Chapitre 3 des Normes canadiennes pour la lutte antituberculeuse : Le diagnostic de la tuberculose active et de la tuberculose pharmacorésistante

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• Auteurs et affiliations
• Points clés
• Introduction
• Imagerie
• Microbiologie
• Énoncé de divulgation
• Financement
• Annexe 1. Normes pour les laboratoires de tuberculose et de mycobactériologie : services et politiques
• Références

Auteurs et affiliations

Marcel A. Behr; Département de médecine, Université McGill, Montréal, Québec, Canada

Simon Grandjean Lapierre; Département de microbiologie, d'infectiologie et d'immunologie, faculté de médecine, Université de Montréal, Montréal, Québec, Canada

Dennis Y. Kunimoto; Département de médecine, faculté de médecine et de dentisterie, Université de l'Alberta, Edmonton, Alberta, Canada

Robyn S. Lee; Dalla Lana School of Public Health, Université de Toronto, Toronto, Ontario, Canada

Richard Long; Département de médecine, faculté de médecine et de dentisterie, Université de l'Alberta, Edmonton, Alberta, Canada

Inna Sekirov; Département de pathologie et de médecine de laboratoire, faculté de médecine, Université de la Colombie britannique, Vancouver, Colombie-Britannique, Canada

Hafid Soualhine; Centre national de référence en mycobactériologie, Laboratoire national de microbiologie, Agence de la santé publique du Canada, Winnipeg, Manitoba, Canada

Christine Y. Turenne; Département de microbiologie médicale et des maladies infectieuses, Collège de médecine Max Rady, Université du Manitoba, Winnipeg, Manitoba, Canada

Points clés

• Le dépistage de la tuberculose (TB) au moyen d'une radiographie pulmonaire de dépistage suivie d'une analyse microbiologique de confirmation est indiqué chez toute personne considérée comme étant à risque élevé de TB active ou présentant des signes et des symptômes de la maladie.
• La radiographie pulmonaire fait partie intégrante de l'algorithme de diagnostic de la TB, mais n'est pas spécifique au diagnostic de la TB pulmonaire. Elle ne permet donc pas de conclure à un diagnostic de TB à elle seule.
• Toutes les mesures possibles devraient être prises pour obtenir un diagnostic microbiologique, qui repose sur l'observation de bacilles acido-alcoolo-résistants (BAAR) à l'examen microscopique de frottis et (ou) de cultures ou sur la détection des acides nucléiques de Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) au moyen de tests d'amplification des acides nucléiques (TAAN).
• Un antibiogramme (épreuve de sensibilité aux antituberculeux) phénotypique devrait être effectué systématiquement sur les isolats d'une première culture positive chez chaque nouveau patient atteint de TB.
• La présence de BAAR par examen microscopique de frottis, de culture de TB positive ou de TAAN chez des patients qui n'ont pas eu de diagnostic de TB auparavant représente une valeur de laboratoire critique et doit être immédiatement signalée au clinicien prescripteur.
• Tous les patients chez qui une TB active est nouvellement diagnostiquée doivent être signalés aux autorités de santé publique.
• L'utilisation du test cutané à la tuberculine (TCT) ou d'un test de libération d'interféron gamma (TLIG) pour le diagnostic de la TB active chez les adultes n'est pas recommandée.
• Un TAAN n'est pas recommandé pour surveiller la réponse au traitement ou déterminer la contagiosité après le début du traitement.
• Des tests moléculaires rapides doivent être réalisés pour prédire s'il y a présence d'une TB pharmacorésistante sur de nouvelles cultures positives et (ou) des échantillons d'un nouveau TAAN positif. L'utilisation de ces tests n'élimine pas la nécessité de réaliser un antibiogramme phénotypique classique.

1. Introduction

Ce chapitre couvre les examens radiologiques réalisés en cas de suspicion de tuberculose pulmonaire et les examens microbiologiques réalisés sur les échantillons prélevés dans tous les sites (pulmonaires et extrapulmonaires), de la microscopie à l'antibiogramme, y compris la prédiction moléculaire de pharmacorésistance.

2. Imagerie

2.1. Radiographie pulmonaire

Ce sont les poumons qui sont les plus fréquemment touchés par la tuberculose, et du point de vue de la santé publique, les cas les plus importants. Au Canada, en 2017, 69,4 % de tous les cas déclarés étaient classés dans la catégorie des cas de TB pulmonaire.^{Référence 1} Malgré la disponibilité accrue de techniques d'imagerie plus détaillées, comme la tomodensitométrie, la radiographie pulmonaire demeure le pilier de l'imagerie thoracique pour dépister la TB pulmonaire. Ce résumé est axé sur l'imagerie thoracique chez l'adulte.

2.1.1. Radiographie pulmonaire

Les radiographies pulmonaires sont importantes pour le diagnostic et la prise en charge de la TB pulmonaire. Elles sont accessibles et peu coûteuses dans la plupart des établissements. Elles peuvent être facilement obtenues et interprétées au point d'intervention et elles sont sécuritaires : une seule radiographie pulmonaire expose le patient à une quantité de rayonnements similaire à ce à quoi il serait exposé naturellement pendant une dizaine de jours. Les radiographies pulmonaires en série fournissent davantage de renseignements, dans la mesure où elles permettent de détecter des changements et donc de déterminer et de suivre l'évolution de la TB active.

La TB pulmonaire peut se manifester de différentes manières sur la radiographie pulmonaire.^{Référence 2} Les principaux profils de diagnostic de la TB active sont résumés dans les sections suivantes

2.1.2. Principaux profils de diagnostic

La présentation radiographique classique de la TB pulmonaire chez les adultes immunocompétents est une maladie qui siège dans la partie supérieure des poumons (c.-à-d. impliquant les segments apicaux ou postérieurs des lobes supérieurs ou les segments supérieurs des lobes inférieurs), avec ou sans cavités pulmonaires, mais sans adénopathie discernable. Ce profil est observé chez 56,2 % des cas de TB pulmonaire à culture positive selon une étude de cohorte longitudinale menée au Canada; chez 67,0 % de ces cas présentant ce profil, l'examen microscopique des expectorations était positif.^{Référence 8} La présence de cavités pulmonaires chez de tels patients augmente la probabilité d'un grade de frottis semi-quantitatif plus élevé (de 1–2+ à 3–4+),^{Référence 3} ce qui peut expliquer en partie pourquoi la positivité du frottis et la présence de cavités pulmonaires sont des facteurs de risque indépendants de transmission.^{Référence 4Référence 5Référence 6} Plus de détails à cet effet sont disponibles dans le Chapitre 2 : La pathogenèse et la transmission de la tuberculose.

Les adénopathies intrathoraciques, qui concernent généralement les ganglions lymphatiques hilaires et (ou) paratrachéaux gauches ou droits, sont une caractéristique commune d'une primo-infection de TB pulmonaire chez les enfants. Ce profil de primo-infection de TB évolutive peut aussi se présenter chez les adolescents et les adultes.

Un nodule pulmonaire calcifié, généralement situé dans la partie inférieure des lobes supérieurs ou dans la partie supérieure des lobes inférieurs et près de la plèvre, est compatible avec un granulome et indique généralement une infection tuberculeuse ancienne.

Les profils inhabituels ou atypiques comprennent un épanchement pleural isolé, l'infection d'un lobe inférieur, un profil micronodulaire diffus (miliaire) et, à l'occasion, une radiographie pulmonaire normale.

2.1.3. Facteurs clés pouvant influencer la présentation radiographique de la TB pulmonaire

Il est connu qu'un âge plus avancé et des conditions immunosuppressives augmentent le risque de TB (par exemple, le virus de l'immunodéficience humaine/syndrome d'immunodéficience acquise [VIH/SIDA], l'immunosuppression à la suite d'une transplantation^{Référence 7Référence 8} et l'insuffisance rénale)^{Référence 9Référence 10Référence 11} et augmentent également la probabilité d'une présentation radiographique atypique de la TB pulmonaire. Une autre maladie prédisposante, la silicose, peut elle-même modifier l'aspect de la radiographie de telle sorte qu'il est difficile de discerner une TB concomitante. Les patients ayant été atteints d'une TB pulmonaire par le passé et qui ont été traités par une thérapie d'affaissement pulmonaire, comme la thoracoplastie, peuvent faire une rechute des années plus tard avec des anomalies radiographiques, qui sont pour la plupart sans rapport avec l'épisode actuel.

2.1.4. Radiographies pulmonaires pendant la grossesse

En règle générale, le risque que pose une TB pulmonaire non diagnostiquée est plus important pour le fœtus que le risque lié à l'exposition aux radiations. Certaines mesures simples peuvent toutefois minimiser le risque d'exposition aux radiations du fœtus. Tout d'abord, éviter autant que possible les radiographies pulmonaires au cours du premier trimestre. Ensuite, limiter l'exposition à une seule vue postéro-antérieure. Enfin, placer un double écran sur l'abdomen, à l'avant et à l'arrière.

2.1.5. Précision et limites de la radiographie pulmonaire

Sensibilité : Si toute anomalie est prise en considération, la sensibilité sera alors supérieure à 95 %;^{Référence 12} l'inclusion des seuls profils clés susmentionnés réduit considérablement la sensibilité de la radiologie pulmonaire. L'examen produit parfois une radiographie normale chez une personne dont la culture d'expectoration est positive et qui vie avec le VIH, surtout si elle présente une immunosuppression avancée, chez les contacts proches d'une personne dont le frottis d'expectoration est positif pour la TB pulmonaire et chez les patients atteints de TB extrapulmonaire. De tels patients peuvent ou non présenter des symptômes respiratoires.

Spécificité : La spécificité est plus grande lorsque seules les anomalies suggérant une TB pulmonaire sur la radiographie sont prises en compte.^{Référence 12} Si la sensibilité est améliorée en considérant toute anomalie comme une TB possible, alors la spécificité est réduite et passe de 89 % à 75 %.

Variabilité entre les personnes qui interprètent les radiographies : L'un des principaux problèmes en ce qui concerne la lecture des radiographies pulmonaires est que l'interprétation est très variable. Même chez les radiologues pulmonaires expérimentés, la concordance des lectures entre les technologues et par le même technologue en ce qui a trait à la présence de cavités pulmonaires, d'adénopathie hilaire ou de probabilité d'une tuberculose active est très faible.

En résumé, la radiographie pulmonaire est un outil imparfait. La sensibilité chez les personnes présentant des symptômes est élevée; une radiographie pulmonaire négative peut donc être un test d'exclusion utile, quoiqu'imparfait. Elle ne peut cependant pas être utilisée comme test unique de confirmation de la TB pulmonaire.

2.2. Autres méthodes radiologiques

2.2.1. Tomodensitométrie

Le principal avantage de la tomodensitométrie est d'augmenter la spécificité du diagnostic de la tuberculose; par conséquent, un tel examen n'est souvent pas nécessaire dans un environnement de soins aigus, surtout lorsqu'une TB est déjà suspectée, que des précautions appropriées sont prises et que des tests microbiologiques sont en cours. La tomodensitométrie peut être mieux révéler des résultats distincts, tels que la présence de cavités pulmonaires ou l'extension endobronchique avec nodules de type « arbre en bourgeons », et peut s'avérer utile dans les cas où la radiographie pulmonaire ne montre pas les résultats « classiques » auxquels on s'attend en cas de TB pulmonaire.^{Référence 13} Bien que la tomodensitométrie soit deux fois plus sensible pour détecter les cavités, ^{Référence 14} c'est la présence ou l'absence de cavités pulmonaires sur la radiographie pulmonaire qui est notée sur le formulaire de déclaration de cas du Canada et qui est utilisée dans le processus de prise de décisions relatives à la durée du traitement. Les résultats de l'examen tomodensitométrique peuvent également mieux correspondre à la positivité microscopique des frottis.^{Référence 15Référence 16Référence 17} Même chez les patients dont le frottis des BAAR est négatif, la tomodensitométrie peut suggérer le risque que la culture du bacille de TB soit positive lorsque les résultats sont compatibles avec une TB pulmonaire.^{Référence 18} La tomodensitométrie peut s'avérer utile chez les patients sévèrement immunodéprimés dont la radiographie est normale ou presque normale en révélant des ganglions lymphatiques anormaux ou une maladie parenchymateuse subtile.

