C) entre 1 et 7 °C, avec de la glace ordinaire ou des contenants réfrigérants (« cryosacs ») et les maintenir froids (4 ± 3 °C), dans l’obscurité, durant le transport (EC, 1994 ; 1998). Au besoin, on devrait utiliser des contenants réfrigérants, de la glace ordinaire, des glacières ou d’autres moyens de réfrigération pour maintenir l’intervalle de températures de l’échantillon dans la fourchette de 1 à 7 °C durant le transport. Les échantillons ne doivent pas geler, pas même en partie, au cours du transport ou de l’entreposage, et on ne doit pas les laisser sécher (EC, 1994).

À l’arrivée au laboratoire, il faut enregistrer la température de l’échantillon et sa date de réception sur une fiche à l’usage du laboratoire (voir l’exemple de l’annexe F). Les échantillons à conserver pour usage ultérieur doivent être gardés dans des récipients étanches, à l’obscurité, à 4 ± 2 °C (EC, 1994 ; 1998). Il est recommandé de soumettre à l’essai le plus tôt possible après le prélèvement, les échantillons de sédiment ou de matières particulaires semblables. L’essai de toxicité du sédiment devrait commencer dans les deux semaines suivant le prélèvement, de préférence dans la semaine qui suit ce dernier ; l’essai ne doit pas démarrer plus de six semaines après le prélèvement (EC, 1994 ; 1997b ; 1997c ; 1998).

4.3 Manipulation et caractérisation des échantillons

Il ne faut pas soumettre au tamisage hydraulique les échantillons de sédiment de référence et d’essai prélevés sur le terrain. Il faudrait en éliminer les particules d’au moins 2 mm ainsi que les gros débris ou les gros organismes indigènes. Selon l’échantillon, on peut à cette fin travailler avec une pincette ou un gant, qu’on devrait rincer ou remplacer, entre chaque échantillon, pour en prévenir la contamination croisée. Si un échantillon renferme beaucoup de particules d’au moins 2 mm et beaucoup d’organismes indigènes macroscopiques qui ne peuvent pas être éliminés avec la pincette ou la main gantée, on peut soumettre l’échantillon à un tamisage sous pression (non hydraulique) au travers d’au moins un tamis d’acier inoxydable à ouvertures convenablement calibrées (p. ex. ≥ 2 mm). Cette manipulation devrait s’appliquer à toutes les fractions de l’échantillon utilisées pour les analyses physicochimiques (y compris l’analyse granulométrique), de même qu’aux fractions destinées aux essais de toxicité des sédiments en phase solide avec V. fischeri. Les modes opératoires utilisés pour la manipulation de chaque échantillon doivent être notés sur la fiche de laboratoire (voir la colonne intitulée « Notes » dans l’exemple de l’annexe F).

Il faut homogénéiser de nouveau le sédiment et l’eau de porosité qui se seraient séparés au cours de l’expédition et de l’entreposage. À cette fin, on mélange l’échantillon, soit dans le récipient qui a servi à son transport ou à son entreposage, soit dans un récipient propre servant à cette opération. On devrait normalement employer un outil non toxique (p. ex. une cuillère ou une spatule en acier inoxydable), tant que la texture et la couleur ne sont pas homogènes. On peut aussi utiliser une méthode mécanique (EC, 1994 ; 1998) pour homogénéiser l’échantillon. Pour chaque échantillon faisant partie d’un essai, il faut que les conditions de mélange, y compris la durée et la température à laquelle l’opération se déroule soient aussi semblables que possible. Si on doute de l’efficacité du brassage de l’échantillon, on devrait prélever des sous-échantillons du sédiment après le mélange, puis en analyser séparément l’homogénéité.

Immédiatement après le mélange de l’échantillon, il faut prélever les sous-échantillons de la matière exigée pour cet essai de toxicité et d’autres (p. ex. EC, 1998) et pour les analyses physicochimiques, les placer dans des enceintes d’essai étiquetées et dans les récipients étiquetés exigés pour l’entreposage des échantillons destinés à des analyses physicochimiques ultérieures. Il faudrait alors transvaser aussi toute fraction subsistant de l’échantillon homogénéisé qui pourrait être nécessaire à des essais supplémentaires de toxicité employant des amphipodes (EC, 1998) ou d’autres organismes dans des récipients étiquetés. On devrait conserver tous les sous-échantillons à entreposer dans des récipients scellés, sans espace d’air, et on doit les ranger à l’obscurité, à 4 ± 2 °C, jusqu’à l’emploi ou l’analyse. Immédiatement avant de l’analyser ou de l’employer dans l’essai de toxicité, il faut mélanger de nouveau à fond chaque sous-échantillon, pour s’assurer de son homogénéité.

