Lignée de canola LBFLFK tolérante aux herbicides avec EPA + DHA

Information sur les aliments nouveaux

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Contexte
Conclusion

Contexte :

Santé Canada a avisé BASF Canada qu'il ne s'oppose pas à l'utilisation alimentaire du canola LBFLFK. Le Ministère a réalisé une évaluation approfondie de cette variété conformément à ses Lignes directrices sur l'évaluation de l'innocuité des aliments nouveaux. Ces lignes directrices sont fondées sur les principes admis internationalement pour établir l'innocuité d'aliments comportant des caractères nouveaux.

Le texte qui suit résume l'avis remis par BASF Canada ainsi que l'évaluation qu'en a faite Santé Canada. Il ne contient aucun renseignement commercial confidentiel.

1. Introduction

BASF Canada a mis au point le canola LBFLFK de manière à ce qu'il produise deux acides gras polyinsaturés à longue chaîne dans la graine, soit l'acide docosahexaénoïque (ADH, C22:6n-3) et l'acide eicosapentaénoïque (AEP, C20:5n-3), et qu'il soit tolérant aux herbicides à base d'imidazolinone. Le canola LBFLFK a été mis au point au moyen de techniques d'ADN recombinant, ce qui a permis d'y introduire dix protéines d'acide gras désaturase et élongase et la protéine acétohydroxyacide synthase (AHAS), qui confèrent une tolérance aux herbicides à base d'imidazolinone.

Cette évaluation de l'innocuité, dont les scientifiques de la Direction des aliments se sont chargés, a été réalisée conformément aux Lignes directrices relatives à l'évaluation de l'innocuité des aliments nouveaux de Santé Canada. Ces directives sont basées sur des efforts d'harmonisation avec d'autres autorités réglementaires et reflètent les documents d'orientation internationaux dans ce domaine (p. ex., le Codex Alimentarius). L'évaluation a pris en compte les éléments suivants : la méthode utilisée pour mettre au point le canola LBFLFK ; une comparaison entre la composition et la qualité nutritionnelle du canola LBFLFK et celles des variétés non modifiées ; et la possibilité que le canola LBFLFK soit toxique ou provoque des réactions allergiques. BASF Canada a déposé des données démontrant que le canola LBFLFK est tout aussi sûr que les variétés de canola traditionnel utilisées dans les aliments au Canada et que sa qualité nutritionnelle est la même.

La responsabilité, imposée par la loi, de l'évaluation préalable à la mise en marché des aliments nouveaux et des ingrédients alimentaires nouveaux incombe à la Direction des aliments comme établi à la partie B du titre 28 du Règlement sur les aliments et drogues (Aliments nouveaux). Le canola LBFLFK est considéré comme un aliment nouveau selon la partie suivante de leur définition :

« c) aliment dérivé d'un végétal, d'un animal ou d'un micro-organisme qui, ayant été modifié génétiquement, selon le cas :

présente des caractères qui n'avaient pas été observés auparavant chez ce végétal, cet animal ou ce micro-organisme. »

2. Mise au point de la plante modifiée

Le requérant a fourni une description des méthodes utilisées pour la mise au point du canola LBFLFK et les données sur la biologie moléculaire caractérisant la modification génétique, qui se traduit par la production des acides gras EPA et DHA dans les graines de la plante grâce à l'expression de dix protéines d'acides gras désaturases et élongases, et par la tolérance aux herbicides à base d'imidazolinone grâce à l'introduction d'une protéine AHAS modifiée.

Le canola LBFLFK a été mis au point par la transformation produite par Agrobacterium de segments d'hypocotyle de la variété commerciale de canola Kumily en utilisant le vecteur LTM593. Ce vecteur contient 13 cassettes d'expression génique : l'élongase delta-6 de Physcomitrella patens (P. patens), la delta-5 désaturase de Thraustochytrium sp., la delta-6 désaturase d'Ostreococcus tauri (O. tauri), la delta-6 élongase de Thalassiosira pseudonana (T. pseudonana), la dela-12 désaturase de Phytophthora sojae (P. sojae), l'oméga-3 désaturase de Pythium irregulare (P. irregular), l'oméga-3 désaturase de Phytophthora infestans (P. infestans), la delta-5 désaturase de Thraustochytrium sp., la delta-4 désaturase de Thraustochytrium sp., l'oméga-3 désaturase de P. irregular, la delta-4 désaturase de Pavlova lutheri (P. lutheri) et la delta-5 élongase d'O. tauri dans la voie de biosynthèse de l'EPA et du DHA, ainsi qu'une acétohydroxyacide synthase modifiée d'Arabidopsis thaliana (A. thaliana) qui confère une tolérance aux herbicides. Deux cassettes d'expression génique ont été introduites deux fois [O3D(Pir) et D5D(Tc)], mais ont des promoteurs spécifiques aux graines différentes afin d'augmenter l'expression pendant la maturation des graines. L'expression des dix gènes de biosynthèse de l'EPA et du DHA entraîne la conversion de l'acide oléique (AO) en EPA et DHA dans les graines de canola LBFLFK.

