Méthode d’essai biologique : essai sur la fécondation chez les échinides ou oursins globuleux et oursins plats, chapitre 10
Section 8 : Modes opératoires particuliers pour les essais sur des échantillons de liquides extraits de sédiments ou de matières semblables
La présente section renferme des instructions générales applicables aux essais sur des liquides extraits d’échantillons de sédiment ou de solides semblables, comme des boues ou des sols. Ces instructions s’ajoutent aux procédures exposées à la section 4. Il importe de souligner que le terme « sédiment » est employé pour des raisons de commodité et qu’il inclut des matières solides semblables, comme des sols ou encore des boues municipales ou industrielles, qui peuvent contribuer à la pollution des eaux naturelles ou qui doivent être soumises à des essais pour d’autres raisons.
8.1 Généralités
Au moment de la publication de la première édition de la présente méthode, en 1992, on considérait de plus en plus important d’évaluer la toxicité des sédiments pour assurer la protection de l’environnement, notamment dans le contexte de l’immersion de déchets en mer, comme le prévoit la Partie 4 de la Loi canadienne sur la protection de l’environnement. Depuis ce temps, le présent essai sublétal a été exécuté régulièrement sur des échantillons d’eau de porosité de sédiment aux termes du Programme d’immersion en mer afin de déterminer si des déblais de dragage peuvent être immergés en mer (LCPE, 1999; Gouvernement du Canada, 2001). Toutefois, l’influence possible de facteurs confusionnels (p. ex., la présence d’ammoniac et de sulfures dans l’eau de porosité des sédiments) sur l’interprétation des résultats a fait naître des incertitudes quant à l’application de cet essai du point de vue de la réglementation (Scroggins et coll., 2003). Environnement Canada a donc entrepris des recherches en vue de mettre au point et de perfectionner la méthode, ce qui a donné lieu à d’autres directives qui ont amélioré l’essai décrit ici sur la fécondation chez les échinides exposés à l’eau de porosité d’un sédiment. De plus, Environnement Canada est en train de mettre au point un nouvel essai comportant un contact sédiment- embryons/larves afin de mesurer la toxicité d’échantillons de sédiment en phase solide pendant les premières étapes du cycle biologique d’échinides (Buday, 2006, Jackman et Doe, 2004, 2006; McLeay, 2007).
L’essai décrit ici sur la fécondation des œufs d’échinides convient à l’évaluation de la toxicité de liquides extraits de sédiments. Il permet de comparer rapidement des extraits de sédiments contaminés (Long et coll., 1990). L’analyse comparative de 7 essais sur des liquides extraits de sédiments a montré que l’essai mené avec des embryons d’échinodermes et l’essai bactériologique Microtox étaient les plus sensibles (Pastorok et Becker, 1989). Les essais de toxicité sublétale, y compris l’essai sur la fécondation chez l’oursin violet de l’Atlantique dans l’eau de porosité de sédiments, étaient beaucoup plus sensibles qu’un essai classique sur un sédiment entier avec des amphipodes (Carr et Chapman, 1992).
Les directives générales qui suivent s’appliquent aux essais sur la fécondation chez des échinides exposés à des liquides extraits de sédiments. Le présent rapport ne renferme pas d’indications sur l’étude sur le terrain ou l’échantillonnage des sédiments, ni sur l’extraction de substances aqueuses ou d’autres matières qu’ils contiennent. On trouvera dans EC (1994) des directives détaillées sur le prélèvement, la manipulation, le transport et l’entreposage d’échantillons de sédiments (v. 8.1.1), de même que des détails sur les procédures d’extraction de liquides (eau de porosité, élutriat ou extraits au solvant; v. 8.2) des sédiments, en vue d’essais toxicologiques et d’analyses chimiques ultérieurs. Les directives contenues dans ce document et celles décrites ici devraient être consultées et suivies. On peut trouver des renseignements sur le fondement de ces directives dans divers ouvrages (p. ex., Mudroch et Macknight, 1991), dans les articles cités dans EC (1994) et dans des études de synthèse sur ce sujet (p. ex., Geisy et Hoke, 1989; McLeay et Sprague, 1991).
