Méthode d’essai biologique : essais toxicologiques sur des truites arc-en-ciel aux premiers stades de leur cycle biologique : chapitre 6

Section 6 : Modes opératoires particuliers pour les essais employant des échantillons d’effluent, d’élutriat et de lixiviat

• 6.1 Options
• 6.2 Prélèvement, étiquetage, transport et entreposage des échantillons
• 6.3 Préparation et aération des solutions d’essai
• 6.4 Eau témoin ou eau de dilution
• 6.5 Observations et mesures
• 6.6 Paramètres ultimes de mesure et calculs

On trouve dans la présente section des instructions particulières relatives à l’essai d’échantillons d’effluent, d’élutriat et de lixiviat, qui s’ajoutent aux modes opératoires exposés dans la section 4.

6.1 Options

Les essais périodiques employant des échantillons d’effluent, d’élutriat ou de lixiviat (c’est-à-dire d’eau usée), pour la surveillance et la vérification de la conformité aux règlements pourraient utiliser les options d’essais E, EA ou EAT (§ 4.3.1). Avant d’adopter l’une de ces options pour un emploi périodique ou fréquent (p. ex. dans le cadre d’un programme de surveillance des effets sur l’environnement) au moyen d’une eau usée donnée, on recommande une évaluation comparative de ces options afin d’en mesurer les différences de sensibilité. On pourrait effectuer n’importe laquelle des trois options, avec renouvellement intermittent ou continu des solutions, selon les objectifs, la nature de l’échantillon, le volume nécessaire, etc.

Lorsque l’on organise un essai EA ou EAT, il est recommandé d’établir un essai E à plusieurs concentrations et de l’exécuter, en parallèle, à l’aide d’échantillons ou de sous- échantillons de l’eau usée utilisée pour la première semaine de l’essai et d’œufs fécondés du même bassin d’organismes d’essai. Les constatations de l’essai E donneront une idée du taux de réussite de la fécondation pour les témoins des essais EA ou EAT, et elles seront utiles à l’évaluation de la sensibilité relative de la substance d’essai pour les options à court terme (E) et à plus long terme (EA ou EAT). On pourrait aussi effectuer une série d’essais E, employant plusieurs concentrations, toutes les semaines, avec les échantillons ou sous- échantillons d’eau usée, à mesure que se déroule l’essai EA ou EAT, afin de fournir des renseignements sur la toxicité relative de la substance d’essai utilisée chaque semaine (Fennell et al., 1998).

Les programmes réglementaires d’essai pourraient exiger des plans d’expérience et des paramètres ultimes de mesure différents de ceux qui sont normalisés et que nous décrivons ici. Par exemple, un règlement pourrait exiger un essai sur une seule concentration d’au moins trois fractions non diluées de l’échantillon et au moins trois solutions témoins des répétitions. Un paramètre de mesure pourrait se fonder sur les résultats donnés par une seule concentration, habituellement non diluée, d’eau usée. Consulter à ce sujet le § 6.6.

Il faudrait examiner sérieusement, avant d’entreprendre tout programme, les volumes nécessaires d’échantillons d’eau usée. Il faudrait à peu près des volumes égaux d’échantillons pour les essais avec renouvellement intermittent et continu, mais les quantités pourraient différer considérablement selon les différentes options^{Note de bas de page 40}. On pourrait économiser des volumes appréciables d’eau usée dans les essais EA et EAT en débutant avec les volumes journaliers inférieurs d’eau d’essai nouvelle, exigés au départ, et en les augmentant graduellement, en fonction des besoins de la biomasse réelle dans l’enceinte expérimentale. Vu la voracité de certains essais EA ou EAT pour les échantillons, plus particulièrement ceux qui emploient au moins 50 alevins par répétition et/ou de gros individus, il pourrait être préférable d’entreprendre ces essais à la source des eaux usées, à l’aide d’un laboratoire mobile. Toute stratégie visant à réduire au minimum les besoins en volume d’échantillon doit, bien entendu, garder les groupes de répétitions intacts et séparés des autres répétitions.

