Information sur les aliments nouveaux – Maïs tolérant le glyphosate – HCEM485

Santé Canada a avisé Stine Seed Farm, inc. qu’il ne s’oppose pas à l’utilisation à des fins alimentaires du maïs exprimant une variante de la 5-énolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) qui lui confère une tolérance au glyphosate. Le Ministère a réalisé une évaluation approfondie de cette lignée de maïs conformément à ses Lignes directrices sur l’évaluation de l’innocuité des aliments nouveaux. Ces lignes directrices sont fondées sur les principes admis internationalement de l’établissement de l’innocuité d’aliments comportant des caractères nouveaux.

Le texte qui suit résume l’avis remis par Stine Seed Farm, inc. à Santé Canada ainsi que l’évaluation du ministère. Il ne contient aucun renseignement commercial confidentiel.

1. Introduction

Le maïs HCEM485 a été génétiquement modifié au moyen du transfert direct d’ADN par faisceau aérosol afin d’insérer 4 copies d’un fragment de 6 kpb dérivé de la lignée autofécondée de maïs B73 contenant la séquence codante EPSPS. Ce fragment a été identifié à partir d’une banque génomique clonée dans un chromosome artificiel bactérien (BAC). Le gène epsps a été modifié par mutagenèse dirigée, ce qui a donné lieu à deux mutations d’acide aminé, soit la thréonine en isoleucine à la position 102 et la proline en sérine à la position 106. Sur le plan des acides aminés, la forme mutée de l’EPSPS, nommée 2mEPSPS, est semblable à 99,7 % aux plantes modifiées génétiquement déjà approuvées, notamment le maïs GA21 (Monsanto, 1999) et le coton GHB614 (Bayer, 2008). Les séquences ont été fournies par le requérant et relèvent du domaine public.

Cette évaluation de l’innocuité, dont les scientifiques de la Direction des aliments se sont chargés, a été réalisée conformément aux Lignes directrices relatives à l’évaluation de l’innocuité des aliments nouveaux de Santé Canada. Ces dernières sont fondées sur les démarches visant l’harmonisation avec les directives établies par d’autres autorités réglementaires et reflètent les documents d’orientation internationaux (p. ex., du Codex Alimentarius). L’évaluation a porté sur la façon dont le maïs HCEM485 a été mis au point, la comparaison de sa composition et de sa qualité nutritionnelle par rapport à celles des variétés non modifiées et enfin, sa toxicité et son allergénicité éventuelles. Stine Seed Farm a produit des données démontrant que le maïs HCEM485 est tout aussi sûr que les variétés de maïs traditionnelles utilisées dans les aliments au Canada, et que leur qualité nutritionnelle est la même.

La responsabilité des évaluations préalables à la mise en marché des aliments et des ingrédients alimentaires nouveaux imposée par la loi incombe à la Direction des aliments comme établi au titre 28 du Règlement sur les aliments et drogues (Aliments nouveaux). Les aliments dérivés du maïs HCEM485 sont considérés comme des aliments nouveaux selon la partie suivante de leur définition :

• « c) aliment dérivé d’un végétal, d’un animal ou d’un microorganisme qui, ayant été modifié génétiquement, selon le cas :
  • (i) présente des caractères qui n’avaient pas été observés auparavant, » 

2. Mise au point de la plante modifiée

Le gène epsps a été isolé à partir de fragments de séquence d’une banque de chromosomes artificiels bactériens (BAC) dérivés de la lignée autofécondée de maïs B73. Le clone contenant l’epsps a été identifié par criblage au moyen d’une sonde à ADN complémentaire à une partie du gène epsps. La cassette contenait les éléments de contrôle de la transcription et de la traduction en position 5’, la séquence codante epsps composée de 8 exons et de 7 introns ainsi que d’un peptide de transition du chloroplaste, et enfin, d’une région 3’ non traduite également pour la régulation de l’expression. Au moyen de techniques moléculaires traditionnelles, la cassette d’expression a été clonée dans un vecteur plasmidique et soumise à une mutagenèse dirigée de façon à introduire les mêmes deux substitutions d’acides aminés que celles introduites dans la 2mEPSPS dans le maïs GA21. La double-mutante 2mEPSPS contient aussi la sérine à la position 89 pour correspondre à la séquence de l’EPSPS native du maïs.