2.2.2. Imagerie par résonance magnétique

La précision de l'imagerie par résonance magnétique (IRM) est similaire à celle de la tomodensitométrie et permet de décrire les résultats liés à une TB pulmonaire dont la culture est positive.^{Référence 19} Cependant, l'intérêt le plus important de l'IRM repose dans le diagnostic et la prise en charge de la tuberculose extrapulmonaire (voir le Chapitre 7 : La tuberculose extrapulmonaire). L'IRM est une considération raisonnable pour l'utilisation chez certains patients pour lesquels on souhaite éviter les radiations ionisantes.

2.2.3. TEP/TDM au ¹⁸F-FDG

La tomographie par émission de positions/tomodensitométrie au ¹⁸F-fluorodésoxyglucose (TEP/TDM au ¹⁸F-FDG) est utilisée principalement pour le diagnostic de cancer et l'établissement de son stade. Elle permet d'identifier les zones d'inflammation active en cartographiant les endroits où les cellules à forte demande métabolique absorbent le traceur analogue du glucose. Le traceur s'accumule dans les cellules inflammatoires, comme les macrophages et les neutrophiles, et peut être quantifié sous la forme d'une valeur de fixation normalisée (VFN). La TEP/TDM au ¹⁸F-FDG ne permet pas de différencier les lésions causées par la TB pulmonaire des lésions causées par un cancer ou une autre infection ou affection inflammatoire.^{Référence 20} L'intensité de fixation du traceur n'est pas non plus liée à l'activité de la tuberculose active, limitant le rôle de la TEP/TEP/TDM au ¹⁸F-FDG dans le diagnostic de la TB pulmonaire.^{Référence 21} Il est concevable que la TEP/TDM-¹⁸F-FDG puisse être utile pour identifier d'autres sites de la maladie chez les patients dont le site d'atteinte est déjà confirmé par le traceur.

2.2.4. Développements futurs de l'imagerie pour la tuberculose

Les logiciels d'intelligence artificielle à apprentissage profond pour la détection de la TB pulmonaire par radiographie pulmonaire ont permis d'atteindre une sensibilité et une spécificité similaires à celles d'un radiologue,^{Référence 22Référence 23} et excédant les seuils des critères de test de triage de l'Organisation mondiale de la Santé (OMS).^{Référence 24} Ces logiciels pourraient s'avérer utiles pour combler les lacunes diagnostiques dans les régions à ressources limitées et éloignées.

Ultérieurement, les dossiers médicaux électroniques pourront peut-être relier les caractéristiques cliniques et radiographiques détectées par ordinateur afin de faciliter le diagnostic.^{Référence 25} L'intensité et la durée du traitement pourraient éventuellement être adaptées à la présentation clinique et radiographique de la TB pulmonaire.

Recommandations :

• Nous recommandons fortement que les radiographies pulmonaires postéro-antérieure et latérale fassent partie intégrante du diagnostic de la tuberculose active, mais qu'elles soient accompagnées de tests microbiologiques pour confirmer la maladie en raison de leur faible spécificité (données probantes).

Énoncés de bonnes pratiques :

• Tous les résultats de la radiographie pulmonaire suggérant une TB pulmonaire doivent être immédiatement signalés au médecin prescripteur.
• Si la TB est suspectée chez une femme enceinte, il est recommandé qu'une radiographie pulmonaire postéro-antérieure soit tout de même réalisée, étant donné que le risque d'une TB pulmonaire non diagnostiquée dépasse de loin tout risque d'exposition aux rayonnements pour le fœtus.

3. Microbiologie

Le rôle du laboratoire de mycobactériologie et de TB consiste à isoler et à identifier les mycobactéries qui ont une importance clinique et à effectuer des antibiogrammes sur ces bactéries. La culture de mycobactéries, sur milieux solide et (ou) liquide, est considérée comme la méthode de référence pour le diagnostic, et la culture en milieu liquide pour l'antibiogramme constitue la méthode de référence en Amérique du Nord.^{Référence 26Référence 27Référence 28} Les tests rapides les plus fréquemment utilisés sont 1) la coloration et l'examen microscopique des frottis pour déceler des bacilles acido-alcoolo-résistants (frottis pour la recherche de BAAR); et 2) les TAAN. Vous trouverez plus de détails sur les méthodologies de laboratoire de la tuberculose dans l'Annexe 1.

3.1. Échantillons cliniques

Vu l'importance incontestable des tests microbiologiques pour le diagnostic de la TB, il est important de s'assurer que les échantillons sont prélevés et traités correctement pour que les résultats obtenus soient valables. Tous les échantillons devraient être prélevés dans des contenants stériles étanches qui sont approuvés par le laboratoire et accompagnés d'un formulaire de demande d'analyse rempli indiquant l'identifiant du patient, le nom du médecin prescripteur, la date et l'heure du prélèvement de même que le type d'échantillon et le site de prélèvement. Dans la mesure du possible, les échantillons prélevés pour le diagnostic initial devraient être obtenus avant le début du traitement antituberculeux.^{Référence 26Référence 29}

Une fois recueillis, les échantillons devraient être transportés rapidement au laboratoire. S'ils ne peuvent pas être transportés ou traités dans l'heure qui suit, ils devraient être conservés à 2–8 °C (non congelés) et gardés à l'abri de la lumière jusqu'à leur transport.

3.1.1. Expectorations

Au moins trois échantillons d'expectorations d'un volume optimal de 5–10 ml chacun devraient être prélevés en vue d'un examen microscopique et d'une culture. Même si, selon les évidences, le rendement obtenu avec le troisième frottis d'expectorations n'est que de 2 à 5 %,^{Référence 30Référence 31} celui obtenu de manière incrémentielle avec la troisième culture peut atteindre 5 à 10 %, en particulier chez les personnes infectées par le VIH.^{Référence 31Référence 32}

Bien que le schéma classique consiste à prélever trois échantillons d'expectorations matinales distincts, il est bien connu que ce schéma n'est pas pratique pour les patients, et la perte au suivi en cours de diagnostic est fréquente. Des travaux de recherche publiés ont mis l'accent sur la possibilité de poser le diagnostic de la TB le « même jour » à l'aide d'échantillons prélevés le même jour. Ces travaux ont montré que le rendement diagnostique n'était pas diminué par une telle pratique.^{Référence 33}

3.1.2. Induction de l'expectoration

Dans une revue systématique de 23 études, les chercheurs rapportaient un pourcentage élevé de succès de l'induction, soit de 76,4 % à 100 %, et les événements indésirables associés à l'intervention étaient peu fréquents et bénins. ^{Référence 34} La sensibilité de l'examen microscopique des échantillons était variable étant donné la dilution des bacilles par la solution saline inhalée. Le rendement était généralement meilleur avec l'induction de l'expectoration qu'avec l'aspiration nasopharyngée ou le lavage gastrique,^{Référence 34} ou encore les échantillons de selles.

Il est important de provoquer l'expectoration avec une grande quantité de solution saline hypertonique à 3 %. Pour obtenir les meilleurs résultats, il est recommandé d'utiliser un nébuliseur à ultrasons qui peut administrer un volume de 5 à 6 ml par minute pendant 15 minutes.^{Référence 35}Avec cette technique, à peu près tous les patients produiront des expectorations, et une seule induction de l'expectoration donnera un rendement équivalent ou supérieur à celui de la bronchoscopie par fibre optique.^{Référence 36} On a réussi à provoquer des expectorations chez de très jeunes enfants^{Référence 37} (voir le Chapitre 9 : La tuberculose de l'enfant). Même si les échantillons semblent souvent aqueux, le laboratoire peut cependant les traiter de la même façon qu'un échantillon d'expectorations spontanées.

3.1.3. Bronchoscopie

On peut avoir recours à la bronchoscopie pour faciliter le diagnostic de TB, si l'on soupçonne également d'autres maladies pulmonaires, comme un cancer du poumon.^{Référence 38} Le recours à la bronchoscopie uniquement pour le diagnostic de la TB active est inconfortable et comporte des risques pour le patient en plus d'être une modalité coûteuse qui peut contribuer à la transmission nosocomiale de la TB si elle n'est pas réalisée dans un milieu approprié où le personnel est protégé. En outre, le rendement global de la bronchoscopie dans des séries prospectives de patients n'est que de 77 %^{Référence 39Référence 40Référence 41Référence 42} Si l'on fait appel à la bronchoscopie, les échantillons d'expectorations post-bronchoscopiques devraient être expédiés au laboratoire pour une recherche de BAAR, car cette intervention a un rendement analogue à celui du lavage et de l'aspiration bronchiques.

3.1.4. Aspiration gastrique

Cette technique a été introduite au début du 20^e siècle et est toujours utilisée dans certains centres.^{Référence 43} Ses principales indications sont la recherche d'une TB chez les enfants qui ne peuvent pas produire d'expectorations, ou pour la même raison, chez les personnes âgées démentes. La technique est relativement simple et est décrite au Chapitre 9 : La tuberculose de l'enfant.

3.1.5. Selles

Comme les jeunes enfants avalent leurs expectorations, il est possible de diagnostiquer la tuberculose active en isolant le bacille M. tuberculosis à partir d'échantillons de selles. Le prélèvement d'échantillons de selles est non invasif et ne nécessite pas d'équipement ni d'expertise spécialisés. Il n'existe cependant pas de recommandations standardisées pour le traitement des selles en vue de la culture et du TAAN. Plusieurs études ont aussi démontré une sensibilité relativement faible des échantillons de selles par rapport aux échantillons obtenus à partir d'expectorations ou d'aspiration gastrique.^{Référence 44} Par conséquent, les cultures de selles ne sont actuellement pas recommandées au Canada pour le diagnostic de TB pulmonaire.

3.1.6. Autres types d'échantillons

Divers types d'échantillons peuvent être prélevés pour le diagnostic de la TB extrapulmonaire. En règle générale, les tissus ont un rendement plus élevé que les liquides et liquides biologiques. Les bonnes pratiques pour le prélèvement et le transport de ces échantillons sont les mêmes que celles appliquées de routine pour le diagnostic de la TB pulmonaire. Le traitement de ces échantillons en laboratoire peut varier sur le plan de la capacité à réaliser un frottis de BAAR, des analyses moléculaires ou une mise en culture complète. Étant donné que les échantillons extrapulmonaires contiennent moins de bactéries et sont souvent moins volumineux, il est préférable de privilégier la culture plutôt que d'autres tests, comme la microscopie ou le TAAN. Des considérations supplémentaires spécifiques aux types d'échantillons sont décrites à l'Annexe 1 de ce chapitre et dans le Chapitre 7 : La tuberculose extrapulmonaire.