Normalement, on ne filtre pas ou on n’agite pas les échantillons d’effluent, de lixiviat ou d’élutriat au cours de l’essai. Cependant, la présence de matières organiques ou norganiques en suspension ou décantables peut nuire au développement des embryons, des alevins ou des truitelles et provoquer des réactions de stress, ralentir la croissance ou exercer d’autres effets sublétaux chez les truitelles ou les sujets plus âgés à des concentrations d’au plus 100 mg/L (Noggle, 1978 ; McLeay et al., 1987 ; Servizi et Martens, 1987). Les fortes concentrations de solides biologiques dans certains types d’effluents traités peuvent aussi contribuer à la toxicité de l’échantillon, en raison de la production d’ammoniaque, de nitrites ou des deux (Servizi et Gordon, 1986). Si l’on soupçonne la contribution à la toxicité par de fortes concentrations de matières en suspension ou de matières décantables dans les échantillons d’effluent, d’élutriat ou de lixiviat et si l’objet de l’étude est de quantifier cette contribution, on devrait réaliser un essai supplémentaire, simultanément. Cet essai serait identique au premier, sauf que la fraction d’échantillon utilisé serait débarrassée des matières par filtration ou décantation.

On recommande de mesurer la létalité aiguë pour les truitelles ou les jeunes arcs-en-ciel de chaque échantillon à utiliser dans un essai EA ou EAT, dès sa réception. Cet essai devrait déterminer la CL 50 après 96 heures ou la mortalité dans un échantillon non dilué, dans une période de 96 heures, conformément aux méthodes d’Environnement Canada (1990b, compte tenu des modifications apportées en 1996). Grâce à la surveillance de la létalité aiguë dans chaque échantillon, on pourrait déceler des variations atypiques de la toxicité due à des déversements de produits chimiques ou à d’autres accidents, à des modifications apportées aux procédés industriels, à l’efficacité d’une station de traitement des eaux usées ou à des variations survenues dans l’environnement au fil du temps (dans le cas du lixiviat). L’information tirée d’essais parallèles sur la toxicité aiguë sera utile à l’interprétation des effets toxiques qui évoluent dans le temps et qui surviennent au cours des essais EA ou EAT.

6.2 Prélèvement, étiquetage, transport et entreposage des échantillons

Les contenants utilisés pour le transport et l’entreposage des échantillons ou des sous- échantillons d’effluent, de lixiviat ou d’élutriat doivent être fabriqués d’un matériau non toxique. Nous recommandons des contenants souples de polyéthylène ou de polypropylène, pour le transport de l’eau potable (p. ex Reliance^MC), dont le volume peut se contracter pour s’adapter à l’intérieur d’une glacière ou dont le volume d’air intérieur peut être maintenu au minimum, lorsque l’on prélève des fractions de l’échantillon au laboratoire pour l’essai toxicologique ou les analyses chimiques. Les contenants doivent être soit neufs, soit nettoyés à fond et rincés à l’eau non contaminée. On devrait aussi les rincer à l’échantillon à prélever. On devrait les emplir complètement de façon à réduire au minimum le volume d’air libre.

Dès le prélèvement, on doit remplir, fermer hermétiquement et étiqueter ou coder chaque contenant. Sur l’étiquette devrait figurer au moins l’indication du type d’échantillon, de son origine, de la date et de l’heure du prélèvement ainsi que du nom du ou des préposés à l’échantillonnage. On ne devrait pas soumettre aux essais les échantillons arrivant au laboratoire non étiquetés ou non codés. On ne devrait pas non plus soumettre automatiquement à l’analyse des échantillons parvenant au laboratoire dans des contenants partiellement remplis, parce que les toxiques volatils s’échappent dans le volume d’air. Cependant, si on sait que la volatilité ne fait pas problème, le chercheur peut, à son gré soumettre ses échantillons aux essais.

