Page 18 : Recommandations au sujet de la qualité des eaux utilisées à des fins récréatives au Canada – Troisième édition

Annexe B : Échantillonnage et analyse microbiologique

B.1 Méthodes de prélèvement des échantillons d'eau

Les échantillons d'analyses microbiologiques doivent être prélevés dans des bouteilles propres, stérilisées et inoffensives pour l'environnement, à couvercle dévissable. On recommande les bouteilles en verre borosilicaté ou en plastique autoclavable capables de résister à des traitements de stérilisation répétés à 121 °C ou à 170 °C. Des bouteilles en mesure de contenir des volumes de 200 à 500 mL devraient suffire pour la plupart des analyses; toutefois, il pourrait être nécessaire, dans certaines circonstances, de prélever des volumes d'eau plus importants (p. ex. 1 L ou 10 L).

Pour l'échantillonnage à la main, ouvrir la bouteille stérilisée en la tenant fermement par la base, l'ouverture vers le bas. Prendre soin d'éviter tout contact avec l'ouverture ou le couvercle pendant toute la durée de la prise d'échantillon. Enfoncer le goulot de la bouteille jusqu'à 15-30 cm sous la surface (que ce soit pour les eaux profondes ou peu profondes). Tourner la bouteille de sorte que l'ouverture soit face au courant (le cas échéant) et légèrement inclinée vers le haut pour laisser l'air s'échapper, et l'éloigner lentement de votre corps, de l'embarcation ou de la plateforme d'échantillonnage. Les échantillons prélevés à partir d'une embarcation ou d'une plateforme flottante doivent l'être en amont de ces objets.

Pour l'échantillonnage à la perche, fixer la bouteille ouverte dans son support conformément aux instructions. Prélever l'échantillon en amont, le plus loin possible, en imitant la méthode utilisée pour l'échantillonnage à la main.

Le volume d'eau recueilli doit suffire pour permettre la réalisation de tous les tests prévus. Avant de refermer la bouteille, verser une petite quantité d'eau afin de ménager un espace vide qui facilitera le mélange de l'échantillon avant l'analyse. Les bouteilles d'échantillonnage refermées doivent être étiquetées et placées dans une glacière contenant des sacs réfrigérants congelés ou des glaçons. Consigner au même moment la date et l'heure du prélèvement, la température de l'eau et les autres renseignements appropriés.

Les autorités compétentes souhaiteront peut-être également inclure dans leur programme de surveillance la collecte de données supplémentaires sur divers paramètres de la qualité de l'eau et les conditions météorologiques propres aux zones contrôlées. Plusieurs chercheurs ont mentionné que ce type d'informations était très utile pour l'élaboration de modèles mathématiques de prévision de la qualité des eaux récréatives (Nevers et Whitman, 2005; Olyphant et Whitman, 2005). Ces informations peuvent notamment inclure :

  • les données pluviométriques;
  • le degré d'ensoleillement ou de couverture nuageuse;
  • la température (de l'air et de l'eau);
  • la hauteur des marées ou le niveau d'eau;
  • la hauteur des vagues;
  • le nombre de baigneurs;
  • la direction et la vitesse du vent;
  • les populations d'oiseaux (goélands, canards, oies, bernaches); et
  • la turbidité.

Un exemple de formulaire d'échantillonnage est fourni à l'annexe E.

B.2 Méthodes de prélèvement des échantillons de sable et de sédiments

Lorsque les données épidémiologiques ou autres laissent à penser que les plages de baignade pourraient être à l'origine de certaines maladies d'origine hydrique chez les baigneurs, il peut s'avérer justifié de procéder à l'échantillonnage et à l'analyse du sable et des sédiments pour y rechercher d'éventuels pathogènes. Beaucoup d'études ont démontré que les bactéries fécales indicatrices et les pathogènes fécaux pouvaient survivre pendant longtemps dans le sable et les sédiments.

