ARCHIVÉE - Trousse Elisa Systems pour la détection de la bêta-lactoglobuline : évaluation de la performance

Avertissement: La publication de cette méthode dans le recueil ne sous-entend pas qu'elle est approuvée ou entérinée par Santé Canada.

Introduction

La présente étude a pour objet d'obtenir des données sur la performance de la trousse Elisa Systems Beta-lactoglobulin (BLG) un allergène alimentaire important retrouvé dans le lait de vache. Cette étude fait partie des mesures soutenues visant à évaluer les méthodes de détection des allergènes dans les aliments et à les intégrer dans le Recueil des méthodes. Une poudre de lait entier représentative a été choisie comme matériel de référence désigné, selon la définition établie par le CMA.

L'évaluation de la trousse s'est faite par l'entremise d'expériences, ou de récupération au cours desquelles des matrices d'aliments choisies ont été artificiellement fortifiées (échantillons fortifiés) avec de la poudre de lait entier.

Méthode évaluée :

Trousse Elisa Systems Beta-Lactoglobulin.

Niveau d'évaluation :

Évaluation complète conformément aux lignes directrices établies pour le Recueil des méthodes d'analyse des allergènes.

Matériel de référence désigné :

De la poudre de lait entier provenant du National Institute of Standards & Technology (NIST) a servi de matériel de référence. Cette poudre de lait entier est un matériel développé conjointement par Agriculture et Agro-alimentaire Canada et le NIST sous le numéro de référence 8435.

Laboratoires participants

Laboratoire de recherche sur les allergènes alimentaires de Santé Canada
Édifice Banting
Ottawa (Ontario)

Laboratoire de la Région de l'Ouest, Santé Canada
Burnaby (Colombie-Britannique)

Laboratoire du Québec, ACIA
Longueuil (Québec)

Laboratoire de la Région de l'Ouest, ACIA
Burnaby (Colombie-Britannique)

Laboratoire d'Hormonologie, CER
Marloie, Belgique

Niveaux de fortification :

Les échantillons ont été fortifiés avec 0, 32 ppm et 80 ppm du matériel de référence NIST 8435. Ces niveaux sont conformes aux lignes directrices d'évaluation du Recueil, selon lesquelles les niveaux de fortification doivent engendrer une réponse de la trousse équivalant à environ 0, 2 et 5 fois la limite de dosage appliquée au matériel de référence donné.

Conditions de fortification :

La fortification a été faite au moyen d'une suspension de la poudre de lait entière NIST 8435 dans une solution tampon phosphate saline (PBS). Les échantillons ont été soit laissés tels quels (échantillons non fortifiés) ou ont été fortifiés avec l'un des deux niveaux, et un code d'identification anonyme leur a été assigné.

Matrices d'intérêt :

Trois matrices différentes ont été utilisées pour l'évaluation : céréales pour bébé, biscuits et chocolat noir. Ces produits ont été choisis parce qu'ils sont les plus susceptibles de contenir des traces de protéines de lait dont la présence n'est pas déclarée. Le risque d'une faible contamination croisée est présent lorsque des aliments qui ne contiennent pas de lait entier ou des composantes de lait comme ingrédient sont fabriqués avec l'équipement servant à fabriquer des produits qui en contiennent.

Matériel et ressources

Nous avons fourni à chaque laboratoire participant les éléments suivants :

• trousses complètes Elisa Systems Beta-Lactoglobulin avec la notice du fabricant contenant des directives pour se servir de la trousse. Les instructions d'utilisation (version PDF) ont été fournies par le fabricant uniquement en Anglais;
• échantillons codés à l'insu (30 de chaque matrice - 90 échantillons au total).

Méthode

Méthode de fortification :

Les niveaux de fortification ont été choisis de façon à obtenir un résultat d'environ 5 ppm et 12,5 ppm (2 et 5 fois la limite de dosage) avec la trousse Elisa Systems Beta-Lactoglobulin. L'étalon de la trousse Elisa Sytems Beta-Lactoglobulin utilisé pour produire la courbe d'étalonnage est différent de la poudre de lait entier NIST. Par conséquent, il était prévu qu'il y aurait une différence entre la quantité de poudre de lait entier NIST utilisée pour fortifier les échantillons et la quantité équivalente de lait écrémé commercial mesurée par la trousse selon les étapes standard de celles-ci. La quantité de poudre de lait entier NIST utilisée pour la fortification a donc été établie en conséquence. Une étude préliminaire a révélé que 32 ppm et 80 ppm de poudre de lait entier NIST étaient nécessaires pour obtenir un résultat équivalant à 2.5 ppm et à 12,5 ppm respectivement avec l'étalon de la trousse de Elisa Systems. Les échantillons ont été fortifiés à l'aide d'une suspension de la poudre de lait entier NIST dans une solution tampon phosphate saline (PBS). Une solution-mère de la poudre de lait entier NIST à une concentration de 440 μg/ml a été préparée par une dilution en série. Un aliquot de 1 g de la poudre de lait entier NIST a été dissous dans 10 ml de PBS (100 mg/ml), puis dilué (1:10) avec du PBS (solution obtenu à 10 mg/ml). Onze ml de la solution à 10 mg/ml a été ensuite diluée jusqu'à 250 ml pour obtenir la concentration finale de 440 μg/ml. Un ml de PBS a été ajouté aux échantillons non fortifiés, 0.364 ml de solution-mère (440 mg/ml) + 0.5 ml PBS ont été ajoutés aux échantillons de 32 ppm et 0.909 ml de solution-mère (440 μg/ml) ont été ajoutés aux échantillons de 80 ppm.