On doit s’efforcer de garder les échantillons d’effluent ou de lixiviat au frais (1 à 7 °C, de préférence 4 ± 2 °C) durant le transport. Lors du prélèvement, les échantillons tièdes (plus de 7 °C) doivent être ramenés à 1 à 7 °C, à l’aide de glace ordinaire (et non de glace sèche) ou de sachets réfrigérants. Au besoin, on doit ajouter dans le contenant de transport des quantités généreuses de glace, de sachets réfrigérants ou d’autres moyens de réfrigération, afin de maintenir la température de l’échantillon dans la fourchette de 1 à 7 °C durant le transport. Pendant ce dernier ou pendant l’entreposage, les échantillons ne doivent pas geler.

À son arrivée au laboratoire, il faut mesurer et noter la température de l’échantillon ou, le cas échéant, de l’un des sous-échantillons (le reste des sous-échantillons n’étant pas ouvert et étant laissé fermé hermétiquement). On peut ramener immédiatement ou durant la nuit la température d’une partie aliquote d’effluent ou de lixiviat dont on a alors besoin à 14 °C et l’utiliser dans l’essai. Le reste de l’échantillon ou des sous-échantillons, dont on a besoin pour le renouvellement ultérieur des solutions, doit être gardé à l’obscurité, dans des contenants fermés hermétiquement, sans volume d’air, à 4 ± 2 °C. Dans le cas des élutriats, de même que dans celui des échantillons destinés à l’élutriation en milieu aqueux puis aux essais sur l’élutriat, les conditions de transport et d’entreposage devraient être les mêmes que celles qui concernent les effluents et les lixiviats.

Les essais employant de l’effluent, un élutriat ou un lixiviat peuvent se faire en un lieu éloigné du lieu de prélèvement, dans les conditions contrôlées de laboratoire. Chaque essai E, EA ou EAT ainsi mené doit être réalisé suivant l’une des deux méthodes et approches suivantes de collecte :

1. On peut utiliser un seul échantillon d’eau usée pour l’essai E, à la condition de le répartir dans trois contenants distincts, dès son prélèvement, en vue du transport et de l’entreposage. Dans ce cas, il faut utiliser chacun des trois sous-échantillons pour préparer toutes les solutions d’essai durant deux ou trois journées consécutives de ce dernier^{Note de bas de page 41}. De même, pour un essai EA ou EAT dans un laboratoire éloigné, on peut utiliser un seul échantillon d’eau usée au cours de chacun des intervalles de 7 jours, à la condition de le répartir dès le prélèvement dans trois contenants entièrement remplis, fermés hermétiquement, puis d’être utilisés de la même manière.
2. Si, au cours des 7 à 10 jours d’entreposage qui précède l’utilisation dans l’essai, on sait que la toxicité des eaux usées évoluera ou si on prévoit ce phénomène, on devrait collecter des échantillons frais, en vue d’un essai E dans un laboratoire éloigné, en au moins trois occasions distinctes, à des intervalles de deux ou trois jours ou moins. On doit utiliser ces échantillons successivement au cours de l’essai^{Note de bas de page 42}. De même, pour les essais EA ou EAT avec des échantillons d’eau usée que l’on sait être ou que l’on prévoit d’être instables au cours de l’entreposage, on devrait, au cours de chaque semaine de l’essai, appliquer ce régime de prélèvement et d’essai (comportant au moins trois échantillons discrets par semaine).

Dans le cas des eaux usées instables, on peut aussi effectuer ces essais sur place, avec un échantillon frais, avec renouvellement continu ou intermittent (v. § 4.3.2 et 6.1, y compris la note 40).