À l'heure actuelle, il n'existe pas de méthode privilégiée pour la collecte et l'analyse des échantillons de sable et de sédiments. Diverses méthodes ont été proposées pour la collecte d'échantillons de sable, y compris l'utilisation de pelles, de spatules, de carottiers, de sondes ou d'autres instruments stérilisés de ce type. On conseille aux autorités de consulter la documentation scientifique pour déterminer les méthodes qui répondent le mieux à leurs besoins. On peut recueillir les échantillons de sédiments dans des bouteilles stériles de 250 à 500 mL à col large, en respectant la procédure décrite pour le prélèvement d'échantillons d'eau afin d'éviter toute contamination. Dans les eaux peu profondes, les bouteilles sont poussées contre le fond afin de recueillir un échantillon à l'interface sédiments-eau. Remplir le récipient à moitié, verser l'excédent d'eau et fermer la bouteille hermétiquement. En eaux plus profondes, on peut également utiliser des appareils de collecte d'invertébrés benthiques comme les bennes Ponar, Petersen ou Ekman (APHA et coll., 2005). Quelle que soit la méthode retenue, il est très important d'utiliser des instruments stérilisés et des techniques aseptiques afin de réduire les risques de contamination accidentelle des échantillons. À l'instar des échantillons d'eau, les échantillons de sable et de sédiments doivent être bien étiquetés et placés dans une glacière contenant des sacs réfrigérants congelés ou des glaçons.

B.3 Transport, conservation et entreposage des échantillons

Les échantillons doivent être conservés, jusqu'à l'analyse, à une température inférieure à 10 °C et à l'abri de la lumière. On peut utiliser des glacières contenant des sacs réfrigérants congelés ou des glaçons pour le transport des échantillons jusqu'au laboratoire. Pour éviter tout risque de contamination, il convient de placer les bouteilles dans les glacières de manière à éviter tout contact des couvercles avec l'eau provenant de la fonte des glaçons ou de la décongélation des autres produits réfrigérants. De plus, les échantillons ne doivent jamais être congelés; il faut donc les protéger de tout contact direct avec les glaçons et les sacs réfrigérants.

La réfrigération des échantillons n'a qu'un effet limité sur la conservation de la distribution des populations de microorganismes dans les échantillons d'eau. L'analyse microbiologique doit donc être effectuée le plus tôt possible pour éviter tout changement imprévisible de la population microbienne (APHA et coll., 2005), dans un délai maximal de 24 heures suivant le prélèvement des échantillons (Bartram et Rees, 2000), et préférablement dans les 8 heures qui suivent le prélèvement (Bartram et Rees, 2000; APHA et coll., 2005). Lorsque le temps requis pour le transport des échantillons dépasse 6 heures, on recommande d'envisager d'effectuer les analyses sur le terrain (APHA et coll., 2005). De même, si les résultats des analyses sont destinés à servir dans le cadre d'une action en justice, on recommande de recourir à des moyens spéciaux prescrits, et maintenir ainsi l'intégrité de la chaîne de possession (APHA et coll., 2005).

Il convient de consigner des données comme la température des échantillons à la réception ainsi que l'heure et la date du prélèvement, de la réception et de l'analyse des échantillons. Ces données pourraient s'avérer précieuses au moment d'interpréter les résultats des analyses (Bartram et Rees, 2000).

B.4 Méthodes d'analyse microbiologique

B.4.1 Indicateurs recommandés de contamination fécale

Il convient de tenir compte du type d'eau à analyser au moment de choisir la méthode d'analyse la plus appropriée. À l'heure actuelle, deux méthodes principales sont habituellement utilisées pour la détection et la numération régulières d'E. coli et des entérocoques dans les eaux récréatives : la fermentation en tubes multiples (FTM) et la filtration sur membrane (FM).

Fermentation en tubes multiples (FTM)

Cette méthode consiste à préparer des dilutions sériées d'un échantillon de 100 mL dans une série de tubes ou de cupules contenant divers types de milieux. Ces sous-échantillons sont ensuite mis à incuber, puis examinés en vue de déceler des réactions positives. Le nombre de tubes positifs par dilution est ensuite comparé à un tableau du nombre le plus probable (NPP), qui fournit une estimation statistique du nombre d'organismes cibles présents dans l'échantillon original de 100 mL.

La FTM présente l'avantage de pouvoir être utilisée pour des échantillons dont l'état rend la FM impraticable - par exemple, dans le cas d'échantillons d'eau turbide, colorée ou très contaminée (Santé Canada, 2006). Par ailleurs, l'utilisation d'un milieu liquide peut permettre une récupération plus facile des organismes stressés. Cette méthode présente cependant un certain nombre d'inconvénients : elle prend beaucoup de temps, utilise de grandes quantités de milieu et de verrerie, et exige de longs délais d'exécution, en particulier lorsqu'il faut ajouter des étapes de confirmation des résultats. De plus, elle ne donne qu'une estimation statistique de la présence de l'organisme cible, et non le nombre véritable de bactéries présentes.