Les gènes utilisés pour la biosynthèse de l'EPA et du DHA dans le canola LBFLFK ont été synthétisés chimiquement sur la base des séquences initialement identifiées et caractérisées à partir des organismes sources. La séquence d'ADN de chaque gène a été modifiée pour optimiser le taux de traduction. La séquence d'acides aminés de chaque nouvelle protéine est inchangée à deux exceptions près : (1) la séquence c-D6E(Tp) a la substitution d'acides aminés P196S, et (2) la séquence c-AHAS(At) contient deux mutations entraînant la substitution des acides aminés souhaités A122T et S653N qui confèrent une tolérance aux herbicides. L'innocuité de la protéine AHAS avec ces deux mutations a déjà été évaluée par Santé Canada. Aucun composant des organismes sources n'a été directement utilisé dans la mise au point du canola LBFLFK.

Le requérant a fourni des informations à l'appui de l'innocuité et de l'utilisation historique (le cas échéant) de chacun des organismes sources P. patens, Thraustochytrium sp., O. tauri, T. pseudonana, P. sojae, P. irregular, P. infestans, P. lutheri dans la voie de biosynthèse de l'EPA et du DHA, ainsi qu'une A. thaliana modifiée (AHAS).

3. Caractérisation de la plante modifiée

Le nombre de sites d'intégration de l'insert d'ADN-T dans le canola LBFLFK a été caractérisé par le séquençage basé sur Illumina d'une lignée T3 et de la variété parente. Sur la base des résultats de cette analyse de séquençage du génome entier, deux sites d'intégration d'ADN-T ont été identifiés : le premier dans le chromosome aléatoire Cnn et le second dans le chromosome C03 du génome du canola LBFLFK.

Une approche de séquençage ciblée par vecteur a confirmé l'absence de séquence squelette du vecteur dans le canola LBFLFK.

L'intégrité et les séquences génomiques de canola adjacentes des inserts d'ADN-T aléatoires Cnn et C03 ont été caractérisées par une PCR spécifique au locus suivie par un séquençage de Sanger et une analyse des clones du chromosome artificiel bactérien (BAC) contenant LBFLFK Insert1 et LBFLFK Insert2, générés à partir de feuilles T3. Une comparaison entre les séquences obtenues de Kumily et celles des régions flanquantes 3' et 5' des deux inserts d'ADN-T dans LBFLFK a révélé une délétion de 8 pb du génome du canola au site d'intégration de l'insert d'ADN-T aléatoire Cnn et une délétion de 31 pb du génome du canola au site d'intégration de l'insert d'ADN-T C03.

La PCR et le séquençage de Sanger ont confirmé que les deux inserts d'ADN-T (Cnn aléatoire et C03) contenaient les 13 cassettes d'expression génique prévues. L'insert d'ADN-T aléatoire Cnn avait une troncature de 184 pb de l'extrémité 5' de la bordure droite et une troncature de 72 pb de l'extrémité 3' de la bordure gauche. En outre, il a été déterminé que les 64 premiers points de base dans la bordure droite de l'insert d'ADN-T aléatoire Cnn étaient un réarrangement de courtes répétitions dérivées de la bordure droite de l'ADN-T. L'insert d'ADN-T C03 avait une troncature de 184 pb de l'extrémité 5' de la bordure droite et une troncature de 53 pb de l'extrémité 3' de la bordure gauche.

Les séquences de l'insert d'ADN-T ont été déterminées comme étant identiques à la séquence de référence de vecteur de LTM593 à l'exception de deux changements de nucléotides simples dans l'insert d'ADN-T aléatoire Cnn et d'un changement de nucléotides dans l'insert d'ADN-T C03. Dans l'insert aléatoire Cnn, une modification du nucléotide cytosine en adénine se trouvait dans la séquence codante du gène delta-12 désaturase, c-D12D(Ps), ce qui a entraîné une substitution des acides aminés phénylalanine en leucine (F83L) dans la protéine D12D(Ps). De plus, une modification des nucléotides de la cytosine en adénine a été trouvée dans la séquence promotrice p-PXR(Lu), qui fait partie d'une cassette d'expression contenant la séquence codante c-O3D(Pir). Ce changement de nucléotide n'entraîne pas de substitution d'acides aminés. Dans l'insert C03, il y avait un changement de nucléotide guanine en thymine dans la séquence codante du gène delta-4 désaturase, c-D4D(Pl). Ce changement a entraîné une substitution des acides aminés alanine en sérine (A102S) dans la protéine D4D(Pl). Ces changements d'acides aminés n'ont aucun impact sur la fonction ou l'activité des protéines respectives.

Des analyses bioinformatiques basées sur la séquence d'ADN obtenue pour les deux inserts d'ADN-T via le séquençage de Sanger ont été effectuées pour étudier la toxicité et l'allergénicité potentielles de protéines potentiellement exprimées identifiées comme des cadres de lecture ouverts (ORF) aux jonctions ADN individuelles des inserts Cnn aléatoire et ADN-T C03. Les ORF potentiels ont été définis comme toute séquence d'acide nucléique contiguë qui contient une chaîne de 30 codons traduits entre deux codons de terminaison dans le cadre (c.-à-d. TAA, TAG ou TGA) de l'un des six cadres de lecture potentiels (trois cadres à lecture avant et trois à lecture inversés). Les ORF potentiels ont été traduits et évalués pour les correspondances d'identité de séquence avec les toxines et allergènes connus afin d'identifier tout besoin de tests de sécurité supplémentaires. Aucune des analyses bioinformatiques n'a révélé de base permettant de soupçonner que l'une quelconque des protéines putatives est toxigène ou allergène.

