Méthode d’essai biologique servant à mesurer l’inhibition de la croissance de la plante macroscopique dulcicole : chapitre 2

Section 2 : Organismes d’essai

• 2.1 Espèce et stade
• 2.2 Origine
• 2.3 Culture
  • 2.3.1 Généralités
  • 2.3.2 Installations et appareils
  • 2.3.3 Milieu de culture
  • 2.3.4 Éclairage
  • 2.3.5 Température
  • 2.3.6 pH
  • 2.3.7 Entretien des cultures
  • 2.3.8 Critères de santé

2.1 Espèce et stade

Lemna minor Linné (Arales : Lemnaceae) doit être utilisée avec la présente méthode d’essai biologique. Les clones recommandés sont Landolt 8434 et 7730^{Note de bas de page 6}. L’annexe E donne une description générale de L. minor et des caractéristiques qui la distinguent d’espèces semblables.

La culture d’essai, qui est constituée de plantes isolées exclusivement en vue de l’obtention d’organismes d’essai, doit être axénique et doit servir à l’inoculation dans tous les récipients d’un essai donné^{Note de bas de page 7}. Les inoculums à utiliser doivent avoir de 7 à 10 jours, être constitués de jeunes colonies^{Note de bas de page 8} en croissance rapide, sans lésion visible (v. la figure 2)^{Note de bas de page 9}.

2.2 Origine

Tous les organismes utilisés dans un essai doivent être issus d’une même souche. Les plantes exigées pour établir les cultures peuvent provenir de collections de cultures, de laboratoires publics ou privés cultivant L. minor en vue d’essais toxicologiques, ou encore de fournisseurs commerciaux de matériel biologique. Au moment du démarrage des cultures d’organismes provenant de sources extérieures, il faut demander à un taxinomiste compétent connaissant les macrophytes aquatiques de confirmer et d’étayer l’identité de l’espèce^{Note de bas de page 10}. Il importe également d’identifier le clone (si possible), car il a été démontré que différents clones de la même espèce peuvent afficher des sensibilités différentes (Cowgill et Milazzo, 1989; SRC, 2003, 2005)^{Note de bas de page 11}. Il est également conseillé de vérifier périodiquement (p. ex. annuellement) l’appartenance taxinomique de la culture du laboratoire ou de remplacer la culture (c.-à-d. la renouveler) par une culture d’une collection reconnue, afin de s’assurer qu’elle n’a pas été contaminée par d’autres Lemna ou d’autres clones, plus particulièrement si le laboratoire maintient plusieurs cultures différentes de Lemna.

On peut obtenir des cultures axéniques ou non axéniques de L. minor auprès de la source canadienne suivante :

Collection de cultures de l’Université de Toronto^{Note de bas de page 12}
Département de botanique, Université de Toronto
25, rue Willcocks, Toronto (Ont.)
Canada, M5S 3B2

Téléphone : (416) 978-3641
Télécopieur : (416) 978-5878
Courriel : jacreman@eeb.utoronto.ca

Site Web : Canadian Phycological Culture Centre (en anglais seulement)

Lemna minor : UTCC 490^{Note de bas de page 13} et 492^{Note de bas de page 14}

Figure 2. Aspect général de Lemna minor en bonne santé et en mauvaise santé

a) Croissance normale du témoin dans des gobelets d’essai en plastique contenant le milieu de l’American Public Health Association (APHA) modifié, les thalles affichant diverses nuances de vert. b) Culture expérimentale dans un milieu Hoagland (à gauche) et acclimatation d’une culture dans le milieu APHA modifié (à droite), toutes deux clairsemées. c) Colonies affichant des lésions sous forme de « morsure de serpent » attribuables à des carences à long terme en fer lorsqu’elles sont cultivées dans le milieu E+ Hoagland d’origine (EC, 1999b). d) Cultures présentant une chlorose (perte de chlorophylle/jaunissement) des thalles dans des gobelets d’essai en plastique.

