Méthode d’essai biologique : essai sur la fécondation chez les échinides ou oursins globuleux et oursins plats, chapitre 6

Section 4 : Méthodes d’essai universelles

• 4.1 Préparation des solutions d’essai
  • 4.1.1 Eau témoin/de dilution
  • 4.1.2 Concentrations
  • 4.1.3 Répétitions
  • 4.1.4 Témoins
• 4.2 Mise en route et réalisation de l’essai
  • 4.2.1 Collecte des gamètes en vue de l’essai
  • 4.2.2 Préparation de suspensions types de gamètes
  • 4.2.3 Rapport spermatozoïdes:œufs
  • 4.2.4 Exposition des gamètes
• 4.3 Conditions de l’essai
  • 4.3.1 Température
  • 4.3.2 Salinité
  • 4.3.3 Oxygène dissous et aération
  • 4.3.4 pH
• 4.4 Observations et mesures
• 4.5 Paramètres et calculs
  • 4.5.1 Validité de l’essai
  • 4.5.2 Essais à concentrations multipless
  • 4.5.3 Essais à concentration unique
• 4.6 Toxiques de référence
• 4.7 Considérations juridiques

Les méthodes décrites dans la présente section s’appliquent à tous les essais sur les substances chimiques, eaux usées et eaux réceptrices décrits aux sections 5, 6et 7, de même que sur les échantillons liquides extraits d’un sédiment (c.-à-d. eau de porosité) ou d’une matière solide semblable décrits à la section 8. Tous les éléments du système d’essai décrit à la section 3 doivent être incorporés dans ces méthodes d’essai universelles. La liste de contrôle (v. tableau 3) dans laquelle sont résumés les conditions et modes opératoires recommandés comprend non seulement les méthodes universelles, mais aussi celles qui conviennent à des substances ou matières d’essai particulières.

Les méthodes d’essai générales proposées ici comportent certaines variantes, dont 3 durées d’exposition. Dans le premier cas, du sperme est d’abord exposé pendant 10 min, puis pendant 10 autres minutes après ajout des œufs. Cette durée d’exposition type est généralement recommandée. Elle réduirait au minimum le vieillissement des gamètes pendant un essai ou une série d’essais. Une courte période d’exposition conviendrait parfaitement aux programmes d’envergure comportant de nombreux essais visant, par exemple, l’identification des composés toxiques d’un effluent complexe (programmes d’IET). Elle permettrait de procéder à des manipulations successives de l’effluent avant que celui-ci ait vieilli de façon notable.

Dans une deuxième variante, du sperme est d’abord exposé pendant 20 min, puis pendant 20 autres minutes après ajout des œufs. Cette option peut être retenue lorsqu’on souhaite comparer des résultats ou des méthodes d’essai (annexe D). La troisième variante prévoit la période d’exposition la plus longue, soit 60 min pour le sperme, plus 20 min pour le sperme et les œufs; elle convient aux essais qui nécessitent une sensibilité maximale. Elle entraîne toutefois une augmentation de la variabilité des résultats (v. 4.2.4).

On peut également choisir entre 3 volumes de solution d’essai : 10 mL, 5 mL ou 2 mL de chacune des concentrations de l’échantillon. Au Canada, les responsables d’essai utilisent généralement un volume type de 10 mL. Ce volume plus élevé devrait faciliter les manipulations et pourrait permettre d’obtenir un degré de précision relativement plus élevé que de petits volumes. Les essais réalisés avec de petits volumes nécessitent toutefois un moins grand nombre d’adultes pour la production des gamètes, de même qu’un bain-marie ou une enceinte à température constante moins grands. De petits volumes peuvent convenir à certaines études, comme les essais sur les effluents d’usines pilotes, notamment dans le cadre d’un programme d’IET.

Tableau 3. Liste de contrôle des conditions et modes opératoires recommandés et exigés pour les essais

4.1 Préparation des solutions d’essai

On doit nettoyer et rincer à fond tous les récipients, appareils de mesure, dispositifs d’agitation et seaux utilisés pour transférer les organismes, conformément aux méthodes normalisées. Il faudrait utiliser de l’eau témoin/de dilution pour le dernier rinçage de tous les éléments devant servir immédiatement à l’essai. On devrait utiliser de l’eau distillée ou désionisée pour le dernier rinçage des instruments destinés à être entreposés après le séchage.

4.1.1 Eau témoin/de dilution

La même eau témoin/de dilution doit servir à la préparation du témoin et de toutes les concentrations d’essai. Il faut mélanger toutes les solutions d’essai avec une tige en verre, un agitateur en Téflon^MC ou tout autre instrument fait d’un matériau non toxique. Avant de procéder à l’essai, la température de l’eau témoin/de dilution et de l’échantillon ou de chaque solution d’essai doit être ajustée au besoin à ± 1 °C de la température recommandée pour l’essai. Il ne faut pas utiliser de thermoplongeur pour réchauffer les échantillons ou les solutions d’essai, car cela pourrait en altérer les composants chimiques et la toxicité. Il faudra peut-être ajuster la salinité ou le pH de l’échantillon de la substance d’essai ou des solutions d’essai (v. 4.3.2 et 4.3.4) ou procéder à une préaération (v. 4.3.3).

L’eau témoin/de dilution peut provenir de la source d’approvisionnement direct du laboratoire en eau de mer naturelle non contaminée, de l’eau « d’amont » (c.-à-d. des eaux réceptrices) prélevée à un endroit précis à l’étude, ou de l’eau de mer reconstituée (artificielle) (v. 2.3.4 et 3.4). On peut, au besoin, porter l’eau de mer à la salinité voulue (30 ± 2 g/kg) par ajout de sels de mer secs du commerce (p. ex., Instant Ocean^MC, Red Sea Salt^MC), de sels de qualité réactif (p. ex., GP2 modifié; v. Bidwell et Spotte, 1985, ou le tableau 2 dans USEPA, 1994 ou 1995) ou de SHS naturelle ou artificielle, ou encore par ajout d’eau désionisée. La SHS, les sels de mer secs ou les sels de qualité réactif doivent provenir de la même source que ceux utilisés pour ajuster la salinité de l’échantillon d’essai ou des solutions d’essai (v. 5.2 et 6.2).

Si la salinité de l’échantillon/des solutions d’essai est ajustée avec de la SHS, l’essai toxicologique doit inclure une série de témoins (témoins de la SHS) préparés uniquement avec cette SHS et de l’eau désionisée et ajustés à la salinité d’essai (30 ± 2 g/kg). De même, si on ajoute des sels de mer secs du commerce ou des sels de qualité réactif à l’échantillon ou aux solutions d’essai, l’essai toxicologique doit inclure une série de témoins (témoins des sels) préparés avec des sels secs provenant de la même source et du même lot et ayant la même concentration que ceux ajoutés à l’échantillon d’essai. Il faut prévoir une deuxième série de témoins (témoins de l’eau de dilution), constitués uniquement d’eau de dilution, si l’eau utilisée pour diluer l’échantillon diffère d’une façon ou d’une autre des témoins de la SHS ou des témoins des sels (p. ex., eau de mer naturelle avec ou sans SHS ou sels secs ajoutés, ou eau douce naturelle avec SHS ou sels secs ajoutés) (v. 4.1.4).

Si on doit entreposer de l’eau de mer naturelle, on devrait la conserver à une température égale ou inférieure à la température d’essai et l’utiliser dans un délai de ≤3 jours.

Les portions d’eau de mer (c.-à-d. l’eau témoin/de dilution ou l’eau de porosité témoin/de référence) servant à déterminer la densité du sperme (v. 4.2.2) et le rapport spermatozoïdes:œufs qui convient à l’essai (v. 4.2.3) devraient être filtrées pour éliminer les solides pouvant interférer avec la numération spermatique. La filtration est particulièrement importante si on utilise de l’eau de mer naturelle. On recommande d’utiliser à cette fin un filtre à pores de ~60 µm (USEPA, 1994). L’eau filtrée devrait être utilisée dans un délai de ≤3 jours.

On utilise parfois de l’eau réceptrice comme eau témoin/de dilution afin de simuler certaines conditions locales, comme le rejet d’effluents, le déversement de substances chimiques ou la pulvérisation de pesticides. Dans ce cas, on doit préparer un deuxième témoin à partir de l’eau de mer du laboratoire dans laquelle on a maintenu les adultes (v. 4.1.4). Il ne faut toutefois pas utiliser d’eau réceptrice d’« amont » si elle est manifestement toxique et si les résultats obtenus avec le témoin ne sont pas valides, selon les critères qui régissent cet essai sur la fécondation^{Note de bas de page 15}. Le cas échéant, on devrait utiliser comme eau témoin/de dilution l’eau de mer reconstituée (v. 2.3.4) ou l’eau de mer naturelle du laboratoire. On pourrait également utiliser l’eau du laboratoire s’il est impossible de prélever et d’utiliser de l’eau réceptrice^{Note de bas de page 17}.

4.1.2 Concentrations

Dans tout essai visant à évaluer la CI_p par analyse de régression (v. 4.5.2), on doit préparer au moins 7 concentrations d’essai et 1 solution témoin (constituée uniquement d’eau témoin/de dilution); un plus grand nombre de traitements (≥10, plus un témoin) est toutefois recommandé. On peut utiliser une série de dilutions géométriques dans laquelle chaque concentration de la solution d’essai équivaut à environ la moitié de la précédente (p. ex., 100, 50, 25, 12,5, 6,3, 3,1, 1,6, etc.). On peut également choisir des concentrations d’essai dans d’autres séries de dilution (p. ex., 100, 75, 56, 42, 32, 24, 18, 13, 10, 7,5; v. annexe F, colonne 7). Il n’est pas conseillé d’utiliser un coefficient de dilution aussi bas que 0,3 (p. ex., concentrations de 100, 30, 9, etc.) pour les essais courants, car l’estimation de la toxicité serait peu précise; toutefois, on peut utiliser un tel coefficient si une grande incertitude entoure la plage des concentrations susceptibles d’être toxiques.