Après la mutagenèse, le plasmide a été amplifié et digéré, et le fragment contenant la cassette d’expression 2mEPSPS a été séparé du squelette plasmidique par purification sur gel d’agarose. Le fragment d’ADN a été introduit dans le tissu de l’embryon de maïs en recourant à l’injection à faisceau aérosol, une méthode permettant d’introduire de l’ADN nu, c.-à-d., sans recourir à un vecteur biologique ou à tout autre type de vecteur. Les cellules cibles étaient dérivées d’une lignée d’élite autofécondée de maïs, Stine 963. Après l’insertion, les cellules ont été récupérées sur un milieu non sélectif, puis soumises à des cycles successifs de croissance sur milieu sélectif contenant des teneurs croissantes de glyphosate.

3. Caractérisation de la plante modifiée

Le génome du maïs HCEM485 a été analysé par transfert de Southern afin d’estimer le nombre d’insertions de la cassette d’expression 2mEPSPS, de caractériser le locus d’insertion et de confirmer l’absence du squelette plasmidique. Les données fournies appuyaient un modèle proposé consistant en quatre copies en tandem complètes de l’insert au même locus, dont la troisième est orientée dans la direction contraire des autres. À partir de l’analyse par transfert de Southern, aucun fragment incomplet de la cassette d’expression n’a été détecté. Le squelette plasmidique n’a pas été détecté dans le maïs HCEM485. En raison de la nature répétitive de la région de l’insert du HCEM485, le requérant n’a pas pu fournir une caractérisation moléculaire plus complète du locus d’insertion, notamment des données sur la séquence des nucléotides.

Une expérience portant sur la ségrégation des caractères a été réalisée afin de démontrer le nombre de loci d’insertion dans HCEM485. La lignée initiale HCEM485 (appelée T0) a été autofécondée pour produire deux générations successives (T1 et T2). La descendance homozygote de la génération T2 a été croisée avec la lignée de maïs 9289 de façon à produire une génération (F1) hybride de plantes hémizygotes pour l’insertion. La descendance F1 a ensuite été croisée avec la lignée de maïs 9032 afin de produire une deuxième génération qui a de nouveau été autofécondée pour produire la génération F2. Les descendants ont fait l’objet d’un examen visant à détecter le caractère de résistance à l’herbicide en appliquant 2,5 fois le taux recommandé de glyphosate pour utilisation sur le terrain. La proportion de plants porteurs du caractère et de plants non porteurs pour chacune des générations a été comparée aux rapports attendus pour la présence des copies du gène à un seul locus. L’accord entre les valeurs attendues et les valeurs observées a été calculé au moyen du test du chi carré avec facteur de correction de Yates. Dans l’ensemble, les données présentées appuient l’allégation du requérant voulant que le caractère de tolérance au glyphosate codé par le gène 2mEPSPS soit conforme à un modèle prévoyant la transmission à un seul locus indiquant que la cassette d’expression a été insérée à un seul emplacement sur le génome.

4. Information sur le produit

Les plantes hôtes et donneuses sont de la même espèce, Zea mays L., qui est utilisée de longue date comme aliment et cultivée à l’échelle de la planète. L’ADN inséré comprend les séquences codantes pour la 2mEPSPS ainsi que les séquences de régulation de l’expression dérivées du maïs; aucune séquence hétérologue autre que celles du maïs n’a été insérée. De plus, aucun autre organisme (Agrobacterium n’a été utilisé comme vecteur pour l’insertion de l’ADN. La possibilité que des séquences transgéniques soient présentes dans la lignée HCEM485 a par conséquent été écartée. Aucune préoccupation n’a été soulevée étant donné que les organismes hôte et donneur sont consommés de longue date en toute innocuité.