L’essai sur la fécondation des œufs d’échinides ne convient pas à des sédiments entiers (c.-à-d. les solides), mais il est utile pour les liquides qui en sont extraits, qu’il s’agisse de lixiviats, d’élutriats, d’extraits au solvant ou d’eau de porosité.
À partir des résultats de l’étude interlaboratoire effectuée en 2008 afin de relever les améliorations à apporter à la partie de la méthode SPE 1/RM/27 relative aux essais sur l’eau de porosité, on a inclus dans les pages qui suivent des procédures additionnelles pour les essais sur des échantillons d’eau de porosité de sédiments (Miller, 2008). Ces procédures peuvent être appliquées afin de réduire l’influence possible de facteurs confusionnels sur les résultats des essais sur la fécondation chez les échinides exposés à l’eau de porosité. Elles sont fondées sur des méthodes mises au point à la Marine Ecotoxicology Research Station, Columbia Environmental Research Centre (Carr, Nipper et Biedenbach, comm. pers., 2008) et incluent l’utilisation d’eau de porosité témoin dans le prétest en vue d’établir le rapport spermatozoïdes:œufs aux fins de l’essai définitif (v. 4.2.3), de même que le recours à une eau de porosité témoin et à un ou des échantillons d’eau de porosité de référence pour déterminer la toxicité (ou son absence) d’échantillons d’eau de porosité provenant de lieux contaminés ou de sites d’intérêt (v. 8.1.4, 8.2.1, 8.2.2 et 8.2.3).
8.1.1 Étiquetage, transport et entreposage des échantillons
On devrait se conformer aux méthodes générales d’étiquetage, de transport et d’entreposage des échantillons de sédiment décrites en 6.1, de même qu’aux indications concernant la plage de températures. Les échantillons ne doivent pas geler (ni complètement, ni partiellement) et ne doivent pas s’assécher (ASTM, 1991b; EC, 1994).
Dans le cas des liquides provenant d’un sédiment, les contenants et les méthodes de manipulation devraient être conformes aux indications fournies en 6.1 pour les élutriats. Si on utilise un solvant non aqueux pour extraire des substances ou des matières, on devrait conserver ces dernières dans un contenant en verre pour s’assurer qu’elles ne subiront pas l’influence du solvant ou du lixiviat présent dans l’échantillon.
Les essais devraient commencer aussitôt que possible après le prélèvement des échantillons. L’extraction du liquide devrait avoir lieu dans les 2 semaines qui suivent le prélèvement, idéalement dans la première semaine. L’essai doit commencer au plus tard 6 semaines après le prélèvement des échantillons (EC, 1994)Note de bas de page 76. L’essai sur le liquide extrait d’un sédiment devrait commencer dans les 24 h suivant l’extraction des solutions (EC, 1994) et obligatoirement dans les 3 jours, à moins d’indication contraire dans un règlement ou dans une autre méthode désignée.
8.1.2 Préparation des échantillons
La nécessité d’homogénéiser ou non l’échantillon avant l’essai est fonction de la nature de celui-ci et des objectifs de l’essai. Le cas échéant, on doit procéder à un mélange soigneux. Les sous-échantillons (c.-à-d. l’échantillon divisé dans deux ou plusieurs contenants) doivent être mélangés (c.-à-d. regroupés en un échantillon composite). S’il faut entreposer de nouveau l’échantillon, on devrait remettre l’échantillon composite ou une fraction de celui-ci dans les contenants des sous-échantillons.
8.1.3 Observations et mesures
Pendant la préparation des solutions d’essai, on devrait observer la couleur, la turbidité, la formation de mousse, la précipitation et d’autres caractéristiques du sédiment et de tout liquide qui en provient, conformément aux indications données en 6.4.