L’essai employant des échantillons d’effluent et de lixiviat devrait débuter au plus tôt après le prélèvement. Dans un essai, on devrait commencer à utiliser l’échantillon dès la journée du prélèvement, si c’est possible, et on doit l’utiliser pas plus de 3 jours après. Si on utilise des effluents ou des lixiviats dans un laboratoire sur place, les échantillons devraient servir à l’essai dans la journée de leur prélèvement^{Note de bas de page 43} (USEPA, 1989).

Les échantillons de sédiment, de sol ou d’autre matière solide prélevés en vue d’une élutriation puis d’un essai sur l’élutriat devraient être extraits et traités le plus tôt possible après le prélèvement et pas plus de 10 jours après leur réception au laboratoire. Pour ce qui concerne les élutriats, on devrait utiliser des parties aliquotes de l’échantillon préparé selon le même calendrier que celui qui a été indiqué pour les effluents ou les lixiviats, si c’est possible. Il n’est pas souhaitable d’entreposer longtemps les échantillons d’élutriat, parce que la toxicité de l’échantillon pourrait ne pas être stable. Les essais sur élutriat doivent débuter dans les 3 jours de la préparation de l’échantillon, à moins qu’un règlement ou une méthode prescrite ne précise le contraire.

6.3 Préparation et aération des solutions d’essai

Il faut agiter vigoureusement le contenant dans lequel l’échantillon ou le sous- échantillon a été prélevé ou a été conservé, juste avant de le vider, pour assurer la remise en suspension des matières décantables. Il faut mesurer immédiatement avant l’emploi la teneur en OD et le pH de chaque échantillon ou sous-échantillon. Au besoin, on devrait aérer au préalable chaque solution d’essai (v. § 4.3.4), avant de répartir les fractions aliquotes dans les enceintes expérimentales où se trouvent les répétitions.

Normalement, il n’est pas nécessaire ni recommandé de filtrer les échantillons ou les sous-échantillons. Cependant, s’ils renferment des organismes qui risquent d’être pris pour les organismes en expérience, ou qui risqueraient de les attaquer ou d’entrer en concurrence avec ces derniers pour la nourriture, il faut les passer, au préalable, sur un tamis à mailles de 60 µm (USEPA, 1989 et 1994). Cette filtration pourrait arrêter les matières en suspension qui sont caractéristiques de l’échantillon ou du sous-échantillon et pourraient autrement contribuer à la toxicité ou la modifier. Si l’on craint cet effet, on devrait effectuer en parallèle un deuxième essai à l’aide d’une fraction non filtrée de l’échantillon ou du sous-échantillon.

Au cours des essais E, EA ou EAT employant des échantillons d’effluent, on devrait normalement aérer à faible débit, dans l’enceinte expérimentale, chaque solution y compris les témoins. On pourrait cependant décider d’effectuer l’essai sans aération, parce que le règlement l’exige, en raison d’une très faible demande d’oxygène par les eaux usées ou parce qu’un objectif de l’essai est d’inclure la demande d’oxygène dans l’effet toxique global. Dans cette éventualité, on recommande un essai avec renouvellement continu (v. § 3.3, 4.3.2 et 4.3.4).

6.4 Eau témoin ou eau de dilution

Les essais employant des échantillons d’effluent ou de lixiviat pour évaluer la conformité aux règlements devraient utiliser de l’eau du laboratoire ou un échantillon de l’eau réceptrice comme eau témoin ou de dilution. Comme les résultats pourraient différer selon les deux types d’eau, il faut décider des objectifs de l’essai avant de choisir l’eau que l’on utilisera. En raison des volumes en jeu, l’emploi de l’eau réceptrice pour les dilutions et les témoins risquerait d’être impraticable pour les essais dans un laboratoire éloigné.

Pour certains essais sur place, il pourrait être souhaitable d’employer l’eau réceptrice comme eau témoin ou de dilution, si l’on souhaite obtenir des renseignements de portée locale. Un exemple important serait la conduite d’essais visant à évaluer l’effet sublétal à la périphérie d’une zone de mélange, conformément à des exigences réglementaires de portée très locale. Le prélèvement, le transport et l’entreposage de ces échantillons devraient être conformes aux instructions du § 6.2.