On prépare d’abord chacune des concentrations et on ajoute aux récipients d’essai de répétition le volume choisi (10 mL, 5 mL ou 2 mL). Les concentrations nominales des solutions (ou concentrations mesurées; v. 5.4) sont utilisées comme concentrations d’essai. On ne tient pas compte de la légère diminution de la concentration imputable à l’ajout des aliquotes de sperme en suspension^{Note de bas de page 17}. La concentration nominale à laquelle le sperme est exposé est adoptée pour tout l’essai. La concentration diminue de ~9 % dans la dernière partie de l’essai, c’est-à-dire après ajout des œufs en suspension, mais aux fins de la caractérisation de l’essai, on utilise les concentrations initiales auxquelles le sperme a été exposé^{Note de bas de page 18}.

Si une grande incertitude entoure la toxicité de l’échantillon, il peut être utile de procéder à un essai de délimitation d’une plage de valeurs ou à un prétest dans le seul but de choisir les concentrations à utiliser pour l’essai définitif. Dans un tel cas, les conditions et modes opératoires n’ont pas à être observés à la lettre. L’utilisation d’une large plage de concentrations (p. ex., de ≥2 ordres de grandeur) devrait faciliter le choix des concentrations pour l’essai réel.

On pourrait se servir d’essais à concentration unique à des fins réglementaires (p. ex., pour des essais à résultat unique). Dans ce cas, il faudrait normalement utiliser un effluent, un lixiviat, une eau réceptrice, un élutriat ou un autre extrait aqueux (eau de porosité) non dilué provenant d’un sédiment ou d’un autre solide semblable, ou une concentration arbitraire ou recommandée d’une substance chimique. L’utilisation de témoins devrait suivre les mêmes règles que pour les essais à concentrations multiples. Le présent document ne décrit pas les essais à concentration unique, mais les modes opératoires sont évidents et tous les conseils donnés ici s’appliquent, sauf que l’essai porte sur une seule concentration et sur un seul témoin.

4.1.3 Répétitions

Dans le cas d’un essai à concentrations multiples comportant par ailleurs la détermination de la CI_p, chaque traitement, y compris le ou les témoins, doit comporter ≥3 récipients d’essai de répétition, mais un nombre supérieur est recommandé (à savoir 5 récipients). S’il s’agit plutôt d’un essai à concentration unique (ou faisant appel à de multiples solutions à concentration maximale) assorti d’un test d’hypothèses^{Note de bas de page 19}, chaque traitement, y compris le ou les témoins, doit inclure ≥4 récipients de répétition^{Note de bas de page 20}, mais un nombre supérieur est recommandé.

4.1.4 Témoins

Tous les essais exigent une exposition témoin faisant appel à l’eau témoin/de dilution (témoin de l’eau de dilution) utilisée pour préparer les concentrations d’essai. Une série distincte de témoins, composés uniquement de SHS ou de sels secs dans de l’eau désionisée dont la salinité est de 30 ± 2 g/kg (v. 2.3.4 et 4.1.1), est requise si de la SHS ou des sels secs sont ajoutés à l’échantillon d’essai ou aux solutions d’essai (v. 4.3.2) et si l’eau de dilution diffère d’une manière quelconque de ce témoin de la SHS ou de ce témoin des sels. Chaque témoin doit comporter le même nombre de répétitions (≥3), comme chacune des autres solutions d’essai. Il faut examiner les résultats obtenus en regard de chaque témoin de l’eau de dilution, témoin de la SHS ou témoin des sels employé dans un essai toxicologique afin de déterminer s’ils sont indépendamment conformes au critère propre à l’essai ou au critère de validité de l’essai (v. 4.5.1). Lorsque 2 séries de solutions témoins sont utilisées (c.-à-d. des témoins de la SHS ou témoins des sels et témoins de l’eau de dilution), les résultats de l’essai toxicologique sont considérés comme valides et acceptables à la condition que chaque série soit indépendamment conforme au critère de validité qui lui est propre (v. EC, 2001 et 2005; v. aussi 4.5.1). Si, et seulement si, les 2 séries de témoins sont conformes au critère de validité de l’essai et que les résultats obtenus pour chacune ne sont statistiquement pas différents d’une série à l’autre, on peut regrouper (au besoin) ces résultats avant le calcul des paramètres statistiques pour chaque série de concentrations d’essai en comparaison des solutions témoins. Il ne faut pas procéder à un tel regroupement avant de déterminer si les résultats de l’essai sont valides ou non (EC, 2001). Si le test-t (EC, 2005) révèle que les résultats obtenus chez les témoins sont statistiquement différents, on ne doit pas regrouper les données - on utilise plutôt les témoins les plus pertinents pour calculer les paramètres statistiques.

Si, pour une raison ou pour une autre, la salinité des solutions d’essai se situe hors de la plage exigée de 28-32 g/kg, on devrait inclure des témoins de la salinité dans l’essai. Si des échantillons constitués essentiellement d’eau douce (salinité de ≤5 g/kg) ont été soumis à l’essai sans ajustement de la salinité, on devrait préparer des témoins de la salinité en ajoutant, dans les mêmes proportions que pour les liquides d’essai, de l’eau désionisée ou de l’eau distillée à une série de récipients. Ces témoins indiquent l’effet d’une faible salinité, mais non l’exacerbation de l’effet qui résulte de l’interaction entre une faible salinité et les substances ou matières toxiques présentes dans l’échantillon (v. 4.3.2).

Lorsqu’on a recours à un solvant pour l’essai sur une substance chimique très peu soluble, on doit préparer une répétition du « témoin du solvant », et ce témoin doit correspondre à la plus forte de toutes les concentrations utilisées pour l’essai.

Si de l’eau réceptrice est utilisée comme eau témoin/de dilution, on doit préparer une deuxième série de témoins à partir de l’eau de mer (artificielle ou naturelle) du laboratoire servant au maintien des adultes (v. 2.3.4).

D’autres types de témoins ne sont pas exigés, mais il est recommandé d’en prévoir pour mieux juger de la qualité des résultats de l’essai. Un témoin à « faible concentration spermatique », par exemple, ne contiendrait que la moitié du sperme utilisé pour l’essai et permettrait de détecter une surconcentration spermatique, problème courant dans cet essai. Si on obtient un taux de fécondation de >90 % avec le témoin type et que le taux obtenu avec le témoin à faible concentration spermatique n’est pas inférieur de 5 % à cette valeur, cela signifie qu’il y a surconcentration spermatique, laquelle est associée à une sensibilité médiocre de l’essai. Un « témoin toxique-œufs » contient une forte concentration du toxique, mais pas de sperme; il permet de déterminer si l’échantillon soumis à l’essai entraîne la formation de fausses membranes de fécondation. Un « témoin à blanc » contenant des œufs mais pas de sperme peut révéler une contamination accidentelle des œufs par le sperme (Chapman, 1991).

4.2 Mise en route et réalisation de l’essai

On doit provoquer le frai de plusieurs échinides afin de recueillir le sperme. On peut combiner le sperme de tous les organismes avant de commencer l’essai. On procède de la même façon pour les œufs. Le sperme est exposé pendant 10, 20 ou 60 min à la substance ou à la matière d’essai placée dans chaque récipient. On ajoute ensuite un nombre approprié d’œufs dans chaque récipient et on poursuit l’exposition pendant 10 ou 20 min pour permettre la fécondation. Finalement, on ajoute un agent de conservation dans tous les récipients pour mettre fin à l’exposition.

4.2.1 Collecte des gamètes en vue de l’essai

Idéalement, le sperme devrait provenir de ≥3 échinides mâles adultes de l’espèce choisie et les œufs, de ≥3 femelles. Étant donné que le sperme ou les œufs d’un organisme donné peuvent être particulièrement sensibles ou, à l’inverse, tolérants, on devrait chercher à obtenir des unités expérimentales homogènes (c.-à-d. éviter des variations en lien avec les parents). La seule façon pratique de procéder consiste à combiner les gamètes mâles ou femelles provenant de parents différents avant de les transférer dans les récipients d’essai; toutefois, la combinaison de gamètes de bonne qualité et de qualité médiocre peut nuire au succès de la fécondation. En conséquence, il faut vérifier les gamètes (v. paragraphe suivant) de chaque mâle et de chaque femelle afin de s’assurer que seuls les gamètes de bonne qualité serviront à l’essai. Si on ne peut obtenir des gamètes de bonne qualité de 3 adultes de chaque sexe (v. paragraphe suivant) et/ou si, en plus de la vérification des gamètes, on procède à un prétest avec une combinaison de gamètes de ≥2 mâles et ≥2 femelles (v. description en 4.2.3), il est possible d’utiliser les gamètes d’un seul adulte de chaque sexe (c.-à-d. le mâle et la femelle dont les gamètes ont donné de bons résultats sur le plan de la fécondation une fois combinés aux fins de la vérification des gamètes et du prétest).

Il faut vérifier les gamètes pour s’assurer que le sous-échantillon de gamètes des mâles et des femelles adultes choisis comme sources probables de sperme et d’œufs pour l’essai présente un taux de viabilité élevé. Pour ce faire, on choisit 3-5 femelles et ≥3 mâles dont on examinera les gamètes respectifs au microscope. On provoque le frai de chaque organisme et on dépose les gamètes dans des récipients distincts. On conserve séparément le sperme de chaque mâle sur de la glace. On en dilue une petite quantité avec de l’eau témoin/de dilution sur une lame pour évaluer au microscope la motilité des spermatozoïdes. On examine également au microscope les œufs de chaque femelle. Les œufs de qualité médiocre sont petits, vacuolisés et de forme irrégulière. On transfère ensuite dans plusieurs flacons à scintillation de petites aliquotes d’œufs de chaque femelle dont les œufs sont de « bonne qualité ». On féconde des groupes distincts d’œufs provenant de chaque lot de « bonne qualité » avec quelques gouttes de sperme dilué provenant lui aussi de lots de « bonne qualité ». Par exemple, si l’examen porte sur les gamètes de 4 femelles et de 3 mâles, on prépare 3 flacons d’œufs par femelle (c.-à-d. un flacon d’œufs pour chaque mâle dont on a provoqué le frai). On verse dans chaque flacon 5-7 gouttes de sperme légèrement dilué (soit 20-50 µL de sperme concentré ou « sec » dans 10 mL d’eau de mer filtrée) de l’un des 3 mâles (les œufs de chaque flacon sont fécondés avec le sperme d’un mâle différent). Après 10 min, on observe au microscope chaque mélange de sperme et d’œufs. On évalue la qualité du sperme d’après la motilité, l’activité et l’agglutination des spermatozoïdes et d’après le succès de la fécondation. On évalue la qualité des œufs d’après leur forme, leur couleur et leur taille et d’après le succès de la fécondation.