On doit caractériser chaque échantillon (notamment de sédiment de référence, de sédiment témoin négatif et de sédiment témoin positif), au moyen de sous-échantillons, au moins relativement aux paramètres suivants (EC, 1998) : dans le cas d’un sédiment entier, le pourcentage de particules très grossières (c’est-à-dire > 1,0 mm), de sables (> 0,063 à 2,0 mm), de fines (0,063 mm ou moins), d’eau et de carbone organique total ; dans le cas de l’eau de porosité, la salinité et le pH. On pourrait également englober d’autres analyses : la teneur en carbone inorganique total, en matières volatiles totales, la demande biochimique d’oxygène, la demande chimique d’oxygène, la capacité d’échange cationique, les sulfures extractibles à l’acide, les métaux, les composés organiques de synthèse, les huiles et les graisses, les hydrocarbures de pétrole, tandis que les analyses de l’eau de porosité porteraient sur diverses caractéristiques physicochimiques telles que l’ammoniac (total et non ionisé) ou le sulfure d’hydrogène. Les modes opératoires recommandés pour le prélèvement de l’eau de porosité sont décrits dans Environnement Canada (1994). Il faudrait s’y conformer pour les besoins de la présente méthode. Pour les applications concernant l’immersion en mer, les renseignements minimaux exigés sont expliqués dans deux lignes directrices d’Environnement Canada (c’est-à-dire EC, 1995a ; 2002a).

Il faut entreprendre le plus tôt possible après le prélèvement des échantillons, les analyses de la répartition granulométrique, pour faciliter la sélection du ou des échantillons convenables de sédiment de référence et, le cas échéant, du sédiment témoin négatif (v. § 4.4 et 6.2).

À la faveur d’études antérieures, on a constaté que V. fischeri tolère tout à fait les fortes concentrations d’ammoniaque (Qureshi et al., 1982) y compris dans l’eau de porosité d’échantillons de sédiments prélevés en milieu marin ou estuarien (McLeay et al., 2001). D’après ces données limitées, les fortes concentrations d’ammoniaque dans l’eau de porosité ne sont pas un facteur majeur de confusion pour les résultats des essais. Cependant, on pourrait vouloir mesurer la contribution de l’ammoniaque de l’eau de porosité à la toxicité de l’échantillon déterminée par la présente méthode de référence. À cette fin, il faudrait mesurer le pH, et la salinité de l’eau de porosité et en doser l’ammoniaque dans les 24 heures suivant l’essai de toxicité du sédiment en phase solide à l’aide de V. fischeri, pour déterminer à quelles concentrations d’ammoniac total et non ionisé les organismes ont été exposés (§ 6.2). Les analyses de l’ammoniaque doivent employer un mode opératoire reconnu et normalisé (par exemple APHA et al., 1995 ; Standard Methods). Les calculs des concentrations d’ammoniac non ionisé doivent se fonder sur la température à laquelle se déroule l’essai, le pH de l’eau de porosité et la salinité de l’échantillon (Trussell, 1972 ; Bower et Bidwell, 1978).