La stabilité de la séquence d'ADN insérée dans le canola LBFLFK a été caractérisée par un séquençage basé sur Illumina. Les séquences de jonction et les distributions de lecture de séquençage ont été comparées sur trois générations de canola LBFLFK (T3, T4, T5). Les profils de distribution de la profondeur de lecture sur l'ensemble de l'ADN-T étaient uniformes avec des pics similaires de profondeur de lecture sur l'ensemble de la séquence d'ADN-T, et les mêmes classes de séquences de jonction uniques (grappe de lecture divisée) ont été observées dans les trois générations de canola LBFLFK testées. Sur la base des résultats de cette analyse de séquençage du génome entier (WGS), on a conclu à la stabilité de la séquence d'ADN insérée dans le canola LBFLFK.

L'hérédité des deux loci d'insertion d'ADN-T du canola LBFLFK a été évaluée sur les générations F2 et F3 en utilisant des semences ségrégatives F2 et F3 dérivées de plantes parentales hémizygotes. La zygosité des plantes des générations T3, F1, et F2 a été évaluée par des tests PCR en temps réel TaqManMD. Une analyse du chi carré de Pearson(c2) a été utilisée pour comparer statistiquement les ratios de ségrégation observés des inserts de canola LBFLFK aux ratios mendéliens attendus. L'analyse a confirmé que les deux inserts étaient hérités de manière stable selon les principes mendéliens.

4. Information sur le produit

Le canola LBFLFK diffère du canola conventionnel par l'introduction des séquences codantes de 10 gènes (12 cassettes d'expression) qui constituent la voie de biosynthèse qui convertit l'AO en EPA et DHA. De plus, l'introduction d'un gène codant une protéine acétohydroxyacide synthase (AHAS) d'A. thaliana contenant deux mutations transmet la tolérance aux herbicides à base d'imidazolinone. Au total, les 13 gènes suivants ont été introduits, ce qui devrait entraîner l'expression de 11 nouvelles protéines : c-D12D(Ps) codant une delta-12 désaturase (Ps) ; c-D6D(Ot) codant une delta-6 désaturase (Ot) ; c-D6E(Tp) codant une delta-6 élongase (Tp) ; c-D6E(Pp) codant une delta-6 élongase (Pp) ; c-D5D(Tc), delta-5 désaturase (Tc) ; c-O3D(Pi) codant une oméga-3 désaturase (Pi) ; c-O3D(Pir) codant une oméga-3 désaturase (Pir) ; c-D5E(Ot) codant une delta-5 élongase (Ot) ; c-D4D(Tc) codant une delta-4 désaturase (Tc) ; c-D4D(Pl) codant une delta-4 désaturase (Pl) ; et c-AHAS (At) codant une synthase acétohydroxyacide.

Des essais au champ ont été lancés pendant la saison de plantation 2015 afin de générer des données d'expression des protéines pour le canola LBFLFK (T4) dans les sites de culture de canola suivants aux États-Unis : Geneva (Minn.) ; Sun River (Mont.) ; American Falls (Idaho) ; et Ephrata (Wash.). À chacun des sites, chaque parcelle comportait un essai non répété (LBFLFK non pulvérisé, LBFLFK pulvérisé avec l'herbicide imidazolinone, et la variété témoin Kumily). Les sites au champ étaient représentatifs des régions productrices de canola adaptées à la production commerciale.

Les parcelles LBFLFK traitées ont été pulvérisées au stade 3-4 feuilles avec un herbicide contenant l'ingrédient actif imazamox, une imidazolinone. Des échantillons de graines immatures ont été prélevés lorsque les graines étaient vertes. Pour la collecte des graines matures, les plantes ont été fauchées à environ BBCH 85 et recueillies une fois que l'humidité a été estimée visuellement à < 10 %. La quantification des protéines a été réalisée en utilisant soit un dosage immuno-enzymatique (ELISA), soit une méthode quantitative par transfert de Western basée sur les capillaires. Le choix de la méthode de quantification dépendait de sa pertinence en fonction des caractéristiques de chaque protéine. L'expression de l'AHAS (At) a été quantifiée dans les tissus végétaux, y compris les graines, la plante entière (aux stades de la rosette et de la floraison), les feuilles, les racines et le pollen en utilisant une méthode quantitative par transfert de Western.

Des tests ELISA ont été utilisés pour déterminer les quantités de D12D(Ps), D6E(Pp), D5D(Tc) et D5E(Ot) présentes dans les échantillons. Des méthodes quantitatives par transfert de Western ont été utilisées pour déterminer les quantités de D6D(Ot), D6E(Tp), O3D(Pir), O3D(Pi), D4D(Pl), D4D(Tc) et AHAS(At) [A122TS653N] présentes dans les échantillons. Les tissus analysés étaient des plantes entières à différents stades de maturité, du tissu foliaire, du tissu racinaire, des graines immatures, des graines matures et du pollen.

