ARCHIVÉE - Trousse Veratox de Neogen pour la détection de marqueurs des allergènes de l'amande : évaluation de la performance

Avertissement : La publication de cette méthode dans le recueil ne sous-entend pas qu'elle est approuvée ou entérinée par Santé Canada.

Introduction

La présente étude a pour objet d'obtenir des données sur la performance de la trousse Veratox de Neogen, trousse commerciale de détection des protéines de l'amande dans les aliments. Cette étude fait partie des mesures soutenues visant à évaluer les méthodes de détection des allergènes dans les aliments et à les intégrer dans le Recueil des méthodes. Une poudre d'amande représentative a été choisie comme matériel de référence désigné, selon la définition établie par le CMA.

Une approche en deux étapes a été adoptée pour l'évaluation. Tout d'abord, le matériel de référence représentatif de l'amande a été utilisé dans des expériences de récupération au cours desquelles des matrices d'aliments choisies ont été artificiellement fortifiées (échantillons fortifiés). Plus tard, des échantillons d'aliments auxquels on a ajouté des quantités connues d'amande dans des conditions pilotes de fabrication seront analysés (échantillons naturels). Les résultats de ces expériences et la performance de la trousse dans chacune de ces conditions d'évaluation seront communiqués à mesure que les données seront disponibles.

Méthode évaluée

Trousse Veratox de Neogen pour les allergènes de l'amande

Niveau d'évaluation

Évaluation complète conformément aux lignes directrices établies pour le Recueil des méthodes d'analyse des allergènes.

Matériel de référence désigné

De la poudre d'amande provenant du Food Allergen Research and Resource Program (FARRP) de l'Université du Nebraska a servi de matériel de référence. Cette poudre d'amande est un amalgame de plusieurs variétés d'amandes disponible commercialement.

Laboratoires participants

Laboratoire de recherche sur les allergènes alimentaires de Santé Canada
Édifice Banting
Ottawa (Ontario)

Laboratoire de la Région de l'Ouest, Santé Canada
Burnaby (Colombie-Britannique)

Laboratoire du Québec, ACIA
Longueuil (Québec)

Laboratoire de la Région de l'Ouest, ACIA
Burnaby (Colombie-Britannique)

Laboratoire de Neogen
Lansing MI, É.-U.

Laboratoires de la
Food Products Association
Washington D.C., É.-U.

Laboratoires du
FARRP
Lincoln, Nebraska, É.-U.

Niveaux de fortification :
Les échantillons ont été fortifiés avec 6,25 et 15,63 ppm de pâte d'amande. Ces niveaux sont conformes aux lignes directrices d'évaluation du Recueil, selon lesquelles les niveaux de fortification doivent engendrer une réponse de la trousse équivalant à environ 0, 2 et 5 fois la limite de dosage appliquée au matériel de référence donné.

Conditions de fortification :
Une petite aliquote de poudre d'amande a été pulvérisée en pâte à l'aide d'un pilon et d'un mortier. La fortification a été faite au moyen d'une suspension de 1 mg/g de la pâte d'amande dans une solution de carboxyméthylcellulose (CMC), conformément à une méthode mise au point par Trucksess et coll., Preparation of Peanut Butter Suspension for Determination of Peanuts Using-Enzyme-Linked Immunoassay Kits, publiée dans le Journal of AOAC International, vol. 87(2), 2004. Les échantillons ont été laissés tels quels (blancs) ou ont été fortifiés avec l'un des deux niveaux, et un code d'identification anonyme leur a été assigné.

Matrices d'intérêt :
Trois matrices différentes ont été utilisées pour l'évaluation : du chocolat au lait (tablettes de chocolat Aero de Nestlé), du chocolat noir (tablettes de chocolat spécial noir de Hershey) et des biscuits (biscuits Dad's à l'avoine de Christie). Ces produits ont été choisis parce qu'ils sont les plus susceptibles de contenir des traces d'amandes dont la présence n'est pas déclarée. Le risque d'une faible contamination croisée est présent lorsque des aliments qui ne contiennent pas d'amandes sont fabriqués avec l'équipement servant à fabriquer des produits qui en contiennent.