8.1.4 Liquide provenant du sédiment témoin et du sédiment de référence
Le liquide (eau de porosité) extrait d’un ou de plusieurs échantillons du sédiment témoin et/ou du sédiment de référence (non contaminé)Note de bas de page 77 doit être analysé de la même façon que celui extrait du sédiment d’essai. Les liquides provenant du sédiment de référence et du sédiment témoin servent à des fins différentes. L’eau de porosité du sédiment de référence, qui est utilisée comme eau de référence du site, permet de comparer les effets biologiques observés pendant l’essai sur l’eau de porosité du sédiment d’essai. Dans la mesure du possible, on devrait toujours se servir de l’eau de porosité de référence à des fins de comparaison, car cela permet d’évaluer la toxicité d’un lieu donné. Cependant, Environnement Canada et d’autres laboratoires ont souvent relevé des effets toxiques évidents de l’eau de porosité provenant de sédiments de référence non contaminés ou ont noté que l’eau de porosité de référence non identifiée dans le cas d’échantillons codés ou à blanc ne se prêtait pas à des comparaisons. Dans de tels cas, il faudrait comparer les effets biologiques de l’eau de porosité d’essai à ceux de l’eau de porosité du sédiment témoin. Par conséquent, de l’eau de porosité provenant d’un ou de plusieurs sédiments témoins (« non contaminés ») devrait être incluse en tant qu’échantillon dans chaque essai sur l’eau de porosité d’un sédiment (ou d’une série de sédiments), pour faciliter l’établissement d’un niveau de base (« normal »). À cette fin, il serait souhaitable d’adopter un « sédiment témoin » non contaminé et normalisé ou, idéalement, une série de sédiments de référence aux caractéristiques différentes qu’on pourrait apparier aux caractéristiques des sédiments à l’étude.
Idéalement, le ou les sédiments de référence devraient avoir les mêmes propriétés physicochimiques que le ou les sédiments à l’étude et être représentatifs des facteurs confusionnels (c.-à-d. les facteurs autres que les contaminants préoccupants) susceptibles d’être présents dans l’échantillon d’eau de porosité (Scroggins et coll., 2003)Note de bas de page 78. Toutefois, il est également important d’utiliser de façon courante une eau de porosité non contaminée (ou eau de porosité témoin) dans les essais sur l’eau de porosité afin de disposer d’une base d’interprétation des données de l’essai. On peut prélever l’eau de porosité témoin d’un sédiment peu contaminé et à faible teneur en ammoniac et en sulfures. Une fois qu’on a repéré un sédiment témoin convenable (non contaminé, stable, connu pour donner un bon taux de fécondation, etc.), on peut en extraire de grands volumes d’eau de porosité et entreposer celle-ci (c.-à-d. la congeler) aux fins d’essais ultérieurs. L’eau de porosité du sédiment témoin sert à d’autres fins que l’eau de mer témoin du laboratoire (à savoir l’eau témoin/de dilution), qui donne une mesure directe de la validité de l’essai. On devrait généralement utiliser les deux types d’eau témoin (eau de mer du laboratoire et eau de porosité provenant d’un sédiment témoin convenable) dans les essais toxicologiques sur l’eau de porosité d’un sédiment contaminé (Scroggins et coll, 2003), de même qu’un échantillon approprié d’eau de porosité provenant d’un ou de plusieurs sites de référence, car l’expérience montre que l’eau de mer témoin du laboratoire, employée seule, ne permettrait peut-être pas d’obtenir une évaluation acceptable de la toxicité de l’eau de porosité.
Il n’existe pas de méthode exclusive pour traiter les résultats obtenus pour le sédiment témoin et le sédiment de référence (c.-à-d. l’eau de porosité). Toutefois, si on inclut dans l’essai l’eau de porosité témoin et l’eau de porosité de référence, qu’on les traite de la même façon que l’eau de porosité d’essai (v. 8.2.1 et 8.2.2) et qu’on les soumet simultanément à un essai, on peut procéder à des tests pour vérifier s’il existe des écarts significatifs entre les résultats obtenus pour le sédiment de référence/témoin et le sédiment d’essai [en d’autres termes, on peut utiliser l’eau de porosité témoin comme base pour établir la présence ou l’absence de toxicité à chaque niveau de traitement (v. 8.2.3); en outre, l’eau de porosité de référence, s’il ne s’agit pas d’un échantillon à blanc ou codé, peut permettre d’évaluer la toxicité propre à un site]. On devrait faire preuve de prudence dans l’interprétation des résultats obtenus pour la substance ou matière d’essai et on devrait s’assurer du concours d’un statisticien. Lorsqu’on ne dispose d’aucun échantillon d’eau de porosité de référence ou d’eau de porosité témoin, il pourrait être nécessaire d’utiliser l’eau témoin du laboratoire (eau témoin/de dilution) à des fins de comparaison avec les résultats des essais sur l’eau de porosité d’échantillons prélevés dans le milieu naturel, mais cette façon de procéder est moins souhaitableNote de bas de page 79. Si on n’utilise que l’eau témoin/de dilution aux fins des comparaisons, on ne dispose alors d’aucun témoin des facteurs confusionnels, et l’interprétation des résultats de l’essai pourrait exiger la connaissance des limites de tolérance des espèces d’essai pour pouvoir déterminer si les échantillons d’essai présentent de tels facteurs. En outre, toute évaluation de la toxicité propre à un site s’en trouverait limitée.