Huit des dix protéines de la voie de biosynthèse de l'EPA et du DHA ont été détectées dans des graines immatures ou matures de canola LBFLFK. L'expression de chaque protéine devrait être plus élevée dans les graines, puisque l'expression est dirigée par un promoteur spécifique aux graines. BASF a déclaré que d'autres types de tissus ont été testés et qu'aucune des protéines impliquées dans la voie de synthèse EPA/DHA n'a été détectée. Deux protéines, D6E(Pp) et O3D(Pi), n'ont pas pu être détectées dans les graines immatures ou matures. Les protéines D6E(Pp), D5D(Tc), O3D(Pi) et D5E(Ot) n'ont pas pu être quantifiées dans les graines immatures. Les protéines D6E(Pp) et O3D(Pi) n'ont pas pu être quantifiées dans les graines matures. Les µg de protéines par g de graines de canola LBFLFK ont été calculés sur la base du poids frais et du poids sec. Le niveau de protéine le plus bas quantifié dans les graines mûres séchées était de 0,93 µg/g de D12D(Ps), et le niveau de protéine le plus élevé quantifié était de 936,43 µg/g de la protéine D6E (Tp). L'AHAS(At) était quantifiable dans tous les types de tissus testés, à l'exception des graines matures.

Le niveau d'expression des protéines membranaires intégrales était inférieur à la limite de quantification (< LQ) dans tous les tissus analysés à l'exception des graines. La protéine AHAS(At) [A122TS653N] nouvellement exprimée, entraînée par un promoteur constitutif, était quantifiable dans tous les tissus sauf les graines matures. Les graines de canola sont les tissus les plus susceptibles d'entrer dans l'approvisionnement alimentaire, généralement après avoir été transformées en fractions d'huile et de farine dégraissée. Les niveaux de protéines dans les graines matures étaient les suivants : moyenne D12D(Ps) 0,93 µg/g poids sec, moyenne D6E(Pp) sous la limite de détection (LD) pour le test (1,04 µg/g poids sec), moyenne D5D(Tc) 1,33 µg/g DW, moyenne D5E(Ot) 15,48 µg/g poids sec, moyenne D6D(Ot) 40,22 µg/g poids sec, moyenne D6E(Tp) 936,43 µg/g poids sec, moyenne O3D(Pir) 504,38 µg/g poids sec, moyenne O3D(Pi) sous la LD pour le test (27,08 µg/g poids sec), moyenne D4D(Pl) 4,16 µg/g DW, moyenne D4D(Tc) 11,81 µg/g poids sec, et moyenne AHAS(At) [A122TS653N ] sous de la limite de quantification (LQ) pour le test (3,05 µg/g poids sec).

Le gène delta-6 élongase de P. patens code une protéine de 46 kDa, le gène delta-5 désaturase de Thraustochytrium sp. code une protéine de 50 kDa, le gène delta-6 désaturase d'O. tauri code une protéine de 34 kDa, le gène delta-6 élongase de T. pseudonana code une protéine de 32 kDa, le gène delta-12 désaturase de P. sojae code une protéine de 46 kDa, le gène oméga-3 désaturase de P. infestans code une protéine de 41 kDa, le gène delta-4 désaturase de Thraustochytrium sp. code une protéine de 59 kDa, le gène oméga-3 désaturase de P. irregular code une protéine de 40 kDa, le gène delta-4 désaturase de P. lutheri code une protéine de 49 kDa, le gène delta-5 élongase d'O. tauri code une protéine de 34 kDa, et le gène acétohydroxy acide synthase d'A. thaliana code un polypeptide de 73 kDa.

La fonctionnalité et la spécificité enzymatiques des trois élongases et des sept désaturases ont été démontrées en utilisant des souches de levure exprimant individuellement chacune des protéines. Des études d'alimentation in vivo ont été réalisées avec 14 intermédiaires potentiels d'acides gras dans la voie des acides gras pour permettre une évaluation de la spécificité de chaque enzyme exprimée. Des membranes isolées de ces souches d'expression de levure ont été utilisées pour effectuer des tests in vitro afin d'évaluer la spécificité du squelette de chacune des élongases et désaturases. La spectrométrie de masse a été utilisée pour effectuer une analyse de cartographie des peptides tryptiques et la comparer à la séquence d'acides aminés déduite des protéines afin de confirmer l'identité des protéines isolées du canola LBFLFK.

L'analyse par transfert de Western a montré que les poids moléculaires apparents des protéines D12D(Ps), D12D(Ps) [F83L], D6D(Ot), D6E(Tp), D5D(Tc), O3D(Pir), D5E(Ot), D4D(Tc), D4D(Pl), D4D(Pl) [A102S] et AHAS(At) [A122TS653N] produites dans le canola LBFLFK étaient conformes aux poids moléculaires prévus de 45,6 kDa, 45,5 kDa, 51,7 kDa, 31,8 kDa, 49,8 kDa, 40,4 kDa, 34,2 kDa, 59,0 kDa, 49,1 kDa, 49,1 kDa et 66,1 kDa, respectivement. On n'a pas observé de bande immunoréactive près de la masse calculée des protéines D6E(Pp) et O3D(Pi) dans les échantillons enrichis en membrane dérivés de graines immatures de LBFLFK. Une analyse de glycosylation a démontré l'absence de glycosylation post-traductionnelle de toutes les nouvelles protéines produites dans le canola LBFLFK, à deux exceptions près. Les anticorps spécifiques à O3D(Pi) et à D6E(Pp) n'ont pas pu détecter de protéine en accord avec la masse moléculaire calculée de la protéine O3D(Pi) ; par conséquent, le statut de glycosylation de cette protéine n'a pas pu être déterminé.

