Méthode d’essai biologique : essais toxicologiques sur des truites arc-en-ciel aux premiers stades de leur cycle biologique : annexes

Annexes

1. Membres du Groupe intergouvernemental de la toxicité aquatique (octobre 1998)
2. Adresses de l’administration centrale et des bureaux régionaux du Service de la protection de l’environnement d’Environnement Canada
3. Écarts méthodologiques des essais aux premiers stades du cycle biologique des salmonidés
4. Distribution, cycle biologique et élevage de la truite arc-en-ciel
5. Séries logarithmiques de concentrations convenant aux essais toxicologiques

Annexe A : Membres du Groupe intergouvernemental de la toxicité aquatique (octobre 1998)

Gouvernement fédéral (Environnement Canada)

C. Blaise
Centre Saint-Laurent
Montréal

S. Blenkinsopp
Direction générale de l’avancement des technologies environnementales
Edmonton

C. Boutin
Centre national de recherche sur la faune
Hull

C. Buday
Centre des sciences de l’environnement du Pacifique
North Vancouver (C.-B.)

A. Chevrier
Division du milieu marin
Hull

K. Day
Institut national de recherche sur les eaux
Burlington (Ont.)

K. Doe
Direction générale de la conservation de l’environnement
Moncton

G. Elliott
Laboratoire d’écotoxicologie
Edmonton

M. Fennell
Centre des sciences de l’environnement du Pacifique
North Vancouver

M. Harwood
Centre Saint-Laurent
Montréal

P. Jackman
Direction de la conservation de l’environnement
Moncton

R. Kent
Direction de l’évaluation et de l’interprétation
Hull

N. Kruper
Laboratoire d’écotoxicologie
Edmonton

D. MacGregor
Centre de technologie environnementale
Gloucester (Ont.)

D. Moul
Centre des sciences de l’environnement du Pacifique
North Vancouver

W.R. Parker
Région de l’Atlantique
Dartmouth (N.-É.)

L. Porebski
Division du milieu marin
Hull

D. Rodrigue
Centre de technologie environnementale
Gloucester

R. Scroggins
Centre de technologie environnementale
Gloucester

A. Steenkamer
Centre de technologie environnementale
Gloucester

D. St-Laurent
Région du Québec
Montréal

G. van Aggelen
Centre des sciences de l’environnement du Pacifique
North Vancouver

R. Watts
Centre des sciences de l’environnement du Pacifique
North Vancouver

P. Wells
Région de l’Atlantique
Dartmouth

W. Windle
Direction de l’évaluation des produits chimiques commerciaux
Hull

S. Yee
Centre des sciences de l’environnement du Pacifique
North Vancouver

Gouvernement fédéral (Commission de contrôle de l’énergie atomique)

P. Thompson
Division de la radioprotection
Ottawa

Provinces

S. Abernethy
Ministère de l’Environnement et de l’Énergie
Etobicoke (Ont.)

C. Bastien
Ministère de l’Environnement et de la faune
Sainte-Foy (Qc)

D. Bedard
Ministère de l’Environnement et de l’Énergie
Etobicoke

M. Mueller
Ministère de l’Environnement et de l’Énergie
Etobicoke

C. Neville
Ministère de l’Environnement et de l’Énergie
Etobicoke

D. Poirier
Ministère de l’Environnement et de l’Énergie
Etobicoke

G. Westlake
Ministère de l’Environnement et de l’Énergie
Etobicoke

Annexe B : Adresses de l’administration centrale et des bureaux régionaux du Service de la protection de l’environnement d’Environnement Canada

Administration centrale
351, boul. Saint-Joseph
Place Vincent-Massey
Hull
K1A 0H3

Région de l’Atlantique
15^eétage, Queen Square
45 Alderney Drive
Dartmouth (Nouvelle-Écosse)
B2Y 2N6

Région du Québec
105, rue McGill
14^eétage
Montréal
H2Y 2E7

Région de l’Ontario
4905, rue Dufferin, 2^eétage
Downsview
M3H 5T4

Région de l’Ouest et du Nord
Pièce 210, Twin Atria n^o2
4999, 98^eAvenue
Edmonton
T6B 2X3

Région du Pacifique et du Yukon^{Note de bas de page 45}
224, rue Esplanade
North Vancouver (Colombie-Britannique)
V7M 3H7

Annexe C : Écarts méthodologiques des essais aux premiers stades du cycle biologique des salmonidés^{Note de bas de page 46}