Recommandations :

• Nous recommandons fortement que, pour toutes les personnes chez qui une tuberculose pulmonaire est soupçonnée, au minimum trois échantillons d'expectoration (spontanée ou provoquée) soient prélevés et testés par microscopie et culture (données probantes).
• Nous recommandons fortement que trois échantillons d'expectoration (spontanée ou provoquée) soient prélevés le même jour, à au moins une heure d'intervalle (données probantes).
• Nous recommandons sous condition que les échantillons d'expectoration soient prélevés dans des récipients stériles sans milieu de transport et transportés au laboratoire de mycobactériologie dans un délai de 24 heures ou conservés à une température de 2 à 8 °C jusqu'au transport (données peu probantes).

3.2. Analyses de laboratoire pour le diagnostic de la tuberculose

3.2.1. Examen microscopique des frottis

L'examen microscopique des frottis d'expectorations est la technique la plus utilisée pour diagnostiquer une TB active.^{Référence 26} Deux colorations sont couramment employées : 1) la coloration classique de Ziehl-Neelsen ou de Kinyoun, avec laquelle le frottis est examiné avec un microscope optique, et 2) la coloration à l'auramine, qui exige un microscope à fluorescence (voir l'Annexe 1). Dans la plupart des pays à revenu élevé (dont le Canada), la microscopie en fluorescence est la technique de référence, car elle peut être lue à un grossissement plus faible que la coloration classique de Ziehl-Neelsen ou de Kinyoun, ce qui permet la lecture plus rapide des lames.^{Référence 28} La sensibilité des méthodes de coloration, peu importe laquelle, est toutefois inférieure à celle de la culture bactérienne. Dans les échantillons concentrés, le seuil de détection de BAAR est de 5 000 à 10 000 bactéries/ml d'expectorations avec la coloration par un fluorochrome,^{Référence 45Référence 46} et de 100 000 bactéries/ml avec la coloration de Ziehl-Neelsen. Le seuil de détection dans les frottis non concentrés est 10 fois plus élevé, ce qui se traduit par une sensibilité beaucoup plus faible. Ceci doit être considéré car souvent, pour les frottis « urgents », les échantillons ne sont pas concentrés. En revanche, la culture permet de détecter aussi peu que 10 bactéries viables.

La spécificité des frottis pour la recherche de BAAR est élevée dans le cas des mycobactéries, mais il convient de rappeler que toutes les mycobactéries non tuberculeuses (MNT) sont acido-alcoolo-résistantes. D'autres bactéries, comme les espèces du genre Nocardia et les Actinomycètes, peuvent être faiblement acido-alcoolo-résistantes, mais elles sont moins fréquentes. Par conséquent, une recherche positive de BAAR dans un frottis indique presque toujours la présence d'une mycobactérie, mais pas nécessairement de M. tuberculosis.^{Référence 28}

Lorsque des BAAR sont observés sur le frottis, le nombre de bacilles est rapporté selon une méthode semi-quantitative décrite à l'Annexe 1.

L'examen microscopique des frottis est à la fois rapide et peu coûteux et permet d'identifier les patients tuberculeux les plus infectieux (voir le Chapitre 11 : La recherche des contacts et la gestion des épidémies de tuberculose).^{Référence 47} Bien qu'il soit utilisé depuis longtemps pour aider à évaluer la contagiosité et gérer l'isolement, le test a des limites bien connues :

• Sa sensibilité est faible et variable (20 à 80 %) et dépend du type d'échantillon, de la population de patients, de la coloration employée, du temps consacré à l'examen et de l'expérience du microscopiste. Il est donc recommandé d'examiner plusieurs frottis d'expectorations pour augmenter la sensibilité globale. La sensibilité est plus forte avec les échantillons respiratoires qu'avec les échantillons non respiratoires, en particulier les liquides biologiques.
• Dans les milieux où l'incidence de la TB est faible, l'examen microscopique des frottis a une spécificité plus faible, car un frottis positif peut être attribuable à une MNT.
• La sensibilité de l'examen microscopique des frottis est plus faible dans les cas de TB de l'enfant et de TB extrapulmonaire, en particulier chez les sujets infectés par le VIH.
• L'examen microscopique des frottis ne peut pas être utilisé pour évaluer la résistance aux antituberculeux.

Recommandations :

• Nous recommandons fortement que l'examen microscopique des frottis soit réalisé sur des échantillons concentrés, lorsque cela est techniquement possible (données probantes).
• Nous recommandons fortement l'utilisation de la microscopie à fluorescence pour maximiser la sensibilité de l'examen microscopique des frottis (données probantes).

3.2.2. Culture des mycobactéries

La culture des mycobactéries peut être effectuée sur tous les types d'échantillons, dans la mesure où ils sont reçus dans des conditions approprié.^{Référence 26} La recherche de M. tuberculosis en culture est considérée comme la méthode de référence pour le diagnostic, étant donné que cette méthode est plus sensible que la microscopie ou les TAAN actuellement disponibles. La culture permet d'identifier le pathogène, permet l'antibiogramme et permet d'obtenir des isolats afin de procéder à un examen d'épidémiologie moléculaire en utilisant l'empreinte d'acide désoxyribonucléique (ADN) ou le séquençage du génome. Les normes et les détails techniques pour la culture mycobactérienne sont décrits à l'Annexe 1.

On considère en général qu'une seule culture positive pour M. tuberculosis confirme le diagnostic de TB active. Il importe toutefois de rappeler que, dans certains cas, les cultures peuvent être faussement positives à cause d'une contamination croisée au laboratoire. Si la suspicion clinique est faible, que le laboratoire signale qu'une seule culture est positive, en particulier si le frottis est négatif et que le délai de détection est long, on devrait envisager la possibilité d'un résultat faussement positif. S'il s'agit d'une possibilité clinique, il faut communiquer avec le laboratoire pour qu'il effectue des examens complémentaires.

Il faut en général de 2 à 8 semaines pour obtenir les résultats de la culture, selon la méthode employée et l'inoculum de bacilles tuberculeux présents dans l'échantillon. Lorsque la croissance est évidente, les laboratoires attribuent une identification présomptive de complexe M. tuberculosis ou de mycobactérie non tuberculeuse avant que d'autres analyses soient réalisées pour confirmer l'identification à l'espèce (voir l'Annexe 1 pour en savoir plus).

Recommandations :

• Nous recommandons fortement que chaque échantillon de volume suffisant provenant d'un patient possiblement atteint de TB fasse l'objet d'un examen microscopique du frottis et d'une culture; en cas de faible volume d'échantillon (< 2 ml)^{Référence 48}, la culture doit avoir préséance sur l'examen microscopique du frottis (données probantes).
• Nous recommandons fortement que les analyses des cultures de mycobactéries incluent au minimum un milieu de culture liquide et, lorsque possible, un milieu liquide de même qu'un milieu solide (données probantes).

3.2.3. Test d'amplification des acides nucléiques

L'amplification des acides nucléiques pour le diagnostic de la TB à partir d'échantillons produit des résultats plus rapidement qu'avec les méthodes de culture classiques.^{Référence 49Référence 50} Certains de ces tests fournissent également des résultats prédictifs.concernant la pharmacorésistance, qui est abordée plus en détail dans la section suivante portant sur les analyses de pharmacorésistance.

D'une part, la sensibilité des TAAN pour détecter la TB dans les frottis positifs obtenus à partir d'échantillons d'expectoration est élevée (> 95 %); ils sont par conséquent utilisés pour fournir un diagnostic présomptif rapide de TB en attendant les résultats des analyses de culture.^{Référence 49Référence 51} D'autre part, la sensibilité des NAAT est plus faible (50 à 70 %) pour dépister la TB dans les échantillons à frottis négatifs/cultures positives.^{Référence 51} La différence de sensibilité s'explique par la sensibilité analytique des TAAN, qui est d'environ 100 bactéries par ml, une sensibilité plus élevée que les frottis pour la recherche de BAAR (nécessitant de 5 000 à 10 000 bactéries par ml), mais plus faible que celle de la culture (moins de 10 bactéries par ml).^{Référence 49Référence 50Référence 51Référence 52} La sensibilité des TAAN est aussi plus faible avec les échantillons extrapulmonaires.^{Référence 52} Les résultats négatifs aux TAAN ne peuvent en eux-mêmes être utilisés pour exclure la TB et les considérations relatives à la prise en charge du patient doivent être régies par d'autres facteurs, comme les facteurs de risque épidémiologiques, la suspicion clinique et les résultats de la culture.

Certaines technologies de TAAN en format de cartouches (comme Xpert, de Cepheid) sont simples à utiliser et peuvent être déployées dans des laboratoires périphériques, ce qui les rend potentiellement utiles dans les régions éloignées, où il n'est pas possible de faire un examen microscopique des frottis et une analyse des cultures de routine sur place. Dans de tels contextes, les résultats de TAAN peuvent être disponibles en quelques heures seulement et potentiellement contribuer à réduire les délais diagnostiques. Il importe toutefois de souligner que l'usage du Xpert dans ces milieux ne devrait pas remplacer les frottis et les cultures classiques.

Les TAAN évoluent en permanence. Les prestataires de soins de santé de première ligne doivent savoir quand un test est mis à jour, car cela pourrait affecter les valeurs prédictives positives ou négatives des résultats. Par exemple, la plateforme GeneXpert, qui est très utile, a récemment introduit le test Xpert MTB/RIF Ultra. Ce test a une sensibilité plus grande, mais une spécificité réduite par rapport au test de première génération.^{Référence 52} La sensibilité supérieure du test Ultra (91 %) pourrait inciter un clinicien à envisager un autre diagnostic si le test est négatif chez un patient dont la probabilité avant test est faible. Dans les pays où le fardeau de la maladie est élevé, le test Ultra a une spécificité plus faible de 96 %, alors que dans les pays où le fardeau de la maladie est faible et où la transmission de la TB est limitée, la spécificité du test Ultra est élevée (99,3 %, IC à 95 % de 96 à 99 %).^{Référence 53} En l'absence d'autres informations corroborant le diagnostic de TB, on pourrait envisager la possibilité d'un faux positif. D'autres détails sur ces tests sont fournis dans l'Annexe 1. En cas de doute, les prestataires doivent contacter le laboratoire pour en savoir plus sur le TAAN utilisé et ses limites.

Comme les TAAN peuvent amplifier les BAAR non viables, ils ne sont pas recommandés pour réaliser le suivi de la réponse au traitement antituberculeux ou pour évaluer la contagiosité des patients après l'instauration d'un traitement.

Recommandations :

• Nous recommandons fortement que, chez tous les nouveaux patients dont le frottis est positif, au moins un échantillon respiratoire positif pour la présence de bacilles acido-alcoolo-résistants soit analysé à l'aide d'un test d'amplification des acides nucléiques développé en laboratoire et approuvé par Santé Canada (données probantes).
• Nous recommandons sous condition que, chez les patients pour qui une infection par la TB est suspectée, un test d'amplification des acides nucléiques soit réalisé sur un échantillon négatif pour la recherche de bacilles acido-alcoolo-résistants sur demande du médecin ou de la santé publique (données peu probantes).
• Nous recommandons fortement de ne pas utiliser les résultats d'un test d'amplification des acides nucléiques pour faire le suivi de la réponse au traitement antituberculeux ou de la contagiosité d'un patient après l'instauration d'un traitement (données probantes).
• Nous recommandons sous condition que, dans les établissements en région éloignée où il n'est pas possible de faire un examen microscopique des frottis et une culture sur place, un test d'amplification des acides nucléiques automatisé avec cartouche soit réalisé pour prendre des décisions rapides sur un traitement antituberculeux et sur un isolement. Dans un tel contexte, des échantillons devraient aussi être envoyés dans un laboratoire clinique ou de référence pour réaliser un examen microscopique des frottis et une culture (données peu probantes).