Le nombre d’œufs fécondés dans chaque flacon devrait également être examiné. Si ce nombre est élevé (95-100 %) dans un flacon en particulier et qu’un prétest (v. 4.2.3) est réalisé avec des gamètes du même lot (c.-à-d. les gamètes de chaque mâle et de chaque femelle, déposés sur de la glace) afin de déterminer le rapport spermatozoïdes:œufs optimal, on peut alors utiliser pour l’essai définitif les lots originels de sperme du mâle et d’œufs de la femelle pour lesquels les aliquotes combinées (sous-échantillons) affichaient un taux de fécondation élevé. Si un laboratoire choisit de ne pas effectuer de prétest pour déterminer le rapport spermatozoïdes:œufs « optimal », il doit utiliser les gamètes combinés de ≥3 mâles et de ≥3 femelles, gamètes dont la bonne qualité a été établie au cours de la vérification. Seuls des gamètes de bonne qualité sont combinés et utilisés dans l’essai^{Note de bas de page 21}. S’il est impossible d’obtenir des gamètes de qualité de 3 mâles et de 3 femelles, on peut réduire le nombre d’adultes, mais il faudra effectuer, avant l’essai définitif, un prétest qui permettra d’établir le rapport spermatozoïdes:œufs optimal pour un lot donné de gamètes, ce qui accroîtra la probabilité du succès de la fécondation chez les témoins. Selon Chapman (1992a), la haute qualité des gamètes est plus importante que leur combinaison.

On provoque le frai en injectant aux adultes du chlorure de potassium (KCl)^{Note de bas de page 22}. On injecte aux oursins globuleux 0,5-1,0 mL de KCl 0,5 M à travers la membrane du péristome (c.-à-d. entre la lanterne d’Aristote et le test) selon un angle allant vers l’extérieur du test, dans le cœlome (v. figure 2)^{Note de bas de page 23}. La dose de KCl peut être divisée et injectée dans plusieurs endroits autour de la lanterne d’Aristote; on peut aussi secouer doucement l’oursin afin de répartir la dose dans son organisme. Dans le cas des oursins plats, on injecte, à un angle, 0,5 mL de la même solution dans la bouche. Une seringue à tuberculine munie d’une aiguille de calibre 25 convient parfaitement. On peut aussi stimuler le test pendant 30 s au moyen d’électrodes dans lesquelles passe un courant continu de 12 V^{Note de bas de page 24}, mais cette méthode semble fonctionner pour l’oursin violet de l’Atlantique seulement.

La technique privilégiée et recommandée pour recueillir le sperme des oursins globuleux est la « collecte à sec ». Une fois le sperme mouillé, sa viabilité diminue grandement (v. note 25). Le sperme devrait donc être recueilli à sec pour qu’il reste viable aux fins de la vérification des gamètes et du prétest (v. 4.2.3), puis de l’essai définitif. Il faut prendre bien soin d’éviter que le sperme « sec » soit contaminé par l’eau ou par la solution de KCl injectée aux organismes pour provoquer le frai. Une des techniques de collecte à sec consiste à placer un mâle adulte, face aborale vers le bas, dans un bécher sec ou une boîte de Petri sèche. On recueille ensuite le sperme au fond du contenant (plutôt qu’à la surface de l’animal). Une autre technique consiste à déposer les mâles sur leur face orale dans un bécher, puis à ajouter de l’eau témoin/de dilution jusqu’à mi-hauteur du test. Le sperme, qui est exsudé par les pores et qui s’accumule sur la surface de l’organisme, est recueilli à l’aide d’une micropipette, transféré dans une petite éprouvette munie d’un bouchon ou d’un couvercle, puis conservé sur de la glace. Ici encore, il faut s’assurer que la surface sur laquelle le sperme sera libéré (c.-à-d. le fond d’une boîte de Petri ou la surface de l’oursin) est sèche pour éviter de mouiller le sperme et, ainsi, de l’activer. On peut procéder de la même façon pour recueillir les œufs, mais ceux-ci devraient être rincés avant d’être entreposés conformément aux indications ci-dessous.

Les clypéastres excentriques pourraient ne pas produire une quantité suffisante de sperme lorsqu’on utilise la technique de collecte à sec. On peut provoquer le frai de ces clypéastres dans un volume minimal d’eau de mer (5 mL)^{Note de bas de page 25}, mais il serait préférable de les suspendre au-dessus de la colonne d’eau. (Il a été constaté que les oursins plats ne fraient pas si leur face aborale est en contact direct avec le fond d’une boîte de Petri rincée à l’eau de mer.)

Si on provoque le frai dans de l’eau, on place l’organisme sur sa face aborale dans un petit bécher d’une capacité de 50-250 mL ou d’une taille appropriée, entièrement rempli d’eau témoin/de dilution à la température d’essai. Une fois le sperme ou les œufs libérés, on extrait le plus d’eau possible. On peut aussi placer les femelles sur leur face orale dans un récipient contenant juste assez d’eau témoin/de dilution pour couvrir le test à hauteur de ~1 cm. Les œufs sont ensuite recueillis sur la surface du test, puis transférés dans un petit bécher ou un autre récipient approprié.

Si le frai ne se produit pas dans les 5-10 min suivant l’injection, on peut faire une deuxième injection, mais cela peut amener les organismes à libérer des gamètes immatures ou de qualité médiocre. L’adulte devrait libérer le sperme ou les œufs sous la forme d’un filet continu, moins de 30 min après la dernière injection. Le sperme libéré dans l’eau prend l’aspect d’un filet dense et blanc, alors que les œufs ont un aspect granulaire et sont généralement de couleur pastel (rosâtre chez les oursins plats). Il arrive parfois que des produits colorés soient exsudés avant ou pendant le frai, mais il ne faudrait pas les confondre avec les gamètes.

La collecte des gamètes devrait prendre fin 15 min après le début de leur libération. Il faudrait recueillir suffisamment de gamètes des mêmes organismes pour la vérification des gamètes, le prétest et l’essai définitif. Les différents prélèvements de gamètes provenant du même organisme sont normalement combinés à l’aide d’une pipette. Pour la manipulation des œufs, beaucoup de responsables d’essai se servent de micropipettes en plastique, d’une capacité de 1 mL, qu’ils amputent de 2-3 mm à l’aide d’un scalpel afin d’obtenir un diamètre de 1 mm et de réduire ainsi les risques de dommage aux œufs.

Le sperme recueilli à sec peut être conservé sur de la glace^{Note de bas de page 26} pendant 4 h avant d’être « activé » dans de l’eau de mer; il peut ensuite être utilisé dans un délai de 30-120 min^{Note de bas de page 27}. Si on recueille le sperme dans des béchers remplis d’eau de mer, on devrait commencer l’essai dans les 30-120 min après la fin de la collecte. Dans l’intervalle, il faut le conserver dans une quantité minimale d’eau, sur de la glace.

On rince les œufs à 3 reprises. On ajoute d’abord 100 mL d’eau témoin/de dilution, on mélange, on laisse reposer 10 min, puis on décante. Si on recueille une substance pigmentée en même temps que les œufs, il serait indiqué de rincer ces derniers aussitôt que possible après la collecte, car cette substance peut être toxique pour l’oursin violet du Pacifique et, dans certains cas, pour d’autres espèces^{Note de bas de page 28}. Les œufs peuvent être conservés dans la dernière eau témoin/de dilution, à la température d’essai, pendant au plus 4 h avant leur utilisation. On recommande d’aérer légèrement les œufs pendant ce temps.

4.2.2 Préparation de suspensions types de gamètes

On combine le sperme des oursins globuleux ou des oursins plats choisis après vérification des gamètes (v. 4.2.1) afin d’obtenir une suspension concentrée de sperme de qualité. Si le sperme a été recueilli dans des béchers remplis d’eau, on doit le prélever sur le fond des béchers à l’aide d’une pipette. Le sperme devrait être transféré lentement (pour ne pas provoquer de cavitation) à l’aide d’une micropipette (diamètre de ≥1 mm) et déposé dans l’eau en vidant la pipette et en la rinçant à plusieurs reprises avec l’eau dans laquelle on dépose le sperme.

La densité spermatique de la suspension initiale est évaluée à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un autre appareil de numération cellulaire d’une capacité de grossissement de 400 fois^{Note de bas de page 29}. Pour ce faire, on dilue 100-10 000 fois (selon la concentration du sperme) une petite quantité (0,1-1 mL) de la suspension avec de l’acide acétique cristallisable à 10 %, préparé avec de l’eau témoin/de dilution. Il faut ensuite mélanger en retournant 10 fois le récipient, puis attendre que les bulles disparaissent, ce qui prend 1-2 min. On place une goutte du mélange dans la chambre de numération de l’hémocytomètre et on attend 15 min afin que les spermatozoïdes se déposent. Il faut compter les spermatozoïdes qui se trouvent dans les 400 petits carrés du milieu. On calcule le nombre de spermatozoïdes présents dans 1 mL de suspension initiale à l’aide de l’équation suivante : (facteur de dilution) × (nombre de spermatozoïdes) × (facteur de conversion de l’hémocytomètre) × (facteur de conversion des millimètres cubes en millilitres) ÷ (nombre de carrés comptés). Si on utilise un hémocytomètre type (Neubauer), l’équation est la suivante :

nombre de spermatozoïdes/mL = 100 × (spermatozoïdes dénombrés) × 4 000 × 1 000 ÷ 400

Il faut amener la concentration de la suspension initiale de sperme à la concentration désirée pour une suspension type, en utilisant de l’eau témoin/de dilution^{Note de bas de page 30}. La concentration de cette suspension type est déterminée par le rapport spermatozoïdes:œufs choisi (v. 4.2.3).