Annexe D : Distribution, cycle biologique et élevage de la truite arc-en-ciel

Distribution

La truite arc-en-ciel est indigène dans l’ouest de l’Amérique du Nord. On la trouve de la Basse- Californie à l’Alaska. Cependant, le gros des effectifs se trouve du nord de la Californie au nord de la Colombie-Britannique, particulièrement dans les fleuves et les tributaires de même que dans les lacs et les cours d’eau. Dans le centre de la Colombie-Britannique, l’espèce est parfois appelée « truite de Kamloops ». Introduite dans le monde entier, elle fréquente désormais les eaux de toutes les provinces du Canada, du fait de l’ensemencement ou d’une introduction accidentelle. Les populations passent leur vie entière en eau douce, bien qu’elles fréquentent également les eaux estuariennes, aux stades du juvénile ou de l’adulte. La sous-espèce « steelhead » des deux côtes du Canada descend à la mer et revient frayer en eau douce. Au Canada et ailleurs, la truite arc-en-ciel est largement élevée en pisciculture pour repeupler les eaux naturelles destinées à la pêche sportive. C’est l’une des espèces les plus utilisées en aquaculture commerciale et c’est l’un des poissons ordinairement utilisés dans les essais toxicologiques en milieu aquatique partout dans le monde et particulièrement au Canada.

Cycle biologique

L’arc-en-ciel fraie de la fin de l’hiver jusqu’au printemps. Les géniteurs ont habituellement trois ou quatre ans et pèsent de 1,5 à 4 kg, mais ceux qui fraient plus d’une fois sont d’un poids et d’un âge qui peuvent être considérablement plus élevés. La fécondité des femelles est d’environ 1 000 à 1 400 œufs par kilogramme. Les œufs, dont le diamètre varie entre 3,0 et 5,0 mm sont déposés dans des nids de gravier. À la sortie de l’œuf, les alevins mesurent de 80 à 175 mg (poids frais). Ils séjournent dans les graviers jusqu’à la résorption de leur sac vitellin et sortent, fin mai ou en juin, sous la forme de truitelles de 0,1 à 0,2 g nageant librement. Les jeunes nés dans les cours d’eau y passent le premier hiver, après quoi ils gagnent les lacs. Les truitelles et les juvéniles se nourrissent habituellement de larves d’insectes et de zooplancton (p. ex. de daphnies). On sait que les adultes se nourrissent d’insectes, de crustacés et d’autres poissons (Carl et al., 1973 ; Gordon et al., 1987).

La robe des jeunes (jusqu’à 12 cm environ) s’orne de 9 à 13 mouchetures ovales, foncées, le long de la ligne latérale, sur lesquelles se superposent de fines mouchetures noires sur le dos et les côtés. Une série de 5 à 10 taches pigmentées médianes se succèdent le long de la ligne sommitale du dos, devant la nageoire dorsale. Cette dernière possède un bord d’attaque foncé chez les truitelles et une série de barres ou de taches noires distinctes chez les sujets âgés. Aux extrémités des nageoires dorsale et anale on distingue une coloration blanche ou orangé pâle. Sur la nageoire adipeuse, on trouve fréquemment une ou deux taches noires ; la queue n’est presque pas tachetée. On ne trouve aucune touche de rouge sur le dessous de la mâchoire inférieure (Carl et al., 1973).

Élevage

Expulsion provoquée des gamètes

Des considérations pratiques pourraient obliger à l’extraction des gamètes nécessaires à la réalisation des essais toxicologiques chez les géniteurs gardés au laboratoire. Dans cette éventualité, il convient de prendre plusieurs facteurs en considération. Voici une description de certains des aspects les plus fondamentaux de l’opération, mais on devrait, au préalable, étudier à fond l’information détaillée sur les façons précises de s’y prendre.

La disponibilité saisonnière des gamètes à maturité dépend de la situation et des populations locales ainsi que des pratiques utilisées en pisciculture (c’est-à-dire de la température saisonnière de l’eau et de la photopériode). Certaines piscicultures ont réussi à sélectionner et à manipuler différentes populations de géniteurs pour obtenir des gamètes l’année durant.

Normalement, on sépare les mâles des femelles et les adultes des juvéniles. Il est facile de distinguer le sexe des poissons et de reconnaître les mâles adultes, mais la sélection des femelles mûres en vue de l’évacuation des gamètes demande de l’expérience et de la pratique. Si l’on n’examine pas fréquemment les femelles afin de déterminer le moment de l’ovulation, on risque fort de n’obtenir que des œufs stériles. La fécondité des œufs est à son maximum pendant une période de 3 à 4 jours survenant de 4 à 8 jours après l’ovulation. Pour optimiser la fécondation, l’extraction des œufs destinés aux essais toxicologiques devrait survenir au cours de cette période. Si on laisse les œufs vieillir davantage, on risque de nuire à leur survie, non seulement à la fécondation, mais également à tous les stades, de l’œuf embryonné jusqu’à la truitelle.