5. Exposition alimentaire

Le canola LBFLFK fournira une autre source d'EPA et de DHA pour les marchés existants. Selon le requérant, l'EPA et le DHA du canola LBFLFK seront offerts sous forme d'huile raffinée destinée à l'utilisation comme ingrédient alimentaire. L'évaluation nutritionnelle a considéré l'exposition alimentaire à l'EPA et au DHA due à la consommation de cette huile.

6. Nutrition

Des données sur la composition du canola LBFLFK, de sa variété parentale Kumily et de six variétés de canola commerciales de référence ont été recueillies à partir de douze essais au champ menés sur deux saisons de croissance (hiver 2014/2015 et printemps 2015) aux États-Unis.

Dans chaque essai, quatre répétitions de chaque variété ont été plantées dans un plan en parcelles aléatoires complètes. Les parcelles considérées pour les comparaisons de composition ont été traitées avec de l'imidazolinone et des herbicides non sélectifs standards.

Des échantillons de graines ont été récoltés et analysés pour détecter les fibres et les éléments proximaux, les acides gras, les acides aminés, les minéraux, les vitamines, les phytostérols et les anti-nutriments (glucosinolates, acide phytique, phénoliques). Ces composants sont conformes aux recommandations énumérées dans le document de consensus de l'Organisation de coopération et de développement économiques (OCDE) sur les considérations de composition pour les nouvelles variétés de colza à faible teneur en acide érucique (canola). Les analyses de chaque composant ont été effectuées à l'aide de méthodes analytiques approuvées et validées au niveau international et en suivant des procédures d'entreposage et de préparation des échantillons cohérentes et appropriées.

Les données recueillies lors des essais au champ ont été analysées à l'aide d'une méthodologie statistique acceptable. Les données ont été résumées en valeurs moyenne, minimale, maximale et erreur type. Lorsqu'une différence statistiquement significative (valeur p < 0,05) a été identifiée par rapport à la variété parentale, d'autres données permettant d'interpréter la pertinence nutritionnelle possible de la différence ont été recueillies grâce à des comparaisons avec la plage attendue pour le canola conventionnel, telle que définie par les moyens rapportés par le requérant pour les variétés de référence, la base de données sur la composition des cultures de l'Institut international des sciences de la vie et le document de consensus de l'OCDE.

Dans le canola LBFLFK, un certain nombre de désaturases et d'élongases d'acides gras ont été introduites pour faciliter la conversion de l'AO en EPA et DHA. Comme prévu, le profil des acides gras a été affecté comme décrit aux paragraphes 31 à 36.

Des différences statistiquement significatives par rapport à la variété parentale ont été systématiquement observées au cours des deux saisons pour les acides gras suivants (moyennes du témoin hiver/printemps vs moyennes LBFLFK hiver/printemps exprimées en % d'acides gras totaux) : C16:1n-7 (0,34 / 0,38 vs 0,22 / 0,23), C18:0 (1,99 / 2,33 vs 2,62 / 3,06), C18:3n-3 (8,00 / 8,99 vs 5,11 / 5,92), C20:0 (0,66 / 0,70 vs 0,52 / 0,66), C22:0 (0,37 / 0,41 vs 0,26 / 0,30), C24:0 (0,20 / 0,24 vs 0,093 / 0,15), et C24:1n-9 (0,15 / 0,19 vs 0,09 / 0,11). Étant donné que le cultivar modifié ne s'est jamais trouvé systématiquement hors de la plage attendue pour le canola conventionnel, ces différences n'ont pas soulevé de préoccupations en matière d'innocuité nutritionnelle.

Une différence statistiquement significative telle que le cultivar modifié se trouvait constamment en dehors de la plage attendue au cours des deux saisons a été observée pour les acides gras trans totaux (moyennes du témoin hiver/printemps vs moyennes LBFLFK hiver/printemps exprimées en % d'acides gras totaux) : 0,097 / 0,062 vs 0,35 / 0,27. Cependant, des données supplémentaires ont indiqué que la teneur totale en acides gras trans de l'huile raffinée dérivée du cultivar modifié (0,594 %) était comparable à celle de l'huile dérivée de la variété parentale (0,626 %) et se situait dans la plage des huiles marines qui sont des sources d'EPA et DHA (au moins 0,12-2,76 %). De plus, la teneur totale en acides gras trans de l'huile LBFLFK était bien inférieure à celle trouvée dans les huiles de canola (2 314 %) et de soja (1,66 %) couramment consommées selon le Fichier canadien sur les éléments nutritifs. Par conséquent, cette différence n'a pas soulevé de préoccupations en matière d'innocuité nutritionnelle, car la principale exposition aux acides gras trans dans le cultivar modifié devait se faire par le biais de l'huile raffinée.

Des différences statistiquement significatives telles que le canola LBFLFK se trouvait systématiquement hors de la plage attendue au cours des deux saisons ont été observées pour les acides gras cis-monoinsaturés suivants (moyennes du témoin hiver/printemps vs moyennes LBFLFK hiver/printemps, exprimées en % d'acides gras totaux) : C18:1n-9 (54.86 / 56,66 vs 23,52 / 26,18), et C20:1n-9 (0,98 / 1,07 vs 0,59 / 0,68). Les acides gras monoinsaturés peuvent être biosynthétisés à partir d'autres sources de combustible et ne sont donc pas essentiels dans l'alimentation. Par conséquent, ces différences n'ont pas soulevé de préoccupations en matière d'innocuité nutritionnelle.