Filtration sur membrane (FM)

Cette méthode consiste à filtrer l'échantillon d'eau (habituellement 100 mL) sur une membrane qui retient les bactéries. Le filtre est ensuite placé sur un milieu différentiel ou sélectif approprié et mis à incuber. Après l'incubation, les colonies sont dénombrées et les résultats sont notés en nombre d'organismes cibles par 100 mL.

La FM permet d'analyser de plus gros volumes d'eau; elle exige moins de main-d'oeuvre et de matériel, et donne des résultats plus fiables et plus reproductibles en raison du dénombrement direct des organismes. On la préfère donc de loin à la FTM pour les contrôles réguliers de la qualité des eaux récréatives. Elle présente toutefois un certain nombre d'inconvénients : la turbidité de certains échantillons peut faire obstacle à la filtration, et les échantillons très contaminés risquent de remplir le filtre au point de rendre toute numération précise impossible. De plus, le transfert direct sur un milieu sélectif solide risque d'entraver la récupération de certains organismes et de nécessiter l'ajout d'une étape de ressuscitation.

Techniques à substrat défini

Les deux méthodes décrites ci-dessus peuvent être utilisées conjointement avec de nouvelles techniques fondées sur l'aptitude à détecter des enzymes particulières jugées caractéristiques des organismes cibles. Les méthodes qui utilisent E. coli sont fondées sur la détection de l'enzyme β-glucuronidase, que l'on croit limitée à cette bactérie et à certaines souches de Salmonella et de Shigella. Les méthodes qui utilisent les entérocoques sont fondées sur la détection de l'enzyme β-glucosidase, qui est caractéristique de ce groupe. Il s'agit d'incorporer dans le milieu de croissance des substrats chromogènes ou fluorogènes spéciaux qui, lorsqu'ils seront métabolisés par l'organisme cible, donneront à la colonie en développement ou au milieu environnant une propriété unique qui servira au diagnostic. Les substrats chromogènes produisent un changement de couleur distinctif lorsqu'ils sont hydrolysés, tandis que les substrats fluorogènes produisent une substance fluorescente détectable sous rayonnement ultraviolet (UV) de grande longueur d'onde.

De nombreuses méthodes actuellement disponibles sur le marché mettent en oeuvre ces principes dans ce qu'on appelle les « techniques à substrat défini ». Avec ces techniques, les substrats indicateurs sont spécialement conçus pour servir à la fois de source principale de carbone et d'énergie pour la bactérie cible. Les autres bactéries concurrentes sont incapables d'utiliser le substrat et donc de faire obstacle à la récupération de la bactérie cible.

Escherichia coli

Les Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (APHA et coll., 2005) recommandent la méthode mTEC - une méthode FM élaborée par l'United States Environmental Protection Agency (U.S. EPA) - pour la détection et la numération d'E. coli sur les plages naturelles de baignade. Il s'agit de placer le filtre sur un milieu sélectif (mTEC) pour une étape de ressuscitation de 2 heures à 35 °C visant à réanimer les organismes stressés, d'incuber ensuite à 45 °C pendant 22 heures pour la détection de tous les coliformes thermotolérants, puis de transférer sur un substrat à base d'urée pour distinguer les E. coli uréase négatifs des autres coliformes thermotolérants qui sont pour la plupart uréase positifs.

L'U.S. EPA a publié une liste de méthodes approuvées pour la numération d'E. coli dans les eaux récréatives (U.S. EPA, 2006c). La méthode 1103.1 est la méthode mTEC originale. Celle qui porte le numéro 1603 est une méthode mTEC modifiée (à une seule étape) qui utilise un milieu unique contenant un substrat chromogène (5-bromo-6-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide, ou BCIG). L'hydrolyse du chromogène BCIG par E. coli donne aux colonies produites une couleur rouge ou magenta qui les différencie des autres coliformes thermotolérants. La méthode 1604 est une autre méthode de FM qui utilise un milieu appelé MI contenant à la fois un fluorogène (4-méthylumbelliféryl-β-D-galactopyranoside, ou MUGal) et un chromogène (indoxyl-β-D-glucuronide, ou IBDG) pour la détection simultanée des coliformes totaux et d'E. coli, respectivement.