La séquence d’acides aminés de la 2mEPSPS exprimée dans la lignée HCEM485 est semblable à celle exprimée dans l’EPSPS exprimée de façon endogène dans différentes plantes et différents microbes. Le requérant a fait référence à une étude publiée en 2009 selon laquelle une recherche menée dans une base de données publique avait permis d’obtenir des résultats relatifs à plus de 5 000 protéines EPSPS exprimées dans des plantes et des microorganismes. Le requérant a également cité un autre examen réalisé en 2013^{Note de bas de page 1}  par Hammond et ses collègues indiquant qu’aucune protéine EPSPS n’a donné lieu, jusqu’à maintenant, au signalement d’effets toxiques.

Le mécanisme d’action du glyphosate (N-[phosphonométhyl] glycine) fait intervenir l’inhibition de la voie du shikimate dont les fonctions dans la biosynthèse des acides aminés aromatiques sont nécessaires à la survie de la plante. Plus particulièrement, le glyphosate inhibe la 5-énolypyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS), une enzyme qui catalyse le transfert d’un groupement phosphate du phosphoénolpyruvate au shikimate-3-phosphate pour produire le 5-énolpyruvylshikimate-3-phosphate (EPSP). Le caractère de tolérance à l’herbicide résulte de l’intégration d’une forme mutée de l’EPSPS (2mEPSPS) qui n’est pas inhibée par le glyphosate.

Aucune caractérisation de l’expression de la protéine 2mEPSPS dans les tissus végétaux n’a été fournie. Le requérant a expliqué que le degré d’expression dans les tissus cibles ne serait vraisemblablement pas informatif étant donné que les séquences de régulation de l’expression sont les mêmes que celles de l’EPSPS native.

5. Exposition alimentaire

La modification génétique apportée au maïs HCEM485 n’a pas pour but de changer les façons dont l’aliment est habituellement consommé. Par conséquent, l’utilisation du maïs HCEM485 tolérant les herbicides et les produits qui en sont dérivés sera semblable à celle faite des variétés traditionnelles. Le lancement du maïs HCEM485 ne remplacera qu’une part des variétés de maïs existantes et ne devrait pas entraîner de changement de l’apport alimentaire en produits dérivés du maïs.

6. Nutrition

Le requérant a fourni des données sur la composition visant l’évaluation de paramètres nutritionnels clés dans des échantillons de grains et de fourrage de la lignée de maïs HCEM485 et d’hybrides témoins. La lignée de maïs HCEM485 et trois hybrides témoins traditionnels ont été cultivés aux États-Unis en 2007 dans des sites représentatifs de la gamme de conditions environnementales qui prévalent dans les endroits où le maïs est cultivé habituellement (c.-à-d., dans la Ceinture de maïs américaine [Corn Belt]). Les hybrides témoins ont été produits par le croisement de lignées autofécondées, lesquelles avaient précédemment été utilisées dans l’amélioration génétique de la lignée HCEM485. Toutes les plantes ont été cultivées conformément aux pratiques agronomiques locales, selon un plan en blocs aléatoires contenant trois répétitions par site pour chacun des génotypes. Les hybrides HCEM485 ont été traités au glyphosate au stade de croissance 3-4 feuilles (Roundup WeatherMAX) suivant la dose commerciale habituelle. Des échantillons de grains de maïs provenant de chacun des hybrides témoins individuels ont été regroupés pour analyse, et ce, pour chacune des parcelles répétées. Après le traitement, les échantillons ont été analysés selon les méthodes publiées et approuvées par l’AOAC ou selon d’autres méthodes d’analyse conformes aux normes de l’industrie. Les données au sujet des analytes dont la teneur est supérieure à la limite de quantification ont fait l’objet d’une analyse de variance à deux facteurs, le génotype et le site, et cela, à l’échelle des sites. Pour chacune des variables, la signification statistique de l’effet du génotype (c.-à-d., la lignée HCEM485 par rapport aux hybrides témoins) a été déterminée au moyen d’un test F standard.