4.4 Sédiments témoins négatif et positif

Les essais de toxicité limités à un ou à plusieurs échantillons de sédiment fin (renfermant au moins 20 % de fines) n’ont pas besoin d’échantillon de sédiment témoin négatif ni de sédiment de référence non contaminé, puisque la toxicité de ces échantillons ne s’estime pas par comparaison des résultats des essais aux résultats donnés par un échantillon de sédiment non contaminé possédant des caractéristiques granulométriques semblables. Cependant, tout essai de toxicité portant sur un ou plusieurs échantillons de sédiment renfermant moins de 20 % de fines doit comprendre un échantillon de sédiment non contaminé dont le taux de fines ne diffère pas de plus de 30 % de celui du ou des échantillons de sédiment d’essai auxquels on le compare pour estimer la toxicité (v. § 6.2). On peut se servir, à cette fin, d’un sédiment non contaminé prélevé sur le terrain, dans un emplacement non contaminé. Il est cependant recommandé d’employer un sédiment témoin négatif préparé en laboratoire (artificiel), puisqu’on peut faire correspondre étroitement sa teneur en fines à celle du ou des sédiments d’essai. Pour sa préparation, on devrait employer un mélange convenable de sable de silice lavé et/ou de kaolin du commerce, dont la granulométrie correspond à celle du ou des sédiments d’essai. On devrait mélanger ces ingrédients à fond, dans des proportions semblables à celles que l’on trouve dans le ou les sédiments d’essai. Le mode opératoire de la préparation et les résultats des essais de toxicité en phase solide avec V. fischeri employant un sédiment témoin négatif artificiel sont présentés dans Ringwood et al. (1997), Tay et al. (1998) et McLeay et al. (2001).

On devrait faire correspondre aussi étroitement que possible le taux de fines du ou des échantillons de sédiment témoin négatif englobés dans l’essai de toxicité et le taux de fines du ou des sédiments d’essai. Si, dans le cadre d’une étude, on soumet consécutivement à des essais de toxicité une série de sédiments renfermant une large gamme de pourcentages de fines, on pourrait y englober plus d’un sédiment témoin négatif, dont le taux de fines correspondrait aussi étroitement que possible à l’intervalle trouvé dans les sédiments d’essai.

Dans chaque série d’essais de toxicité, on recommande d’inclure un ou plusieurs échantillons de sédiment témoin positif, pour faciliter l’interprétation des résultats (§ 6.2). Ce témoin pourrait être un sédiment contaminé étalon, comme on peut s’en procurer par le Programme des matériaux de référence certifiés (PMRC, autrefois Programme des étalons d’analyse chimique marine) du CNRC, à Ottawa (p. ex. HS-3, Cook et Wells, 1996 ; HS-6, Tay et al., 1998). Ce pourrait aussi être un échantillon de sédiment non contaminé (p. ex. un sédiment témoin négatif artificiel ou un sédiment de référence non contaminé prélevé sur le terrain), enrichi, au laboratoire, d’un ajout dosé de toxique (EC, 1995b). Une troisième possibilité serait d’utiliser un échantillon fortement contaminé de sédiment prélevé sur le terrain, dont on aurait démontré la toxicité pour V. fischeri dans des essais en phase solide ; on évite cette option à moins de bien connaître d’avance les caractéristiques de ce sédiment (y compris son comportement dans un essai en phase solide employant V. fischeri). On doit utiliser un sédiment témoin positif comme toxique de référence quand on évalue la sensibilité des organismes d’essai ainsi que la précision et la fiabilité des résultats obtenus par le laboratoire pour cette matière de référence (section 5).

4.5 Conditions d’essai

4.5.1 Grandes lignes de l’essai

L’essai de mesure de la toxicité d’échantillons de sédiment entier, en phase solide, comprend les étapes et l’appareillage décrit sommairement dans le § 3.2.2.

Le tableau 1 est la liste de contrôle des conditions exigées ou recommandées pour la méthode de référence. D’autres détails figurent dans les § 4.5.2 à 4.5.5.

4.5.2 Manipulations, réglages et corrections

• On ne doit pas soumettre les sédiments d’essai, y compris le ou les échantillons de sédiment de référence dont on recommande l’inclusion dans chaque série d’essais, au tamisage hydraulique. On n’autorise aucune correction de la salinité de l’eau de porosité^{Note de bas de page 7}.
• On ne doit pas ajuster le pH des échantillons.
• On ne devrait pas aérer les échantillons, les solutions filles ou les filtrats.
• Il ne faut pas ajuster ou corriger les lectures de la bioluminescence correspondant aux concentrations des sédiments d’essai à l’aide de lectures relatives aux concentrations de sédiments de référence ou d’autres sédiments^{Note de bas de page 8}.
• Il faut normaliser, compte tenu de l’humidité de l’échantillon, l’effet mesuré statistique de l’essai (c’est-à-dire la CI 50 ; v. § 6.1).