D'autres méthodes appliquant des principes similaires ont été approuvées pour la numération d'E. coli dans l'eau potable (ISO, 1998; APHA et coll., 2005; U.S. EPA, 2006b). De même, plusieurs méthodes commercialisées - des versions prêtes à l'emploi, miniaturisées ou simplifiées des tests FM/FTM traditionnels - ont également été approuvées (U.S. EPA, 2006b).

Les laboratoires canadiens souhaiteront peut-être évaluer l'applicabilité de méthodes particulières à l'analyse des eaux récréatives de leurs régions respectives.

Entérocoques

Les Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (APHA et coll., 2005) proposent deux méthodes officielles de dépistage des entérocoques sur les plages de baignade : une méthode de FTM et une méthode de FM. La première consiste à inoculer une série de tubes de bouillon azide dextrose, et à incuber à 35 °C pendant 48 heures. La présence d'entérocoques est confirmée par la croissance bactérienne sur une gélose de type bile-esculine trahie par l'apparition de colonies noir brunâtre à halos bruns. La méthode de FM est la méthode mE décrite à l'origine par l'U.S. EPA en 1985. Les filtres sont placés sur une gélose mE, incubés à 41 °C pendant 48 heures, puis transférés sur une gélose esculine-fer pour confirmer l'hydrolyse de l'esculine. On considère que les colonies de couleur rose à rouge et à précipités noirs à brun rougeâtre sont formées d'entérocoques.

L'U.S. EPA a également publié une liste de méthodes approuvées pour la numération des entérocoques dans les eaux récréatives (U.S. EPA, 2006c). La méthode 1106.1 est la méthode mE originale. Celle qui porte le numéro 1600 est une méthode mEI modifiée (à une seule étape) qui permet de réduire de 48 à 24 heures le temps requis pour l'analyse. Cette méthode utilise un milieu unique contenant un substrat chromogène (indoxyl-β-D-glucoside) dont l'hydrolyse par les entérocoques donne aux colonies un halo bleu qui les distingue des bactéries autres que des entérocoques.

Comme dans le cas des E. coli, d'autres méthodes fondées sur des principes similaires ont été approuvées pour la numération des entérocoques dans l'eau potable (ISO, 2000; APHA et coll., 2005; U.S. EPA, 2006b). Plusieurs méthodes commercialisées - des versions prêtes à l'emploi, miniaturisées ou simplifiées des tests FM/FTM traditionnels - ont également été approuvées (U.S. EPA, 2006b). Les laboratoires canadiens souhaiteront peut-être évaluer l'applicabilité de méthodes particulières à l'analyse des eaux récréatives de leurs régions respectives.

B.4.2 Microorganismes pathogènes

Le dépistage systématique des microorganismes pathogènes (bactéries, virus, protozoaires) dans les eaux récréatives n'est pas recommandé. Toutefois, certaines circonstances peuvent justifier le recours à des tests de dépistage d'organismes particuliers - par exemple, lors d'études portant sur l'éclosion possible de maladies d'origine hydrique.

Agents pathogènes bactériens

Les Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (APHA et coll., 2005) décrivent des méthodes d'isolation, de détection et d'identification des agents pathogènes bactériens préoccupants pour les eaux récréatives : Campylobacter, E. coli O157:H7, Salmonella, Shigella, Aeromonas, Legionella, Mycobacterium, Pseudomonas, Leptospira et Staphylococcus aureus.

En règle générale, les méthodes d'isolation et de détection des bactéries pathogènes dans les eaux récréatives suivent le même protocole fondamental : concentration de l'organisme cible (par FM, centrifugation ou culture sur milieu enrichi), distinction des autres organismes non ciblés (p. ex. par culture sur milieux sélectifs ou à l'aide de méthodes de détection fondées sur des anticorps) et confirmation (à l'aide d'une combinaison d'évaluations morphologiques, de tests biochimiques et de méthodes d'identification sérologique).