3.3. Diagnostic de pharmacorésistance

Le diagnostic de pharmacorésistance peut être posé au moyen de deux approches : 1) les méthodes phénotypiques (culture) et 2) les méthodes moléculaires (génotypiques). Un antibiogramme phénotypique devrait être effectué systématiquement sur tous les isolats d'une première culture positive chez chaque nouveau cas de TB. Les méthodes moléculaires (par exemple, le test Xpert MTB/RIF décrit précédemment) peuvent être utilisées sur les échantillons ou sur les cultures positives. Avec les méthodes moléculaires, nous utilisons délibérément le terme « prédiction de pharmacorésistance » plutôt que « test de pharmacorésistance » parce que : a) ces tests ne permettent pas d'obtenir des données directement indicatives d'une pharmacorésistance, et b) pour les raisons détaillées dans la section suivante, ils peuvent donner des résultats faussement positifs qui sont réfutés lorsqu'un antibiogramme phénotypique est réalisé sur le même échantillon.

Des détails sur les tests phénotypiques sont fournis à l'Annexe 1. Un antibiogramme phénotypique est effectué à partir d'une culture positive. Il faut jusqu'à 14 jours pour obtenir les résultats après réception de la culture positive. Si l'isolat est résistant aux médicaments de première ligne, la réalisation d'un antibiogramme complet peut nécessiter plus de temps étant donné qu'une deuxième série d'antibiotiques est alors testée. Contrairement aux tests moléculaires, l'antibiogramme phénotypique fournit une preuve directe de l'efficacité d'un antibiotique (la croissance de l'organisme est inhibée par l'antibiotique).

Les tests moléculaires font appel à deux approches conceptuellement différentes : les tests ciblés et le séquençage du génome entier. Dans un test ciblé, on recherche une mutation ou un ensemble de mutations connues pour prédire la résistance. Ces tests spécifiques ont une sensibilité imparfaite, car ils n'examinent que des éléments spécifiques de gènes sélectionnés; ils peuvent négliger des mutations sur d'autres sites. Par exemple, environ 10 % des cas de résistance à l'isoniazide sont dus à des mutations non analysées par les tests d'hybridation inverse en bande (Line Probe Assay).^{Référence 54} Ces tests présentent également une spécificité imparfaite, car ils indiquent si une mutation se trouve dans un gène, mais ne caractérisent pas ladite mutation, à savoir si elle confère une pharmacorésistance ou non.

En revanche, le séquençage du génome entier analyse l'ensemble du chromosome bactérien. Ce test est plus sensible, car il peut détecter les mutations associées à de la pharmacorésistance en dehors des régions examinées dans les tests ciblés. Il est aussi plus spécifique, car il peut faire la distinction entre les mutations qui confèrent ou non la pharmacorésistance. Le séquençage du génome complet est utilisé de routine dans certains milieux (voir l'Annexe 1) pour prédire la sensibilité aux médicaments; dans ces contextes, les isolats pour lesquels une sensibilité à tous les antibiotiques de première intention est prédite ne sont pas soumis à un antibiogramme phénotypique. Par conséquent, lorsque le séquençage du génome entier est approuvé par les laboratoires de santé publique canadiens, les prestataires peuvent s'attendre à recevoir un rapport de sensibilité pour tous les antibiotiques plus rapidement que la norme actuelle (2 semaines). Aussi, s'il existe des mutations associées à la pharmacorésistance à des antibiotiques de première intention, un antibiogramme de deuxième intention peut être lancé immédiatement, ce qui peut accélérer de plusieurs semaines la réception d'un rapport pour ces médicaments. L'impact sur les soins aux patients de ces constatations reste cependant à déterminer. D'autres informations sur les tests de pharmacorésistance se trouvent à l'Annexe 1.

Recommandations :

• Nous recommandons fortement qu'un antibiogramme phénotypique soit réalisé de routine pour tous les isolats retrouvé en culture pour chaque nouveau cas de TB (données probantes).
• Nous recommandons sous condition que des tests moléculaires rapides de prédiction de la pharmacorésistance soient réalisés afin de prédire rapidement si une nouvelle culture de TB positive présente une pharmacorésistance. L'utilisation de ces tests n'élimine pas la nécessité de réaliser un antibiogramme phénotypique classique basé sur une culture (données peu probantes).
• Nous recommandons sous conditions que, dans l'attente d'une culture positive, des analyses d'antibiogramme moléculaires rapides soient réalisées sur des échantillons positifs pour TB par test d'amplification des acides nucléiques. L'utilisation de ces tests n'élimine pas la nécessité de réaliser une culture, puis un antibiogramme phénotypique à partir de celle-ci (données peu probantes).

3.4. Futurs développements en matière de diagnostic de la TB en laboratoire

3.4.1. Tests sanguins (sérologie, signatures de l'expression génique)

Pendant des décennies, les chercheurs et l'industrie ont misé sur les analyses sanguines pour le dépistage de la TB. Malheureusement, les tests sérologiques de la tuberculose sont imprécis,^{Référence 55Référence 56} ce qui a poussé l'OMS à émettre une forte recommandation contre leur utilisation.^{Référence 57} Une nouvelle génération de tests sérologiques de dépistage de la TB portant sur les signatures de l'expression génique est en cours de développement et d'évaluation. Au moment où le présent document a été écrit, aucun de ces tests n'a atteint une sensibilité suffisante pour exclure la tuberculose active ni une spécificité suffisante pour être utilisé comme test unique pour le diagnostic de la TB.^{Référence 58}

Le TLIG est un autre test sanguin. Comme décrit dans le Chapitre 4 : Le diagnostic de la tuberculose, le TLIG ne permet pas de faire la distinction entre l'infection et la maladie; c'est pourquoi une politique récente de l'OMS décourage son utilisation pour le diagnostic de la tuberculose active. Chez les enfants, le TCT et les TLIG sont utiles comme indicateurs de l'infection tuberculeuse récente et peuvent servir à étayer un diagnostic de TB active, en combinaison avec des données cliniques, radiographiques et microbiologiques (voir le Chapitre 9 : La tuberculose de l'enfant).

3.4.2. Tests enzymatiques sur liquides biologiques (adénosine désaminase)

Les laboratoires reçoivent parfois des demandes impliquant l'envoi de liquide pleural, péricardique ou péritonéal pour le dosage de l'adénosine désaminase (ADA), un marqueur d'inflammation sérologique. Un examen systématique de ces tests dans les pays où le fardeau de la maladie est élevé a rapporté une sensibilité et une spécificité de 90 % pour ces pays. Étant donné qu'il y a un risque de faux positif pour ce test en cas d'empyème et de certains types de cancers, celui-ci n'est pas recommandé au Canada.^{Référence 59} Même si les résultats d'ADA peuvent appuyer le diagnostic de la tuberculose, ils ne permettent pas de déterminer le traitement antibiotique étant donné qu'aucun antibiogramme n'est associé à leur résultat.

3.4.3. Tests urinaires (détection des lipoarabinomannane [LAM] urinaires)

Les tests urinaires ont fait l'objet d'un intérêt accru suite à leur étude chez des patients atteints de VIH/SIDA à un stade avancé qui rapportent un diagnostic de TB et une instauration subséquente d'un traitement plus rapidement.^{Référence 60} Ceux-ci ne sont pas offerts dans les laboratoires de TB canadiens étant donné la disponibilité d'autres modalités diagnostiques et du faible fardeau de la tuberculose chez les populations atteintes de VIH (voir le Chapitre 10 : Le traitement de la tuberculose active chez les populations particulières).

Recommandations :

• Nous déconseillons fortement l'utilisation de tests sérologiques, de l'adénosine désaminase et de tests urinaires avec l'anticorps LAM pour le diagnostic de la TB (données probantes).
• Nous déconseillons fortement l'utilisation d'un test cutané à la tuberculine ou un test de libération d'interféron gamma pour le diagnostic de la tuberculose active chez les adultes (données probantes).

Énoncé de divulgation

Les éditeurs et auteurs des Normes canadiennes pour la lutte antituberculeuse ont déclaré des conflits d'intérêts potentiels au moment de leur nomination et ceux-ci ont été mis à jour tout au long du processus, conformément à la politique de divulgation des conflits d'intérêts de la Société canadienne de thoracologie (SCT). Les déclarations de conflits d'intérêts des membres individuels sont publiées sur le site Web des Normes canadiennes pour la lutte antituberculeuse.

Financement

Les Normes canadiennes pour la lutte antituberculeuse 8e édition sont financées par la SCT et l'Agence de la santé publique du Canada. Elles sont éditées par la SCT et publiées par la SCT en collaboration avec l'Association pour la microbiologie médicale et l'infectiologie (AMMI) Canada (en anglais seulement). Il importe cependant de souligner que les recommandations cliniques contenues dans les Normes ont été formulées par la SCT. Les éditeurs et auteurs des Normes canadiennes pour la lutte antituberculeuse sont responsables devant le Comité des lignes directrices canadiennes en santé respiratoire de la SCT et le conseil d'administration de la SCT. Les éditeurs et auteurs des Normes canadiennes pour la lutte antituberculeuse de la SCT sont fonctionnellement et éditorialement indépendants de toute source de financement et n'ont reçu aucun financement direct de sources externes. La SCT reçoit des subventions sans restriction qui sont combinées à un compte d'exploitation central afin de faciliter les activités d'application des connaissances assemblées de la SCT et de ses panels de directives et de normes. Aucun bailleur de fonds n'a joué un rôle dans la collecte, l'examen, l'analyse ou l'interprétation de la documentation scientifique ou dans la prise de décision concernant les recommandations présentées dans le présent document.

Annexe 1. Normes pour les laboratoires de tuberculose et de mycobactériologie : services et politiques

A.1. Introduction

Le diagnostic de la tuberculose (TB) est le fruit d'un processus collaboratif entre les médecins et les autres fournisseurs de soins de santé, y compris les laboratoires cliniques et de référence. Avant d'offrir des services de mycobactériologie, chaque laboratoire devrait évaluer le niveau de services requis et sa capacité à offrir ces services d'une manière sécuritaire et fiable.^{Référence 26Référence 61} Un questionnaire complet permettant aux laboratoires d'évaluer leur capacité à travailler avec les bacilles du complexe Mycobacterium tuberculosis (CMTB) figure dans le document intitulé Mycobacterium tuberculosis : Assessing Your Laboratory, édition 2019, produit par l'Association of Public Health Laboratories des États-Unis.^{Référence 28} La présente annexe traite de certaines normes s'appliquant aux laboratoires de mycobactériologie canadiens.