4.5.3 Température

• L’essai emploie la bactérie luminescente Vibrio fischeri, souche NRRL B-11177, que l’on réactive dans une eau pure et non toxique et que l’on conserve à 5,5 ± 1,0 °C, jusqu’au transvasement des aliquotes dans chaque solution fille. Normalement, on obtient cette température si on insère la cuvette renfermant la solution bactérienne reconstituée dans le puits indiqué du photomètre (si on utilise le modèle 500 de Microtox). Sinon, il faut employer un incubateur thermostaté.
• On doit faire incuber toutes les dilutions de chaque échantillon de sédiment d’essai (y compris le sédiment de référence) inoculées avec les bactéries pendant 20 min à 15 ± 0,5 °C. Un bain d’eau ou un local thermostaté ferait l’affaire.
• Après incubation et filtration, on doit garder à 15 ± 0,5 °C, pendant les 10 min que dure leur stabilisation, tous les filtrats des dilutions transvasés dans des cuvettes. Cette température est normalement maintenue dans les puits du photomètre. On peut aussi maintenir les filtrats dans cet intervalle de température en plaçant leurs cuvettes dans un portoir que l’on garde dans un incubateur ou un local thermostaté.

4.5.4 Durée des manipulations

• Les bactéries lyophilisées devraient être reconstituées immédiatement avant d’être inoculées dans les solutions filles. Cette solution bactérienne devrait être utilisée dans les deux heures suivant la reconstitution et doit l’être dans les trois heures. Le moment de la reconstitution devrait être enregistré sur la fiche de laboratoire (voir exemple, annexe F).
• Il faut laisser les solutions filles se stabiliser à 15 ± 0,5 °C pendant au moins 10 min avant l’inoculation avec la solution bactérienne. L’inoculation devrait se dérouler le plus vite possible : 4 min, au plus, pour toutes les dilutions d’essai. Sur la fiche de laboratoire (annexe F), enregistrer l’heure de la première inoculation comme heure de départ de l’essai.
• On doit laisser toutes les solutions filles incuber pendant 20 min. Une fois ces solutions filtrées et transvasées dans les cuvettes, les filtrats doivent être mis à incuber dans les cuvettes pendant 10 min avant d’en mesurer la production lumineuse^{Note de bas de page 9}.
• La durée totale du transvasement des filtrats des cuvettes et la lecture de leur bioluminescence devrait être semblable à celle de l’inoculation bactérienne des solutions filles (≤ 4 min).

4.5.5 Tableau des dilutions

• Les solutions expérimentales comprennent trois témoins (eau de dilution uniquement) et 12 solutions filles (dilutions).
• La concentration maximale est normalement de 197 000 mg/L (19,7 %, poids de sédiment humide en volume), chaque concentration successive étant la moitié de la précédente.

4.6 Modes opératoires

La méthode d’essai biologique comporte l’incubation simultanée d’au moins trois solutions témoins (constituées d’un inoculum de V. fischeri reconstitué dans le diluant) ainsi que de 12 dilutions différentes de la matière d’essai dans le diluant^{Note de bas de page 10}. Après la période prescrite d’incubation, on filtre les solutions incubées (se trouvant dans les tubes à essai, à une température fixée) et les solution filles, puis on transvase les filtrats dans les cuvettes. Après une courte période de stabilisation des conditions de maintien des filtrats, on mesure par photométrie la bioluminescence des organismes subsistant dans le filtrat.

Dans la présente section, les modes opératoires appliqués à un photomètre présupposent l’emploi du modèle 500 de Microtox ou d’un photomètre possédant des caractéristiques semblables. Comme le modèle 500 possède 30 puits pour conserver les cuvettes renfermant les filtrats des dilutions, le technicien a la possibilité de dédoubler l’essai ou d’effectuer deux essais simultanément sur des échantillons différents. La description qui suit du mode opératoire suit le parcours d’un échantillon de sédiment dans ses diverses étapes. Selon le plan de l’expérience et la nature ainsi que la source des sédiments d’essai, on devrait aussi inclure dans chaque étude un ou plusieurs échantillons de sédiment de référence prélevés sur le terrain (v. § 4.1 et 6.1). Les essais de toxicité comportant un ou plusieurs échantillons de sédiment grossier (c’est-à-dire moins de 20 % de fines) doivent comprendre un sédiment témoin négatif (artificiel ou naturel) ou un sédiment de référence, dont le taux de fines ne diffère pas de plus de 30 % du taux se trouvant dans le ou les sédiments d’essai (v. § 6.2). On recommande aussi l’inclusion d’un sédiment témoin positif (§ 4.4) dans chaque série d’essais de toxicité. Pour englober un ou plusieurs échantillons de sédiment d’essai en même temps qu’un sédiment de référence, un sédiment témoin négatif et/ou sédiment témoin positif dans une seule étude, il est nécessaire de passer chaque échantillon l’un après l’autre.