Un certain nombre d'acides gras cis-polyinsaturés, à l'exception de l'EPA et du DHA, ont été détectés uniquement dans le cultivar modifié (C18:2n-9, C18:3n-6, C18:4n-3, C20:2n-9, C20:3n-3, C20:3n-9, C20:3n-6, C20:4n-3, C20:4n-6, C22:4n-3, C22:4n-6, C22:5n-3 et C22:5n-6). Le requérant a fourni des preuves que ces acides gras non essentiels sont présents dans d'autres organismes et aliments qui sont consommés couramment en toute sécurité. Par conséquent, leur présence dans le canola LBFLFK n'a pas soulevé de préoccupations en matière d'innocuité nutritionnelle.

L'EPA (C20:5n-3) et le DHA (C22:6n-3) ont été détectés dans le canola LBFLFK, mais n'ont pas été détectés dans le témoin parental ou les variétés de référence. La teneur moyenne en EPA (% d'acides gras totaux) des graines de canola LBFLFK issues des essais menés pendant les saisons de croissance d'hiver et de printemps était de 7,21 % et 6,27 %, respectivement. La teneur moyenne en DHA (% d'acides gras totaux) des graines de canola LBFLFK issues des essais menés pendant les saisons de croissance d'hiver et de printemps était de 1,02 % et 0,77 %, respectivement. Des données supplémentaires fournies par le requérant ont indiqué que la teneur combinée en EPA et DHA de l'huile raffinée dérivée du cultivar modifié était de 4,5 % des acides gras totaux. Le projet de document de la Direction des aliments (DA) intitulé « Réévaluation de la position de la DA sur l'apport de référence pour l'addition d'huiles riches en EPA/DHA aux aliments dans le cadre du processus de notification relatif aux aliments nouveaux (Titre 28) » propose des niveaux d'ingestion de référence à utiliser dans les scénarios de modélisation de l'exposition pour les huiles contenant de l'EPA ou du DHA. Ces apports de référence représentent des limites supérieures au-dessus desquelles des effets néfastes sur la santé associés à l'apport combiné habituel de DHA ou d'EPA seraient possibles. Pour les huiles contenant à la fois de l'EPA et du DHA, l'apport de référence est de 3 g/jour. Il a été déterminé que la sécurité nutritionnelle de l'EPA et du DHA trouvés dans le cultivar modifié devrait être évaluée par rapport à cet apport de référence en fonction de l'exposition à l'huile raffinée.

Le requérant a estimé l'impact du remplacement de l'huile de canola conventionnelle dans les aliments par de l'huile LBFLFK en utilisant des données complètes sur la consommation alimentaire recueillies dans le cadre du National Health and Nutrition Examination Survey aux États-Unis. Dans l'ensemble, l'apport combiné estimé d'EPA et de DHA après le remplacement de l'huile de canola par l'huile LBFLFK était ≤ 0,18 g/jour à la moyenne et ≤ 0,43 au 90e centile, respectivement, pour tous les groupes de population et pour les deux sexes. En outre, le requérant a envisagé un autre scénario dans lequel l'huile LBFLFK a remplacé l'huile de poisson (menhaden) dans les aliments. Étant donné que la teneur combinée en EPA et DHA de l'huile de menhaden est supérieure à celle de l'huile LBFLFK, la substitution directe de l'huile de menhaden par de l'huile LBFLFK ne peut que réduire l'exposition à l'EPA et au DHA. D'après ces scénarios, l'utilisation alimentaire du canola LBFLFK ne devrait pas entraîner une consommation combinée habituelle d'EPA et de DHA au-dessus du niveau de référence de la DA de 3 g/j. Par conséquent, la présence d'EPA et de DHA dans le canola LBFLFK n'a pas soulevé de préoccupations en matière d'innocuité nutritionnelle.

Le requérant a indiqué que l'attachement stéréochimique de l'EPA et du DHA au triacylglycérol dans le canola LBFLFK peut différer de celui de certaines sources conventionnelles, mais est susceptible de se situer dans la plage attendue pour les sources conventionnelles. De plus, les preuves scientifiques sont actuellement insuffisantes pour conclure que l'attachement stéréochimique au triacylglycérol a un effet sur la biodisponibilité de l'EPA et du DHA. Par conséquent, cette différence potentielle n'a pas soulevé de préoccupations en matière d'innocuité nutritionnelle.

Des différences statistiquement significatives ont été systématiquement observées au cours des deux saisons pour les composants non lipidiques suivants (moyennes du témoin hiver/printemps vs moyennes LBFLFK hiver/printemps, unités) : fibre détergente neutre (18,40 / 15,26 vs 16,65 / 14,55, % poids sec), vitamine K1 (0,088 / 0,11 vs 0,097 / 0,12, mg/100 g poids sec), calcium (0,33 / 0,32 vs 0,30 / 0,29, % poids sec), magnésium (0,33 / 0,34 vs 0,31 / 0,32, % poids sec), glucobrassicine (0,34 / 0,31 vs 0,96 / 0,67 μmol/g poids sec), gluconapine (1,40 / 2,30 vs 1,72 / 2.45, μmol/g poids sec), sinapine (1,00 / 1,02 vs 0,89 / 0,95, % poids sec), phytostérols totaux (0,93 / 0,89 vs 0,88 / 0,75, % poids sec). Étant donné que le cultivar modifié ne s'est jamais trouvé systématiquement hors de la plage attendue pour le canola conventionnel, ces différences n'ont pas soulevé de préoccupations en matière d'innocuité nutritionnelle.