Il est essentiel de manipuler les poissons avec soin quand on en vérifie la maturité. En effet, il est très facile de briser les œufs non pondus, qui deviennent stériles. On reconnaît la femelle prête, aux signes suivants : augmentation de volume de l’abdomen, qui devient plus mou ; gonflement et coloration en rouge de la papille saillant à l’orifice urogénital ; expulsion spontanée d’œufs par cet orifice. On peut examiner ces œufs en les rendant transparents et en vérifiant la position de la vésicule germinative et des gouttelettes lipidiques dans le vitellus. Ces manipulations des géniteurs et la vérification de leur maturité exigent un personnel expérimenté.

L’évacuation des œufs peut être confiée à une ou deux personnes, selon leur expérience. Ordinairement, l’une immobilise le poisson pendant que l’autre procède à l’évacuation. On peut s’y prendre de diverses façons selon que l’on entend sacrifier la femelle ou l’anesthésier. On devrait éviter d’exercer une force excessive au cours de l’opération. Le mâle peut donner sa laitance plus d’une fois, à la condition qu’on lui accorde un repos d’une semaine entre chaque séance afin de ne pas nuire à la qualité de la laitance.

Manipulation des gamètes

Les modes opératoires exposés dans le présent rapport exigent la fécondation des œufs immédiatement avant le début de l’essai. Il faut donc coordonner et synchroniser l’approvisionnement et la manipulation des œufs non fécondés et de la laitance. Si on peut obtenir les gamètes directement au laboratoire, par des géniteurs gardés sur place, il est souvent plus facile et plus économique de se les procurer d’une écloserie et de faire transporter au laboratoire la laitance et les œufs non fécondés (v. § 2.2). Dans les conditions optimales si l’on prend les conditions nécessaires, on peut ainsi transporter ces gamètes et les stocker quelques jours avant la fécondation. Il est cependant souhaitable de réduire au minimum la période d’entreposage (idéalement moins de 24 h), afin d’améliorer la probabilité de réussite de la fécondation.

La laitance conserve entre 70 et 90 % de son pouvoir de fécondation pendant au moins 5 jours si on la manipule et on l’entreposage convenablement. Dans la laitance fraîche, les spermatozoïdes restent immobiles à cause de la teneur en potassium du liquide séminal. La qualité ultérieure du sperme dépend de la température de transport et d’entreposage, la hauteur de laitance dans le récipient, de la stérilité de ce dernier et de l’humidité. Les basses températures (idéalement entre 0 et 4 °C) prolongent la durée de conservation du sperme. Il faut plus de sperme pour féconder un lot d’œufs expédié et conservé au froid que si la fécondation n’avait pas été différée. Il importe de maintenir la hauteur de laitance dans le récipient à un minimum (< 6 mm) pour que le sperme soit convenablement oxygéné. Il est également souhaitable d’aérer la laitance avec de l’oxygène. L’emploi d’oxygène ou d’air saturé en humidité peut prolonger considérablement la durée de conservation, car il aide à prévenir la déshydratation des gamètes.

On peut transporter et entreposer les œufs non fécondés à peu près de la même façon que la laitance. Il faudrait collecter les œufs le plus tôt possible après l’ovulation, car la durée de conservation diminue avec l’âge des œufs. On devrait disposer les œufs sur au plus 4 couches et les expédier et les stocker à une température variant entre 0 et 4 °C, dans des contenants isolés, conçus de façon à réduire le risque de bris au minimum. Ainsi traités, les œufs non fécondés devraient conserver un taux normal de fécondité pendant environ 3 jours. Pour maximiser la fécondation, on devrait féconder les œufs entreposés avec de la laitance fraîche.

Fécondation

Bien que la fécondation puisse avoir lieu en présence d’eau, il faut éviter cette technique, puisqu’elle déclenche la fermeture du micropyle avant l’exposition des œufs aux solutions d’essai. C’est pourquoi il faut utiliser la fécondation à sec. Quand on emploie cette méthode, il est recommandé de féconder les œufs d’au moins 4 femelles⁴⁷(v. § 2.2), dans un seau ou un bac de plastique sec et propre. On ajoute ensuite la laitance d’au moins une fiole renfermant des spermatozoïdes motiles, lorsqu’ils sont activés (v. § 2.2). Il est préférable d’utiliser la laitance de plusieurs mâles afin d’accroître la probabilité de fécondation. Cependant, la laitance ne doit provenir que des fioles (1 à 4, selon la motilité des spermatozoïdes) dont le contenu s’est révélé actif lors de son mélange avec de l’eau douce ou du liquide ovarien (§ 2.2). Dès l’addition de la laitance, on mélange doucement les gamètes (p. ex. à la main, revêtue d’un gant chirurgical propre ; ou à l’aide d’une plume d’oie). On recommande 5 minutes d’agitation, pour la fertilisation (Fennell et al., 1998) ; on peut aussi accorder 20 minutes à l’opération (Birge et al., 1985). La fécondation devrait se produire sous faible éclairage. Immédiatement après, on devrait transvaser le plus rapidement possible dans les solutions d’essai des groupes d’œufs fécondés. Ce transfert complet de tous les groupes d’embryons fraîchement fécondés s’effectue normalement en moins de 10 minutes par essai (Yee et al., 1996) et elle doit être terminée en moins de 30 minutes par essai.