Pour la numération spermatique, on peut aussi avoir recours à la turbidité ou à la densité optique comme indicateur du nombre de spermatozoïdes/mL, sans utiliser l’hémocytomètre. Cette technique présente l’avantage d’accélérer le processus, car cette mesure ne demande que quelques minutes, alors que la numération à l’aide d’un hémocytomètre demande 20-30 min (NCASI, 1992). Elle permet donc de commencer l’essai plus rapidement après la collecte des gamètes. Dans un tube de spectrophotométrie de 1 cm, on mélange la solution concentrée de sperme à de l’eau témoin/de dilution juste avant de commencer l’essai. On peut utiliser des turbidimètres types conçus pour l’analyse d’échantillons d’eau. Selon le NCASI (1992), une plage de 2,0-4,0 unités de turbidité néphélométrique (uTN) correspond à la concentration spermatique souhaitée. Une teneur de 2,5 millions de spermatozoïdes/mL serait associée à ~3,0 uTN chez le clypéastre excentrique et à ~2,7 uTN chez l’oursin violet du Pacifique. Les mesures de la turbidité offrent une précision presque aussi élevée que la numération. Le NCASI (1992) a établi que le CV moyen des résultats de numérations répétées à l’aide d’un hémocytomètre était de ~9 % lorsque les dilutions de sperme provenaient d’un seul organisme et de 12 % lorsqu’elles provenaient de 3 mâles (5 uTN dans les 2 cas). Au moment de la préparation du présent document, aucun autre laboratoire n’était en mesure de fournir une évaluation de l’analyse turbidimétrique. Le dernier critère permettant de déterminer si l’évaluation turbidimétrique de la densité spermatique a donné des résultats satisfaisants serait le taux de fécondation chez le témoin pendant l’essai par rapport au critère de validité de ≥60 % et de <98 % de fécondation (v. 4.5.1).

On peut choisir le volume type initial de 10 mL, ou encore un volume de 5 mL ou de 2 mL pour l’essai. La concentration de gamètes étant la même dans tous les cas, on ajoute donc au volume choisi une quantité proportionnelle de la suspension de gamètes. Ainsi, dans le volume le plus élevé (10 mL), on ajoute 0,1 mL de la suspension spermatique et 1,0 mL de la suspension d’œufs. (Le tableau 4 indique le nombre de gamètes et le volume de la suspension à ajouter aux 3 volumes d’essai.)

Le nombre de spermatozoïdes apparaissant dans les colonnes 4/5 et 7 est déterminé par des rapports spermatozoïdes:œufs de 200:1 et de 2 500:1 choisis à titre d’exemples.

Les présentes recommandations quant au nombre de gamètes à ajouter aux solutions et quant aux méthodes à employer s’appliquent à un essai où on utilise un volume initial de 10 mL. On doit d’abord calculer la concentration souhaitée pour la suspension de sperme. Avec un volume de 10 mL, on utilise ~2 000 œufs et le rapport spermatozoïdes:œufs se situe le plus souvent entre 50:1 et 2 500:1 (v. 4.2.3), bien qu’il puisse parfois atteindre ≥20 000:1. S’il se situe entre 50:1 et 2 500:1, le nombre de spermatozoïdes nécessaire variera de 100 000 à 5 millions. Puisqu’on ajoute 0,1 mL de la suspension spermatique, la concentration de spermatozoïdes de la suspension type devra normalement se situer entre 1 million et 50 millions/mL^{Note de bas de page 31}.

On peut facilement déterminer les dilutions à utiliser grâce à l’équation type suivante :

C1 × V1 = C2 × V2

« concentration 1 × volume 1 = concentration 2 × volume 2 ».

Par exemple, si la numération révèle que la concentration de la suspension initiale est de 125 millions de spermatozoïdes/mL et qu’on désire utiliser 5 mL d’une suspension type dont la concentration est de 40 millions/mL, on pourrait calculer comme suit le volume nécessaire (V1) de la suspension initiale qui devra être porté à 5 mL :

125 × V1 = 40 × 5, donc V1 = 1,6 mL.

On détermine la densité de la suspension d’œufs en procédant à une numération, puis on prépare une solution dont la concentration est de 2 000 œufs/mL.

Pour la numération, on ajoute 1 mL ou moins de la suspension à une cellule de Sedgwick-Rafter et on l’observe sous un grossissement de 20-100 fois. Il peut être utile de diluer 10 fois, 100 fois ou même 1 000 fois une aliquote pour la numération. À mesure qu’on gagne de l’expérience, on peut diluer la suspension initiale en se fondant simplement sur son aspect, jusqu’à l’obtention d’une concentration de quelques centaines d’œufs/mL pour ensuite compter le nombre d’œufs présents dans 0,5 mL. Toute autre technique de numération jugée efficace peut être utilisée. Il est possible d’ajuster la densité de la suspension de façon à atteindre une concentration de 2 000 œufs/mL en y ajoutant de l’eau témoin/de dilution ou, s’il faut augmenter sa densité, en laissant les œufs sédimenter avant d’extraire l’eau de la suspension.

Pour un volume d’essai de 5 mL, on procède exactement de la même façon, mais on ajoute de plus petits volumes de la suspension de gamètes aux récipients d’essai (tableau 4), soit 0,05 mL de la suspension spermatique (contenant généralement 2-25 millions de spermatozoïdes, selon le rapport spermatozoïdes:œufs souhaité) et 0,5 mL de la suspension d’œufs (contenant 1 000 œufs).

Pour un volume initial de 2 mL, on réduit proportionnellement le volume des suspensions de gamètes : 0,02 mL de la suspension spermatique (contenant généralement 0,8-10 millions de spermatozoïdes) et 0,2 mL de la suspension d’œufs (contenant ~400 œufs).

4.2.3 Rapport spermatozoïdes:œufs

Chaque laboratoire devrait procéder à un prétest afin de déterminer le rapport optimal spermatozoïdes:œufs, soit celui qui produit un taux de fécondation de 80 % dans des conditions contrôlées^{Note de bas de page 32}. Si les taux de fécondation étaient très faibles chez les témoins, il pourrait être difficile de faire la distinction entre les effets d’un toxique sur la fécondation et une performance généralement médiocre et variable en l’absence du toxique de référence. Toutefois, des taux de fécondation élevés peuvent indiquer une surconcentration de spermatozoïdes susceptible de masquer, en le compensant partiellement, l’effet du toxique, ce qui réduit la sensibilité de l’essai et augmente la CI₂₅^{Note de bas de page 33}. On dispose de plusieurs méthodes pour établir le rapport spermatozoïdes:œufs qui convient puisque le critère de conformité d’un essai est le taux de fécondation réel chez le témoin, qui doit se situer entre ≥60 % et <98 % (limites de contrôle) pour que l’essai soit valide (v. 4.5.1).

D’après la documentation, les rapports spermatozoïdes:œufs se situant entre 50:1 et 2 500:1 donnent des taux de fécondation satisfaisants pour les espèces d’essai (v. annexe D). Les rapports qui suivent, signalés par les laboratoires du Canada et des États-Unis ayant participé à une enquête récente (v. 1.1), ont permis d’obtenir un taux de fécondation de 70-90 % : oursin vert, 2 000:1 et jusqu’à 5 000:1^{Note de bas de page 34}; oursin violet du Pacifique, généralement entre 100:1 et 500:1, mais aussi peu que 2:1 et jusqu’à 2 000:1; clypéastre excentrique, souvent autour de 200:1 et jusqu’à 400:1, mais aussi entre 50:1 et 6 000:1 selon des sources fiables; oursin blanc, généralement 20 000:1; oursin violet de l’Atlantique, 2 500:1. Des lignes directrices aussi sommaires ne peuvent toutefois pas garantir l’obtention de résultats satisfaisants par tous les laboratoires et pour toutes les périodes du frai. Des essais interlaboratoire canadiens, par exemple, ont montré que le rapport spermatozoïdes:œufs devait parfois être 10 fois supérieur aux valeurs mentionnées ci-dessus (Miller et coll., 1992).

Idéalement, on devrait établir le rapport spermatozoïdes:œufs approprié immédiatement avant chaque essai, en se servant des gamètes qui seront utilisés dans l’essai. On peut écourter et simplifier le prétest en adoptant 1-2 rapports jugés relativement bas. En se fondant sur les résultats obtenus, on pourrait porter le nombre de gamètes qu’on désire utiliser sur une « courbe du succès de la fécondation » construite à partir des expériences antérieures du laboratoire, ce qui permettrait de choisir un rapport approprié au moment de procéder à l’essai proprement dit.

Un autre prétest peut être effectué pour déterminer le rapport spermatozoïdes:œufs à utiliser pour obtenir un taux de fécondation de 80 % chez les témoins (Carr et Chapman, 1995)^{Note de bas de page 35}. Ainsi, on fait appel à deux répétitions de l’eau témoin/de dilution et à une répétition de chacune des 3 concentrations d’un toxique de référence en regard desquelles chaque rapport spermatozoïdes:œufs (c.-à-d. 5) sera mesuré afin de déterminer celui qui sera « optimal » pour l’essai. Les rapports spermatozoïdes:œufs employés dans le prétest devraient couvrir une plage étendue de concentrations spermatiques (p. ex., écart d’un ordre de grandeur entre chacune). On exécute le prétest de la même façon que l’essai habituel, avec ajout d’une aliquote adéquate de sperme dans chaque flacon, puis ajout des œufs après le temps d’exposition qui convient. Une fois le pourcentage de fécondation établi pour tous les rapports spermatozoïdes:œufs de chaque traitement, on se base sur le taux de fécondation obtenu dans l’eau témoin/de dilution (taux ciblé : 80 %) pour choisir le rapport spermatozoïdes:œufs qui maximisera la possibilité d’obtenir, avec le toxique de référence, des résultats qui se situeront à l’intérieur des limites de la zone de confiance de la carte de contrôle. Cette façon de procéder permet de choisir le rapport spermatozoïdes:œufs affichant la sensibilité qui convient quant au taux de fécondation optimal ciblé chez les témoins.