Si l’on doit utiliser un échantillon d’eau réceptrice d’amont comme eau témoin ou de dilution, il faut préparer une solution témoin distincte à l’aide de l’eau d’alimentation du laboratoire servant normalement à l’élevage du poisson et aux essais avec ce dernier. Il faut comparer les paramètres biologiques (p. ex. la viabilité des embryons, le taux de mortalité des alevins ou des truitelles, l’incidence de difformités chez le poisson, le poids des truitelles à la fin de l’essai) mesurés chez le poisson exposé à l’eau témoin du laboratoire et chez le poisson exposé à l’échantillon d’eau réceptrice d’amont (§ 4.5).

On peut entreprendre les essais exigeant un degré poussé de normalisation avec de l’eau reconstituée qui sert dans les témoins et aux dilutions. Cela exige des volumes assez importants, mais, dans certains cas, cela pourrait être faisable et souhaitable. On recommande alors l’emploi d’une eau reconstituée douce (dureté de 40 à 48 mg de CaCO₃par litre, pH de 7,2 à 7,5 ; v. § 5.4). Par exemple, il pourrait valoir la peine d’employer une eau reconstituée douce si l’on voulait réduire au minimum l’influence de l’eau de dilution. Cette situation pourrait se présenter dans les études visant à corréler les données toxicologiques obtenues sur divers types et sources d’eaux usées, d’un certain nombre de laboratoires ou d’un seul laboratoire où la qualité de l’eau est variable. Il n’est pas recommandé d’ajuster la dureté de l’eau reconstituée à des valeurs supérieures aux valeurs ordinaires de l’eau réceptrice d’une eau usée donnée ni de régler le pH à l’extérieur de la fourchette normale, puisque l’on peut ainsi réduire (ou augmenter) la toxicité de la substance d’essai et arriver à des résultats expérimentaux trompeurs.

6.5 Observations et mesures

On devrait noter journellement le nombre de sujets manifestement morts (essais E, EA et EAT) et difformes (essais EA et EAT) dans chaque répétition. On devrait effectuer le dénombrement complet des stades pertinents, y compris des sujets manquants, à la fin de chaque stade important de chaque essai (c’est-à-dire 7 jours après la fécondation dans l’essai E, 7 jours après l’éclosion de la moitié des sujets dans le groupe témoin de l’essai EA et au moment de l’accession au stade de la truitelle de la moitié des sujets témoins dans l’essai EAT). Dans ce dernier essai, on mesure le taux de mortalité et le poids sec moyen des truitelles survivantes après 30 jours d’exposition (et alimentation) [v. § 4.4 et 4.5]. On devrait aussi noter journellement le nombre d’alevins sortis de l’œuf (essais EA et EAT) et le nombre de truitelles (essai EAT) dans chaque répétition ainsi que les comportements anormaux.

On devrait effectuer diverses mesures, outre celles qui sont précisées dans les § 4.3.3, 4.3.4, 4.3.5 et 4.4, sur les caractéristiques de l’eau usée et les conditions qui existent au cours de l’essai. Lorsque l’on prépare les solutions à partir de l’échantillon d’eau usée, on devrait noter la couleur de cette dernière, sa turbidité, son odeur et son homogénéité (c’est-à-dire présence de matières flottantes ou décantables). Lors de la dilution à l’eau, on devrait noter les phénomènes de précipitation, de floculation, le changement de couleur, l’odeur ou d’autres réactions. Au cours de l’essai, on devrait noter toute modification d’apparence des solutions, par exemple formation de mousse, dépôt, floculation, variation de la turbidité et de la couleur.

