Méthode d’essai biologique : essai sur la fécondation chez les échinides ou oursins globuleux et oursins plats, chapitre 8

Section 6 : Modes opératoires particuliers pour les essais sur des échantillons d’effluent, de lixiviat et d’élutriat

• 6.1 Prélèvement, étiquetage, transport et entreposage des échantillons
• 6.2 Préparation des solutions d’essai
• 6.3 Eau témoin/de dilution
• 6.4 Observations et mesures au cours de l’essai
• 6.5 Paramètres de l’essai et calculs

La présente section renferme des instructions particulières sur le prélèvement et la préparation d’échantillons d’effluent, de lixiviat et d’élutriat et sur leur emploi dans les essais. Ces instructions s’ajoutent aux procédures exposées à la section 4.

6.1 Prélèvement, étiquetage, transport et entreposage des échantillons

Les contenants utilisés pour le transport et l’entreposage des échantillons d’effluent, de lixiviat ou d’élutriat doivent être fabriqués d’un matériau non toxique. Sont recommandés les contenants souples en polyéthylène ou en polypropylène servant au transport de l’eau potable (p. ex., Reliance^MC). Leur volume peut se contracter pour s’adapter à l’intérieur d’une glacière, et le volume d’air intérieur peut être maintenu au minimum lorsqu’on y prélève des fractions de l’échantillon au laboratoire en vue d’essais toxicologiques ou d’analyses chimiques. Les contenants doivent être soit neufs, soit nettoyés à fond et rincés à l’eau non contaminée. Il faudrait aussi les rincer avec l’échantillon à prélever et les remplir complètement de façon à réduire au minimum le volume d’air libre.

La plupart des essais portant sur un effluent, un lixiviat ou un élutriat seront exécutés « hors site » dans des conditions contrôlées de laboratoire. L’essai devrait être entrepris dans les 24 h suivant le prélèvement, si possible, mais pas plus de 3 jours après. Les échantillons de sédiment ou d’un autre matière solide prélevés en vue de l’extraction puis d’un essai sur l’élutriat devraient aussi être soumis à l’essai le plus tôt possible. L’extraction devrait commencer dans les 2 semaines suivant le prélèvement (idéalement dans la première semaine) et les essais doivent être entrepris au plus tard 6 semaines après le prélèvement (EC, 1994). On devrait se conformer aux modes opératoires décrits dans EC (1994) pour la préparation des élutriats. Les essais portant sur des élutriats doivent commencer dans les 3 jours suivant leur préparation ou dans les délais indiqués dans un règlement ou un protocole.

En général, un échantillon de 2 L convient à un essai à concentrations multiples réalisé hors site, aux analyses chimiques courantes et à tout ajustement ou reprise d’essai. Les essais à concentration unique exigent un volume moindre (v. 4.5.3). Dès le prélèvement, il faut remplir, fermer hermétiquement et étiqueter ou coder chaque contenant. On devrait indiquer sur l’étiquette au moins le type d’échantillon, son origine, la date et l’heure du prélèvement ainsi que le nom de la ou des personnes ayant procédé au prélèvement. On ne devrait pas soumettre à des essais les échantillons arrivant au laboratoire non étiquetés ou non codés, ni utiliser pour les essais courants les échantillons parvenant au laboratoire dans des contenants partiellement remplis, car les toxiques volatils peuvent passer dans le volume d’air. Cependant, s’il sait que la volatilité ne fait pas problème, le responsable de l’essai peut, à son gré, soumettre ces échantillons à des essais.

On doit s’efforcer de garder les échantillons d’effluent ou de lixiviat au frais (1-7 °C, de préférence 4 ± 2 °C) durant le transport. Dès le prélèvement, il faut refroidir à 1-7 °C les échantillons tièdes (>7 °C) à l’aide de glace hydrique (et non de glace sèche) ou de sachets réfrigérants. Au besoin, on doit ajouter dans le contenant de transport des quantités généreuses de glace hydrique, des sachets réfrigérants ou d’autres moyens de réfrigération, afin de maintenir la température de l’échantillon dans la plage de 1-7 °C durant le transport. Les échantillons ne doivent pas geler pendant le transport ou l’entreposage.

Il faut mesurer et consigner la température de l’échantillon dès son arrivée au laboratoire. On peut amener à la température d’essai, immédiatement ou pendant la nuit, une aliquote d’effluent ou de lixiviat dont on a besoin à cette fin et l’utiliser pour l’essai. On doit garder dans l’obscurité le reste de l’échantillon destiné à des essais ultérieurs, dans des contenants fermés hermétiquement, sans espace libre, à 4 ± 2 °C.