D'autres méthodes de dépistage plus rapide des bactéries pathogènes présentes dans les eaux récréatives, fondées sur des techniques biochimiques, immunologiques ou génétiques (séquençage de gènes) de pointe, sont actuellement à l'étude. Les résultats obtenus récemment avec les méthodes fondées sur la réaction en chaîne de la polymérase (PCR) suscitent un certain intérêt à cet égard. On a déjà décrit des méthodes PCR de détection de la présence dans l'eau de toutes les bactéries pathogènes jugées préoccupantes. Par ailleurs, diverses méthodes PCR quantitatives ou de numération en temps réel ont été décrites pour un certain nombre de bactéries entériques pathogènes, y compris Salmonella, Campylobacter et E. coli O157:H7. De plus amples recherches seront nécessaires pour mettre au point des méthodes normalisées qui seront à la fois précises, fiables et abordables. Plusieurs chercheurs ont publié des examens décrivant l'état actuel des connaissances concernant l'utilisation des techniques récentes pour la numération et la détection des pathogènes présents dans les eaux récréatives (Ashbolt, et coll., 2001; Noble et Weisberg, 2006; Savichtcheva et Okabe, 2006). On conseille aux laboratoires canadiens de consulter la documentation scientifique pour en savoir plus sur l'applicabilité de méthodes particulières pour l'analyse des eaux récréatives dans leurs régions respectives.

Agents pathogènes viraux

La plupart des laboratoires de microbiologie de l'eau ne sont pas en mesure de détecter les virus pathogènes. Ces tests, lorsqu'ils sont nécessaires, doivent être confiés à des virologistes disposant des installations requises pour manipuler ce type d'organismes.

Les méthodes de détection des virus d'origine hydrique ont été normalisées dans une certaine mesure. Toutefois, même les méthodes les plus reconnues continuent de faire l'objet de recherches, de modifications et d'améliorations. Les Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (APHA et coll., 2005) décrivent des méthodes de concentration des virus et fournissent des informations sur les méthodes de détection et d'identification. Par ailleurs, l'U.S. EPA a publié un document intitulé Manual of Methods for Virology (U.S. EPA, 2001a), qui fournit des renseignements détaillés sur les diverses étapes de la récupération, du dépistage, de la numération et de l'identification des virus présents dans l'eau, dans les eaux usées et dans d'autres effluents du même type.

Les méthodes de récupération et de détection des virus pathogènes présents dans les échantillons d'eaux de surface sont en général complexes. Les virus étant présents en petit nombre dans les eaux contaminées par les matières fécales, leur détection nécessite la concentration de volumes d'eau considérables (jusqu'à des milliers de litres). Les méthodes d'adsorption-élution ou d'ultrafiltration sont les méthodes principales utilisées pour recueillir et concentrer les particules virales présentes dans les échantillons d'eau. Les échantillons filtrés peuvent être par la suite concentrés davantage au moyen de techniques de floculation ou de précipitation.

Les méthodes de culture cellulaire sont celles auxquelles on a le plus souvent recours pour la détection des virus entériques dans l'eau. Bien que fournissant des renseignements très utiles sur l'infectiosité et les concentrations de virus, elles risquent toutefois d'être laborieuses et chronophages et elles ne conviennent pas pour tous les types de virus. On a, plus récemment, eu recours à des méthodes conventionnelles fondées sur la PCR pour détecter les virus dans les échantillons environnementaux. Seule la culture cellulaire permet pour l'instant d'évaluer la viabilité des virus; il n'existe aucune méthode de rechange. On étudie actuellement la possibilité de recourir à des applications particulières de la PCR (transcriptase inverse suivie de PCR, PCR quantitative, PCR à culture cellulaire intégrée) pour surmonter certains des obstacles qui nuisent à l'efficacité des méthodes d'identification conventionnelles par PCR.

Diverses variations de la méthode de PCR se sont montrées utiles pour la détection des virus dans les eaux récréatives. Toutefois, malgré les progrès considérables accomplis dans ce domaine, aucune méthode normalisée n'a encore été mise au point. On conseille donc aux intéressés de consulter la documentation scientifique pour en savoir plus sur diverses méthodes particulières. Plusieurs articles de synthèse ont été publiés sur les méthodes actuelles, ainsi que sur les techniques en devenir possibles dans ce domaine (Bosch, 1998; Griffin, et coll., 2003; Fong et Lipp, 2005).