Il est recommandé de procéder à ce prétest pour les essais sur l’eau de porosité. Il faudrait prévoir 2 répétitions de l’eau de porosité témoin (v. 8.1.4) en plus des 2 répétitions de l’eau témoin/de dilution et de 1 répétition de chacune des 3 concentrations du toxique de référence (v. plus haut)^{Note de bas de page 36}. On peut combiner le prétest à une vérification étendue des gamètes en ayant recours à des combinaisons données de gamètes de mâles et de femelles individuels (p. ex., le sperme de chacun des mâles est mis à l’essai avec les œufs de chacune des femelles pour déterminer quelle combinaison de gamètes affiche la meilleure qualité; v. 4.2.1). Ainsi, une fois les gamètes de chaque mâle et de chaque femelle combinés selon le bon rapport spermatozoïdes:œufs, on obtient le taux idéal de fécondation chez les témoins, de même que la sensibilité adéquate en regard du toxique de référence (en d’autres termes, les résultats se situeront à l’intérieur des limites de la zone de confiance de la carte de contrôle). On peut ensuite choisir ces gamètes pour l’essai définitif, car on connaît d’avance le rapport spermatozoïdes:œufs qui convient.

Dans la pratique, tout laboratoire peut, à partir de son expérience, établir un rapport « type » qui donne généralement les résultats escomptés pour une espèce donnée. Toutefois, l’utilisation systématique d’un rapport « type » risque de réduire la qualité de l’essai. Ainsi, lorsqu’un rapport type donne un taux de fécondation de <60 % ou de ≥98 % chez les témoins (v. 4.5.1), l’essai ne serait pas valide et devrait être repris à l’aide d’un autre rapport. D’autres essais peuvent perdre de leur sensibilité s’il y a « surconcentration » spermatique. Le rapport spermatozoïdes:œufs doit parfois être ajusté en fonction de la période du frai - on a signalé des cas où le rapport a dû être décuplé (Chapman, comm. pers., 1992b).

Compte tenu de la variation normale du taux de fécondation chez les témoins, on recommande fortement d’effectuer un prétest. Les responsables des essais qui connaissent bien l’essai sur la fécondation chez les échinides considèrent que le prétest effectué pour chaque essai définitif leur a permis, à long terme, d’économiser beaucoup de temps et d’argent ainsi que de sauvegarder des échantillons parfois irremplaçables.

Plutôt que d’effectuer un prétest témoin, on peut préparer 2-3 répétitions des rapports spermatozoïdes:œufs pour chaque concentration d’essai, y compris pour les témoins. On utiliserait alors les résultats obtenus en regard du rapport ayant donné un taux de fécondation de 80 % chez les témoins pour calculer la CI_p (v. 4.5.2). Le NCASI (1992) souligne que cette façon de procéder est plus rapide qu’un prétest suivi d’un essai; elle permet aussi d’éviter que des changements dans l’activité des spermatozoïdes ne surviennent entre le prétest et l’essai proprement dit.

Si le rapport spermatozoïdes:œufs est déterminé par un prétest ou arbitrairement, il faut aussi établir la densité de la suspension spermatique à utiliser (v. 4.2.2). Par exemple, s’il faut ajouter 2 000 œufs pour atteindre un rapport de 2 000:1, le volume de 0,1 mL de suspension spermatique ajouté devra contenir 4 millions de spermatozoïdes, ce qui correspond à 40 millions de spermatozoïdes par mL de suspension.

4.2.4 Exposition des gamètes

Pour l’exposition, on place les récipients dans un support pour tubes à essai ou tout autre type de support, lui-même placé dans un bain-marie ou un autre appareil à température contrôlée. Les récipients doivent être disposés de façon aléatoire dans le support ou à l’intérieur de chaque colonne; dans ce dernier cas, chaque colonne contient une répétition de chaque concentration et du témoin^{Note de bas de page 37}. Tous les récipients doivent porter une étiquette ou un code correspondant à leur position, ce qui permettra d’identifier les concentrations et les répétitions.

Lors de la préparation d’aliquotes représentatives des solutions d’essai (c.-à-d. les témoins plus au minimum les concentrations élevée, moyenne et faible s’il s’agit d’un essai à concentrations multiples), on doit en mesurer la température, la salinité, la teneur en OD et le pH. Si le protocole d’essai l’exige ou le permet, les valeurs doivent ou devraient être ajustées aux niveaux acceptables (v. 4.3) avant l’ajout des solutions dans les récipients d’essai.

Pour l’essai, on peut choisir entre 3 durées d’exposition qui n’ont par ailleurs aucune incidence sur la méthode d’essai utilisée. Évidemment, on ne peut choisir qu’une seule durée pour un essai donné ou pour des essais comparatifs. L’exposition la plus courte sert normalement aux essais types et à des fins de surveillance. On expose le sperme pendant 10 min, on ajoute les œufs et on poursuit l’exposition pendant 10 autres minutes (essai de 20 min). Dans le cas de l’oursin violet de l’Atlantique, la formation de la membrane de fécondation prend plus de temps que chez les 4 autres espèces d’essai; il est donc recommandé d’utiliser une durée d’exposition plus longue (20 + 20 min ou 60 + 20 min).

On peut avoir recours à l’une ou l’autre des 2 périodes d’exposition plus longues pour répondre à des exigences particulières, comme une recherche ou une comparaison des résultats avec d’autres données. On peut donc utiliser une exposition du sperme de 20 min, suivie d’une exposition du sperme et des œufs de même durée (essai de 40 min). L’exposition la plus longue comporte une exposition du sperme pendant 60 min, suivie d’une exposition du sperme et des œufs pendant 20 min (essai de 80 min)^{Note de bas de page 38}.

La durée d’exposition est indépendante des 3 volumes possibles (on a donc 9 options pour l’essai). On utilise généralement un volume d’essai de 10 mL; c’est l’option qui a été retenue dans le présent document^{Note de bas de page 39}. On procède exactement de la même manière avec des volumes de solution d’essai de 5 mL et de 2 mL, mais on réduit proportionnellement les volumes des suspensions de gamètes (v. tableau 4).

On mélange d’abord la solution de sperme, puis l’essai commence dès l’ajout de 0,1 mL de cette solution à tous les récipients qui contiennent déjà 10 mL de la solution d’essai (v. 4.1.2). À la fin de la période d’exposition du sperme, on agite la préparation d’œufs et on en ajoute 1,0 mL à tous les récipients. Il faut utiliser des micropipettes automatiques afin de respecter les courts délais nécessaires à l’exécution de ces tâches. Il faut faire très attention lorsqu’on ajoute le sperme et les œufs dans les récipients et on doit déverser directement dans la solution d’essai tout le liquide libéré par la pipette en veillant à ce qu’il ne touche pas les parois du récipient; de plus, l’extrémité de la pipette ne doit pas entrer en contact avec la solution d’essai. On devrait agiter les suspensions de gamètes après avoir rempli chaque groupe de 2-3 récipients. Une fois le sperme ajouté, on devrait bien mélanger les solutions en faisant pivoter les récipients, en prélevant et libérant du liquide avec la pipette ou en actionnant brièvement un agitateur-mélangeur vortex; on procède de la même façon après avoir ajouté les œufs.

On devrait établir à quel intervalle le sperme sera ajouté à chaque récipient (p. ex., toutes les 5 s). On devrait ajouter les œufs aux récipients dans le même ordre et suivant le même intervalle que le sperme de façon à uniformiser le temps d’exposition. De la même manière, on devrait mettre fin à l’essai en respectant le même ordre et le même intervalle. On ne devrait pas ajouter les gamètes en fonction des concentrations, mais plutôt par groupe de répétitions, c’est-à-dire en commençant par le premier groupe de répétitions et ainsi de suite (Chapman, 1992a).

Lorsque la période d’exposition du sperme et des œufs est écoulée, on met fin à l’essai en ajoutant à chaque récipient soit ≤2 mL de glutaraldéhyde à 1 %, soit ≤2 mL de formol tamponné à 10 %^{Note de bas de page 40}. (On divise la quantité d’agent de conservation par 2 ou par 5 si on utilise les petits volumes.) On devrait compter les œufs conservés au plus tard 3 jours après la fin des essais. Lors de l’entreposage, les récipients contenant les œufs devraient toujours être scellés (p. ex., au moyen d’une pellicule de plastique).

4.3 Conditions de l’essai

Il s’agit d’un essai sans renouvellement des solutions ni aération. La température d’essai est de 15 °C pour les 4 espèces indigènes et de 20 °C pour les espèces non indigènes. Dans tous les récipients, la salinité est normalement à 1 g/kg près de celle du témoin, la plage étant de 28-32 g/kg. S’il y a lieu, il faut chercher à élever la teneur en OD de toutes les solutions d’essai au-dessus de 40 % de saturation, avant la mise en route de l’essai.

4.3.1 Température

La température d’essai devrait être de 15 °C pour l’oursin vert, l’oursin violet du Pacifique et le clypéastre excentrique. Elle devrait être de 20 °C pour l’oursin violet de l’Atlantique et l’oursin blanc, 2 espèces non indigènes. La température de toutes les solutions d’essai ne devrait pas s’écarter de plus de 1 °C de la valeur visée et déterminée par les mesures des aliquotes ou des récipients sans gamètes (réservés à la surveillance de la température). Avant l’essai, on doit mesurer la température dans les aliquotes du ou des témoins, de même que des concentrations d’essai élevée, moyenne et faible.

Les températures d’essai recommandées sont de 3-7 °C plus élevées que les valeurs recommandées pour le maintien des adultes d’une même espèce, mais elles doivent demeurer dans l’échelle biocinétique. Ces températures plus élevées devraient favoriser la détection de certains toxiques^{Note de bas de page 41}. Certaines des températures recommandées sont conformes à celles antérieurement utilisées dans les méthodes au Canada ou dans les méthodes normalisées aux États-Unis. Cependant, elles sont inévitablement différentes des températures utilisées ailleurs, étant donné la profusion des méthodes (v. annexe D).