2.3 Culture

2.3.1 Généralités

Le tableau 1 résume les conditions et les modes opératoires recommandés ou exigés pour la culture de L. minor exposés ici. Ces renseignements visent à permettre une certaine souplesse, d’un laboratoire à l’autre, dans la normalisation des conditions qui, si elles n’étaient pas régies, pourraient influer sur la santé et le comportement des organismes d’essai. La sous-section 2.3 s’inspire en grande partie de Saskatchewan Research Council (SRC) (1997) et de l’Organisation de coopération et de développement économiques (OCDE) (1998, 2002).

Si les plantes proviennent d’un laboratoire ou d’une collection de cultures de l’extérieur, elles doivent être cultivées au laboratoire pendant au moins trois semaines avant de servir.

On perpétue les cultures mères axéniques par repiquage hebdomadaire d’une plante dans des tubes à essai de 25 × 150 mm contenant environ 25 mL de milieu stérile E+ Hoagland modifié (SRC, 2003) et obturés au moyen de capsules Kimcaps^MC. On transfère les Lemna en asepsie dans des tubes à essai renfermant le milieu E+ Hogland modifié fraîchement préparé et on les laisse incuber, inclinées, sous éclairage et à température contrôlés.

L’apparition d’un trouble dans le milieu d’une culture mère de Lemna dénote une contamination bactérienne, tandis qu’une contamination par les moisissures peut ne pas être évidente tant que de vastes colonies n’apparaissent pas dans le milieu ou qu’une pellicule biologique ne se forme pas sur les parois du récipient. Les cultures contaminées (p. ex. par des algues, des protozoaires, des champignons microscopiques ou des bactéries) doivent être éliminées ou stérilisées (v. 2.3.7).

Les cultures utilisées dans les essais toxicologiques (c.-à-d. les cultures d’essai) devraient être entreprises 7 à 10 jours avant le démarrage de l’essai. Pour optimiser la récolte de plantes possédant 2 ou 3 thalles, préparer une ou plusieurs cultures d’essai. Prélever 5 à 10 plantes dans un tube d’essai renfermant des cultures âgées d’une semaine et les transférer en asepsie dans une boîte de Petri de 150 mm de diamètre (ou tout autre récipient peu profond et stérile) renfermant au moins 1 à 1,5 cm (≥100 mL) de milieu stérile E+ Hoagland et laisser incuber dans les conditions de l’essai. Les plantes des cultures d’essai ne devraient pas être en surnombre à la fin de l’incubation de 7 à 10 jours. On considère qu’il y a surnombre (encombrement) si les plantes couvrent plus des deux tiers de la superficie du milieu de croissance.

Pour déterminer si la culture d’essai satisfait aux critères de santé exposés en 2.3.8, on prépare chaque fois que l’on entreprend une culture d’essai un ou plusieurs récipients renfermant environ 100 mL du milieu d’essai (milieu de l’American Public Health Association (APHA) modifié, milieu de l’Institut des normes de Suède (SIS) ou milieu Steinberg modifié, selon celui qui sera utilisé dans l’essai).

On devrait préparer des cultures filles multiples d’une culture axénique de Lemna afin de s’assurer que l’on dispose d’au moins une culture stérile en cas de contamination^{Note de bas de page 15}. Le maintien de la propreté du laboratoire, le recours à de bonnes techniques stériles et l’utilisation adéquate d’une hotte à flux laminaire sont des éléments essentiels de la culture axénique de L. minor (Acreman, 2006; voir l’annexe F).

On dépose une seule Lemna à trois thalles dans chaque récipient. En supposant que les cultures semblent saines (v. la note 8 et la figure 2), on considère qu’elles sont acceptables pour l’essai si le nombre de thalles de départ (ou le nombre moyen de thalles si l’on utilise plusieurs récipients) dans le ou les récipients préparés pour surveiller l’état de santé de la culture est au moins 8 fois plus élevé (c.-à-d. ≥24 thalles) le jour 7 (v. 2.3.8).