À moins d’indication contraire, les élutriats et les échantillons destinés à l’extraction en milieu aqueux puis à l’essai toxicologique devraient être transportés et entreposés dans les conditions précisées ci-dessus.

6.2 Préparation des solutions d’essai

Il faut agiter soigneusement, juste avant de le vider, le contenant dans lequel l’échantillon a été prélevé pour assurer la remise en suspension des matières décantables. Les sous-échantillons (c.-à-d. les échantillons répartis dans ≥2 récipients) doivent être mélangés afin d’assurer leur homogénéité. La teneur en OD et le pH de chaque échantillon doivent être mesurés juste avant l’utilisation. Au besoin, il faudrait pré-aérer l’échantillon (v. 4.3.3) avant de préparer les solutions d’essai et de les répartir dans les enceintes d’essai.

La salinité de chaque échantillon devrait être mesurée avant de commencer l’essai. Si elle est à l’extérieur de la plage considérée acceptable pour l’essai (soit 28-32 g/kg), la salinité de l’échantillon ou de chaque solution d’essai devrait être ajustée en conséquence avec de la SHS naturelle ou artificielle, des sels de mer secs, des sels de qualité réactif (v. 2.3.4 et 4.3.2) ou de l’eau désionisée seulement. Les concentrations nominales d’essai doivent être préparées et consignées en tenant compte de tout ajustement de la salinité.

Normalement, il n’est ni nécessaire ni recommandé de filtrer les échantillons. Cependant, si un échantillon d’effluent ou de lixiviat renferme des débris ou des organismes indigènes qui pourraient être confondus avec les gamètes ou les œufs fécondés ou les attaquer, l’échantillon doit être filtré à travers un tamis à pores de 60 µm avant d’être utilisé (USEPA, 1994). Cette filtration pourrait arrêter une partie des solides en suspension ou décantables, caractéristiques de l’échantillon, qui risquent autrement de contribuer à une partie de la toxicité ou de la modifier. Par exemple, les teneurs élevées en solides biologiques de certains types d’eaux usées traitées peuvent entraîner la formation d’ammoniac et/ou de nitrite et contribuer de ce fait à la toxicité de l’échantillon (Servizi et Gordon, 1986). Il se pourrait aussi qu’une forte teneur en solides en suspension inhibe la fécondation ou endommage directement les gamètes. Si on s’inquiète de l’effet de la filtration sur la toxicité, on devrait effectuer un deuxième essai (simultané) avec un échantillon non filtré.

6.3 Eau témoin/de dilution

Pour les essais de surveillance et de vérification de la conformité réalisés sur des échantillons d’effluent ou de lixiviat, on devrait utiliser, comme eau témoin/de dilution, soit l’eau de mer du laboratoire s’il a été démontré qu’elle donnait invariablement des résultats valides, soit un échantillon d’eau réceptrice. Étant donné que les résultats pourraient différer selon la source, on doit fixer les objectifs de l’essai avant d’effectuer ce choix. On devrait également tenir compte des difficultés et des coûts du transport, car l’utilisation d’eau réceptrice comme eau témoin/de dilution augmente le volume de liquide à expédier au laboratoire. Cependant, les difficultés et les coûts du transport ne seront peut-être pas un facteur important dans ce genre d’analyse à petite échelle.

L’utilisation d’eau réceptrice non contaminée comme eau témoin/de dilution peut être souhaitable s’il faut obtenir de l’information propre au site quant à l’incidence toxique potentielle d’un effluent, d’un lixiviat ou d’un élutriat sur cette eau (v. 4.3.2). Un exemple important d’une telle situation consisterait à mesurer l’effet sublétal d’une substance à la limite d’une zone de mélange, en vertu des exigences réglementaires propres à un lieu donné. Les conditions de prélèvement, de transport et d’entreposage des échantillons d’eau réceptrice devraient être conformes aux directives énoncées en 6.1. Tout échantillon d’eau réceptrice utilisée comme eau témoin/de dilution pour l’essai sur un effluent ou un lixiviat devrait être filtré conformément aux recommandations établies pour l’eau témoin/de dilution naturelle, au moyen d’un tamis à mailles de 60 μm (USEPA, 1994; v. aussi 3.4). Si on utilise un échantillon d’eau réceptrice comme eau témoin/de dilution, il faut préparer une solution témoin distincte avec l’eau de mer du laboratoire normalement utilisée pour les essais sur la fécondation (p. ex., l’eau servant au maintien des organismes; v. 4.1.1).

Pour les essais nécessitant un degré élevé de normalisation, on devrait utiliser de l’eau de mer reconstituée (artificielle) comme eau témoin/de dilution (v. 3.4). Il pourrait s’agir, par exemple, d’essais visant à comparer la toxicité d’un effluent, d’un lixiviat ou d’un élutriat à la toxicité d’échantillons prélevés ou mis à l’essai ailleurs.