Protozoaires pathogènes

L'analyse des protozoaires pathogènes est hors de la portée de la plupart des laboratoires d'analyse de la qualité de l'eau. Ces analyses doivent être confiées à des spécialistes hautement qualifiés utilisant des équipements très spécialisés.

Les Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (APHA et coll., 2005) présentent un aperçu des méthodes qui peuvent servir à la récupération et à la détection de Giardia et de Cryptosporidium dans les échantillons environnementaux. Toutefois, elles ne décrivent pas de méthodes particulières.

L'U.S. EPA a approuvé deux méthodes de détection de Giardia et de Cryptosporidium dans les échantillons d'eau : la méthode 1622, conçue spécialement pour la détection de Cryptosporidium, et la méthode 1623, qui peut servir à la détection simultanée des deux genres de protozoaires (U.S. EPA, 2006c). Ces méthodes sont considérées comme les plus couramment utilisées pour la détection de Giardia et de Cryptosporidium dans l'eau. La détection des kystes de Giardia et des oocystes de Cryptosporidium est toutefois difficile et complexe. Même les méthodes les plus reconnues et les plus courantes présentent des lacunes à cet égard liées à la récupération de ces organismes. Les recherches se poursuivent pour en améliorer l'exactitude et la sensibilité.

La récupération et la détection des kystes de Giardia et des oocystes de Cryptosporidium dans les échantillons d'eau comportent trois grandes étapes : la concentration (par floculation, centrifugation ou filtration), la séparation des débris gênants (par centrifugation en gradient de densité, séparation immunomagnétique ou tri de cellules marquées par fluorescence) et la détection (par coloration par immunofluorescence ou par des méthodes fondées sur la PCR).

De toutes les méthodes utilisées pour la détection, celle fondée sur la coloration par immunofluorescence est la plus courante à l'heure actuelle. Elle consiste à appliquer des anticorps fluorescents qui reconnaissent spécifiquement les antigènes des kystes et oocystes, et à repérer ensuite les kystes et oocystes ainsi marqués par immunofluoromicroscopie.

Plusieurs méthodes conventionnelles d'identification par PCR ont été décrites pour la détection de Giardia et de Cryptosporidium dans les eaux récréatives. D'autres techniques d'analyse, telle celle fondée sur le polymorphisme de restriction (RFLP), ont été décrites pour la caractérisation plus approfondie des espèces et des génotypes de Cryptosporidium. Les informations sur le génotype peuvent servir à identifier les hôtes qui risquent d'être à l'origine d'éclosions dues à Cryptosporidium.

Les méthodes actuelles de détection ne nous renseignent ni sur la viabilité ni sur l'infectiosité des kystes et oocystes, et c'est là une de leurs lacunes. On a élaboré à cette fin des tests distincts qui s'appuient sur l'observation du degré de dékystement ou de l'inclusion/exclusion de colorants fluorescents particuliers. D'autres méthodes nécessitent l'utilisation de cultures cellulaires ou de sujets animaux. Des variantes particulières de la méthode de PCR (transcriptase inverse suivie de PCR, PCR quantitative) ont également été mises au point pour faciliter la quantification des organismes et fournir des estimations de la viabilité des kystes et des oocystes. En règle générale, ces tests sont coûteux et difficiles à réaliser, et ils sont habituellement utilisés à des fins de recherches particulières.

Les lecteurs sont invités à consulter la documentation scientifique pour en savoir plus sur des méthodes particulières. Il existe par ailleurs des documents de synthèse sur les techniques moléculaires utilisées aux fins de la détection et de l'identification de Giardia et de Cryptosporidium (Caccio, 2003).

Cyanobactéries et leurs toxines

Diverses méthodes sont envisageables pour la détection des cyanobactéries et des microcystines dans les échantillons d'eau et de fleurs d'eau. Elles varient sensiblement quant au degré de complexité et au niveau d'information qu'elles peuvent procurer. Le choix de la méthode la plus appropriée dépendra du type et du degré d'informations requis, ainsi que de la disponibilité des installations de laboratoire et des analystes qualifiés.

Divers documents publiés traitant des méthodes pouvant servir à la détection des cyanobactéries et des microcystines présentes dans les eaux récréatives sont disponibles (Chorus et Bartam, 1999; Falconer, 2005). Des articles de synthèse décrivant les techniques actuelles et en devenir ont également été publiés (p. ex. McElhiney et Lawton, 2005). Les personnes intéressées sont invitées à consulter la documentation pour obtenir de plus amples informations sur des méthodes particulières.