Les cultures de plus de 10 jours deviennent encombrées et les plantes sont plus petites; on ne devrait pas les utiliser pour les essais. La culture d’essai se contamine facilement si elle est exposée à de l’air ou à du matériel non stériles. Si le milieu se trouble -- signe de contamination bactérienne --, on ne peut pas utiliser les Lemna et il faut les remplacer par une culture non contaminée (v. 2.3.7).

La veille de la mise en route de l’essai, on rince deux fois dans le milieu d’essai (v. 3.4) un nombre suffisant de L. minor (culture non encombrée de 7 à 10 jours en milieu E+ Hoagland modifié), en remplaçant le milieu usé (milieu E+ Hoagland modifié) par du milieu d’essai frais (milieu APHA modifié, milieu SIS ou milieu Steinberg modifié). On devrait ensuite transférer les Lemna dans un récipient peu profond renfermant au moins 2 cm de milieu d’essai frais^{Note de bas de page 16}. Les cultures ne devraient pas être encombrées (en d’autres termes, les Lemna ne devraient pas se chevaucher et au moins le tiers de la superficie du milieu devrait être exempt de thalles). Laisser incuber ces cultures d’acclimatation, dans les conditions de l’essai, pendant 18 à 24 h avant de les utiliser. Bien que l’on conserve les cultures mères de Lemna en asepsie, l’acclimatation et les essais n’ont pas lieu en milieu stérile. On recommande donc de prendre des précautions raisonnables pour éviter la contamination de la culture par les algues et de manipuler les Lemna sous une hotte à flux laminaire (v. l’annexe F).

2.3.2 Installations et appareils

On doit cultiver les Lemna dans des installations à température et sous éclairage contrôlés (pièce, incubateur ou enceinte environnementale à température constante)^{Note de bas de page 17}. La zone de culture devrait être bien ventilée pour empêcher des hausses locales de la température sous les rampes d’éclairage (Institut de recherche environnementale appliquée (ITM), 1990), tandis que l’air du système d’alimentation devrait être exempt d’odeurs et de poussières. Idéalement, l’installation de culture devrait être isolée de celle des essais afin de réduire le risque de contamination des cultures par les substances ou matières d’essai. On devrait aussi isoler les cultures des secteurs du laboratoire servant à la préparation des solutions mères ou des solutions expérimentales, à l’entreposage des effluents ou d’autres matières ou substances et au nettoyage de l’équipement.

Les récipients et les accessoires entrant en contact avec les cultures de Lemna et les milieux de culture doivent être faits d’un matériau non toxique et chimiquement inerte et, si nécessaire, ils devraient être stériles. Les matériaux tels que le verre borosilicaté (p. ex. Pyrex^MC), l’acier inoxydable, la porcelaine, le nylon, le polystyrène haute densité ou le plastique de polyéthylène perfluoré (p. ex. Téflon^MC) peuvent être utilisés pour réduire au minimum la lixiviation et la sorption. On peut utiliser des récipients en plastique uniquement si les Lemna n’adhèrent pas aux parois^{Note de bas de page 18} et que la sorption de la substance d’essai sur le plastique n’excède pas la sorption sur le verre (ASTM, 1991). Les matériaux ou substances tels que le cuivre, le laiton, les métaux galvanisés, le plomb et le caoutchouc naturel ne doivent pas entrer en contact avec les récipients ou les milieux de culture, les échantillons pour essai, les récipients d’essai, l’eau de dilution ou les solutions expérimentales.

Les articles faits d’un matériau ou d’une substance autres que ceux mentionnés ici ne devraient pas être utilisés à moins que l’on ait démontré que leur emploi n’altère pas la qualité des cultures de Lemna. On devrait nettoyer et rincer à fond tous les récipients et accessoires de culture avec l’eau utilisée dans les cultures, avant de les employer à nouveau. Il faut nettoyer chimiquement et stériliser, avant emploi, la verrerie neuve et celle qui a déjà été utilisée (EC, 1992a). Tous les récipients de culture et d’essai devraient être dotés d’un couvercle transparent adéquat afin d’éviter l’empoussièrement et de réduire l’évaporation au minimum (v. 3.3).