A.2. Exigences pour les laboratoires

A.2.1. Exigences en matière de biosécurité

Le diagnostic microbiologique de la tuberculose s'obtient par la détection des organismes du CMTB dans les échantillons cliniques. L'approche diagnostique varie d'une province à l'autre et peut inclure une combinaison de laboratoires de première ligne dans les régions éloignées, de laboratoires hospitaliers plus spécialisés et de laboratoires de référence provinciaux. Les laboratoires canadiens où l'on manipule des agents pathogènes pour l'humain, comme M. tuberculosis, doivent se conformer à la Loi sur les agents pathogènes humains et les toxines (LAPHT) ^{Référence 62} ainsi qu'aux exigences opérationnelles et aux exigences en matière de biosécurité connexes décrites dans les Normes et lignes directrices canadiennes sur la biosécurité (NLDCB), 2e édition.^{Référence 63} Dans ces normes et lignes directrices, M. tuberculosis est considéré comme un agent pathogène du groupe de risque 3, pour lequel un niveau de confinement (NC) 3 est requis pour les activités pouvant entraîner une propagation. Toutefois, certaines activités diagnostiques peuvent être réalisées sans danger au NC2, comme l'indique la nouvelle Directive en matière de biosécurité portant sur le complexe Mycobacterium tuberculosis (CMTB).^{Référence 64} Cette directive doit être utilisée conjointement avec les NLDCB afin d'assurer la sécurité du personnel de laboratoire réalisant les activités de diagnostic liées à M. tuberculosis.

A.2.2. Réception et transport des échantillons

La plupart des échantillons soumis pour une culture mycobactérienne proviennent des voies respiratoire, mais des tissus, des liquides biologiques stériles, de l'urine et des produits d'aspiration gastrique sont aussi couramment reçus (voir le Chapitre 3 : Le diagnostic de la tuberculose active et de la tuberculose pharmacorésistante et le Chapitre 7 : La tuberculose extrapulmonaire). Si un laboratoire ne dispose pas d'installations pour le traitement des échantillons, ceux-ci devraient être envoyés à un laboratoire muni de telles installations. L'envoi devrait avoir lieu dans les 24 heures qui suivent le prélèvement, de façon à éviter la prolifération d'autres micro-organismes et la détérioration des échantillons.^{Référence 28} Ceux-ci devraient être gardés au réfrigérateur à 4 °C (sauf dans le cas des hémocultures et des échantillons de liquide céphalorachidien [LCR]) s'ils ne sont pas transportés immédiatement.

Tous les types d'échantillons cliniques peuvent être contagieux et devraient donc être manipulés avec le même soin. Les laboratoires sont tenus de respecter la Loi sur le transport des marchandises dangereuses du Canada et la Réglementation pour le transport des marchandises dangereuses de l'IATA (pour le transport aérien) lorsqu'ils expédient des échantillons cliniques ou des cultures à un autre laboratoire. Le laboratoire qui reçoit les échantillons doit les accepter et les traiter conformément aux lois et règlements applicables. Le lecteur trouvera les renseignements les plus à jour sur le transport des matières dangereuses sur le site Web du gouvernement du Canada.^{Référence 65}

A.2.3. Assurance qualité et vérification de la compétence

Tous les laboratoires devraient être agréés par une organisation nationale/internationale d'agrément reconnue et participer à des programmes internes et externes d'assurance et de contrôle de la qualité en collaboration avec un laboratoire de référence. Ces programmes évaluent la reproductibilité et la variabilité interlaboratoires des méthodes utilisées ainsi que le respect des techniques d'analyse normalisées. Pour les laboratoires périphériques qui réalisent des tests d'amplification des acides nucléiques (TAAN) dans les régions éloignées du Canada, l'assurance qualité peut être obtenue sous la supervision d'un laboratoire de mycobactériologie clinique agréé, afin de garantir des résultats exacts avec des échantillons témoins et de valider par recoupement les résultats obtenus avec les TAAN avec d'autres résultats obtenus à partir des mêmes échantillons.

A.3. Détection et identification des espèces du complexe

Mycobacterium tuberculosis

A.3.1. Digestion, décontamination et concentration des échantillons

Dès leur réception au laboratoire, les échantillons respiratoires soumis pour le diagnostic de la TB doivent être décontaminés et concentrés. La décontamination garantit que les autres micro-organismes présents dans les échantillons, notamment ceux de la flore bactérienne respiratoire, ne croissent pas en plus grande quantité que ceux de la TB dans les milieux de culture solides et liquides, ce qui rendrait le test impossible à interpréter et limiterait la sensibilité de la culture. La concentration sépare le mucus et les débris des cellules mycobactériennes, ce qui augmente la sensibilité de l'examen microscopique des frottis. Les processus de décontamination et de concentration améliorent également les performances analytiques des tests moléculaires effectués sur des échantillons cliniques primaires en augmentant la quantité de matériel génétique de TB disponible et en éliminant les substances inhibitrices potentielles de la réaction en chaîne par polymérase (PCR). Pour vérifier le succès du processus de décontamination, il est recommandé de surveiller les taux de contamination.

La décontamination et la concentration des échantillons primaires ne sont pas des processus automatisés. Ils requièrent du temps de personnel de laboratoire et doivent faire l'objet d'un contrôle de qualité. Les échantillons stériles, comme le liquide céphalorachidien et les biopsies de tissus, n'ont cependant pas besoin d'être décontaminés ou concentrés et peuvent être traités immédiatement pour la microscopie, le TAAN et (ou) la culture.

A.3.2. Frottis et microscopie

Pour le diagnostic précoce et rapide de la TB, les laboratoires ont encore recours au frottis pour une recherche de BAAR classique. Globalement, la sensibilité du frottis varie de 20 % à 80 % et dépend de nombreux facteurs, dont le type d'échantillon, le colorant employé et l'expérience du technologue. ^{Référence 66Référence 67Référence 68Référence 69}L'examen microscopique en fluorescence peut se faire au moyen d'un microscope à fluorescence classique muni d'une lampe à vapeur de mercure ou à l'aide d'un microscope plus récent à diode électroluminescente, qui offre de nombreux avantages pratiques et dont l'OMS a reconnu l'utilité. La sensibilité de toutes les méthodes de coloration est inférieure à celle de la culture. Dans les échantillons concentrés, le seuil de détection de BAAR est de 5 000 à 10 000 bactéries/ml d'expectorations avec la coloration par un fluorochrome et de 100 000 bactéries/ml avec une coloration à la carbol-fuschine (par exemple, Ziehl-Neelsen). Bien que certains laboratoires, pour obtenir rapidement les résultats, préparent un « frottis direct » à partir de l'échantillon, sans digestion, décontamination, ni concentration, cette pratique est à éviter à cause de son manque inhérent de sensibilité.^{Référence 68} Le seuil de détection dans les frottis non concentrés est 10 fois plus élevé, ce qui se traduit par une sensibilité beaucoup plus faible. La culture est plus sensible que le frottis et peut détecter une charge bacillaire aussi faible que 10 bactéries/ml.

Les directives suivantes devraient être respectées :

• On devrait préparer et fixer les lames individuellement pour éviter la contamination croisée.
• Une lame témoin contenant des BAAR connus (témoin positif) et une autre lame contenant des bactéries qui ne sont pas acido-alcoolo-résistantes (témoin négatif) devraient être incluses dans chaque série de frottis colorés afin d'évaluer la possibilité d'une contamination.
• Les frottis d'échantillons primaires devraient être colorés et examinés par une méthode faisant appel à un fluorochrome. Les laboratoires devraient faire confirmer tout nouveau frottis positif par un deuxième technologue. Les frottis douteux devraient être répétés ou colorés à la carbol-fuschine avant d'être lus de nouveau.
• Chaque fois qu'on utilise un nouveau lot de réactif de coloration par un fluorochrome et carbol-fuschine, on devrait vérifier le résultat de la coloration à l'aide de frottis témoins positif et négatif avant de lire les frottis des patients.
• Les résultats des frottis devraient être consignés suivant un système établi de classement recommandé par l'OMS,^{Référence 48} le Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)^{Référence 70} ou l'Association of Public Health Laboratories (APHL)^{Référence 71} (voir le Tableau 1).
• Les laboratoires devraient participer à un programme approuvé de vérification de la compétence qui comporte la lecture de frottis pour une recherche de BAAR.
• L'American Thoracic Society (ATS), les Centers for Disease Control and Prevention (CDC) des États-Unis et la Société canadienne de thoracologie recommandent aux laboratoires qui ne lisent pas au moins 15 frottis de BAAR par semaine d'envoyer leurs échantillons à un autre laboratoire ou à un laboratoire de référence.

A.3.3. Détection moléculaire des mycobactéries directement dans les échantillons cliniques

La détection moléculaire de l'acide désoxyribonucléique (ADN) de M. tuberculosis à partir d'échantillons cliniques utilise des TAAN, habituellement basés sur PCR. C'est pourquoi les cliniciens utilisent souvent les termes TAAN et PCR de manière interchangeable. Outre les tests commerciaux, il existe de nombreux protocoles de tests moléculaires développés par les laboratoires eux-mêmes. Contrairement aux TAAN normalisés commerciaux, les TAAN maison peuvent donner des résultats inconstants^{Référence 50}, il est donc recommandé de les valider avant de les utiliser. De plus, ils ne devraient être utilisés que dans des laboratoires agréés qui disposent de systèmes d'assurance qualité.

Auparavant, la réalisation de TAAN nécessitait une infrastructure de laboratoire sophistiquée et des techniciens très compétents. Cette situation a changé lorsque des systèmes partiellement ou entièrement automatisés, tels que le test Xpert MTB/RIF^© (Cepheid Inc, Sunnyvale, Californie), ont été progressivement introduits dans les laboratoires canadiens. Le test Xpert MTB/RIF^© est un test PCR niché et automatisé dans une cartouche utilisant la plateforme GeneXpert^©, qui permet de détecter simultanément M. tuberculosis pour le diagnostic et les mutations conférant une pharmacorésistance à la rifampicine, un marqueur de la TB-MR, en moins de deux heures avec un minimum de manipulations techniques. Même en utilisant ces tests moléculaires automatisés dans une cartouche, le risque de contamination du site de test avec de l'ADN amplifié exige la mise en place et le respect de processus de laboratoire normalisés stricts pour le contrôle de la qualité. Au moment de la rédaction de ce document, les tests suivants sont disponibles sur le marché et approuvés par Santé Canada : Roche (COBAS^® Taqman^®MTB, PCR en temps réel), Becton-Dickinson (BD ProbeTec^®, amplification par déplacement de brin [strand displacement amplification, ou SDA]), Gen-Probe (Amplified Mycobacterium tuberculosis Direct [AMTD], amplification médiée par la transcription [transcription mediated amplification, ou TMA]), Hain Lifescience (Genotype^® Mycobacteria Direct, PCR) et Cepheid (Xpert MTB/RIF^®, PCR nichée automatisée dans une cartouche). Le COBAS^® Taqman^® MTB, l'AMTD et le Xpert MTB/RIF sont approuvés pour les tests directs sur des échantillons d'expectorations. Un registre mis à jour en temps réel des tests peut être trouvé sur le site Web en référence pour faire une recherche sur les instruments médicaux homologués au Canada.^{Référence 72}