Le requérant a réalisé l’analyse des échantillons de graines en contrôlant 87 paramètres, dont tous les macronutriments, les acides aminés, les acides gras, les oligoéléments et les facteurs antinutritionnels d’origine naturelle déterminés par l’OCDE dans son document intitulé Consensus Document on Compositional Consideration for New Varieties of Maize (document de consensus sur les considérations qui ont trait à la composition des nouvelles variétés de maïs [Zea mays]). Des 65 comparaisons entre analytes qui se sont révélées adéquates pour l’analyse statistique, 45 n’ont révélé aucune différence statistiquement appréciable. Les différences moyennes les plus marquées (> 10 %) entre la lignée de maïs HCEM485 et les hybrides témoins ont été observées à l’égard du cuivre (de 13,01 % plus faible dans la lignée HCEM485), de la vitamine B1 (de 12,23 % plus faible dans la lignée HCEM485), de l’acide folique (de 15,25  % plus faible dans la lignée HCEM485), de l’alpha-tocophérol (de 13,38 % plus faible dans la lignée HCEM485), du delta-tocophérol (de 18,19  % plus faible dans la lignée HCEM485), du gamma-tocophérol (de 12,46 % plus faible dans la lignée HCEM485), des tocophérols totaux (de 12,75  plus faible dans la lignée HCEM485) et de l’inositol (de 13,36 % plus faible que dans la lignée HCEM485).

Le requérant a conclu que dans les cas où des différences appréciables sur le plan statistique avaient été observées, l’ampleur de ces différences était considérée comme limitée, et tous les nutriments analysés se situaient dans la fourchette de variation naturelle dont la documentation fait état (base de données de la composition des cultures de l’ILSI et OCDE). De plus, le requérant a conclu qu’aucun modèle récurrent n’a permis de présumer que des changements importants sur le plan biologique auraient été apportés à la composition du grain ou du fourrage de manière fortuite par suite de la modification génétique.

La quantité et la qualité des renseignements fournis ont été jugées satisfaisantes. Les différences indiquées dans les données sur la composition entre la lignée de maïs HCEM485 et les hybrides témoins n’ont suscité aucune préoccupation en matière de nutrition ou d’innocuité.

7. Chimie et toxicologie

La demande ne contenait aucune donnée relative aux contaminants chimiques, y compris des données sur les métaux lourds, les polluants organiques persistants (POP) ou mycotoxines présents dans la plante. Compte tenu du mode d’action de ce caractère, on ne s’attend pas à ce que la modification génétique introduite modifie la vulnérabilité des plantes HCEM485 aux mycotoxines qui produisent des champignons, pas davantage qu’elle augmente l’absorption de contaminants chimiques, par rapport à celles des variétés traditionnelles. Du point de vue de l’innocuité chimique et par rapport au maïs traditionnel, la présence de HCEM485 dans l’approvisionnement alimentaire canadien n’aurait pas une importance particulière pour la santé.

Le requérant n’a pas fourni d’études toxicologiques indépendantes au sujet de la 2mEPSPS. Il a plutôt fait valoir que la 2mEPSPS exprimée dans la lignée HCEM485 était la même que celle exprimée dans d’autres lignées qui avaient fait l’objet d’analyses toxicologiques relevant du domaine public.

L’équivalence est fondée sur les données démontrant l’identité de la protéine, sa structure biochimique ainsi que sa fonction ou son activité. L’identité de la 2mEPSPS a été établie grâce à la séquence d’acides aminés déduite. La 2mEPSPS exprimée dans la lignée HCEM485 est identique à celle exprimée dans les lignées GHB614 et GA21, à l’exception de la substitution d’un seul acide aminé qui fait en sorte que la lignée HCEM485 ressemble davantage à l’EPSPS native du maïs. Sur le plan des acides aminés, le degré d’homologie entre ces protéines est de 99,7 %. La séquence de la 2mEPSPS exprimée dans E. Coli en fusion avec l’étiquette hexahistidine (His6) utilisée dans le cadre de transferts de Western était la même que celle de la 2mEPSPS des lignées GHB614 et GA21. Les analyses par transfert de Western ont démontré l’équivalence et la conservation structurales entre la 2mEPSPS, la 2mEPSPS exprimée dans E. Coli en fusion avec l’étiquette hexahistidine et la 2mEPSPS exprimée dans la lignée GA21 ainsi que dans la lignée HCEM485. L’anticorps monoclonal a permis de distinguer la 2mEPSPS de l’EPSPS native présente dans plusieurs bactéries et espèces de végétaux. La détection de la 2mEPSPS dans les échantillons d’essai ainsi que de l’EPSPS dans le maïs non transformé au moyen d’anticorps polyclonaux donne à penser que l’arrangement des épitopes en trois dimensions est préservé et que la structure globale est maintenue à la fois dans la forme mutante et dans la forme native de l’EPSPS. L’équivalence fonctionnelle a été établie par l’expression du caractère de tolérance du glyphosate. Globalement, des preuves appuient l’allégation d’équivalence entre la protéine 2mEPSPS exprimée dans la lignée HCEM485 ainsi que dans les lignées GHB614 et GA21, et la protéine 2mEPSPS exprimée dans E. Coli en fusion avec l’étiquette hexahistidine.