L’équipement recommandé pour le maintien des cultures axéniques de Lemna comprend les éléments suivants : des anses d’inoculation jetables pour le transfert des Lemna en asepsie; un autoclave pour stériliser la verrerie et les milieux; une hotte stérile (à flux laminaire) pour maintenir les conditions axéniques pendant les transferts (v. l’annexe F)^{Note de bas de page 19}.

2.3.3 Milieu de culture

Il faut utiliser le milieu E+ Hoagland modifié (SRC, 2003) pour cultiver les spécimens de L. minor qui serviront aux essais sur des eaux usées (p. ex. des effluents, des élutriats et des lixiviats) ou des eaux réceptrices^{Note de bas de page 20}. On donne au tableau 2 la composition chimique de ce milieu.

Pour préparer 1 L de milieu E+ Hoagland modifié, on ajoute les ingrédients suivants à 900 mL d’eau désionisée distillée sous verre (ou l’équivalent) :

Solution A 20 mL Solution B 1 mL Solution C 20 mL Solution D 10 mL Solution E 1 mL Sucrose 10 g Extrait de levure 0,10 g Tryptone (bactotryptone) 0,6 g

Les substances utilisées doivent être de qualité réactif. Le milieu est agité jusqu’à dissolution complète du contenu. On rajuste le pH pour qu’il se situe entre 4,4 et 4,8 au moyen de NaOH ou de HCl, puis on porte le volume à 1 L avec de l’eau distillée. Le milieu est autoclavé pendant 20 min à 121 °C et à 124,2 kPa (1,1 kg/cm²). On devrait conserver les solutions mères dans l’obscurité (c.-à-d. dans des bouteilles ambrées ou recouvertes) en raison de leur photosensibilité potentielle. Chaque solution mère (A, B, C, etc.) peut se garder un mois au réfrigérateur (4 °C), à la condition d’être isolée des solvants ou d’autres contaminants possibles. Une fois autoclavé, le milieu E+ Hoagland modifié que l’on a préparé peut être entreposé jusqu’à un mois à la température ambiante, dans l’obscurité^{Note de bas de page 22}.

On peut utiliser d’autres milieux riches en nutriments (milieu SIS ou milieu Steinberg, p. ex.) pour conserver les cultures de L. minor qui seront utilisées pour les essais sur des substances chimiques seulement, pourvu que ces cultures soient conformes aux critères de santé des organismes à utiliser dans l’essai (v. 2.3.8).

2.3.4 Éclairage

Les organismes cultivés devraient être soumis à un éclairage fluorescent en spectre continu sans interruption ou à un éclairage équivalent^{Note de bas de page 23}. Le débit de fluence photonique, mesuré au niveau du milieu de culture, devrait se situer entre 64 et 90 µmol/(m² · s) (environ 4 000 à 5 600 lux)^{Note de bas de page 24}. Étant donné que l’intensité lumineuse a tendance à varier dans un espace donné, on devrait la mesurer en plusieurs points dans la zone servant aux cultures (au niveau du milieu de culture) et elle ne devrait pas s’écarter de plus de ±15 % du débit de fluence photonique choisi.

2.3.5 Température

On devrait cultiver L. minor à 25 ± 2 °C^{Note de bas de page 25}. Si les cultures sont maintenues à l’extérieur de cette plage, la température doit être rajustée graduellement (≤3 °C/jour) et gardée à l’intérieur de cette plage pendant au moins deux semaines avant le début de l’essai. Si la température dans les récipients de culture (ou dans un ou deux récipients supplémentaires servant à la surveillance de la température de l’eau) est fondée sur celle relevée dans l’incubateur ou la pièce à température contrôlée, à proximité des récipients de culture, par exemple, il faut établir et vérifier périodiquement le rapport entre les lectures et la température dans les récipients pour s’assurer que les plantes sont cultivées dans la plage de températures souhaitée.