4.3.2 Salinité

La salinité devrait être de 30 g/kg dans un essai classique. Elle devrait être dans la plage de 28-32 g/kg dans toutes les solutions d’essai et ne pas s’écarter de plus de 1 g/kg par rapport à la salinité du témoin^{Note de bas de page 42}.

Lorsque l’essai a trait à une substance chimique, on devrait porter cette substance à la ou aux concentrations d’essai avec de l’eau témoin/de dilution dont la salinité est dans la plage requise (v. 4.1.1, 5.2 et 5.3). La salinité des échantillons aqueux (p. ex., substances chimiques ou formulations préparées dans de l’eau; effluents, lixiviats) ou des solutions d’essai devrait être mesurée avant l’essai. Si elle est à l’extérieur de la plage de 28-32 g/kg, elle devrait être ajustée selon l’une ou l’autre des méthodes suivantes : 1) ajout direct de sels secs à l’effluent ou à une autre matière (p. ex., lixiviat ou élutriat); 2) ajout de SHS (selon les directives fournies dans EC, 2001, et en 2.3.4). On peut utiliser de l’eau désionisée pour réduire la salinité des échantillons d’essai. L’échantillon ne doit pas être porté à la température d’essai avant cet ajustement de la salinité. En fait, la température à laquelle se déroule l’ajustement de la salinité devrait approcher celle de l’échantillon au moment de sa réception ou encore de sa sortie du réfrigérateur s’il a été réfrigéré pendant la nuit à 4 ± 2 °C (EC, 2001).

Si on choisit la première méthode, on peut ajouter à l’échantillon non dilué la quantité de sels de mer secs du commerce (p. ex., Instant Ocean^MC, Red Sea Salt^MC) ou de sels de qualité réactif (p. ex., GP2 modifié; v. Bidwell et Spotte, 1985, ou le tableau 2 dans USEPA, 1994 ou 1995) qui permettra de hausser sa salinité à 30 ± 2 g/kg. Tout échantillon auquel on a ajouté directement des sels secs doit « vieillir » au plus 16-24 h avant son utilisation dans un essai toxicologique (EC, 2001). Lorsqu’il faut faire vieillir un échantillon, la quantité requise de sels doit être ajoutée pendant qu’on mélange l’effluent; par la suite, l’échantillon dont la salinité a été ajustée (à 30 ± 2 g/kg) doit être conservé dans l’obscurité pendant 16-24 h à 4 ± 2 °C, dans un contenant hermétiquement fermé comportant le moins possible d’air (et sans aération). Le pH de l’échantillon devrait être mesuré et consigné avant et après l’ajout de sels, mais avant le vieillissement. Après cette période de vieillissement, il faudrait mélanger l’échantillon d’effluent, porter sa température à celle de l’essai, vérifier et consigner son pH, préparer les concentrations d’essai et mettre l’essai en route (EC, 2001).

Si on choisit la deuxième méthode, la salinité de l’échantillon doit être ajustée à celle de l’essai (30 ± 2 g/kg) par l’ajout de la quantité nécessaire de SHS (et, au besoin, d’eau désionisée). Il faut utiliser à cette fin de la SHS dont la salinité est de 90 ± 1 g/kg. On doit suivre les indications fournies dans EC (2001) et en 2.3.4 pour préparer la SHS. Si on utilise une SHS dont la salinité est de 90 g/kg pour porter la salinité d’un échantillon d’eau douce à 30 g/kg (v. 3.4 et 4.1.1), la concentration maximale de l’échantillon pouvant être utilisée pour l’essai serait de 67 %.

Les échantillons d’effluent, de lixiviat, d’eau réceptrice, d’élutriat et d’eau produite ou tout autre extrait aqueux d’un sédiment pourraient également être soumis à l’essai sans ajustement de la salinité lorsque l’objet de l’étude consiste à évaluer l’effet total, y compris les écarts de salinité. Il ne faudrait pas oublier que, si un échantillon est essentiellement constitué d’eau douce (salinité de <5 g/kg) ou d’une saumure (p. ex., eau produite), les résultats de l’essai de toxicité indiqueront probablement une salinité peu propice à la fécondation plutôt que la présence d’un ou de plusieurs toxiques dans l’échantillon. Lorsque l’essai porte sur un échantillon à salinité non ajustée, il est conseillé de prévoir une série de témoins de la salinité faisant appel à des concentrations identiques d’eau distillée (v. 4.1.4), de réaliser un deuxième essai avec un échantillon dont la salinité est ajustée ou d’employer ces deux méthodes, pour évaluer l’apport de la salinité à la toxicité.

4.3.3 Oxygène dissous et aération

Avant l’essai, on devrait préaérer l’échantillon ou une aliquote de l’échantillon seulement si sa teneur mesurée en OD indique qu’elle serait en dehors de la plage de 40-100 % de saturation en air dans une ou plusieurs concentrations d’essai. L’aération devrait se faire par introduction d’air comprimé exempt d’huile au moyen d’une conduite d’air et d’un tube en plastique ou en verre jetable à petite ouverture (p. ex., tube capillaire ou pipette à pointe Eppendorf, avec ouverture de ~0,5 mm). L’aération doit se faire à un rythme minimal et contrôlé qui ne devrait pas excéder 100 bulles/min. La préaération doit être limitée à 20 min ou au temps voulu pour obtenir 40 % de saturation en air en deçà de 20 min (ou 100 % en cas de sursaturation évidente)^{Note de bas de page 43}. Qu’on ait ou non obtenu 40-100 % de saturation en air dans l’aliquote de l’échantillon ou dans toutes les solutions d’essai comme on pourrait s’y attendre, l’aération doit être interrompue au bout de 20 min et l’essai, être mis en route. Il faut consigner, au début de l’essai, la teneur en OD des aliquotes représentatives des solutions d’essai, dont celle à concentration élevée. Toute préaération doit figurer dans le rapport d’essai, y compris la durée et le taux d’aération (section 9).

Lorsque la teneur en oxygène dans un ou plusieurs récipients est inférieure à 40 % de saturation, l’essai n’est pas valide aux fins de l’évaluation de la toxicité, en soi, de la matière ou de la substance d’essai. L’essai demeurerait cependant valide aux fins de l’évaluation de l’effet total de la matière (p. ex., un effluent) ou de la substance (p. ex., une substance chimique), y compris sa désoxygénation^{Note de bas de page 44}. Dans la plupart des cas, l’utilisation requise d’une eau témoin/de dilution saturée en oxygène donnera lieu à des niveaux d’OD qui ne devraient pas influer considérablement sur les résultats de l’essai.

4.3.4 pH

On doit mesurer le pH dans les aliquotes du ou des témoins, aux concentrations élevée, moyenne et faible, avant de procéder à l’essai.

On devrait normalement effectuer les essais toxicologiques à des fins d’évaluation de la conformité ou de surveillance sans ajuster le pH. Cependant, lorsque l’échantillon de la matière ou de la substance d’essai fait passer le pH de l’une ou l’autre des solutions d’essai à l’extérieur de la plage de 7,5-8,5, les résultats obtenus pourraient correspondre aux seuls effets imputables au pH^{Note de bas de page 45}. Si on souhaite évaluer un ou des toxiques en soi plutôt que les effets nocifs ou modificateurs du pH, on devrait ajuster le pH des solutions ou de l’échantillon ou effectuer parallèlement un deuxième essai à pH ajusté^{Note de bas de page 46}. Dans ce dernier cas, et selon l’objet de l’étude, on peut ajuster le pH initial de l’échantillon ou de chaque solution d’essai^{Note de bas de page 47} jusqu’à l’obtention d’une valeur équivalant à celle du pH de l’eau témoin/de dilution ± 0,5, avant l’exposition des gamètes. Une autre méthode acceptable pour ce deuxième essai à pH ajusté consiste à ajuster chaque solution d’essai, y compris le témoin, à la hausse jusqu’à ce que le pH se situe entre 7,5 et 8,0 (pour une solution à pH <7,5) ou à la baisse jusqu’à ce que le pH se situe entre 8,0 et 8,5 (pour une solution à pH >8,5). On devrait normalement utiliser pour ces ajustements des solutions d’acide chlorhydrique (HCl) ou d’hydroxyde de sodium (NaOH) titrant £1 N. Dans certains cas (p. ex., des échantillons d’effluent dont le pH est fortement tamponné), on devra recourir à des titres supérieurs d’acide ou de base^{Note de bas de page 48}.

Dans certains cas, il pourrait être souhaitable de réaliser l’essai le plus sensible pour détecter des substances chimiques toxiques plutôt que d’inclure le pH dans l’effet total d’une substance chimique, d’un effluent, d’un lixiviat ou d’un élutriat, ou encore d’un liquide (comme l’eau de porosité) extrait d’un sédiment ou d’une autre matière solide. Il faudrait alors éliminer tout effet associé à un pH bas ou élevé sur la viabilité des gamètes et sur le succès de la fécondation, en ajustant le pH des solutions d’essai, s’il y a lieu, pour qu’il soit dans la plage privilégiée de 8,0 ± 0,2^{Note de bas de page 49}.

Abernethy et Westlake (1989) fournissent des indications utiles pour l’ajustement du pH. On devrait laisser s’équilibrer, après chaque addition d’acide ou de base, les aliquotes des échantillons ou les solutions d’essai faisant l’objet d’un ajustement du pH. Le temps requis à cette fin dépendra du pouvoir tampon de la solution ou de l’échantillon. Pour les échantillons d’effluent, un délai de 30-60 min est recommandé entre chaque ajustement du pH (Abernethy et Westlake, 1989). Dans un essai avec des échinides, on ajusterait le pH des aliquotes utilisées pour préparer les concentrations d’essai, on consignerait le pH de chaque aliquote (v. 4.4) et on effectuerait l’essai sans procéder à d’autres ajustements.

Lorsque l’essai toxicologique vise à mieux comprendre les caractéristiques des toxiques présents dans la substance ou matière d’essai, l’ajustement du pH est souvent employé parmi d’autres techniques (p. ex., oxydation, filtration, extraction à l’air, ajout d’un chélatant), pour caractériser et préciser la toxicité de l’échantillon. Ces techniques d’IET sont utiles pour déterminer les caractéristiques physicochimiques du ou des toxiques ainsi que la mesure dans laquelle ils peuvent être détoxiqués (USEPA, 1991a, 1991b).