4.6.1 Photomètre, bain d’eau et fiche de laboratoire

• Mettre l’ordinateur, le photomètre et la balance sous tension.
• Dans le cas du modèle 500 de Microtox, s’assurer que la commande de la température derrière l’appareil est réglée à « Microtox Acute ».
• Insérer 15 cuvettes dans les trois premières rangées (A à C) de puits. Ceux-ci seront maintenus à 15 ± 0,5 °C. Les puits d’incubation sont disposés selon une matrice de rangées étiquetées A à C et de colonnes numérotées 1 à 5. On les désigne A1 à C5.
• Insérer une cuvette dans le puits de réactif et y transvaser à la pipette 1,0 mL de solution de reconstitution. Cette solution sera maintenue à 5,5 ± 1 °C.
• Mettre sous tension l’incubateur du bain d’eau. Laisser la température de l’eau se stabiliser à 15 ± 0,5 °C.
• Brasser l’échantillon pour l’homogénéiser, à la cuillère d’acier inoxydable.
• Remplir la fiche de laboratoire (v. § 7.2.7 et l’annexe F). Placer 15 tubes d’EPS (v. annexe E, tableau 5) dans un portoir.

4.6.2 Sous-échantillons pour la détermination de l’humidité

• Pour chaque sédiment d’essai, étiqueter et peser trois flacons vides (p. ex. flacons de verre pour spectrométrie de scintillation, de 20 mL, ou autres récipients convenant au séchage et à la pesée) et en noter les poids à 0,01 g près. Saisir les données, si on emploie une feuille de calcul pour convertir la CI50 en une valeur basée sur le poids du sédiment sec (§ 6.1).
• Ajouter 5,0 ± 0,2 g de sédiment aux flacons et noter les poids à 0,01 g près (ou les saisir dans la feuille de calcul).
• Faire sécher les sous-échantillons en portant les flacons dans une étuve à 100 ± 5 °C pendant 24 h. Noter la température de l’étuve.
• Noter les poids secs à 0,01 g près.

4.6.3 Solution mère

• Peser 7,00 ± 0,05 g d’échantillon homogénéisé dans un becher de verre ou de plastique jetable de 50 mL.
• Ajouter une tige magnétique revêtue de téflon de 2,5 cm et 35,0 mL de « diluant en phase solide » au becher.
• Agiter 10 min sur un agitateur magnétique, à une vitesse suffisante pour créer un tourbillon dont la profondeur atteint la moitié de celle du liquide.

4.6.4 Solutions filles

• Verser 1,50 mL de « diluant en phase solide » (section 3) dans les 14 premiers tubes sur le portoir (§ 4.6.1). Le tube 15 renfermera la concentration maximale, provenant de la solution mère.
• À la fin des 10 min d’agitation de la solution mère, utiliser l’extrémité d’une macropipette à cône de grand calibre pour transvaser 1,50 mL de suspension du becher de 50 mL, dont on continue d’agiter le contenu, vers chacun des tubes d’EPS n^os 15 et 14. À cette fin, insérer plonger l’extrémité de la pipette près de la paroi du becher à environ la moitié de la profondeur de l’échantillon en train d’être agité. Éviter de colmater l’extrémité tout en aspirant l’échantillon.
• En commençant par le tube d’EPS 14, dans lequel se trouvent 3,00 mL de solution, effectuer une série de dilutions à la 1/2 comme suit : mélanger le contenu trois fois avec la macropipette, puis prélever rapidement 1,50 mL à environ un tiers de la profondeur (pour aider à prélever une partie des sables lourds). Transvaser cette aliquote dans le tube 13. Répéter l’opération de mélange et de transvasement du tube 13 au tube 12, puis poursuivre, à la suite, du 12 au 11, etc. jusqu’au transvasement de 1,5 mL d’une dilution à la 1/2 dans le tube 4. Enfin, mettre au rebut 1,5 mL du tube 4. Les tubes 1 à 3 ne renferment que du diluant et servent de témoins.
• Placer le portoir et ses tubes d’EPS renfermant toutes les solutions (dilutions) filles (y compris les témoins) dans le bain d’eau, à 15 ± 0.5 °C. Les laisser 10 min pour permettre à la température de s’équilibrer. Le niveau de l’eau dans le bain devrait se situer juste au-dessus du niveau du liquide dans les tubes d’EPS.