Lorsque les solutions sont très colorées ou opaques ou que, dans une ou plusieurs enceintes expérimentales, les échantillons moussent, on devrait inspecter les embryons et les alevins en soulevant brièvement l’incubateur au-dessus de chaque solution. Au besoin, on devrait transporter l’incubateur rapidement vers un récipient contenant de l’eau témoin ou de dilution claire, le temps de faire des observations sur la mortalité et l’aspect ou les comportements aberrants. Il faut traiter de la même façon toutes les répétitions, y compris les témoins pendant les manœuvres d’inspection.

Lorsque les échantillons d’effluent ont une teneur appréciable en matières solides, il est souhaitable de doser les matières totales en suspension et les matières décantables dès leur réception (APHA et al., 1995). Ces mesures font partie de la description globale de l’effluent et constituent des caractéristiques qui pourraient influer sur les résultats de l’essai toxicologique. On devrait aussi effectuer des mesures supplémentaires qui sont susceptibles d’aider à caractériser chaque échantillon d’effluent, de lixiviat ou d’élutriat, notamment le pH, la conductivité, la dureté, l’alcalinité, la couleur, la DCO, la DBO, l’OD et la concentration de certains toxiques (p. ex. acides résiniques, dérivés chlorophénoliques, métaux dissous, chlore, chloramine, ammoniaque).

6.6 Paramètres ultimes de mesure et calculs

Les paramètres ultimes de mesure des essais effectués avec des échantillons d’eau usée seront habituellement les paramètres ordinaires, c’est-à-dire la CE 50 et la CE 25 pour la non-viabilité des truites à leur divers stades de développement dans les essais E, EA et EAT ainsi que, dans l’essai EAT, la CL 50 après 30 jours et la CI 25 après 30 jours, relativement au poids moyen atteint par les truitelles. D’autres comptes rendus descriptifs sur le retard du développement, les difformités et le comportement sont exigés à la fin des essais de plus longue durée, et l’on peut détailler les observations supplémentaires (facultatives), comme il est décrit au § 4.5.

Dans les essais pour surveiller ou réglementer les effluents, les lixiviats ou les élutriats, il faut utiliser les options et les paramètres de mesure standards définis dans la section 4. Dans l’essai EAT, qui possède trois paramètres standards de mesure, l’effet le plus sensible serait pris comme l’indicateur définitif de la toxicité. Les méthodes ordinaires d’analyse s’appliqueraient (v. § 4.5).

Des essais réalisés à des fins de surveillance et de conformité aux règlements devraient normalement comprendre, pour le moins, trois répétitions de l’échantillon ou de sous- échantillons non dilués (ou une dilution précisée de l’échantillon) et trois solutions témoins des répétitions. Selon les exigences réglementaires, on pourrait limiter les essais de détermination de la conformité à une seule concentration (eau usée non diluée, sauf indication du contraire) ou on pourrait exiger une série de dilutions (c’est-à-dire un essai employant plusieurs concentrations différentes), plus de l’eau usée non diluée (v. § 4.5). Les essais employant une seule concentration sont souvent un moyen efficient de détermination de la présence d’une toxicité mesurable et aussi d’évaluation rapide d’un nombre important d’échantillons.

On pourrait adapter à des fins spéciales l’essai toxicologique standard, par exemple pour localiser, dans une usine, les sources de toxicité ou pour évaluer l’efficacité de changements de procédés dans une usine ou du traitement des effluents. Les essais pourraient porter sur une série de concentrations ou une seule concentration (échantillon non dilué ou dilué à une concentration convenable, plus un témoin). Les paramètres de mesure dépendraient des objectifs poursuivis, mais ils pourraient englober des limites « tout ou rien » arbitraires, par exemple le pourcentage maximal d’embryons non viables ou le pourcentage maximal de mortalité des alevins au bout d’un temps convenable. On trouve dans le § 4.5 des instructions utiles sur l’analyse statistique et les comptes rendus consécutifs aux séries d’essais portant sur différents échantillons, chacun évalué à une concentration seulement.