Si une SHS artificielle ou naturelle (v. 2.3.4) est ajoutée à l’échantillon ou aux solutions d’essai (v. 6.2), l’essai toxicologique doit inclure une série de témoins (c.-à-d. des témoins de la SHS) dont la salinité est ajustée à la salinité requise pour l’essai (soit 30 ± 2 g/kg) en utilisant uniquement cette SHS et de l’eau désionisée. De même, si on ajoute des sels de mer secs du commerce ou des sels de qualité réactif à l’échantillon ou aux solutions d’essai, il faut prévoir une série de témoins (c.-à-d. des témoins des sels), préparés avec des sels secs dont la source, le lot et la concentration sont identiques à ceux des sels secs ajoutés à l’échantillon d’essai. Une deuxième série de témoins (c.-à-d. des témoins de l’eau de dilution) composés à 100 % d’eau de dilution est requise si l’eau utilisée pour diluer l’échantillon diffère d’une façon quelconque des témoins de la SHS ou des témoins des sels (v. 4.1.1). La salinité de toutes les concentrations d’essai ne devrait pas s’écarter de plus de 1 g/kg de celle des témoins.

Si on souhaite évaluer l’effet total d’eaux usées, y compris leur salinité (faible ou élevée) à des fins de surveillance réglementaire ou autres (dont la recherche), l’essai pourrait être réalisé sans ajustement de la salinité (à 30 ± 2 g/kg) de l’eau témoin/de dilution ou de l’échantillon/des solutions d’essai. Par exemple, on pourrait ajuster la salinité de l’eau témoin/de dilution à celle de l’eau réceptrice ou à 30 ± 2 g/kg, mais sans ajuster la salinité de l’échantillon ou des solutions d’essai. Ce genre d’évaluation devrait inclure un deuxième essai à salinité ajustée et/ou une série de témoins de salinité (v. 4.1.4).

6.4 Observations et mesures au cours de l’essai

Il convient de mesurer le succès de la fécondation conformément aux instructions énoncées en 4.4.

On devrait observer la couleur, la turbidité, l’odeur et l’homogénéité (présence de matières flottantes ou de décantats) de l’échantillon d’effluent, de lixiviat ou d’élutriat, pendant la préparation des solutions d’essai. On devrait consigner toute réaction ou tout changement évident qui survient au cours de la dilution ou pendant l’essai (p. ex., précipitation, floculation, formation de mousse, odeur, changement de couleur, accroissement ou diminution de la turbidité).

Dans le cas des échantillons d’effluent renfermant une quantité appréciable de solides, il est souhaitable de mesurer dès leur réception leur teneur en solides en suspension et en matières décantables (APHA et coll., 1989, 2005), qui font partie de la description globale de l’effluent et qui sont des caractéristiques susceptibles d’influer sur les résultats de l’essai toxicologique.

6.5 Paramètres de l’essai et calculs

Les essais de surveillance et de vérification de la conformité aux exigences réglementaires devraient normalement comprendre ≥3 répétitions par concentration (y compris le témoin) si un essai à concentrations multiples est exécuté et qu’une CI_pest calculée. Un essai comparant des solutions à concentration maximale à une solution témoin (concentration unique) au moyen du test d’hypothèse devrait normalement inclure, à tout le moins ≥4 répétitions. Les modes opératoires pour les essais de vérification de la conformité pourraient préciser qu’une seule concentration (100 % de l’échantillon, à moins d’indication contraire) doit être utilisée ou pourraient exiger la détermination de la CI_p.

Les essais toxicologiques peuvent viser d’autres fins, comme l’identification des sources de toxicité dans une usine ou l’évolution de la toxicité résultant des changements apportés aux procédés ou au traitement des déchets. Ces essais pourraient porter sur des concentrations multiples ou sur une seule concentration (100 % de la concentration d’origine ou une dilution convenable, plus un témoin).

Les essais à concentration unique sont souvent d’un bon rapport coût-efficacité lorsqu’il s’agit de déterminer si on est en présence ou non d’une toxicité mesurable ou d’évaluer préalablement la toxicité relative d’un nombre élevé d’échantillons. Les paramètres à mesurer dépendraient des objectifs, mais ils pourraient englober les cotes arbitraires « satisfaisant » ou « non satisfaisant » ou le taux de réduction de la fécondation à une concentration donnée. On trouvera en 4.5.3 des indications pertinentes sur l’analyse statistique et les comptes rendus consécutifs aux séries d’essais sur différents échantillons évalués chacun à une concentration seulement.