Matériel et ressources

Certains hyperliens donnent accès à des sites d'organismes qui ne sont pas assujettis à la  
. L'information qui s'y trouve est donc dans la langue du site.

Nous avons fourni à chaque laboratoire participant les éléments suivants :

  • trousses complètes Veratox de Neogen pour les allergènes de l'amande, y compris la notice du fabricant contenant des directives pour se servir de la trousse. Les instruction d'utilisation (Version PDF - 55,62 Ko - anglais seulement) ont été fournies par le fabricant uniquement en Anglais;
  • échantillons codés à l'insu (30 de chaque matrice - 90 échantillons au total).

Méthode

Méthode de fortification

Les niveaux de fortification ont été choisis de façon à obtenir un résultat d'environ 5 ppm et 12,5 ppm (2 et 5 fois la limite de dosage) avec la trousse Veratox de Neogen pour les allergènes de l'amande. L'étalon de la trousse de Neogen utilisé pour produire la courbe d'étalonnage est différent de la poudre d'amande de référence. Par conséquent, il était prévu qu'il y aurait une différence entre la quantité d'amande utilisée pour fortifier les échantillons et la quantité d'amande mesurée par la trousse. La quantité de poudre d'amande de référence utilisée pour la fortification a donc été établie en conséquence. Une étude préliminaire a révélé que 6,25 ppm et 15,6 ppm de poudre d'amande de référence étaient nécessaires pour obtenir un résultat équivalant à 5 ppm et à 12,5 ppm respectivement avec l'étalon de la trousse de Neogen. Les échantillons ont été fortifiés à l'aide d'une suspension de la poudre d'amande de référence dans une solution de CMC à laquelle ont été ajoutés de l'albumine bovine et du thimérosal. Une solution-mère de pâte d'amande dans le CMC à une concentration de 1 mg/g a été préparée, puis diluée dans une solution tampon phosphate saline (PBS) (7,8 g dans un volume total de 250 mL pour l'échantillon fortifié avec 6,25 ppm; 19,5 g dans un volume total de 250 mL pour l'échantillon fortifié avec 15,6 ppm). Une aliquote de 1 mL de solution de fortification a été ajoutée à chaque échantillon. Pour les échantillons non fortifiés 14 g de la suspension de CMC (1 mg/ml) a été dilué avec du PBS jusqu'à un volume de 250 ml. Un aliquote de 1 mL de ce mélange a été ajoutée à chaque échantillon non fortifié.

Préparation des échantillons

Les 630 échantillons requis (10 réplicats de chacun des trois niveaux des trois produits pour sept laboratoires) ont été préparés au Laboratoire de recherche sur les allergènes alimentaires de Santé Canada. Des échantillons de 5 g ont été pesés, puis déposés dans des bouteilles à bouchon vissé de 250 mL (210 échantillons par produit). Les échantillons ont été séparés en groupes de 70, puis chaque groupe a été fortifié à l'un des trois niveaux. Chaque échantillon s'est vu assigner un code numérique, puis les échantillons ont été regroupés pour chacun des sept laboratoires participants et distribués.

Extraction et analyse des échantillons

Chaque laboratoire a soumis les échantillons à une extraction en suivant la méthode indiquée dans la trousse de Neogen. L'extraction a été effectuée directement dans les bouteilles d'échantillons fournies. Les laboratoires ont ensuite analysé les extraits d'échantillons à l'aide de la trousse Veratox de Neogen pour les allergènes de l'amande en suivant la méthode indiquée dans la notice du fabricant. Les résultats ont été calculés au moyen du logiciel Log/Logit de Neogen.