Lors d'une revue systématique récemment complétée et qui visait à évaluer l'exactitude du Xpert MTB/RIF, Cochrane a recensé 18 études publiées.^{Référence 73} La majorité de ces études ont été menées dans des pays à revenu faible ou moyen. Bien que le test ait été initialement présenté comme un test réalisé au point d'intervention, dans 17 des 18 études, les tests à l'aide du Xpert ont été réalisés dans des laboratoires de référence par des techniciens compétents. Dans la méta-analyse portant sur la détection de M. tuberculosis (15 études, 7 517 participants), la sensibilité et la spécificité médianes globales étaient estimées à 88 % (83 %, 92 %) et à 98 % (97 %, 99 %), respectivement. Dans les échantillons cliniques, le test Xpert pouvait distinguer M. tuberculosis des autres mycobactéries non tuberculeuses (MNT) avec une grande précision. Des 139 échantillons avec MNT, une réactivité croisée a été observée dans un seul échantillon. Un rapport plus récent de Cochrane a examiné la version plus récente du test, soit le test Xpert MTB/RIF Ultra^©(Cepheid Inc, Sunnyvale, Californie) et l'a comparée au test Xpert MTB/RIF^©. Les paramètres de fonctionnement du test classique sont demeurés les mêmes dans cette méta-analyse actualisée : sensibilité et spécificité de 84,7 % (78,6 à 89,9 %) et de 98,4 % (97,0 à 99,3), respectivement. En comparaison, pour le test plus récent (Ultra), la sensibilité et la spécificité regroupées de sept études (2 834 participants) par rapport à la culture étaient de 90,9 % (86,2 à 94,7 %) et de 95,6 % (93,0 à 97,4 %). Dans l'ensemble, les données disponibles montrent une précision élevée pour la détection de la tuberculose pour les deux tests, bien que la sensibilité soit plus élevée et la spécificité plus faible pour le test Xpert Ultra.^{Référence 52} Le laboratoire doit donc être attentif, lors de la transition vers le test Ultra, de la possibilité d'observer des échantillons positifs au TAAN dans des échantillons dont la culture est négative. Il est à noter que les données proviennent principalement de pays où le fardeau de la maladie est élevé et qu'ils impliquent l'utilisation d'échantillons d'expectorations spontanées. Il n'existe pas de données similaires concernant les milieux à faible incidence et l'utilisation d'échantillons d'expectorations provoquées. Cependant, les études rétrospectives ont démontré que dans les milieux où le fardeau de la TB est faible et où la transmission de la maladie est très limitée, la spécificité du test Ultra est très élevée (99,3 %, IC 95 %, 96 à 99 %).^{Référence 53} Bien que limitées, les données opérationnelles suggèrent également que le test Xpert MTB/RIF est capable de réduire de manière significative le délai entre le diagnostic et le traitement.^{Référence 74}

Les TAAN sont actuellement recommandés pour les échantillons de sécrétions respiratoires, bien qu'ils puissent être à l'exception utilisés pour d'autres échantillons (par exemple, du liquide céphalorachidien) dans des laboratoires qui ont validé leurs tests pour ces types d'échantillons. Comme le précise le Chapitre 3 : Le diagnostic de la tuberculose active et de la tuberculose pharmacorésistante, les TAAN ne doivent pas être utilisés pour surveiller la réponse au traitement antituberculeux ou à des fins de contrôle de l'infection après le début du traitement.

Dans certains cas, les résultats peuvent être « indéterminés » à cause de la présence d'inhibiteurs dans l'échantillon ou d'une très faible quantité de bacilles. Des témoins adéquats devraient être inclus au besoin pour exclure l'inhibition par l'échantillon. Il faut prendre grand soin d'éviter la contamination croisée des échantillons qui seront soumis à un TAAN. Les laboratoires devraient s'assurer que les locaux sont propres et suivre les pratiques qui s'appliquent pour les tests moléculaires lorsque les solutions utilisées pour les TAAN sont préparées afin de prévenir efficacement la contamination. Les pièces du laboratoire où les réactifs moléculaires sont préparés, où la matrice d'ADN est manipulée et où la détection post-amplification s'effectue devraient être séparées. Il est déconseillé de réaliser des tests moléculaires dans un laboratoire de niveau de confinement 3, où les cultures mycobactériennes se multiplient, car cela augmente les possibilités de contamination.

Les méthodes PCR développées en laboratoire peuvent être moins coûteuses que les méthodes commercialement disponibles, mais elles nécessitent des compétences techniques avancées. Ces méthodes peuvent servir à la détection du CMTB^{Référence 75} dans des échantillons qu'il n'est pas recommandé d'analyser avec une trousse commerciale, tels les blocs de tissu fixés au formol ou les échantillons extrapulmonaires. En plus des résultats, il convient d'indiquer dans le rapport la sensibilité analytique des tests réalisés. Avant d'utiliser un test moléculaire CMTB (développé par un laboratoire ou par une entreprise), les laboratoires devraient consulter la ligne directrice du CLSI, intitulée Molecular Diagnostic Methods for Infectious Disease pour obtenir des conseils au sujet de la validation et de la mise en œuvre d'une nouvelle épreuve diagnostique moléculaire.^{Référence 76} Toute méthode nouvelle ou modifiée devrait être validée afin qu'on puisse en évaluer les caractéristiques de performance et les paramètres techniques. Toutes les méthodes d'analyse devraient être vérifiées pour qu'on puisse s'assurer qu'elles sont adéquates avant d'être utilisées. Des programmes de contrôle et d'assurance de la qualité doivent être mis en place pour surveiller les performances des TAAN et éviter les résultats faussement positifs ou faussement négatifs.

A.3.4. Culture des mycobactéries

La culture demeure la méthode de référence pour le diagnostic de la TB en laboratoire 1,2,20. Les bacilles tuberculeux croissent habituellement plus vite en milieu liquide que sur gélose. Aussi, la culture en milieu liquide a une sensibilité environ 15 à 30 % supérieure à celle de la culture en milieu solide.^{Référence 77} Trois systèmes automatisés de culture en milieu liquide sont approuvés par Santé Canada : le BACTEC MGIT (Mycobacterial growth indicator tube [tube indicateur de croissance mycobactérienne]) de Beckton-Dickinson, le BacT/ALERT de bioMérieux et le Myco-ESP culture System II de Trek Diagnostic Systems Inc. Ces systèmes totalement automatisés permettent une détection fluorimétrique ou colorimétrique de la croissance des mycobactéries et augmentent le débit de traitement des échantillons à analyser. Dans le cas de la TB pulmonaire, la sensibilité de trois cultures d'expectorations dépasse 90 %, mais il faut six échantillons pour atteindre une sensibilité de 100 %. Trois cultures d'échantillons sont recommandées pour permettre de poser un primo diagnostic, car ce nombre satisfait à la fois aux exigences de sensibilité et d'efficience^{Référence 78}

Au moins un milieu liquide par échantillon clinique devraient être ensemencés pour la culture de BAAR et, selon l'échantillon, les laboratoires peuvent également ensemencer un milieu solide. Les milieux de culture devraient être incubés pour un minimum de 6 et jusqu'à 8 semaines. Les cultures positives de CMTB devraient être conservées pendant au moins 1 an au cas où d'autres tests seraient nécessaires^{Référence 28Référence 79}

Il est important de se rappeler qu'une culture faussement positive du CMTB est possible, principalement en raison d'une contamination croisée au laboratoire, bien qu'une contamination d'échantillons et des erreurs de la part de prescripteurs aient été signalées.^{Référence 80Référence 81} Si on obtient une seule culture positive, en particulier si le frottis était négatif et que la culture est devenue positive après beaucoup plus de temps que le délai moyen, on devrait mener une enquête et considérer le résultat comme un faux positif possible. Le laboratoire concerné devrait mener une enquête et vérifier toutes les cultures positives effectuées le même jour ou manipulées à proximité de la culture positive unique. S'il existe d'autres cultures positives qui pourraient être la source d'une contamination croisée, il convient de procéder à des analyses génétiques sur l'isolat en question ainsi que d'autres isolats traités à la même date par le même laboratoire.^{Référence 82}

A.3.5. Identification des espèces de mycobactéries isolées en culture

L'identification des mycobactéries d'après leurs caractéristiques biochimiques et physiques est un processus long et fastidieux qui ne permet pas toujours d'identifier correctement le bacille en cause. L'identification rapide d'une culture de CMTB (par opposition à une culture de MNT) et l'identification plus poussée des espèces composant le CMTB sont nécessaires à des fins cliniques et de santé publique.

L'identification rapide d'une culture peut être réalisée par différentes approches, basées principalement sur les caractéristiques génotypiques ou le dépistage d'antigènes ou la spectrométrie de masse des protéines. Les tests immunochromatographiques ciblant l'ADN ou les protéines de M. tuberculosis se sont révélés être un moyen sensible et spécifique pour identifier les espèces composant un CMTB. De même, une analyse par désorption/ionisation laser assistée par matrice MALDI-ToF (matrix assisted laser desorption ionization) peut être utilisée pour déterminer de manière concluante qu'un organisme fait partie du groupe CMTB ou du groupe MNT. Aucune de ces approches ne permet de faire la différenciation des espèces d'un complexe de mycobactéries tuberculeuses.

Les techniques basées sur le génotype, comme les TAAN ciblant des gènes spécifiques de différenciation (par exemple, les régions de différence), le séquençage ciblé (par exemple, le gène gyrB) ou le séquençage du génome entier peuvent permettre de différencier les espèces composant un CMTB. La confirmation d'un organisme en croissance comme M. bovis (ou le bacille de Calmette-Guérin [BCG] de M. bovis) est particulièrement importante étant donné la résistance intrinsèque de ces organismes à la pyrazinamide et la nécessité de rechercher une cause sous-jacente à l'infection au BCG (traitement du cancer de la vessie ou après la vaccination du jeune enfant).

A.3.6. Épreuves de sensibilité aux antituberculeux

La méthode des proportions sur milieu solide demeure la méthode de référence pour l'antibiogramme du CMTB.^{Référence 83} Toutefois, comme il s'agit d'une technique fastidieuse et que la période d'incubation est longue, les méthodes plus rapides de détection en milieu liquide faisant appel à des systèmes de surveillance continue sont maintenant recommandées. De plus, les résultats de l'antibiogramme sont souvent disponibles dans les 10 à 14 jours après réception de la culture. On consultera la plus récente ligne directrice du CLSI pour connaître les paramètres d'analyse.^{Référence 84}

• Les laboratoires qui réalisent des antibiogrammes doivent généralement être des laboratoires de référence agréés afin d'assurer qu'ils ont un volume d'activité suffisant pour maintenir l'expertise.
• La sensibilité aux antibiotiques de première intention doit être testée pour tous les nouveaux isolats de tuberculosis. Les antituberculeux de première intention (ou majeurs) sont l'isoniazide (INH), la rifampicine (RMP), l'éthambutol (EMB) et la pyrazinamide (PZA).
• Un antibiogramme pour les antibiotiques de seconde intention devrait être réalisé lorsqu'on détecte une résistance à un antituberculeux de première intention, et ce, que l'antibiogramme avec ces antituberculeux de première intention soit répété ou non.
• Les antituberculeux de deuxième intention disponibles (au moment de la rédaction du présent document) dans les laboratoires de référence au Canada comprennent l'amikacine, les fluoroquinolones (lévofloxacine et [ou] moxifloxacine), la rifabutine, l'éthionamide, l'acide p-aminosalicylique et le linézolide.
• Les laboratoires devraient tester au moins un agent de chaque classe; on devrait notamment tester au moins une fluoroquinolone, qui devrait être choisie en consultation avec les médecins qui traitent la plupart des patients atteints de TB pharmacorésistante.
• D'autres médicaments sont utilisés pour le traitement de la TB multirésistante (TB-MR), notamment la bédaquiline, la clofazimine, la cyclosérine, le delamanide et l'imipénème/meropénème., notamm Aucun test de résistance pour la bédaquiline, le delamanide et la clofazimine n'est disponible au Canada, mais les auteurs du présent document invitent les laboratoires de référence à répondre à ce besoin, étant donné que les médicaments sont utilisés et que des normes sont disponibles. Bien que la cyclosérine et l'imipénème/meropénème soient des options thérapeutiques viables, le CLSI ne recommande pas de les inclure dans les épreuves de résistance.