8.2 Essais sur des liquides provenant de sédiments et de solides semblables
Les toxiques que contiennent les sédiments ou les sols peuvent évoluer en phase aqueuse et avoir une incidence sur les organismes présents dans les eaux naturelles. La phase aqueuse peut être un liquide provenant du sol ou du sédiment (p. ex., eau interstitielle ou eau de porosité) ou un liquide utilisé pour traiter un échantillon et en extraire les toxiques potentiels (p. ex., un élutriat).
Un liquide provenant d’un sédiment soumis à un essai toxicologique devrait vraisemblablement appartenir à l’une ou l’autre des quatre grandes catégories suivantes :
- de l’eau interstitielle, qui remplit l’espace entre les particules (c.-à-d. l’eau de porosité) et qui pourrait procéder d’un échange avec l’eau sus-jacente d’un estuaire, d’une baie, etc., qu’on extrait généralement du sédiment par centrifugation ou par compression (ASTM, 1991b);
- de l’eau, essentiellement de l’eau douce, utilisée pour obtenir un extrait aqueux des matières que contient un sédiment (c.-à-d. un élutriat), par exemple, en agitant un échantillon dans une solution d’eau non contaminée. Cette catégorie n’est pas très appropriée pour les essais sur la fécondation des œufs d’échinides;
- de l’eau témoin/de dilution ou toute autre eau non contaminée dont la salinité équivaut à celle de l’eau de mer et qui sert à obtenir un extrait aqueux, comme en 2 ci-dessus;
- des solvants autres que l’eau (p. ex., solvants organiques), utilisés pour piéger des substances ou matières de l’échantillon de sédiment (Schiewe et coll., 1985; True et Heyward, 1990).
L’eau des trois premières catégories pourrait être analysée comme un échantillon liquide normal, conformément aux méthodes universelles décrites à la section 4 et aux modes opératoires décrits à la section 6 pour les effluents, les lixiviats et les élutriats. Pour ce qui est de la quatrième catégorie (les solvants), l’option privilégiée consiste à utiliser la même concentration de solvant dans chaque récipient d’essai. On porte l’eau témoin/de dilution à utiliser dans l’essai à la même teneur en solvant que la concentration la plus élevée de l’échantillon d’essai. Des concentrations moins élevées sont préparées avec de l’eau témoin/de dilution modifiée pour que l’effet du solvant, le cas échéant, soit le même dans tous les récipients. On devrait disposer d’un témoin sans solvant en plus du témoin avec solvant. De plus, il serait souhaitable de réaliser un essai distinct pour déterminer la CIpdu solvant.
8.2.1 Préparation des échantillons d’essai
Un document d’Environnement Canada (EC, 1994) contient des directives précises sur l’extraction des liquides (p. ex., eau de porosité, élutriat ou extrait au solvant) d’un sédiment. Ces directives devraient être consultées et suivies lors de la préparation des extraits pour les essais sur la fécondation chez les échinides, de même que de l’eau de porosité témoin et de référenceNote de bas de page 80.
