Méthode d’essai biologique servant à mesurer l’inhibition de la croissance de la plante macroscopique dulcicole : chapitre 3

Section 3 : Système d’essai

• 3.1 Installations et appareils
• 3.2 Éclairage
• 3.3 Récipients d’essai
• 3.4 Eau témoin/de dilution

3.1 Installations et appareils

L’essai d’inhibition de la croissance de L. minor doit se dérouler dans une pièce, un incubateur, une enceinte environnementale ou une installation équivalente maintenus à température constante, dotés d’une bonne commande de la température et d’un éclairage acceptable (v. 3.2). L’installation doit pouvoir maintenir la température moyenne quotidienne de toutes les solutions expérimentales à 25 ± 2 °C (v. 4.3). Les conditions de l’essai (p. ex. qualité de l’éclairage, débit de fluence photonique et température) devraient être uniformes dans la totalité de l’enceinte environnementale. L’installation devrait être bien ventilée et être à l’abri des perturbations physiques ou de tous contaminants susceptibles d’avoir une incidence sur les organismes d’essai. Elle devrait aussi être isolée du local de culture des Lemna. Il faudrait réduire au minimum l’empoussièrement et les émanations dans les installations d’essai et de culture.

Aucun matériau de construction ni aucune pièce d’équipement susceptible d’entrer en contact avec les matières et les solutions d’essai et avec l’eau témoin/de dilution ne doit contenir de substance ou de matière pouvant être lixiviée dans les solutions à des concentrations qui pourraient être toxiques ou qui pourraient accroître la sorption des substances ou matières d’essai (v. 2.3.2). Le laboratoire doit être doté d’instruments pour mesurer les paramètres fondamentaux de la qualité de l’eau (température, conductivité, teneur en oxygène dissous, pH) et il devrait être en mesure de procéder à l’analyse rapide et précise d’autres paramètres tels que la dureté, l’alcalinité, la teneur en ammoniaque et en chlore résiduel.

Tous les instruments servant aux mesures courantes des paramètres physicochimiques et biologiques fondamentaux doivent être l’objet d’un entretien convenable et d’un étalonnage régulier.

Les installations d’élimination devraient pouvoir accepter les déchets de laboratoire et toute matière contaminée (revêtement des bancs de travail, vêtements de laboratoire, etc.) (United States Environmental Protection Agency (USEPA), 1996).

3.2 Éclairage

Les conditions d’éclairage auxquelles on soumet les organismes d’essai devraient être les mêmes que celles définies en 2.3.4. On recommande le recours à un éclairage fluorescent en spectre continu ou l’équivalent (v. la note 23). L’éclairage doit être maintenu pendant toute la durée de l’essai, et le débit de fluence photonique doit se situer entre 64 et 90 µmol/(m² · s) (environ 4 000 à 5 600 lux; v. la note 24] à la hauteur où se trouvent les Lemna dans le milieu d’essai^{Note de bas de page 28}. Le débit de fluence photonique, mesuré en plusieurs points de la zone d’essai au niveau du milieu d’essai, ne devrait pas varier de plus de ±15 % de la valeur choisie^{Note de bas de page 29}.

3.3 Récipients d’essai

Il est recommandé d’utiliser des gobelets jetables en polystyrène ou des fioles Erlenmeyer. Des cristallisoirs, des boîtes de Petri et des béchers en verre peuvent aussi être employés^{Note de bas de page 30}; cependant, on devrait utiliser le même type et la même taille de récipient dans tout le laboratoire^{Note de bas de page 31}. Des récipients en verre devraient être utilisés pour les essais sur les substances chimiques (section 5). Les récipients doivent être suffisamment larges pour permettre la croissance des thalles dans les récipients témoins, sans qu’ils se recouvrent à la fin de l’essai. Le fait que les radicelles touchent le fond du récipient n’a pas d’importance, mais il est conseillé de prévoir une profondeur minimale de 4 cm de solution. Le récipient doit contenir au moins 100 mL de solution au cours de l’essai, et l’on recommande 150 mL^{Note de bas de page 32}.