4.4 Observations et mesures

Au terme de l’exposition, on prélève, après mélange^{Note de bas de page 50}, des œufs intacts dans chaque récipient d’essai; on dénombre une quantité égale d’œufs (100-200) provenant de chaque récipient, puis on classe les œufs selon qu’ils sont fécondés ou non (figure 3)^{Note de bas de page 51}. La numération s’effectue au moyen d’un microscope grossissant (× 100), de préférence à contraste de phase. Une cellule à numération, comme une cellule de Sedgwick-Rafter, pourrait être utile, mais la numération peut être réalisée à l’aide d’une boîte de Petri gravée. La technique utilisée est importante et peut influer sur l’exactitude de la numération. La cohérence de l’opération devrait faire l’objet d’une vérification, surtout lorsque plusieurs personnes se partagent la tâche de la numération des œufs.

Le soulèvement de la membrane de fécondation constitue le critère de fécondation. La membrane peut être entièrement ou partiellement soulevée, ou encore être affaissée (v. figure 3), ces 3 caractéristiques étant absentes chez les œufs non fécondés (NCASI, 1991)^{Note de bas de page 52}.

Figure 3. Caractéristiques des œufs fécondés et non fécondés

Dessins linéaires des œufs, tels qu’ils apparaissent sous un microscope à dissection. Les trois dessins de la rangée supérieure sont des œufs d’oursin globuleux, tel l’oursin vert. L’œuf de gauche n’est pas fécondé. Celui du milieu montre une membrane de fécondation partiellement soulevée et est considéré comme fécondé. Celui de droite montre une membrane de fécondation entièrement soulevée. Les œufs de l’oursin violet du Pacifique sont semblables, sauf qu’une membrane hyaline peut être visible entre l’œuf et la membrane de fécondation. Les trois dessins de la rangée inférieure sont des œufs de clypéastre excentrique. L’œuf de gauche n’est pas fécondé, celui du milieu est fécondé, avec membrane partiellement soulevée, et celui de droite est fécondé également, avec membrane entièrement soulevée. La pellicule gélatineuse qui entoure les œufs du clypéastre renferme des granules pigmentaires; elle disparaît habituellement pendant les phases ultérieures de développement des œufs. [Dessins réalisés par M.A. White à partir de lames préparées par McGibbon et Moldan (1986) et des dessins de Kelley Battan, NCASI, Anacortes (WA).]

4.5 Paramètres et calculs

L’inhibition de la fécondation, évaluée en fonction des témoins, constitue le paramètre biologique de l’essai. On calcule le taux de fécondation pour chaque récipient d’essai.

Dans le cas d’un essai à concentrations multiples, c’est la concentration inhibitrice correspondant à un pourcentage d’effet précisé (CI_p) qui constitue le paramètre exigé. Il faut utiliser si possible l’analyse de régression pour le calcul de la CI_p, selon les indications fournies en 4.5.2 ci-dessous et dans EC (2005). Les limites de confiance de 95 % doivent être fournies pour toute CI_p signalée.

4.5.1 Validité de l’essai

L’essai n’est pas valide si le taux de fécondation moyen de toutes les répétitions de l’eau témoin est de <60 % ou de ≥98 %^{Note de bas de page 53}. Aussi, une courbe dose-effet positive et logique devrait être atteinte pour que les résultats soient considérés comme valides - en d’autres termes, l’effet sur la fécondation doit généralement devenir plus marqué à des concentrations plus élevées.

Si l’OD était inférieur à 40 % de saturation dans au moins un récipient d’essai, il faudrait considérer que l’essai ne mesure pas la toxicité intrinsèque de la substance ou de la matière d’essai, mais bien son effet total (v. 4.3.3).

4.5.2 Essais à concentrations multiples

L’analyse des données toxicologiques recueillies au moyen d’essais sur la fécondation chez les échinides présente des particularités pour les raisons suivantes :

1. Même si les données sont binomiales par nature (un œuf est soit fécondé, soit non fécondé), elles satisfont souvent à l’hypothèse de normalité du fait qu’il y a 100 répétitions^{Note de bas de page 54}.
2. Selon un des critères de validité de l’essai établi par Environnement Canada, le taux de fécondation (réaction) chez le témoin doit se situer entre ≥60 % et <98 %. Il ne sera donc pas de 100 % (conformément au plan d’expérience), et il faut tenir compte de ce fait dans l’analyse des données. En outre, comme cette réaction ne sera pas maximisée, il est possible que la fécondation soit plus élevée (stimulée) à de faibles concentrations de la substance d’essai (réaction hormétique).

L’analyse par la méthode des probits constituerait le choix habituel pour les données binomiales des essais à concentrations multiples. Toutefois, les techniques de régression non linéaire (plus précisément, la procédure d’estimation de paramètres) présentent plusieurs avantages par rapport à l’analyse par la méthode des probits^{Note de bas de page 55}, notamment :

1. la capacité d’estimer directement la réaction des organismes témoins (la correction d’Abbott^{Note de bas de page 56} est inutile);
2. un plus grand choix de modèles, y compris la possibilité de modéliser l’hormèse^{Note de bas de page 57}, le cas échéant;
3. la possibilité d’éviter le rejet injustifié de l’analyse fondée sur le test du khi-deux portant sur l’hétérogénéité^{Note de bas de page 58}.

La régression non linéaire est habituellement appliquée à des données continues. Cependant, des techniques de pondération peuvent permettre de tenir compte de la nature binomiale des données et de corriger l’hétérogénéité de la variance^{Note de bas de page 59}. La transformation arc-sinus (racine carrée), qui a toujours servi à transformer les données binomiales aux fins de l’analyse, n’est pas recommandée^{Note de bas de page 60}.

Compte tenu de ce qui précède, dans un essai à concentrations multiples, le paramètre statistique exigé pour le taux de fécondation est une CI_p et ses limites de confiance de 95 %, établies au moyen d’une analyse de régression non linéaire.

Il est vivement recommandé de tracer un diagramme initial des données brutes (taux de fécondation) en fonction du logarithme de la concentration afin d’obtenir une représentation visuelle des données, de vérifier si les résultats obtenus sont raisonnables en regard des calculs statistiques ultérieurs et de déterminer s’il existe des valeurs aberrantes. Tout écart important entre le graphique de la CI_p approximative et la CI_p calculée à l’aide d’un programme informatique doit être expliqué. Le graphique permettrait aussi de déterminer si un lien logique a été obtenu entre la concentration logarithmique (ou, dans certains cas, la concentration) et l’effet, ce qui est souhaitable dans tout essai valide (EC, 2005).

L’analyse de régression constitue la principale méthode statistique à utiliser pour calculer la CI_p, à la condition de satisfaire aux hypothèses ci-dessous (figure 4). Un certain nombre de modèles permettent d’évaluer les données sur la fécondation au moyen d’une analyse de régression. Pour que les méthodes de régression puissent être utilisées, les données doivent satisfaire aux hypothèses de normalité et d’homoscédasticité. À cette fin, il faut appliquer des techniques de pondération binomiale à toutes les données. Il convient aussi d’examiner les données afin de détecter les valeurs aberrantes à l’aide d’une des méthodes recommandées (v. 10.2 dans EC, 2005). On doit tenter d’ajuster plus d’un modèle aux données. Enfin, il faut choisir le modèle présentant le meilleur ajustement^{Note de bas de page 61} pour déterminer la CI_p et ses limites de confiance de 95 %. Pour déterminer le meilleur ajustement, il est recommandé d’utiliser l’erreur quadratique moyenne résiduelle la plus basse (ou une autre mesure d’ajustement, comme l’AIC ou le BIC^{Note de bas de page 62}). Les paramètres calculés au moyen d’une analyse de régression doivent être encadrés par les concentrations d’essai; l’extrapolation des paramètres au-delà de la concentration expérimentale maximale ne constitue pas une pratique acceptable.

Figure 4. Organigramme général de l’analyse statistique des données d’un essai à concentrations multiples en vue d’établir une CI_p

Dans le cas de certaines matières ou substances très toxiques, il est possible que le taux de fécondation soit nul ou quasi nul^{Note de bas de page 63} à une ou plus d’une concentration. Les résultats connexes à la ou aux concentrations d’essai élevées n’apportent alors aucune autre information quant à la réaction des organismes, et les résultats nuls répétitifs peuvent influer sur les hypothèses de régression de la normalité et de l’homoscédasticité^{Note de bas de page 64}. Les données sur la concentration d’essai la plus faible associée à un taux de fécondation nul ou quasi nul sont conservées dans l’ensemble de données, mais celles sur la ou les concentrations élevées suivantes doivent en être supprimées avant les analyses de régression.

La possibilité de décrire mathématiquement l’hormèse (c.-à-d. une stimulation ou une réaction « supérieure à celle du témoin » ne se produisant que lors d’une exposition à des concentrations faibles) dans la courbe dose- réponse a été intégrée dans les modèles de régression récents (v. 10.3 dans EC, 2005). Les données relatives à une hormèse peuvent être saisies directement puisque tous les points de données peuvent être pris en compte et incorporés dans le modèle; il n’y a aucun équeutage des points de données indiquant une réponse hormétique.

Si les données ne se prêtent pas à une analyse de régression (à savoir lorsque les hypothèses de normalité et d’homoscédasticité ne peuvent être satisfaites), on peut avoir recours à une interpolation linéaire (p. ex., le programme ICPIN; v. 6.4.3 dans EC, 2005) pour calculer une CI_p. Dans ce cas, on utiliserait les valeurs logarithmiques des données sur la concentration, mais sans appliquer une pondération binomiale. Si les données révèlent une hormèse et que le programme ICPIN est utilisé, les réactions des organismes témoins doivent être prises en compte pour les concentrations donnant lieu à une hormèse(option 4, sous-section 10.3.3, EC, 2005).

Pour chaque concentration d’essai, y compris le ou les traitements témoins, le pourcentage moyen d’œufs fécondés (± ET), tel qu’il est établi à la fin de l’essai, doit être consigné.