On s’est servi de diverses techniques pour transférer des groupes d’œufs fraîchement fécondés dans les solutions d’essai. Le choix en est laissé aux chercheurs, à la condition de limiter l’exposition des œufs fraîchement fécondés à l’eau avant l’essai (pour les débarrasser de tout débris indésirable ou de laitance excédentaire) et de transférer ensuite rapidement tous les groupes d’œufs (c’est-à-dire le plus tôt possible, dans un délai de 30 minutes) dans les solutions d’essai (v. § 4.2). Une technique éprouvée et recommandée (Canaria et al.,1996 ; Yee et al., 1996 ; Fennell et al., 1998) est de remplir en partie des nacelles étiquetées et tarées de chacune des solutions d’essai, puis de transférer les groupes d’œufs fraîchement fécondés dans les nacelles (un groupe par nacelle). Une cuillère de plastique (p. ex. pour mesurer le café) est utile à cette fin, pour permettre le transfert rapide du nombre approximatif d’œufs exigés par répétition dans chaque nacelle. Après chaque transfert, on fait un premier dénombrement des œufs. Dès que tous les groupes ont été distribués dans les nacelles, on recompte les œufs dans chaque nacelle et on en ajuste le nombre au besoin. Après une période supplémentaire de pas plus de 30 minutes (pour assurer le durcissement à l’eau et réduire le stress au minimum au cours de cette période ; Fennell et al., 1998), on doit ensuite transférer le contenu de chaque nacelle doucement dans l’enceinte expérimentale assignée.

Une autre technique recommandée (Birge, 1996) consiste à transférer chaque groupe d’œufs fraîchement fécondés directement du récipient de fécondation à l’enceinte expérimentale, au moyen d’un outil de taille convenable (p. ex. une cuillère ou pelle de plastique ou un becher gradué, percé de petits trous pour permettre l’évacuation de l’eau ou un rinçage rapide à l’eau). Pour supprimer les débris ou la laitance excédentaire, on peut laver les œufs en plongeant la cuillère dans de l’eau témoin dont on aura préalablement réglé à température à celle du milieu d’essai. À la fin des transferts, on peut compter les œufs déposés dans chaque incubateur et faire les corrections nécessaires d’après le nombre ou l’aspect (p. ex. uniformité de la taille), au besoin (v. § 4.2).

Incubation et développement des embryons

On trouvera dans le tableau D.1 les températures optimale et létale pour les embryons de truite arc-en-ciel. La température de l’eau est la principale variable déterminant le développement des embryons et elle peut servir à prédire le moment où ils atteindront les divers stades de développement. Les valeurs peuvent varier d’une race à l’autre de la même espèce. Le tableau D.2 indique les périodes prévues d’incubation pour obtenir un taux d’éclosion de 50 %.

Les embryons sont particulièrement vulnérables aux chocs mécaniques (agitation) à certains stades de leur développement. On ne peut pas alors les manipuler, les agiter, les verser ou les transporter sans causer de mortalité considérable. Cette sensibilité aux chocs a été mise en évidence à trois étapes du développement des embryons, chacune étant plus sensible que la précédente. La première survient entre 10 et 45 min après l’immersion des œufs dans l’eau après la fécondation. Elle coïncide avec la fusion des chromosomes parentaux. La deuxième étape sensible survient 2 à 72 h après l’immersion des embryons, alors que les cellules sont en division rapide. La troisième et la plus vulnérable survient 4 à 14 jours après la fécondation, lorsque l’embryon est en différenciation cellulaire rapide. La sensibilité aux chocs mécaniques diminue ensuite et n’est plus décelable dès le stade de l’œuf embryonné.

Comme la vitesse de développement embryonnaire dépend de la température, la sensibilité variera selon les conditions d’incubation. Cependant, pour réduire les pertes au minimum, on devrait éviter de manipuler les embryons moins de 24 h après leur immersion dans les solutions d’essai. Les embryons sont sensibles pendant ces 24 premières heures, mais pas excessivement. Toutefois, on ne devrait pas les déranger du tout après cette période jusqu’au stade de l’œuf embryonné.

Annexe E : Séries logarithmiques de concentrations convenant aux essais toxicologiques^{Note de bas de page 48}