Sur la base des informations fournies, la Division de l'évaluation nutritionnelle préalable à la mise en marché n'a identifié aucun problème d'innocuité concernant l'utilisation alimentaire d'huile dérivée du canola LBFLFK d'un point de vue nutritionnel.

7. Toxicologie

La Section de l'évaluation toxicologique préalable à la mise en marché (SETPM) a évalué l'innocuité du canola LBFLFK en vérifiant la toxicité potentielle du produit fini, c'est-à-dire l'huile de graines de canola hautement raffinée.

Aucun historique de justification de l'exposition sécuritaire aux aliments n'a pu être fourni pour les organismes sources P. sojae, O. tauri, T. pseudonana, P. patens, Thraustochytrium sp., P. irregular, P. infestans et P. lutheri.

Le niveau d'expression de chaque protéine a été déterminé dans la graine oléagineuse de canola LBFLFK en utilisant un essai immuno-enzymatique (ELISA) ou un transfert de Western quantitatif. Les niveaux d'expression des protéines pour D12D(Ps), D6D(Ot), D6E(Tp), D5D(Tc), O3D(Pir), D5E(Ot), D4D(Tc), D4D(Pl) et AHAS variaient de 1 à 936 μg/g de poids sec dans les graines en développement et matures. Il a été rapporté que deux des protéines transgéniques, D6E(Pp) et O3D(Pi), étaient inférieures à la LD et à la LQ dans les graines de canola LBFLFK (LQ = 6-71 μg/g de poids sec).

Une nouvelle expression de la protéine AHAS (contenant les mutations A122T et S653N) dérivée d'A. Thaliana a déjà été approuvée par Santé Canada dans diverses variétés de cultures destinées à la consommation humaine. L'innocuité de la protéine AHAS(At) est bien établie et ne suscite pas de préoccupations toxicologiques.

Les séquences d'acides aminés prévues de tous les transgènes ont été comparées à des séquences de toxines connues extraites de la base de données de séquences peptidiques non redondantes GenBank du National Center for Biotechnology Information (NCBI) (date de recherche : 3 mai 2017 ; 121 686 747 séquences). Un score E de ≤ 1 a été considéré comme positif par rapport aux toxines connues et aux séquences d'antinutriments.

Les protéines O3D(Pir) et AHAS ont montré des alignements positifs avec les protéines non toxiques, la désaturase d'acide gras oméga-3 et l'acétolactate synthase 3, respectivement. Ces protéines sont exprimées dans Ricinus communis (ricin), qui produit également la toxine ricine. Cependant, ces protéines ne sont pas impliquées dans la biosynthèse de la ricine, mais sont bien caractérisées et participent respectivement à la synthèse des acides gras et des acides aminés à chaîne ramifiée. Le requérant et l'évaluateur ont conclu que les protéines nouvellement exprimées dans le canola LBFLFK n'avaient pas de similitude de séquence avec les toxines orales connues.

Le requérant a déclaré qu'à des fins alimentaires, le canola LBFLFK ne sera utilisé que pour la production d'huile de canola hautement raffinée. Le requérant a fourni des données montrant que l'huile de canola EPA + DHA, tout comme les autres huiles végétales hautement transformées, est dépourvue de toutes protéines, y compris les 11 protéines transgéniques évaluées dans cette demande.

Le SETPM a conclu que les 11 protéines transgéniques exprimées dans le canola LBFLFK ne devraient pas poser de problèmes toxicologiques aux consommateurs, car elles sont absentes du produit alimentaire final, qui est une huile raffinée hautement transformée. Si le requérant demandait des utilisations alimentaires supplémentaires pour le canola LBFLFK qui contient ses protéines, une évaluation plus approfondie serait nécessaire pour combler les lacunes dans les données qui existent dans la base de données toxicologiques pour ces protéines.

Sur la base des informations fournies, le SETPM n'a identifié aucun problème d'innocuité concernant l'utilisation alimentaire d'huile dérivée du canola LBFLFK d'un point de vue toxicologique.

8. Allergénicité

La Section d'évaluation toxicologique préalable à la mise en marché (SETPM) a évalué l'innocuité du canola LBFLFK en vérifiant la toxicité potentielle du produit fini, c'est-à-dire l'huile de graines de canola hautement raffinée.

Une nouvelle expression de la protéine AHAS (contenant les mutations A122T et S653N) dérivée d'A. Thaliana a déjà été approuvée par Santé Canada dans diverses variétés de cultures destinées à la consommation humaine. La sécurité allergénique de la protéine A. thaliana AHAS est bien établie et ne présente pas de risque allergène.

Les séquences d'acides aminés prévues de tous les transgènes ont été comparées à des séquences d'allergènes connus extraites de la base de données sur les protéines allergènes du Programme de recherche et ressources sur les allergies alimentaires (PRRAA) (2017 ; 2035 séquences). Les protéines ne partageaient pas ≥ 35 % d'identité d'acides aminés avec un allergène connu et ne contenaient pas d'épitopes d'allergènes potentiels (une correspondance de séquence exacte sur 8 acides aminés). Sur la base des résultats de l'analyse bioinformatique, le requérant et l'évaluateur ont conclu que les protéines nouvellement exprimées dans le canola LBFLFK ne partageaient pas la similitude des séquences avec les allergènes oraux connus.