4.6.5 Reconstitution du réactif bactérien

• Prendre un flacon de bactéries lyophilisées (Microtox Acute Reagent) en entreposage.
• L’ouvrir et en reconstituer le contenu, en versant rapidement de la solution de reconstitution de la cuvette se trouvant dans le puits de réactif du modèle 500 de Microtox (ou d’un autre photomètre) dans le flacon, en en faisant tourbillonner le contenu trois fois et en versant les bactéries réhydratées dans la même cuvette.
• Remettre la cuvette dans le puits de réactif.
• À l’aide d’une pipette de 500 :L, aspirer tout le réactif bactérien reconstitué du flacon, l’ajouter à la cuvette et mélanger 10 fois à l’aide de la même pipette et du même cône de pipette.
• Noter le numéro de lot du réactif, la date de péremption et l’heure de la reconstitution sur la fiche de laboratoire (v. § 7.2.7 et annexe F).

4.6.6 Inoculation et incubation

• Préparer les trois pipettes suivantes : a) une pipette automatique (telle que la pipette Eppendorf ou Oxford Nichiryo), dotée d’une seringue de 0,5 mL de capacité à cône « ultramicro » ; b) une macropipette (p. ex. Oxford, de 1 à 5 mL) ; c) une pipette de 500 :L.
• Après équilibrage de la température pendant 10 min des tubes d’EPS renfermant les solutions filles (§ 4.6.4), régler un chronomètre à 20 min, mais sans le mettre en marche.
• S’assurer que la pipette automatique est réglée pour distribuer 20 µL par éjection. Placer le cône sous la surface de bactéries reconstituées (réactif bactérien reconstitué) et aspirer suffisamment de réactif pour au moins 18 éjections.
• En maintenant le cône au-dessus du réactif et contre la paroi de la cuvette, effectuer deux éjections. Essuyer soigneusement le cône avec une serviette de papier propre (p. ex. KimWipe^MD) après avoir aspiré le réactif. Plonger ensuite le cône dans un tube ou un becher renfermant du « diluant en phase solide » et effectuer une autre éjection (pour rincer l’extérieur du cône). Rejeter le contenu de ce tube ou de ce becher.
• Mettre en marche la minuterie réglée à 20 min, noter l’heure (ce sera l’heure de démarrage de l’essai) sur la fiche de laboratoire, puis éjecter immédiatement 20 µL de réactif dans chacun des tubes d’EPS, en débutant par le tube 1 (première solution témoin) et poursuivre, à la suite, jusqu’au tube 15 inclusivement. En appuyant le collier du cône « ultramicro » sur le rebord supérieur de chaque tube, on fait en sorte que le cône se trouve à la surface de l’échantillon et non au fond du tube.
• Enlever et mettre au rebut le cône « ultramicro ». Éjecter ce qui reste de réactif de la seringue dans la cuvette d’attente du puits de réactif.
• Si on est censé effectuer un second essai (c’est-à-dire soit avec un deuxième échantillon, soit un essai en double avec le même échantillon), en même temps, dans les 15 puits restants du photomètre, fixer de nouveau un cône propre à la seringue, remplir cette dernière de réactif, puis inoculer la série suivante de solutions filles. Ce second essai (parallèle) peut être effectué avec soit un autre échantillon de sédiment d’essai (effectivement ou peut-être contaminé), de sédiment de référence, de sédiment témoin négatif ou de sédiment témoin positif.
• Avec la macropipette réglée à 1,5 mL, mélanger le contenu de chaque tube deux fois, en commençant par le tube 1 (premier témoin) et en passant consécutivement aux tubes suivants jusqu’au tube 15, inclusivement.
• Insérer une colonne de filtration (v. note 5, § 3.2.3) sur chaque tube, son extrémité inférieure étant positionnée à environ 1 cm au-dessus de la surface du liquide. Ne pas mouiller le filtre, ce qui pourrait nuire à la filtration de l’échantillon.