2.3.6 pH

Le pH des cultures devrait se situer entre 4,4 et 4,8. Le pH du milieu E+ Hoagland modifié est de 4,6 environ, de sorte que les Lemna seront à ce pH lorsqu’elles seront transférées dans le milieu frais. Cependant, le pH dérive vers 7-8 à mesure que la culture vieillit pendant 7 à 10 jours dans le milieu E+ Hoagland modifié (Moody, 1998). On ne devrait pas rajuster le pH des cultures de Lemna.

2.3.7 Entretien des cultures

Chaque semaine, on devrait préparer plusieurs cultures mères dans le milieu E+ Hoagland modifié pour conserver la culture mère du laboratoire dans un état de croissance rapide (v. 2.3.1). Les cultures de Lemna qui n’ont pas été repiquées hebdomadairement doivent l’être en milieu frais au moins deux fois au cours des 14 jours précédant immédiatement l’essai, pour qu’elles reviennent à leur vitesse de croissance rapide. On devrait repiquer les Lemna chaque fois que l’on met sur pied un essai, et ce, afin de disposer d’un nombre convenable d’organismes acclimatés.

On devrait éviter, si possible, la stérilisation des cultures de Lemna contaminées (par des algues, des protozoaires, des champignons microscopiques et des bactéries, p. ex.). Il est fortement recommandé de jeter les cultures montrant des signes de contamination plutôt que de les traiter. Il est possible de procéder de cette façon si l’on maintient plusieurs cultures séparées. Si l’on ne peut pas éviter l’emploi de cultures stérilisées, il faut attendre au moins huit semaines après la stérilisation. On doit conserver un registre (notamment sur la date de la stérilisation, la méthode, les agents et la quantité employés, de même que les motifs du traitement) sur toutes les cultures que l’on aura décontaminées^{Note de bas de page 26}.

2.3.8 Critères de santé

Les cultures de L. minor à utiliser dans les essais toxicologiques doivent satisfaire aux critères de santé suivants :

• le nombre de thalles dans le ou les récipients préparés pour surveiller la santé des cultures doit être au moins 8 fois plus élevé au bout de 7 jours pour que les cultures expérimentales puissent servir dans un essai (en d’autres termes, le nombre moyen de thalles par récipient doit être d’au moins 24 après 7 jours).

À cette fin, on peut préparer des récipients d’essai^{Note de bas de page 27} individuels contenant chacun 100 mL du milieu expérimental (milieu APHA modifié, milieu SIS ou milieu Steinberg modifié) qui servira dans un essai donné, chaque fois qu’une culture d’essai est mise en route (v. 2.3.1). De la culture mère, on transfère une seule Lemna à trois thalles dans chaque récipient et on laisse incuber 7 jours. On compte alors les thalles dans chaque récipient et, si le nombre moyen est au moins 8 fois plus élevé qu’au départ (c.-à-d. ≥24 thalles), la culture est considérée comme acceptable pour l’essai. Ces individus témoins ne doivent pas servir dans l’essai toxicologique.

L’aspect général de la culture d’essai (dans le milieu E+ Hoagland modifié) doit également être pris en compte. La culture doit être constituée de colonies jeunes, en croissance rapide, sans lésions visibles (v. 2.1, la note 8 et la figure 2). On doit utiliser pour l’essai des plantes qui semblent saines. Des thalles vert vif et l’absence de zones décolorées constituent des caractéristiques indicatives du bon état de santé des plantes.

Un laboratoire qui effectue régulièrement des essais toxicologiques devrait procéder tous les mois à des essais toxicologiques de référence avec la ou les cultures de Lemna dans les conditions et selon les modes opératoires exposés en 4.6. Il devrait aussi effectuer un essai toxicologique de référence en même temps que l’essai toxicologique. Les critères connexes servant à juger de la santé et de la sensibilité de la culture, selon les conclusions de cet essai toxicologique de référence et des essais antérieurs de référence, sont énoncés à la sous-section 4.6.