Le requérant a fourni des résumés d’études publiées portant sur la toxicité réalisées sur le maïs GA21 et le coton GHB614. Ces résumés comprenaient une évaluation accessible au public portant sur l’évaluation de l’innocuité réalisée par l’ANZFA (maintenant connu sous FSANZ, 2000)^{Note de bas de page 2} , qui visait à évaluer la majeure partie de l’information examinée par Santé Canada ainsi qu’un article plus récent publié par Hérouet-Guicheney et coll. (2009)^{Note de bas de page 3} .

L’exposé de synthèse publié par Hérouet-Guicheney et coll. (2009) soutient l’innocuité de la 2mEPSPS démontrée dans des études antérieures. L’administration de 2 000 mg/kg pc de la protéine 2mEPSPS produite dans E. Coli à des souris n’a entraîné aucun effet indésirable. L’équivalence a été établie entre la protéine d’origine bactérienne et celle que l’on retrouve dans la lignée GHB614 du coton ainsi que dans les lignées transgéniques de canola et de soja. L’électrophorèse de polyacrylamide en présence de sulfate de sodium dodécylique (PAGE en présence de SDS), la chromatographie liquide à haute performance (CLHP) couplée à la méthode d’ES-MS (CPL-SM), le séquençage N-terminal et le transfert Western font partie des méthodes utilisées aux fins de caractérisation de la protéine. Les auteurs ont également réalisé des essais de digestibilité sur la protéine 2mEPSPS d’origine bactérienne et mené des recherches dans des bases de données pour déterminer l’homologie de la protéine avec des toxines ou des allergènes connus.

Selon les données d’équivalence et les renseignements fournis, la caractérisation toxicologique de l’enzyme EPSPS modifiée exprimée dans la lignée de maïs HCEM485 n’a suscité aucune préoccupation.

8. Allergénicité

De plus, une recherche a été réalisée dans la base de données AllergenOnline, en recourant à une fenêtre glissante de 80-mères pour des épitopes à 8 acides aminés pour rechercher d’éventuels épitopes, qui a permis de conclure que la 2mEPSPS ne ressemble à aucun allergène connu. Les résultats d’analyses bioinformatiques appuient l’allégation selon laquelle la 2mEPSPS n’est pas allergène.

9. Conclusion

L’examen qu’a réalisé Santé Canada de l’information présentée à l’appui de l’utilisation alimentaire du maïs HCEM485 n’a pas suscité de préoccupations sur le plan de l’innocuité. De l’avis de Santé Canada, les aliments dérivés du maïs HCEM485 ne comportent pas davantage de danger et sont tout aussi nutritifs que les variétés de maïs actuellement sur le marché.

L’opinion formulée par Santé Canada n’a trait qu’à l’utilisation alimentaire du maïs HCEM485. Les questions relatives à son utilisation dans l’alimentation animale ont été étudiées séparément conformément aux processus réglementaires mis en œuvre par l’Agence canadienne d’inspection des aliments (ACIA). L’ACIA a évalué l’information fournie sur l’incidence potentielle du maïs HCEM485 sur l’environnement et la santé animale. Elle en a conclu que de ces points de vue, la vente commerciale des produits dérivés de cette lignée de maïs ne soulève aucune préoccupation.