4.6.7 Préparation de l’ordinateur

• Préparer l’ordinateur à la réception des données du photomètre.
• Faire démarrer le progiciel et les menus pour l’essai en phase solide.
• Suivre les consignes à l’écran.
• Consulter le guide de l’utilisateur pour obtenir des renseignements complémentaires.
• Le logiciel pourrait demander la saisie du nombre de témoins (3), du nombre de dilutions (12), de la concentration initiale (197 000 mg/L), du coefficient de dilution (2) et de la durée de l’essai (30 min).

4.6.8 Filtration

• Au son de la minuterie réglée à 20 min, donner au logiciel les réponses convenables.
• Remettre la minuterie à 10 min et la déclencher. Avec le logiciel de Strategic Diagnostics Inc. (Omni^MDVersion 1.18 ou l’équivalent), le démarrage est automatique. Sinon, programmer le logiciel pour qu’il fasse démarrer cette période de 10 min automatiquement, par l’action d’une touche sur le clavier.
• Pousser doucement le filtre dans le tube 1 (premier témoin) vers le bas, suffisamment loin pour obtenir légèrement plus de 500 µL de filtrat dans le tube. Puis, en utilisant la pipette de 500 µL, transvaser 500 µL de filtrat dans la cuvette se trouvant dans le puits A1 du photomètre.
• Répéter cette étape pour les 15 tubes, à l’aide du même cône de pipette, en terminant avec 500 µL de filtrat transférés du tube 15 à la cuvette C5.
• Prendre note du temps exigé pour terminer tous les transvasements.
• Souvent, quand on manipule des sédiments riches en fines, le filtre de la solution fille la plus concentrée (tube 15) se colmate. Obtenir ce qui peut être récupéré et le transvaser dans la cuvette désignée (C5). Habituellement, la luminescence de ces échantillons aura diminué à zéro avant la lecture de la concentration maximale. Signaler ce type de problème sur la fiche de laboratoire (v. § 7.2.7 et annexe F).
• À la fin de tous les transvasements, répondre à l’ordinateur, s’il y a lieu. Habituellement, cela nécessitera la photométrie de la luminescence (§ 4.8), ce qui prendra à peu près le même temps qu’il a fallu pour la filtration et le transvasement des filtrats vers les cuvettes.
• Les données sont souvent envoyées du photomètre à l’ordinateur, étant reçues par le logiciel qui construit un fichier de données.

4.7 Mesures et observations

Consulter le § 4.3 pour connaître les exigences et les recommandations concernant la caractérisation des échantillons (p. ex. mesures de la granulométrie et d’autres caractéristiques physicochimiques de la matière d’essai).

Le mode opératoire de la mesure de la luminescence bactérienne dans les solutions filles varie selon le photomètre et le logiciel utilisés. Dans le cas du modèle 500 de Microtox, placer le premier témoin (cuvette A1) dans le puits de lecture, puis appuyer sur le bouton de réglage « set ». L’instrument abaisse la cuvette dans le puits (parfois 2 ou 3 fois) pour régler la lecture de zéro (obscurité) et du témoin à environ 95 et, de la sorte, établir la gamme convenable de sensibilité pour les mesures photométriques. Quand le voyant vert s’allume, appuyer sur le bouton de lecture « read ». Lire la cuvette, puis la retirer du puits de lecture et la remettre dans le bloc d’incubation. Si le progiciel n’enregistre pas les données photométriques, les noter sur la fiche de laboratoire. Faire la lecture et l’enregistrement de la luminescence de toutes les cuvettes, en prenant à peu près le même temps par cuvette qu’il en a fallu pour la filtration et le transvasement (v. § 4.6.8). Avec le logiciel de Strategic Diagnostics Inc. (Omni^MDVersion 1.18 ou l’équivalent), le minutage est effectué par l’ordinateur, et un signal indique le moment où on devrait lire chaque cuvette.

Si un problème survient, consulter les guides de l’utilisateur du photomètre et du logiciel utilisés.

4.8 Critère de validité de l’essai

Le critère suivant décide de la validité de l’essai de toxicité du sédiment effectué à l’aide de la présente méthode de référence^{Note de bas de page 11} :

• Le coefficient de variation représentant la lecture photométrique moyenne des filtrats des trois solutions témoins faisant partie de l’essai doit être inférieur ou égal à 12 %.