A.3.7. Prédiction moléculaire de la pharmacorésistance

La prédiction moléculaire de la pharmacorésistance de M. tuberculosis est devenue un outil important pour l'identification rapide de la TB-MR. Ces méthodes moléculaires peuvent réduire le temps nécessaire à la détection d'une pharmacorésistance à l'aide de méthodes phénotypiques et accélérer l'adaptation du traitement. Les tests moléculaires pour identifier les déterminants de pharmacorésistance procurent des résultats présomptifs et l'utilisation de ces tests n'élimine pas la nécessité de réaliser un antibiogramme classique.

Les méthodes moléculaires devraient être validées, comme toute autre méthode, et devraient toujours être accompagnées d'un antibiogramme phénotypique. Cependant, jusqu'à présent, il n'y a pas de témoins positifs définis pour représenter la présence de souches de M. tuberculosis multirésistantes. Une option récemment développée consiste à utiliser des souches sécuritaires de BCG (un vaccin contre la tuberculose) marquées ayant des mutations connues conférant une résistance à l'INH, à la RMP, à la moxifloxacine ou à la bédaquiline.^{Référence 85} Le BCG est déjà résistant à la PZA.

Les méthodes permettant de prédire la résistance comprennent la PCR mise au point en laboratoire, les tests d'hybridation inverse en ligne commerciaux approuvés, les tests basés sur la PCR en temps réel, le séquençage ciblé et le séquençage du génome entier. À l'exception du séquençage du génome entier, toutes les méthodes sont limitées par des cibles spécifiques et prédéterminées du génome; les mutations, insertions et délétions associées à la résistance qui ne font pas partie de ces cibles peuvent donc être manquées. Les deux méthodes génotypiques ciblées qui sont approuvées par l'OMS sont les suivantes : 1) les tests d'hybridation inverse en ligne (LPA, pour line-probe assay); et 2) le test GeneXpert MTB/RIF.

Des LPA ont été conçus et évalués pour l'antibiogramme direct sur des échantillons d'expectorations à frottis positif ou pour l'antibiogramme rapide sur les isolats obtenus en culture. Deux LPA sont offerts sur le marché : l'Inno-Liparif.TB (Innogenetics, Belgique) et le GenoType MTBDRplus (Hain Lifescience, Allemagne). Le test GenoTypeMTBDRplus est approuvé par Santé Canada.^{Référence 86} Il peut être utilisé pour tester les expectorations ou une culture de M. tuberculosis. Une méta-analyse a révélé que le GenoType MTBDRplus a une sensibilité globale de 98,1 % et une spécificité globale de 98,7 %.^{Référence 87} L'exactitude en ce qui concerne l'INH était variable, la sensibilité étant inconstante et plus faible (84,3 %) et la spécificité, élevée (99,5 %). L'OMS reconnaît l'utilité des LPA pour le diagnostic rapide de la résistance à l'INH et à la RMP dans les échantillons d'expectorations à frottis positif. Cependant, l'utilisation de LPA n'élimine pas la nécessité de la culture et de l'antibiogramme classiques.

Comme nous l'avons indiqué précédemment, le Xpert MTB/RIF permet de diagnostiquer rapidement la TB et permet aussi de détecter les mutations au gène rpoB pour la résistance à la RMP avec une sensibilité d'environ 94 % et une spécificité de 98 %.^{Référence 52} Cependant, ces estimations concernent des milieux où le fardeau de la maladie est élevé. La valeur prédictive dans le cas de la résistance à la RMP dépend de la prévalence de la TB pharmacorésistante dans un milieu donné. Dans la méta-analyse susmentionnée sur le test de diagnostic de la tuberculose, une analyse a également été réalisée pour la détection d'une résistance à la RMP (11 études, 2 340 participants). La sensibilité et la spécificité médianes globales étaient estimées à 94 % (87 %, 97 %) et à 98 % (97 %, 99 %), respectivement. Bien que la spécificité soit élevée, la prévalence de la résistance à la RMP est faible au Canada. La prise en charge des patients présentant un rapport de résistance isolé à la RMP chez un individu présentant un faible risque de TB-MR est abordée au Chapitre 8 : La tuberculose pharmacorésistante. Le problème se retrouve probablement dans la dernière génération de test, le Xpert Ultra, où la sensibilité et la spécificité globales pour la résistance à la RMP étaient de 94,9 % (88,9 à 97,9 %) et 99,1 % (97,7 à 99,8 %).^{Référence 52}

Contrairement aux approches ciblées, le séquençage du génome entier fournit des renseignements sur l'ensemble du génome; ces données peuvent ensuite être utilisées non seulement pour prédire la résistance, mais aussi la sensibilité à différents antibiotiques, selon les associations génotype-phénotype connues.^{Référence 88}

Le séquençage du génome entier s'est avéré avoir une sensibilité et une spécificité élevées pour la prédiction de la résistance phénotypique aux antibiotiques de première intention.^{Référence 89} Une analyse de plus de 10 000 génomes réalisée avec les données phénotypiques associées provenant de 16 pays a été menée dans le cadre du projet CRyPTIC (Comprehensive Resistance Prediction for Tuberculosis : an International Consortium) a permis de déterminer que la sensibilité des prédictions obtenues par séquençage du génome entier pour l'IHN, la RMP, l'EMB et la PZA était, respectivement, de 95,5 %, 97,1 %, 94,6 % et 91,3 %. La spécificité des prédictions pour ces antibiotiques était quant à elle de, respectivement, 98,8 %, 99,0 %, 93,6 % et 96,8 %.^{Référence 89} Fait important pour un milieu à faible résistance comme le Canada, la valeur prédictive négative modélisée de cette approche est demeurée supérieure à 95 %, même lorsque le niveau de prévalence de la résistance va de 34 % (PZA) à 57 % (RMP). Une sous-analyse a également été réalisée, laquelle s'est limitée aux ensembles de données non enrichis pour la résistance; en tirant parti de l'association entre la résistance à l'INH et la résistance à d'autres antibiotiques, la sensibilité totale aux antibiotiques de première intention était de 99,7 %, ce qui est concordant avec les antibiogrammes phénotypiques. Des résultats similaires ont par la suite été rapportés dans des études menées aux Pays-Bas^{Référence 90} et dans l'état de New York.^{Référence 91} Les résultats discordants de ces études ont été principalement attribués à des erreurs d'écriture ou d'étiquetage, à des mutations pour lesquelles la concentration minimale inhibitrice était proche du seuil (comme c'est souvent le cas avec l'EMB) ou à l'impossibilité de reproduire les résultats obtenus avec le test Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT).^{Référence 91}

Aux Pays-Bas, on a estimé que le passage au séquençage du génome entier pour prédire la sensibilité réduisait les tests phénotypiques pour la TB d'environ 90 %,^{Référence 90} étant donné qu'un test phénotypique n'était plus réalisé lorsqu'une prédiction de pansensibilité était donnée pour un isolat^{Référence 89} pour détecter les écarts susmentionnés ainsi que les nouvelles mutations et (ou) les mutations qui n'ont pas encore été cataloguées; il serait cependant préférable que les laboratoires canadiens envisageant de passer aux prédictions fondées sur le séquençage du génome entier continuent de tester avec un antibiogramme phénotypique un pourcentage minimum d'isolats (par exemple, 5 %) pour lesquels une prédiction de pansensibilité a été donnée à la suite du séquençage du génome entier.

En plus de réduire les demandes de tests phénotypiques, l'utilisation des prédictions de résistance obtenues par séquençage du génome entier a le bénéfice potentiel de réduire les délais d'exécution. C'est ce qu'on peut constater dans deux scénarios. Si le séquençage du génome entier prédit une résistance, le laboratoire peut procéder immédiatement à la réalisation d'un antibiogramme pour les antibiotiques de première et de deuxième intention de manière simultanée, plutôt que de le faire de manière séquentielle. Si le séquençage du génome entier prédit une sensibilité totale aux antibiotiques de première intention, le résultat peut être transmis directement, sans attendre qu'un antibiogramme phénotypique soit réalisé.

Idéalement, pour réduire les délais d'exécution, le séquençage du génome entier devrait être réalisé directement sur les expectorations; obtenir suffisamment d'ADN génomique de M. tuberculosis,^{Référence 92Référence 93} et atteindre la profondeur de séquençage nécessaire pour l'analyse de la résistance demeurent cependant un défi. Pour permettre l'identification de la plupart des variantes de faible fréquence, une cible de profondeur de couverture d'environ 100 x est recommandée pour les cultures positives. Dans l'état de New York, le séquençage est réalisé sur des cultures de MGIT positives précoces, pour lesquelles une concentration minimale de 0,2 ng/μl est requise afin d'atteindre un taux d'échec inférieur à 7 % sur le séquençage initial du génome entier; dans ces conditions, la profondeur moyenne était de 133 x et des résultats étaient déclarés en moyenne 9 jours plus tôt pour les antibiotiques de première intention et 32 jours plus tôt pour les antibiotiques de deuxième intention, comparativement aux délais d'exécution d'un antibiogramme, qui est de 15 jours à partir du premier résultat positif et comprend le mélange hebdomadaire des échantillons.

A.4. Tests de libération d'interféron gamma

Les tests de libération d'interféron gamma (TLIG) ont été mis au point pour la détection de l'infection tuberculeuse (voir le Chapitre 4 : Le diagnostic de la tuberculose). Ils détectent la réponse immunitaire à médiation cellulaire à des antigènes spécifiques du CMTB (y compris les souches virulentes de M. bovis), mais qui sont absents dans la souche M. bovis du BCG et la plupart des MNT (les antigènes sont exceptionnellement présents dans M. kansasii, M. szulgai et M. marinum). La détection d'une réponse à ces antigènes indique une infection actuelle ou antérieure par M. tuberculosis. Deux types de TLIG sont actuellement homologués au Canada : QuantiFERON-TB Gold In-Tube Plus (QFT-Plus) (Cellestis/Qiagen, Carnegie, Australie) et T-SPOT.TB (T-SPOT) (Oxford Immunotec, Abingdon, Royaume-Uni).

Des échantillons de sang total sont nécessaires pour les TLIG. Ces derniers peuvent être effectués par tout laboratoire agréé au Canada : nul besoin d'expertise en mycobactériologie ni de laboratoire de niveau de confinement 3. Il faut tout de même une compétence de laboratoire clinique standard pour prélever les échantillons, les transporter et exécuter le test.

Les laboratoires doivent s'assurer que le prélèvement et le transport des échantillons sont normalisés. Il est en effet connu que les étapes préanalytiques telles que l'agitation des tubes, l'intervalle entre le prélèvement du sang et l'incubation, et la durée exacte d'incubation ont une influence sur les résultats^{Référence 94Référence 95}. Si on utilise des étuves portatives, il importe de s'assurer que leur température peut être stabilisée précisément à 37 °C. Des méthodes d'assurance qualité strictes sont nécessaires pour déceler les tendances inhabituelles dans les résultats (p. ex. un pic du nombre de résultats indéterminés en raison d'une faible réponse à l'agent mitogène ou de fortes réponses des témoins négatifs), et il est important d'analyser un témoin négatif et un témoin positif à chaque test. Les détails spécifiques de chaque test sont disponibles dans les instructions des fabricants.