Le requérant a démontré que les protéines D12D(Ps), D6D(Ot), D6E(Tp), D5D(Tc), O3D(Pir), D5E(Ot), D4D(Tc) et D4D(Pl) présentes dans les extraits de protéines de semences brutes LBFLFK ont été dénaturés lorsqu'ils ont été incubés à des températures de 50 à 90 °C pendant 20 minutes (comme déterminé par le test d'activité enzymatique et le transfert de Western). Le test a démontré que ces protéines étaient structurellement instables à des températures élevées. La transformation et le raffinage des graines de canola en huile impliquent de semblables températures élevées (entre 80 et 105 °C pendant 15 à 20 minutes). Il est prévu que les protéines dénaturées seront plus sensibles à la digestion dans le tractus gastro-intestinal.

Le requérant a démontré que les protéines D12D(Ps), D6D(Ot), D5D(Tc), O3D(Pir), D5E(Ot), D4D(Tc), D4D(Pl) présentes dans les extraits de protéines de graines brutes LBFLFK ont été entièrement digérées après incubation avec du liquide gastrique simulé (10 U pepsine/μg de protéine ; pH 1,2) ou du SIF (~ 10 mg/ml de pancréatine ; pH 7,5) pendant 2 minutes, comme déterminé par transfert de Western. Le D6E(Tp) s'est révélé sensible à la digestion séquentielle avec SGF (30 minutes) suivi de SIF (30 secondes). Ainsi, les protéines D12D(Ps), D6D(Ot), D6E(Tp), D5D(Tc), O3D(Pir), D5E(Ot), D4D(Tc) et D4D(Pl) devraient être facilement digérées dans les conditions normalement présentes dans le tractus gastro-intestinal humain.

Il a été rapporté que les quantités de deux des protéines transgéniques, D6E(Pp) et O3D(Pi), étaient inférieures aux niveaux de détection et de quantification dans les graines de canola LBFLFK. En outre, le requérant n'a pas pu isoler des quantités suffisantes de systèmes d'expression microbiens en raison de la nature intraitable des protéines membranaires intégrales. À ces niveaux d'expression extrêmement bas, il est peu probable que des quantités toxicologiquement pertinentes de D6E(Pp) et O3D(Pi) soient présentes dans l'huile de canola hautement raffinée.

Le requérant a déclaré qu'à des fins alimentaires, le canola LBFLFK ne sera utilisé que pour la production d'huile de canola hautement raffinée. L'huile de canola LBFLFK s'est révélée, comme les autres huiles végétales hautement transformées, dépourvue de toutes protéines, y compris les onze protéines transgéniques évaluées dans cette demande.

Le SETPM a conclu que les 11 protéines transgéniques exprimées dans le canola LBFLFK ne susciteraient pas de préoccupations de sécurité allergénique aux consommateurs, car elles ne se trouveront pas dans l'huile finale hautement raffinée.

Sur la base des informations fournies, le SETPM n'a identifié aucune préoccupation relative à l'innocuité concernant l'utilisation alimentaire d'huile dérivée du canola LBFLFK du point de vue de l'allergénicité.

Conclusion :

L'examen qu'a réalisé Santé Canada des renseignements présentés à l'appui de l'utilisation alimentaire d'huile hautement raffinée dérivée du canola LBFLFK ne suscite pas de préoccupations sur le plan de l'innocuité des aliments. Santé Canada est d'avis que l'huile hautement raffinée dérivée de cette variété de canola est aussi sûre et nutritive que l'huile hautement raffinée dérivée des variétés de canola actuellement sur le marché.

Comme l'huile hautement raffinée dérivée du canola LBFLFK présente un changement important du point de vue de la composition nutritionnelle, un étiquetage spécial est requis pour ce produit. Le requérant a été avisé de communiquer avec l'Agence canadienne d'inspection des aliments (ACIA) pour que celle-ci examine le nom usuel et l'étiquetage proposés par le requérant pour ce produit à des fins de vente.

L'opinion de Santé Canada ne porte que sur l'utilisation alimentaire du canola LBFLFK. Les questions relatives à leur utilisation dans l'alimentation animale ont été étudiées séparément conformément aux processus réglementaires mis en œuvre par l'Agence canadienne d'inspection des aliments (ACIA). L'ACIA a conclu qu'il ne suscite pas de préoccupations en matière d'innocuité, que ce soit sur le plan de l'environnement ou de l'alimentation animale. Ce point de vue est valable pour les produits alimentaires dérivés de la lignée de canola LBFLFK destinés à la vente à des fins de consommation humaine et animale.

Le présent document d'information sur les aliments nouveaux a été préparé pour résumer l'avis sur le produit visé de la Direction des aliments, Direction générale des produits de santé et des aliments, Santé Canada. Cet avis est fondé sur l'analyse détaillée des renseignements fournis par le requérant, conformément aux Lignes directrices relatives à l'évaluation de l'innocuité des aliments nouveaux.

Also available in English.

Pour obtenir plus de renseignements, veuillez communiquer avec :

Section des aliments nouveaux
Direction des aliments
Direction générale des produits de santé et des aliments
Santé Canada, PL2204A1
251, promenade Sir Frederick Banting
Ottawa (Ontario) K1A 0K9
hc.bmh-bdm.sc@canada.ca

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Date de modification :: 2021-04-30

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