On devrait couvrir les récipients d’essai pour éviter l’éventuelle contamination des milieux par l’air ainsi que la perte des constituants volatils. On recommande d’utiliser des couvercles en polystyrène qui s’ajustent sur les gobelets en plastique, ou encore des couvercles ou fonds de boîte de Petri qui couvrent le dessus des flacons Erlenmeyer; d’autres couvercles peuvent également convenir^{Note de bas de page 33}. Dans un essai donné, les récipients d’essai et les couvercles (c.-à-d. leur type, leur taille et leur forme), de même que la profondeur et le volume des solutions, doivent tous être identiques.

Les récipients d’essai devraient être placés sur un fond noir antireflet (p. ex. un carton noir pour affiche) pendant toute la durée de l’essai^{Note de bas de page 34}. Il convient d’évaluer tout nouveau système expérimental (p. ex. récipients, couvercles, conditions d’éclairage et de température) au moyen d’un essai non toxicologique dans lequel seul le milieu d’essai est utilisé dans tous les récipients. À la fin de cet essai, le coefficient de variation (CV) du nombre de thalles et de la masse sèche des thalles devrait être inférieur à 20 %.

3.4 Eau témoin/de dilution

Dans un essai donné, la même eau doit servir à préparer les dilutions des échantillons et les témoins. Le choix de l’eau témoin/de dilution dépend de la substance ou de la matière d’essai, des objectifs de l’essai ainsi que de la logistique, des considérations pratiques et des coûts du prélèvement des échantillons (v. les sections 5 à 7). Ces facteurs pourraient donc mener au choix du type précis d’eau témoin/de dilution qui convient le mieux à la situation. On recommande pour cela le milieu d’essai, qui est constitué d’eau désionisée ou distillée sous verre à laquelle on a ajouté des produits chimiques de qualité réactif (c.-à-d. des nutriments pour la croissance des Lemna).

On recommande trois milieux d’essai pour la présente méthode; le choix de ces milieux est fonction de la nature de la substance d’essai. Dans le cas d’une eau usée (v. 6.3) et d’une eau réceptrice (v. 7.3), il faut utiliser comme eau témoin/de dilution un milieu de croissance de l’American Public Health Association (APHA) modifié (Saskatchewan Research Council (SRC), 1997)^{Note de bas de page 35}. En ce qui concerne les substances chimiques, les produits commerciaux ou les mélanges connus (v. 5.3), on devrait utiliser le milieu de croissance de l’Institut des normes de Suède (SIS) modifié (l’Organisation de coopération et de développement économiques (OCDE), 1998, 2002) ou le milieu de croissance Steinberg modifié (ISO, 2005)^{Note de bas de page 36}.

On peut aussi utiliser comme eau témoin/de dilution un échantillon d’eau réceptrice ou d’eau d’amont (prélevé près de la source de contamination, mais en retrait de cette dernière ou en amont de la source), enrichie des mêmes nutriments de qualité réactif et à la même concentration que ceux ayant servi à constituer le milieu de croissance APHA modifié (eau réceptrice enrichie de nutriments), pour les essais sur les effluents (v. 6.3) ou les eaux réceptrices (v. 7.3)^{Note de bas de page 37}. Si l’on souhaite évaluer l’effet toxique d’un produit ou d’un composé chimiques précis sur une eau réceptrice donnée, on peut utiliser comme eau témoin/de dilution l’eau réceptrice à laquelle on a ajouté la même concentration de nutriments que celle ayant servi à la préparation du milieu SIS ou du milieu Steinberg modifié (v. 5.3). Dans un cas comme dans l’autre, si l’on utilise de l’eau réceptrice enrichie de nutriments, il faut d’abord la passer sur des filtres en fibre de verre (à ouvertures d’environ 1 µm, p. ex. filtre Whatman GF/C) pour réduire la possibilité de contamination du milieu d’essai par les algues, puis on peut la passer sur des filtres à ouvertures de 0,22 µm pour supprimer tout risque résiduel de contamination bactérienne ou algale (SRC, 1997). Les conditions de prélèvement, de transport et d’entreposage de l’eau de surface devraient être conformes à celles décrites en 6.1.

Le milieu d’essai ou l’eau réceptrice enrichie de nutriments (servant d’eau témoin et d’eau de dilution) doivent être préparés selon les indications des sections 5, 6 et 7 et être réglés à la température de 25 ± 2 °C avant emploi (v. 4.1).