A.4.1. Rendement des tests, assurance qualité et interprétation des résultats : information technique clé

A.4.1.1. QFT-Plus

Le test QuantiFERON Gold Plus est la nouvelle version du test QuantiFERON Gold TB. Ce test comprend quatre tubes : un témoin négatif, un tube d'antigènes TB 1 (TB1), un tube d'antigènes TB 2 (TB2) et un témoin mitogène. Le tube d'antigènes TB1 contient des peptides provenant des antigènes ESAT-6 et CFP-10, qui sont conçus pour déclencher une réponse immunitaire des lymphocytes T auxiliaires CD4+. Le tube d'antigènes TB2 contient une série de peptides exclusifs aux antigènes ESAT-6 et CFP-10 supplémentaires qui, ensemble, déclenchent la sécrétion d'interféron gamma (IFN-γ) par les lymphocytes T CD4+ et CD8+.

Le sang peut être prélevé directement dans les 4 tubes de test QFT-Plus, ou encore dans un seul tube avec héparine de lithium, puis transféré dans les tubes QFT-Plus. Les échantillons de sang prélevés dans les tubes avec héparine de lithium peuvent être conservés à 2–8 °C pendant 48 heures avant leur transfert dans les tubes QFT-Plus.

Communication et interprétation des résultats pour le test QFT-GIT : consultez la notice de l'emballage du fabricant (reproduite dans le Tableau 3). Les résultats du test QFT-Plus sont positifs si l'un ou l'autre ou les deux tubes de test avec les antigènes TB (TB1 et [ou] TB2) sont positifs.

Bien que le seuil de positivité du QFT soit de 0,35 UI/ml d'IFN-γ pour TB1-Nil ou TB2-Nil, il est important de fournir au clinicien qui a demandé le test la valeur numérique du résultat (valeur quantitative) ainsi que l'interprétation (positif, négatif, indéterminé). Il est recommandé d'interpréter avec prudence les valeurs d'IFN-γ obtenues avec le QFT qui se situent entre 0,20 et 1,00 UI/ml. Les taux élevés de positivation et de négativation du TLIG et la reproductibilité imparfaite ont été signalés dans les écrits lorsque les résultats sont de cet ordre. Les résultats se situant dans cette fourchette de valeurs se sont pourtant avérés cliniquement significatifs dans certaines populations à haut risque. La valeur prédictive positive des résultats se situant dans cette fourchette varie donc en fonction des facteurs de risque clinique (voir le Chapitre 4 : Le diagnostic de la tuberculose).

Des notes explicatives devraient accompagner les résultats indéterminés dans les cas suivants, conformément aux instructions du fabricant :

• témoin nul élevé (forte production de base d'interféron) : interprétation impossible
• témoin mitogène bas (réponse nulle aux antigènes stimulants) : interprétation impossible

Les résultats indéterminés ou non fiables peuvent être causés par :

• un problème technique, y compris un protocole inadéquat
• des concentrations excessives d'IFN-γ en circulation ou la présence d'anticorps hétérophiles
• un délai de plus de 16 heures entre le prélèvement du sang et l'incubation à 37 °C
• la conservation du sang à une température inadéquate

(17–25 °C)

• le mélange insuffisant des tubes de prélèvement
• le lavage incomplet de la plaque ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay).

Si on croit qu'un résultat indéterminé est causé par un problème technique (p. ex. lavage des plaques), il faut répéter l'analyse.

A.4.1.2. T-Spot

L'épreuve T-SPOT^{Référence 96Référence 97Référence 98} est une technique immunoenzymatique de type ELISPOT (enzyme-linked immunospot), dans laquelle un nombre défini de cellules mononucléées du sang périphérique (CMSP) sont incubées avec des antigènes CFP-10 et ESAT-6. Les lymphocytes T qui ont été préalablement sensibilisés aux antigènes de M. tuberculosis à la suite d'une infection sécrètent de l'IFN-γ en réponse à la stimulation in vitro avec CFP-10 et ESAT-6.

L'épreuve T-SPOT nécessite un prélèvement sanguin standard dans des tubes avec héparine de lithium. Après le prélèvement, les cellules du CMTB sont séparées et dénombrées.

L'épreuve T-SPOT nécessite un inoculum de 1 × 10 CMTB par patient (2,5 × 105 par puits, pour un total de quatre puits [témoin nul, antigène ESAT-6, antigène CFP-10 et témoin positif [phytohémagglutinine, ou PHA]]. Des colonies de CMTB ajoutées aux puits sont fixées sur une membrane de puits. Les cellules qui répondent aux antigènes libèrent des IFN-γ à proximité de leur emplacement sur la membrane, qui sont ensuite visualisés à l'aide d'anticorps contre les IFN-γ. Les résultats sont quantifiés en comptant les spots qui apparaissent là où des IFN-γ sont libérés. Pour l'interprétation des résultats de l'épreuve T-Spot, consultez la Figure 1.

Habituellement, on n'observe aucun spot ou on n'en observe que quelques-uns dans le puits du témoin négatif.

Si on compte plus de 10 spots dans le puits du témoin négatif, le résultat devrait être considéré comme « indéterminé ».

Si on observe un grand nombre de spots ou un fond sombre dans le puits du témoin négatif, on doit vérifier s'il y a contamination d'un réactif ou du milieu de culture.

Le puits du témoin positif devrait contenir plus de 20 spots.

Si le puits du témoin positif contient moins de 20 spots, le résultat est considéré comme « indéterminé » (à moins que le panel A ou B ne soit « réactif », conformément aux exigences de communication des résultats, voir la Figure 1); vérifier si les conditions d'incubation recommandées ont été respectées. Une réponse faible à la PHA pourrait indiquer une anergie chez le patient.

Pour la figure 1, la notice PDF du test T (en anglais seulement) contient des données et des détails supplémentaires.

Figure 1 : Texte descriptif

• On ne doit observer que peu de spots, voire aucun, dans le témoin négatif. Si l'on compte plus de 10 spots, les résultats sont considérés comme non valides et il faut refaire le test.
• Le témoin positif qui renferme un agent mitogène doit compter plus de 20 spots. Si l'on compte moins de 20 spots, les résultats sont considérés comme indéterminés et il faut refaire le test, à moins que le panel A-Nul ou le panel B-Nul contienne au moins 8 spots, auquel cas on obtiendra un résultat positif du test. Si le témoin positif renfermant un agent mitogène compte moins de 20 spots en l'absence de ces seuils pour le panel A-Nul ou le panel B-Nul, il faut s'assurer que les conditions d'incubation recommandées ont été respectées.
• Lorsque les deux témoins conviennent :
  • Si le panel A-Nul ou le panel B-Nul compte au moins 8 spots, il s'agit d'un résultat positif pour la tuberculose.
  • Si le panel A-Nul de même que le panel B-Nul comptent au plus 5, 6 ou 7 spots, il s'agit d'un résultat limite pour la tuberculose, et il faut refaire le test.
  • Si le panel A-Nul et le panel B-Nul contiennent tous les deux au plus 4 spots, il s'agit d'un résultat négatif pour la tuberculose.

A.5. Critères pour la transmission des rapports et délais d'exécution

Voici quelques recommandations s'appliquant à chaque système de transmission des résultats de laboratoire :

• On devrait pouvoir trouver facilement dans les modes opératoires normalisés (MON) les délais d'exécution établis et les paramètres de transmission des rapports pour chaque méthode d'analyse (Tableau 2).
• Les rapports doivent être datés et indiquer le microbiologiste de laboratoire qui a supervisé les analyses.
• Les données rapportées doivent être diffusées par un système d'information de laboratoire numérique accessible au clinicien qui soumet le test, par ligne téléphonique sécurisée, par télécopieur ou par courriel, et ce, dans les 24 heures suivant la réalisation du test.
• Les résultats préliminaires (par exemple, un nouveau résultat de BAAR positif) et les changements critiques (par exemple, un MNT reclassé en tuberculosis) devraient être immédiatement communiqués au médecin ayant soumis le test, idéalement par téléphone.
• Le médecin ayant soumis le test et la santé publique doivent être informés dès qu'une souche de TB pharmacorésistante suspectée ou confirmée est détectée.
• Lorsque les rapports concernent des tests non normalisés (par exemple l'utilisation pour l'antibiogramme d'antituberculeux non recommandés par le CLSI, il faudrait le mentionner.
• On devrait évaluer tous les ans les délais d'exécution de la microscopie et des TAAN et les vérifier régulièrement (tous les mois) pour s'assurer qu'ils sont respectés.

Tableau 1. Nombre de bactéries observées au microscope et interprétation du laboratoire^{Table 1 note de bas de page a} (Nombre de BAAR observés selon la méthode de coloration)

Colorationà la fuchsine (Kinyoun) (grossissement 1 000 x)Table 1 note de bas de page b	Fluorochrome (Auramine) (grossissement 250x)	Méthode d'interprétation semi-quantitative : rapport
0 par 300 champs	0 par 30 champs	Négatif
1-2 par 300 champs	1-2 par 30 champs	Examen non concluant, à répéter
1-9 par 100 champs	1-9 par 10 champs	1+ (rare)
1-9 par 10 champs	1-9 par champ	2+ (faible quantité)
1-9 par champ	10-90 per champ	3+ (quantité modérée)
>9 par champ	>90 per champ	4+ (nombreux)
Abréviation : BAAR = bacille acido-alcoolo-résistant. Notes de bas de page : Table 1 Note de bas de page a Tiré des Normes canadiennes pour la lutte antituberculeuse, 7iemeédition. Agence de la santé publique du Canada. Retour à la référence de la table 1 note de bas de page a Note de bas de page b Tous les rapports doivent indiquer la méthode de coloration utilisée ainsi que le nombre réel d'organismes observé Retour à la référence de la table 1 note de bas de page b

Tableau 2. Résumé des délais d'exécution suggérés (se reporter aux sections correspondantes pour en savoir plus)^{Référence 28}

Procédure	Délais d'exécution/de transmission du rapport
Prélèvement des échantillons et réception au premier laboratoire	24 heures
Examen microscopique des frottis BAAR	24 heures après réception de l'échantillon, si disponible
Test d'amplification des acides nucléiques (TAAN) pour la détection de M. tuberculosis	< 7 jours après les résultats du frottis ou 24 heures après la réception de l'échantillon si aucun frottis de BAAR n'est disponible localement.
Identification de l'isolat mycobactérien comme étant un complexe de M. tuberculosis (ou une mycobactérie non tuberculeuse)	2 jours après une culture positive
Antibiogramme phénotypique avec les antituberculeux de première intention.	3 semaines après une culture positive reçue dans un laboratoire de référence, selon l'antibiotique
Transmission de tous les résultats d'analyse	24 heures après la fin des tests
Abréviation : BAAR = bacille acido-alcoolo-résistant.

Tableau 3. Critères d'interprétation pour le test QuantiFERON^®-TB Gold Plus (recommandations du fabricant)

Témoin nul (IU/ml)	Antigène TB1 et (ou) TB2, moins témoin nul (IU/ml)	Mitogène, moins témoin nul (IU/ml)	QuantiFERON®-TB (IU/ml)	Report/Interprétation
≤ 8,0	< 0,35	≥ 0,5	Négatif	Infection par M. tuberculosis peu probable
	≥ 0,35 et < 25 % de la valeur nulle	≥ 0,5
	≥ 0.35 et ≥ 25 % de la Valeur nulle	N'importe quelle valeur	Positif	Infection par M. tuberculosis probable
	< 0,35	< 0,5	Indéterminé	Résultats indéterminés pour la réponse à l'antigène TB. Répéter l'analyse si cela est cliniquement indiqué.
	≥ 0,35 et < 25 % de la Valeur nulle	< 0,5
> 8,0	N'importe quelle valeur	N'importe quelle valeur

Références