Préparation des échantillons :

Les 450 échantillons requis (10 réplicats de chacun des trois niveaux des trois produits pour cinq laboratoires) ont été préparés au Laboratoire de recherche sur les allergènes alimentaires de Santé Canada. Des échantillons de 5 g ont été pesés, puis déposés dans des bouteilles à bouchon vissé de 250 mL (150 échantillons par produit). Les échantillons ont été séparés en groupes de 50, puis chaque groupe a été fortifié à l'un des trois niveaux. Chaque échantillon s'est vu assigner un code numérique, puis les échantillons ont été regroupés pour chacun des cinq laboratoires participants et distribués.

Extraction et analyse des échantillons :

Chaque laboratoire a soumis les échantillons à une extraction en suivant la méthode indiquée dans la trousse Elisa Systems Beta-Lactoglobulin. L'extraction a été effectuée directement dans les bouteilles d'échantillons fournies. Les laboratoires ont ensuite analysé les extraits d'échantillons à l'aide de la trousse Elisa Systems Beta-Lactoglobulin en suivant la méthode indiquée dans la notice du fabricant.

Résultats

Les résultats de l'évaluation ont révélé une bonne concordance inter- et intralaboratoires pour les 450 échantillons. Aucun faux positif n'a été signalé. Six des 150 échantillons fortifiés avec 32 ppm de poudre de lait entier NIST (équivalent a 2.5 ppm de l'étalon standard de la trousse) ont donné un résultat faux négatif par rapport au seuil de 2,5 ppm établi par la trousse pour considérer des échantillons positifs. Il importe de noter que même si tous ces échantillons se situaient sous le seuil de 2,5 ppm, ils donnaient tous des résultats proches de 2,5 ppm, avec des densités optiques largement supérieure à celles des échantillons non fortifiés. De plus, les faux négatifs ont été obtenus uniquement pour le chocolat noir. Tous les échantillons fortifiés avec 80 ppm de poudre de lait entier NIST ont donné des résultats positifs.

Pour chaque groupe de dix échantillons dans une matrice donnée fortifiés à l'un des trois niveaux de fortification et analysés par un laboratoire donné (par exemple, les échantillons de chocolat noir fortifiés avec 32 ppm analysés par le laboratoire 2) la moyenne et l'écart-type des résultats ont été calculés. Tous les résultats dépassant deux écarts-types par rapport à la moyenne étaient considérés comme aberrants et ont été exclus. Sur les 450 échantillons, seuls huit ont été exclus pour cette raison.

L'écart réduit d'un élément indique l'importance et le sens de l'écart de cet élément par rapport à la moyenne de sa distribution, exprimée en unités de l'écart-type de sa distribution. Un écart réduit de 2,0 indique qu'un résultat se situait à deux écarts-types au-dessus de la moyenne, tandis qu'un écart de -2,0 indique qu'il se situait à deux écarts-types au-dessous. L'écart réduit a été calculé pour chaque produit alimentaire objet de l'étude, à chacun des niveaux de fortification et pour chaque laboratoire. Seulement trois résultats étaient supérieurs à 2,0, et la plupart des résultats étaient inférieurs à 1,0, ce qui révèle une assez bonne concordance entre tous les laboratoires participants. De plus, les écarts réduits les plus élevés provenaient d'échantillons non fortifiés, ce qui est justifiable, car un changement minime de densité optique produit une variation proportionnellement plus élevée pour les échantillons non fortifiés que pour les autres échantillons.

Un résumé des résultats de chacun des sept laboratoires est présenté ici.

Il faut noter que les quantités ajoutées pour la fortification sont indiquées en ppm de la poudre de lait entier NIST , mais que les résultats obtenus au moyen de la trousse sont exprimés en ppm de l'étalon Elisa Systems, exprimé en ppm de la poudre de lait écrémé commercial. Des résultats approximatifs de 5 ppm et de 12,5 ppm de l'étalon Elisa Systems étaient attendus pour les échantillons fortifiés avec 32 et 80 ppm du lait entier en poudre NIST . Le choix d'utiliser la poudre de lait entier NIST pour cette évaluation a été fait en raison de sa disponibilité et de sa caractérisation bien définie comme matériel de référence. Il faut noter que la poudre de lait entier NIST n'a pas été conçue pour le contrôle d'allergènes alimentaires. Comme précisé dans la section "Méthodes" vue la différence entre les étalons standards de la trousse (poudre de lait écrémé) et la matériel de référence choisi (poudre de lait entier : NIST) les résultats observés ne sont pas inattendus.

Conclusion

La trousse Elisa Systems Beta-Lactoglobulin a donné des résultats satisfaisants avec les matrices et les niveaux utilisés au cours de l'évaluation. C'est le chocolat noir qui présentait les taux de récupération les plus faibles. Ce résultat n'est pas surprenant, car le chocolat noir contient des concentrations élevées de tanins et d'autres composés phénoliques qui peuvent gêner l'extraction de protéines. Les céréales pour bébé, présentaient les meilleurs taux de récupération.

Les données de l'évaluation, qui reposent sur des échantillons fortifiés à l'aide de la poudre de lait entier NIST, pourront être complétées par d'autres données obtenues avec des échantillons naturels fabriqués au moyen d'une quantité de lait ou de BLG connue. Les données d'études ultérieures seront ajoutées à ce rapport lorsqu'elles seront disponibles, afin de fournir davantage de données sur la performance de cette trousse commerciale.