Dénombrement cellulaire

Les Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (APHA et coll., 2005) décrivent des méthodes de numération des cyanobactéries (mêmes méthodes que pour la numération du phytoplancton) dans l'eau. Les concentrations sont déterminées par comptage direct au microscope en utilisant une cellule de dénombrement de dimensions connues, et en estimant ensuite le volume de l'échantillon original par rétrocalcul. La plupart des cyanobactéries se présentent sous forme de colonies ou de filaments et risquent d'être difficiles à distinguer; il est donc recommandé de faire appel à un spécialiste de l'identification des cyanobactéries.

Dosage des microcystines

L'analyse des toxines totales nécessite la détermination préalable des microcystines à l'état libre et de celles liées aux cellules. Diverses étapes préalables sont donc souvent requises pour extraire et concentrer les toxines présentes dans les échantillons, par exemple : concentration des cellules de cyanobactéries, lyse cellulaire, et extraction et purification des toxines. Une trousse de test de terrain (commercialisée) peut être utilisée comme outil de dépistage pour déterminer la présence ou l'absence de toxines dans un approvisionnement d'eau. Si la présence d'une toxine est détectée dans un échantillon à l'aide de la trousse de test de terrain, un échantillon peut alors être soumis à un laboratoire reconnu pour une analyse de confirmation.

L'épreuve biologique sur des souris était jusqu'à récemment la méthode de choix pour vérifier la toxicité d'une fleur d'eau. Cette épreuve a été remplacée au cours des dernières années par des méthodes plus fiables et plus sensibles réalisées en laboratoire, comme l'épreuve d'inhibition de l'activité de la protéine phosphatase et le dosage immunoenzymatique (ELISA). Ces méthodes présentent toutefois l'inconvénient de ne pas fournir de mesure directe de la toxicité des échantillons. Divers types d'épreuves biologiques utilisant des invertébrés et des cultures cellulaires ont donc été examinés en guise de solution de rechange aux épreuves réalisées sur des souris.

L'épreuve d'inhibition de l'activité de la protéine phosphatase est une épreuve biochimique de détection des microcystines qui s'appuie sur l'aptitude de ces dernières à inhiber l'activité des enzymes. Il s'agit d'une méthode de détection rapide et sensible des microcystines. Ce test fournit une estimation quantitative des microcystines totales présentes, sans toutefois nous renseigner sur les diverses variantes de microcystines que peuvent contenir les échantillons. Une trousse commercialisée de détection des microcystines dans les échantillons d'eau est actuellement disponible.

Le test ELISA est considéré comme une solution très prometteuse pour la détection des microcystines présentes dans les échantillons de cyanobactéries et d'eau. Les méthodes ELISA sont rapides et sensibles, mais ne sont pas, à ce jour, suffisamment spécifiques pour permettre la distinction entre les différentes variantes individuelles de microcystines. Diverses trousses de détection des microcystines dans les échantillons d'eau sont actuellement vendues dans le commerce.

La combinaison d'une chromatographie liquide (CL) et d'une spectroscopie de masse (SM) est la méthode de laboratoire la plus communément utilisée pour l'identification et la quantification des microcystines; elle constitue la référence par rapport à laquelle sont évaluées les autres méthodes. Les analyses fondées sur cette méthode sont longues à mettre en oeuvre, techniquement exigeantes, coûteuses, et demandent des équipements spécialisés. Toutefois, des procédures normalisées ont déjà été décrites, et un certain nombre de laboratoires d'analyse possèdent les instruments nécessaires. L'absence de normes a limité l'utilité de cette méthode pour l'identification des variantes de microcystines.

Des méthodes fondées sur la PCR ont récemment été décrites pour la détection des cyanobactéries à l'aide d'amorces qui reconnaissent spécifiquement les fragments de gènes appartenant aux Microcystis spp., ou de gènes responsables de la production de microcystines (mcy). Ces méthodes ont permis, dans une certaine mesure, d'identifier et de dénombrer les cyanobactéries et leurs toxines dans des échantillons de fleurs d'eau; toutefois, elles sont toujours en voie d'élaboration et nécessitent de plus amples recherches.

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