4.5.3 Essais à concentration unique

Le plan d’expérience le plus utilisé pour mesurer la fécondation chez les échinides est un essai à concentrations multiples. Cependant, si le responsable de l’essai souhaite procéder à un essai à concentration unique (p. ex., pour évaluer des sédiments provenant de différents lieux d’échantillonnage), la méthode d’essai par contact [décrite dans Méthode d’essai biologique : Méthode de référence pour déterminer la toxicité sublétale chez des embryons/larves d’échinides (oursins globuleux ou oursins plats) en contact avec un sédiment (en préparation - titre provisoire)] pourrait mieux convenir, étant donné qu’un sédiment fait partie du plan d’expérience.

Dans un essai à concentration unique, on compare la réaction des organismes à une ou plusieurs solutions d’essai à la concentration maximale (provenant, p. ex., de sites multiples) à celle des organismes témoins. L’analyse des données toxicologiques recueillies au moyen d’essais sur la fécondation chez les échinides présente des particularités. En effet, même si les données sont binomiales par nature (un œuf est soit fécondé, soit non fécondé), elles satisfont souvent à l’hypothèse de normalité du fait qu’il y a 100 répétitions^{Note de bas de page 65}. En conséquence, les recommandations formulées ici privilégient les techniques connexes aux données quantitatives (continues).

Si le taux de fécondation est évalué en regard d’une seule solution d’essai et d’un témoin, le test-t^{Note de bas de page 66} convient habituellement. Lorsque plus d’un site expérimental est à l’étude et que le responsable de l’essai souhaite comparer de nombreux traitements avec le témoin ou comparer les traitements entre eux, il peut avoir recours à divers tests comparatifs (v. 3.3 dans EC, 2005). Le choix du test à utiliser est fonction des éléments suivants :

1. le type de comparaison à établir (p. ex., une série complète de comparaisons par paire entre tous les sites ou une comparaison des données propres à chaque emplacement avec celles du témoin seulement);
2. un gradient dans la réponse chimique et/ou biologique est prévu;
3. les hypothèses de normalité et d’homoscédasticité sont satisfaites.

Dans la plupart des cas, il est inutile d’appliquer la correction d’Abbott au taux de fécondation^{Note de bas de page 67}.

Pour chaque solution ou traitement d’essai, y compris le ou les traitements témoins, le pourcentage moyen d’œufs fécondés (± ET), tel qu’il est établi à la fin de l’essai, doit être consigné.

4.6 Toxiques de référence

Il faut utiliser couramment un ou des toxiques de référence pour évaluer, dans des conditions d’essai normalisées, la sensibilité relative des lots de gamètes ainsi que la précision et la fiabilité des données obtenues en laboratoire pour le ou les toxiques de référence choisis (EC, 1990d).

Dans le cas des adultes acclimatés graduellement aux conditions d’essai et maintenus au laboratoire pendant une période prolongée (>3 jours), la sensibilité des gamètes à un ou des toxiques de référence doit être déterminée à l’aide d’un essai sur le ou les toxiques de référence mené dans les 14 jours précédant ou suivant la date de l’essai définitif. On peut aussi choisir d’effectuer ces deux essais en parallèle, auquel cas il faudra utiliser le même lot de gamètes dans les deux essais.

Si la collecte des gamètes a lieu la journée de l’arrivée des adultes au laboratoire ou dans les 3 jours qui suivent, on doit procéder à un essai sur le ou les toxiques de référence avec une fraction des gamètes qui seront utilisés dans l’essai définitif afin de déterminer leur tolérance à ce ou ces toxiques, dans les mêmes conditions d’essai que celles applicables à l’échantillon ou aux échantillons d’essai et en même temps que l’essai toxicologique proprement dit.

Les critères sur lesquels se fondent les recommandations relatives aux toxiques de référence sont les suivants :

• la disponibilité de la substance à l’état pur;
• la durée utile (stabilité) de la substance à long terme;
• la solubilité élevée dans l’eau;
• la stabilité en solution aqueuse;
• l’innocuité relative de la substance pour ses utilisateurs;
• la facilité avec laquelle la substance peut être dosée avec précision;
• une courbe dose-réponse satisfaisante pour les gamètes d’échinides;
• l’incidence connue du pH sur la toxicité de la substance utilisée dans l’essai;
• l’incidence connue de la salinité sur la toxicité de la substance utilisée dans l’essai.

Pour l’essai, on recommande le cuivre comme toxique de référence^{Note de bas de page 68}. On doit évaluer, conformément aux méthodes et conditions énoncées dans le présent document, la sensibilité des gamètes au moyen d’essais visant à déterminer la CI_p du cuivre. Pour tous les essais à concentrations multiples décrits ici, on doit faire appel à l’analyse de régression pour calculer la CI_p du toxique de référence et ses limites de confiance de 95 %, si possible, selon les indications fournies en 4.5.2 et dans EC (2005). On devrait employer du sulfate de cuivre ou du chlorure de cuivre pour préparer les solutions mères, qui devraient être acides (pH 3-4). Ces solutions peuvent être utilisées immédiatement ou entreposées dans l’obscurité à 4 ± 2 °C pendant plusieurs semaines. La teneur en cuivre devrait être exprimée en mg Cu⁺⁺/L.

Pour les solutions témoins/de dilution, on utilise de l’eau de mer naturelle ou reconstituée. Pour assurer un degré élevé de normalisation de l’essai toxicologique de référence, on devrait ajuster la salinité de l’eau témoin/de dilution en fonction d’une valeur constante favorable aux gamètes, soit une plage de 28-32 g/kg, de préférence 30 g/kg.

On devrait mesurer, au moyen des méthodes d’analyse chimique appropriées (p. ex., APHA et coll., 1989, 2005), les concentrations du toxique de référence dans toutes les solutions mères. Au moment de préparer les solutions d’essai, il faudrait prélever des aliquotes du témoin et des concentrations faible, moyenne et élevée pour les analyser immédiatement ou les entreposer aux fins d’une analyse ultérieure, dans l’éventualité d’une CI_p se situant à l’extérieur des limites de la zone de confiance. Le cas échéant, les aliquotes doivent être entreposées dans l’obscurité à 4 ± 2 °C. Les solutions de cuivre devraient subir un traitement de conservation avant d’être entreposées (APHA et coll., 1989, 2005). On devrait procéder à l’analyse chimique des aliquotes entreposées à cette fin dès que l’essai toxicologique est terminé. Le calcul de la CI_p devrait se fonder sur les concentrations mesurées lorsqu’elles diffèrent suffisamment (≥20 %) des concentrations nominales et lorsque la précision des analyses chimiques est satisfaisante.

Une fois qu’on dispose d’un nombre suffisant de données (EC, 1990d), une carte de contrôle doit être établie et mise à jour pour chaque toxique de référence utilisé. On porte les CI_p successives sur le graphique et on les examine pour déterminer si les résultats se situent dans l’intervalle de ± 2 ET des valeurs obtenues dans les essais précédents. Pour chaque CI_p, on recalcule la moyenne géométrique ainsi que les limites de la zone de confiance supérieure et inférieure (± 2 ET, calculé en fonction des données logarithmiques)^{Note de bas de page 69} jusqu’à ce que les statistiques se stabilisent (USEPA, 1989, 2002; EC, 1990d).

Si une CI_p particulière tombe à l’extérieur de ces limites, il convient de mettre en doute la sensibilité des gamètes, de même que l’exécution et la précision de l’essai. Comme cette situation peut se produire dans 5 % des cas par le simple jeu du hasard, l’obtention d’une seule valeur aberrante de la CI_p n’est pas nécessairement un signe de sensibilité anormale du lot de gamètes ou de précision insatisfaisante des données toxicologiques; c’est seulement un avertissement. Si cela se produisait, on devrait procéder à un examen approfondi de toutes les conditions de maintien des organismes et des conditions d’essai.

Il pourrait être indiqué, dans ce cas, de comparer le succès de la fécondation pour différents rapports spermatozoïdes:œufs en fonction des valeurs déjà obtenues. Cette évaluation devrait fournir une indication utile de la viabilité décroissante des gamètes, comme ce pourrait être le cas à la fin de la période du frai. Selon les résultats, il pourrait être nécessaire de reprendre l’essai toxicologique de référence avec de nouveaux gamètes et/ou un nouveau lot d’adultes avant d’entreprendre d’autres essais de toxicité.

Le fait que les résultats soient tous à l’intérieur des limites de la zone de confiance n’est pas nécessairement un gage de la cohérence des résultats obtenus par le laboratoire. Des données historiques extrêmement variables pour un toxique de référence donné élargiraient ces limites à un point tel qu’un nouveau résultat d’essai pourrait se trouver à l’intérieur des limites, tout en représentant une variation indésirable dans les résultats de l’essai. On trouvera des indications sur la variation raisonnable des données sur les toxiques de référence (c.-à-d. les limites de la zone de confiance d’une carte de contrôle) à la sous- section 2.8.1 et à l’annexe F de EC (2005).

Une CI_p qui tombe à l’extérieur des limites de contrôle (moyenne ± 3 ET) révèle presque à coup sûr que l’essai est inacceptable et qu’il devrait être repris après un examen attentif de tous ses aspects. Si les paramètres se situent entre les limites de contrôle et les limites de la zone de confiance plus de 5 % du temps, cela révélerait une détérioration de la précision. Encore là, l’essai le plus récent devrait être repris après un examen attentif des modes opératoires, des conditions et des calculs.

4.7 Considérations juridiques

Il faut veiller à l’admissibilité, devant un tribunal, des échantillons prélevés et analysés dans le dessein d’engager des poursuites. À cette fin, les échantillons doivent être représentatifs de la matière ou de la substance échantillonnée, ne pas être contaminés par des substances ou matières étrangères et être identifiables quant à la date, à l’heure et au lieu du prélèvement; il faut aussi que leur chaîne de conservation soit documentée et qu’ils aient été analysés le plus tôt possible après le prélèvement. Les responsables de l’exécution de l’essai et de la transmission des résultats doivent assurer la continuité de la preuve aux fins de la procédure judiciaire (McCaffrey, 1979) et l’intégrité des résultats de l’essai.