Le mélange des « sous-échantillons » du liquide extrait des sédiments (p. ex., des extraits successifs) devrait être conforme aux instructions énoncées en 6.2. Les sous- échantillons ne devraient pas être mélangés si on cherche à déterminer la toxicité relative de chacun des extraits successifs. Les échantillons ou sous-échantillons d’élutriat ou d’eau de porosité devraient être centrifugés pour éliminer les solides en suspension (EC, 1994). Seuls les échantillons d’eau de porosité témoin peuvent être congelés en vue de leur entreposage à long terme. La congélation peut se faire à -20 °C; l’entreposage à cette même température peut durer jusqu’à 1 an, à la condition que les échantillons soient exempts de particules avant la congélation. Pour obtenir une eau de porosité exempte de particules, on devrait centrifuger 2 fois les échantillons (p. ex., après centrifugation à ~3 000 × g pendant 15 min à 4 °C, on recueille l’eau de porosité en prenant soin de ne pas enlever les particules près de la couche de sédiment, puis on centrifuge de nouveau l’eau de porosité à ~3 000 × g pendant 15 min à 4 °C). Les échantillons devraient être décongelés la veille de l’essai. Une fois décongelés, il faudrait les centrifuger afin d’en retirer les particules en suspension qui ont précipité, car celles-ci pourraient empêcher les spermatozoïdes de repérer et de féconder les œufs (Carr et Chapman, 1995). On devrait déterminer le pH et la teneur en OD de l’échantillon en tenant compte des limites précisées en 4.1.2 et 4.1.3.
Une fois le liquide obtenu, on prépare les concentrations d’essai de la manière habituelle (v. 4.1.2). Comme pour les essais sur un effluent, un lixiviat et un élutriat, l’essai pourrait être à concentration unique (plus un témoin) s’il s’agit de vérifier la conformité aux règlements, ou à concentrations multiples si on souhaite déterminer la CIp(v. 6.5). Les méthodes de prélèvement et d’analyse du liquide provenant des échantillons de sédiment témoin ou de référence devraient être les mêmes que pour le sédiment d’essai.
8.2.2 Eau témoin/de dilution
Si l’échantillon de sédiment provient d’un milieu marin ou estuarien et que l’eau qui en est extraite est essentiellement de l’eau de mer dont la salinité se situe dans la plage prévue pour l’essai (28-32 g/kg), il est recommandé de se conformer aux méthodes universelles décrites à la section 4.
Lorsque le liquide provenant d’un sédiment se compose surtout d’eau douce ou que sa salinité est inférieure à celle de l’eau de mer normale (c.-à-d. une eau comparable à celle d’un estuaire), on devrait normalement ajuster la salinité de toutes les solutions d’essai et solutions témoins en fonction d’une même valeur (≤1 g/kg de la plage de 28-32 g/kg). Pour ce faire, on ajuste habituellement une aliquote de l’échantillon conformément aux méthodes décrites en 4.3.2. Il est recommandé d’utiliser des sels de mer secs du commerce, des sels de qualité réactif ou de la SHS naturelle ou artificielle, comme il est indiqué en 2.3.4.
Dans les essais à concentrations multiples d’eau de porosité, il faut utiliser la même eau témoin/de dilution (p. ex., l’eau de mer du laboratoire) pour l’eau de porosité de référence et/ou témoin, de même que pour les dilutions et les témoins de l’eau de porosité d’essai. De plus, l’eau de porosité de référence et/ou témoin et l’eau de porosité d’essai doivent inclure les mêmes traitements (c.-à-d. des dilutions de l’eau de porosité) et devraient comporter le même nombre de répétitions pour chaque traitement (pour faciliter les essais lorsqu’il y a d’importants écarts entre les résultats obtenus pour l’eau de porosité).
Pour le calcul de la CIp, il faut prévoir ≥3 répétitions par traitement (on en recommande 5) et 7 concentrations d’essai (on en recommande un plus grand nombre) (v. 4.1.2, 4.1.3 et 4.5.2).
8.2.3 Paramètres et calculs
Les paramètres des essais sur des liquides provenant de sédiments devraient être conformes aux options et aux démarches énoncées en 4.5 et 6.5.
Pour déterminer statistiquement s’il y a d’importants écarts entre l’eau de porosité de référence et/ou témoin et l’eau de porosité d’essai, on compare le taux de fécondation dans chaque traitement de l’eau de porosité d’essai au traitement équivalent de l’eau de porosité de référence et/ou témoin à l’aide du test-t de DunnettNote de bas de page 81.
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