Résultats

Un certain nombre de difficultés se sont posées au cours de cette validation. La première était liée aux échantillons de biscuits. Lorsque la solution de fortification a été ajoutée aux échantillons de biscuits, elle a formé une masse gommeuse qui ne s'est pas séparée suffisamment une fois agitée. Les taux de récupération avec les biscuits ont donc été légèrement inférieurs aux prévisions. Le problème de la récupération avec les échantillons de biscuits semble lié à la période qui sépare la fortification et l'extraction des échantillons, les taux de récupération les plus faibles étant associés au délai le plus long entre ces deux étapes. La deuxième difficulté avait trait à l'expédition des échantillons au laboratoire 6. Leur transport a subi un retard de deux semaines dû au transporteur et aux formalités de dédouanement. Lorsque les résultats des échantillons de biscuits ont enfin été analysés, ils ont donné de très mauvais résultats, et ils ont donc été exclus de l'étude. Trois des échantillons de biscuits du laboratoire 2 fortifiés avec 6,25 ppm ont aussi été exclus à cause d'un défaut de fonctionnement de leur agitateur.

Les résultats de l'évaluation ont révélé une bonne concordance inter- et intralaboratoires pour les 597 autres échantillons. Aucun faux positif n'a été signalé. Six des 197 échantillons fortifiés avec 6,25 ppm ont donné un résultat négatif par rapport au seuil de 2,5 ppm établi pour considérer des échantillons positifs. Il importe de noter que même si tous ces échantillons se situaient sous le seuil de 2,5 ppm, ils donnaient tous des résultats proches de 2,5 ppm, et leur densités optique était largement supérieure à celui des échantillons non fortifiés. Cinq de ces faux négatifs ont été obtenus avec le chocolat noir et un avec les biscuits. Tous les échantillons fortifiés avec 15,63 ppm ont donné des résultats positifs.

Pour chaque groupe de dix échantillons dans une matrice donnée à l'un des trois niveaux de fortification qui a été analysé par un laboratoire (par exemple, les échantillons de chocolat au lait fortifiés avec 6,25 ppm du laboratoire 2) la moyenne et l'écart-type ont été calculés. Tous les résultats dépassant deux écarts-types par rapport à la moyenne étaient considérés comme aberrants et ont été exclus. Sur les 597 échantillons, seulement six ont été exclus pour cette raison.

L'écart réduit d'un élément indique l'importance et le sens de l'écart de cet élément par rapport à la moyenne de sa distribution, exprimée en unités de l'écart-type de sa distribution. Un écart réduit de 2,0 indique qu'un résultat se situait à deux écarts-types au-dessus de la moyenne, tandis qu'un écart de -2,0 indique qu'il se situait à deux écarts-types au-dessous. L'écart réduit a été calculé pour chaque produit alimentaire objet de l'étude, à chacun des niveaux de fortification et pour chaque laboratoire. Seulement trois résultats étaient supérieurs à 2,0, et la plupart des résultats étaient inférieurs à 1,0, ce qui révèle une assez bonne concordance entre tous les laboratoires participants.

Un résumé des résultats de chacun des sept laboratoires est présenté ici.

Il faut noter que les quantités ajoutées pour la fortification sont indiquées en ppm de la poudre d'amande du FARRP, mais que les résultats obtenus au moyen de la trousse sont en ppm de l'étalon de Neogen. Des résultats approximatifs de 5 ppm et de 12,5 ppm de l'étalon de Neogen étaient attendus pour les échantillons fortifiés avec 6,25 et 15,63 ppm de la poudre d'amande du FARRP.

Conclusion

La trousse Veratox de Neogen pour les allergènes de l'amande a donné des résultats satisfaisants avec les matrices et les niveaux utilisés au cours de l'évaluation. C'est le chocolat noir qui présentait les taux de récupération les plus faibles. Ce résultat n'était pas surprenant, car le chocolat noir contient des concentrations élevées de tanins et d'autres composés phénoliques qui peuvent gêner l'extraction de protéines. Le chocolat au lait, qui contient moins de composés phénoliques que le chocolat noir, avait les meilleurs taux de récupération. Les résultats des biscuits se situaient entre les deux.

Les données de l'évaluation, qui reposent sur des échantillons fortifiés à l'aide de la poudre d'amande du FARRP, seront complétées par d'autres données obtenues avec des échantillons naturels fabriqués au moyen d'une quantité d'amandes connue. Ce genre d'étude est en voie d'élaboration. Les données d'études ultérieures seront ajoutées à ce rapport lorsqu'elles seront disponibles, afin de fournir davantage de données sur la performance de cette trousse commerciale.

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